Summary
本工作描述了生产用于 克氏锥虫 DNA检测的即用型qPCR的步骤，该qPCR可以预先加载到反应容器中并在冰箱中储存数月。
Abstract
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种非常灵敏和精确的技术，可以从大量样品中扩增微量的核酸靶标。它已广泛应用于许多研究领域，并在转基因作物的人体诊断和性状选择等领域实现工业应用。然而，qPCR不是一种防错技术。将所有试剂混合到单个预混液中，随后分配到常规qPCR板的96个孔中可能会导致操作人员错误，例如试剂混合不正确或分配到孔中不准确。这里介绍了一种称为凝胶化的技术，其中预混液中存在的大部分水被试剂取代，这些试剂在提交真空时形成溶胶-凝胶混合物。结果，qPCR试剂在室温下有效保存数周或在2-8 °C下保存数月.此处显示了制备每种溶液的详细信息以及旨在检测克氏锥虫 卫星DNA（satDNA）的凝胶化反应的预期方面。类似的程序可以应用于检测其他生物。开始凝胶化qPCR运行就像从冰箱中取出板，将样品添加到各自的孔中并开始运行一样简单，从而将全板反应的设置时间减少到加载样品所需的时间。此外，可以批量生产和控制凝胶化PCR反应的质量，从而节省时间并避免在运行常规PCR反应时出现常见的操作错误。
Introduction
恰加斯病是在20世纪初在 巴西农村地区发现的，那里的贫困普遍存在1，2。即使在今天，这种疾病仍然与美洲健康的社会和经济决定因素有关。恰加斯病是双相的，包括急性期和慢性期。它是由 克氏锥 虫寄生虫感染、通过昆虫媒介传播、通过先天途径输血或口服摄入受污染的食物引起的3，4。
恰加斯病的诊断可以通过观察临床症状（尤其是罗马尼亚征）、血涂片显微镜检查、血清学和分子检测（如实时荧光定量 PCR （qPCR） 或等温扩增4，5，6，7，8，9）进行。临床症状和血涂片显微镜检查用于疑似急性感染病例，而寻找抗体则用作无症状患者的筛查工具。由于其敏感性和特异性，qPCR 已被建议用作慢性患者的监测工具、正在接受治疗的急性患者测量血液中寄生虫负荷以及作为治疗失败的替代标志物6，8，10，11，12.尽管qPCR比目前可用的测试更具敏感性和特异性，但由于运输和储存需要冷冻温度，qPCR在全球贫困地区被有效地阻止了诊断工具13，14，15。
为了绕过这一障碍，已经探索了冻干和凝胶化等保护技术16，17。虽然冻干可提供多年的保存，但它需要不含甘油的特殊试剂，甘油通常用于酶稳定/保存18。虽然凝胶化已被证明可以提供数月的保存，但它允许使用常规试剂19。凝胶化溶液包括四种组分，每种组分在过程中都有特定的作用：糖海藻糖和黑糖糖在干燥过程中通过还原溶液中的游离水分子来保护生物分子，糖原产生更广泛的保护基质，氨基酸赖氨酸用作自由基清除剂以抑制生物分子羧基之间的氧化反应， 氨基和磷酸基团。这些组分定义了溶胶-凝胶混合物，可防止在干燥过程中损失三级或四级结构，从而有助于维持生物分子在补水时的活性19。一旦在反应管内稳定，反应可以在2-8°C下储存几个月或在21-23°C下储存数周，而不是常规的-20°C。 这种方法已被纳入旨在帮助诊断恰加斯病、疟疾、利什曼病、结核病和环孢子虫病等疾病的测试中13，14，15，20。
本工作描述了为凝胶化程序准备所需解决方案的所有步骤、过程中的陷阱以及八管条带内即用型凝胶化qPCR的预期最终方面。相同的方案可以适用于单管或96孔板。最后， 克氏锥虫 DNA的检测将显示为对照运行。
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Protocol
1. 储备溶液和凝胶化混合物的制备
注意：将制备四种储备溶液（400 mg / mL的melezitose，400 mg / mL的海藻糖，0.75 mg / mL的赖氨酸和200 mg / mL的糖原）并根据 表1 所示的比例混合以产生凝胶化混合物。尽管该方案描述了 10 mL 储备溶液的生产，但它可以适用于较低或较高体积。
- 美来糖溶液
- 称取 4 g 蜜蜂托糖放入 15 mL 塑料管中，加入 6 mL 无核酸酶水，以仪器的最大速度涡旋直至粉末溶解。
注意：可以添加更多的水以促进溶解，注意不要超过最终体积（见下文）。 - 用无核酸酶水将最终体积补足至 10 mL。贴标并在2-8°C下储存长达6个月。
