Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63316
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1,2, 1,3
1Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS), Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2Pós-graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 3Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

Summary

Bu çalışma, reaksiyon kabına önceden yüklenebilen ve birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabilen T. cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR üretme adımlarını açıklamaktadır.

Abstract

Gerçek zamanlı PCR (qPCR), çok sayıda numuneden nükleik asit hedeflerinin dakika miktarlarını yükseltmeye olanak tanıyan son derece hassas ve hassas bir tekniktir. Birçok araştırma alanında yaygın olarak kullanılmış ve genetiği değiştirilmiş organizmaların (GDO) mahsullerinin mahsullerinde insan teşhisi ve özellik seçimi gibi alanlarda endüstriyel uygulama sağlamıştır. Ancak, qPCR hatasız bir teknik değildir. Tüm reaktiflerin daha sonra normal bir qPCR plakasının 96 kuyucuğuna dağıtılan tek bir ana karışımda karıştırılması, reaktiflerin yanlış karıştırılması veya kuyucuklara yanlış dağıtılması gibi operatör hatalarına yol açabilir. Burada, jelleştirme adı verilen bir teknik sunulmaktadır, bu sayede ana karışımda bulunan suyun çoğu, bir vakuma gönderildiğinde bir sol-jel karışımı oluşturan reaktiflerle ikame edilir. Sonuç olarak, qPCR reaktifleri oda sıcaklığında birkaç hafta veya 2-8 oC'de birkaç ay boyunca etkili bir şekilde korunur Her bir çözeltinin hazırlanmasının ayrıntıları, T. cruzi uydu DNA'sını (satDNA) tespit etmek için tasarlanmış jelleştirilmiş bir reaksiyonun beklenen yönüyle birlikte burada gösterilmiştir. Diğer organizmaları tespit etmek için benzer bir prosedür uygulanabilir. Jelleştirilmiş bir qPCR çalıştırması başlatmak, plakayı buzdolabından çıkarmak, numuneleri kendi kuyularına eklemek ve çalıştırmayı başlatmak kadar basittir, böylece tam plaka reaksiyonunun kurulum süresini, numuneleri yüklemek için gereken süreye