- 称取 4 g 蜜蜂托糖放入 15 mL 塑料管中，加入 6 mL 无核酸酶水，以仪器的最大速度涡旋直至粉末溶解。
- 海藻糖溶液
- 在 15 mL 塑料管中称取 4 g 海藻糖，加入 6 mL 无核酸酶水，以仪器的最大速度涡旋直至粉末溶解。
注意：可以添加更多的水以促进溶解，注意不要超过最终体积（见下文）。 - 用无核酸酶水将体积补足至10 mL，并通过0.2 μm过滤器过滤溶液。贴标并在2-8°C下储存长达6个月。
- 在 15 mL 塑料管中称取 4 g 海藻糖，加入 6 mL 无核酸酶水，以仪器的最大速度涡旋直至粉末溶解。
- 糖原溶液
- 在 15 mL 塑料管中称取 2 g 糖原，加入 6 mL 无核酸酶水，以仪器的最大速度涡旋直至粉末溶解。
注意：可以添加更多的水以促进溶解，注意不要超过最终体积（见下文）。 - 将溶液在2-8°C下静置8-12小时，因为糖原的溶解产生大量气泡（图1）。用无核酸酶水将体积补足至 10 mL。贴标并在2-8°C下储存长达6个月。
- 在 15 mL 塑料管中称取 2 g 糖原，加入 6 mL 无核酸酶水，以仪器的最大速度涡旋直至粉末溶解。
- 赖氨酸溶液
- 称取 7.5 mg 赖氨酸在 15 mL 塑料管中，加入 6 mL 无核酸酶水。以仪器的最大速度涡旋，直到粉末溶解。
注意：可以添加更多的水以促进溶解，注意不要超过最终体积（见下文）。 - 用无核酸酶水将体积补足至10 mL，并通过0.2 μm过滤器过滤溶液。将溶液转移到琥珀色烧瓶中或避光。贴标并在2-8°C度下储存长达6个月。
- 称取 7.5 mg 赖氨酸在 15 mL 塑料管中，加入 6 mL 无核酸酶水。以仪器的最大速度涡旋，直到粉末溶解。
- 凝胶化混合物（GM）
- 在50 mL塑料管中，根据 表1混合储备溶液的体积。
- 通过管的十次端到端倒置混合试剂。
注意：如果在层流安全罩中执行此步骤，则不需要过滤步骤。如果未在清洁环境中执行此步骤，则在将其转移到琥珀色烧瓶之前，通过0.2μm过滤器过滤溶液。 - 将溶液转移到琥珀色烧瓶中或避光。贴标并在2-8°C下储存长达3个月。
注意：作为制备凝胶化混合物的质量控制步骤，请确保测量的pH，电导率和密度值在以下范围内：pH 5.55-6.66;电导率 0.630-0.757 mS/cm;密度1.08-1.11克/厘米3.所有测量应在25°C下进行。
2. 凝胶化用qPCR预混液的制备
注意：在此步骤中，制备用于凝胶化的qPCR预混液。因此，不向混合物中加入水，而是加入凝胶化混合物（表2）。
- 在冷藏容器中解冻试剂。根据 表2在1.5 mL管中混合试剂。此处显示了最终体积为 25 μL 的反应示例，其中包含 5 μL DNA 样品。
注意：在此步骤中，DNA样品不会添加到混合物中;它在这里仅用于计算qPCR预混液每种试剂的最终体积。应在开始运行之前添加 DNA 样本（请参阅下面的步骤 4）。
3. 反应容器上试剂的凝胶化
- 适当乘以 表2 所示的体积以制备八管联管或96孔板。
- 将 表2 所示的18.5μL凝胶化预混液移液到每个反应孔中。
注意：该体积代表用于一次反应的寡核苷酸混合物，PCR缓冲液和凝胶化混合物的体积（根据 表2），并且将根据试剂的浓度和一次反应所需的体积而变化。凝胶化预混液中的最终体积与常规预混液中的体积不同，因为不加水。 - 将管/板放在真空烤箱内的导热支架（例如铝）中。
注意： 导热支架是可选的。操作员必须确保管子底部与真空烤箱架接触，以实现快速热平衡。 - 每两个96孔板放置一个膨润土粘土袋。
注意：膨润土粘土袋用于通过真空施加的压差从凝胶化预混料中吸收去除的水。发现膨润土粘土袋对于少于两个96孔板是不必要的。 - 将含有凝胶化预混液的管/板置于三个真空循环（30±5mBar）下，每个30分钟，与真空释放交替，直到达到大气压（900-930mBar），在受控温度（30°C±1°C）（图2）。
注意：仪器使用软件来控制参数，循环示例如图 2所示。用户必须为运行创建配置文件，指示所选参数。 - 循环完成后，通过确保体积明显减小（图3）并且用手指敲击试管/板时液体不会移动，检查试管/板是否对试剂进行适当的凝胶化。
注意：如果未发生凝胶化，则当敲击管时，溶液会溅到管壁上（图3）。 - 使用前密封并将管/板在2-8°C下储存8-12小时。
4. 使用凝胶化的 qPCR
- 从冰箱中取出试管条或板，然后在工作站中打开它进行样品操作。向每个反应容器中加入 15 μL 无核酸酶水。
注意：凝胶化试剂的体积被认为约为 5 μL。因此，连同DNA样品体积（见下文），最终反应体积为25 μL。 - 加入 5 μL DNA 样品。
注意：可以使用任何qPCR质量的DNA模板。在本工作中，从10 88C. cruzi 表鞭毛虫（菌株Dm28c）中提取DNA，并使用TE缓冲液以1：10的比例连续稀释。 - 密封管/板并进入所选设备。运行实验并继续进行常规数据分析。
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Representative Results
形成凝胶化混合物的三种试剂在剧烈涡旋下很容易溶解。然而，糖原需要仔细涡旋以确保粉末完全溶解。不幸的是，剧烈涡旋会产生大量气泡，这使得难以确定溶液的实际体积（图1A-B）。因此，必须让糖原溶液在冰箱中休息，直到气泡中捕获的大部分溶液向下移动到主溶液体。考虑到生产方案和实验室常规，将凝胶板在冰箱中保存过夜（或约8-12小时），导致大多数气泡沉降，从而更容易确定正确的体积并调整到所需的最终体积（图1C）。注意图1B-C中糖原管之间的气泡体积差异，分别在溶解后和过夜沉降后。
一旦将凝胶化混合物添加到qPCR预混液中以代替水（表2），管条或板就可以进入真空炉了。真空烤箱的搁板包含一个帕尔贴加热元件，确保与其接触的任何管子保持相同的温度。在本协议中，腔室内的温度保持在30°C，而压力在910-930 mBar（大气压）和30 mBar（近真空）之间变化。图2显示了随时间变化的两个变量，显示了恒温（绿线，上 图 ）和压力变化（红线，下图）。循环结束后，孔内的预混液体积减小并在底部凝胶化，即当用手指敲击试管时不会移动或飞溅（图3）。现在可以将试管封盖并储存在2-8°C。 如果凝胶化混合物（表1）制备不正确，反应将无法凝胶化;在将凝胶化混合物与qPCR试剂混合之前，建议的质量控制步骤应先看到故障。
要使用时，试管/板内的凝胶化试剂必须重悬于无核酸酶的水中，并且DNA样品通常在水或TE缓冲液中稀释。溶胶 - 凝胶混合物试剂的重悬是在qPCR热方案变性的第一步（通常在95°C下5-10分钟）实现的，因此不需要额外的步骤。图4A显示了使用已发表的寡核苷酸序列15对克氏锥虫DNA进行qPCR检测的代表性痕迹。次优结果包括灵敏度损失，这可以通过具有已知基因组靶标浓度的溶液的稀释曲线进行测试，以及特异性损失，可以使用一组相关的锥虫微生物进行测试。图4B显示了当凝胶化过程未正确执行或反应在2-8°C下储存6个月以上后失去稳定性时可能出现的灵敏度损失。
图1：糖原的溶解产生大量气泡。 由于糖原在增溶过程中产生过多气泡，因此在调整到最终体积之前，糖原溶液必须保持静止。（A）涡旋过程中形成的气泡。（B）粉末全部溶解，但由于气泡过多，无法确定最终体积。（C）在冰箱（中间管）中12小时后，气泡体积减小。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：真空循环（下图）和温度控制（上图）。 显示了温度（上图）和压力（下图）变化的代表性曲线。黑线代表编程的变化，而绿线和红线代表仪器的实际读数。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：八管条内凝胶化预混液的各个方面 。 （A）在真空曝光前进行qPCR预混液。（B）由于凝胶化不完全（只有一个真空循环），液体溅在管壁上。（C）凝胶化的qPCR试剂，体积明显减少。当敲击试管时，液体不会溅到壁上。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：检测 克氏锥 虫表鞭毛虫 DNA 的凝胶化预混液的代表性痕迹。 从 克氏锥虫 表鞭毛虫（108 个细胞）中提取的DNA以1：10的比例连续稀释，并使用凝胶化qPCR检测104 至100 细胞的DNA浓度。（A）正确凝胶化qPCR的预期结果（B）使用未正确执行凝胶化的板检测相同的样品，导致灵敏度损失。请注意，在图 B中检测到较低浓度的频率较低。 请点击此处查看此图的大图。
| 溶液 | 库存集中度 | 卷 |
| 美来糖 | 400毫克/毫升 | 3毫升 |
| 特雷欧糖 | 400毫克/毫升 | 6毫升 |
| 赖氨酸 | 0.75毫克/毫升 | 3毫升 |
| 糖原 | 200毫克/毫升 | 3毫升 |
| 无核酸酶水 | 那 | 质量校准 20 毫升 |
表 1：用于生产 20 mL 凝胶化混合物的溶液的储备浓度和体积。 必须按比例调整每种储备溶液的体积，以产生更低或更高的凝胶化混合物的最终体积。
| 反应混合试剂 | 常规预混液 | 凝胶化预混液 |
| 低聚混合物 （25X） | 1 微升 | 1 微升 |
| PCR缓冲液（2X） | 12.5 微升 | 12.5 微升 |
| 凝胶化混合物* | - | 5 微升 |
| 无核酸酶水 | 6.5 微升 | - |
| 脱氧核糖核酸样本* | 5 微升 | 5 微升 |
| *最大为最终反应体积的20% | ||
表2：用于常规或凝胶化反应的qPCR预混液的试剂体积。 两种预混液之间的区别在于，将水添加到常规预混液中，而将凝胶化混合物添加到凝胶化预混液中（即代替水）。
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Discussion
近年来，人们强调需要找到更敏感和更具体的技术来帮助诊断热带和被忽视的疾病。虽然寄生虫学（光学显微镜）和血清学检测对流行病学控制很重要，但局限性，特别是在敏感性和床旁适用性方面。DNA扩增技术，如PCR，等温扩增和相应的变异，长期以来一直在实验室环境中使用，但技术障碍使其无法在现场环境中使用。主要障碍之一是试剂的运输和储存需要-20°C的温度。为了补救这种情况，已经使用冻干和凝胶化等技术将PCR反应储存在冰箱16，18，19之外。
本工作显示了凝胶化qPCR反应以检测反应容器内的 克氏锥虫 DNA所需的所有步骤，无论是试管，试管条，微流控芯片还是板。使用RT-LAMP反应的初步研究表明，凝胶化技术也可用于保存和屏蔽其他核酸扩增和修饰酶，如Rosado等人所述。19. 虽然相对简单，但在qPCR例程中导致大多数操作错误的两个步骤是（a）糖原和蜜糖溶液的制备和（b）在真空步骤之前计算要添加到每个反应管中的反应混合物的体积。首先，糖原溶液必须在最终体积调节之前冷藏过夜，并且必须剧烈涡旋美来糖溶液（可能在50°C下温和加热）以完全溶解。其次，计划实验的研究人员必须意识到，真空前计算的试剂体积可能不均匀，因为没有添加水以四舍五入到反应体积。在运行PCR之前，当通过加入样品和水重新溶解凝胶化反应时，将获得实际反应体积。
该方法的最大限制是反应的稳定性，在2-8°C下约6-8个月14，15;它比冻干反应短得多，冻干反应可能保持稳定18年。根据寡核苷酸序列的特异性，可能会发生非特异性结合和扩增，研究人员应仔细检查。例如，Costa和合作者报告说，用于检测 C. cayetanensis 的凝胶化qPCR的退火温度必须在+1°C下调整，以避免非特异性扩增15，21。同样，研究人员应避免使用可能受凝胶化组分调节的酶或使用凝胶化组分作为底物。
凝胶化技术特别有用，因为它易于在实验室常规中使用，并且可以引入生产线16，19，22，从而顺利进行质量控制;后者反过来又可以在多个操作员之间提供可靠且可比较的数据，并有效地消除关键步骤中常见的操作员错误，并消除运输和储存过程中的冷冻温度要求。初步研究表明，消除冷链将使qPCR测试的总体成本降低多达20%14。消除冷链也使得在欠发达地区实施qPCR作为被忽视疾病（如恰加斯病）的验证性测试成为可能，从而有利于其流行病学控制23。
最后，凝胶化方案简化了qPCR测试的使用，因为它只需要用户添加水和提取的 克氏锥虫 DNA，避免了试剂处理过程中的错误，并减少了设置时间以及试剂污染的可能性。这些特性为常规诊断实验室提供了效率，加快了向患者提供结果的速度，提高了诊断的可靠性。最后，由于它不需要-20°C冷链，因此适用于资源匮乏环境中的诊断使用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Aline Burda Farias为真空烘箱提供的技术援助，并感谢巴拉那分子生物学研究所（IBMP，巴西库里提巴）的行政部门允许使用上述设备。这项工作的部分资金来自 CNPq 445954/2020-5 赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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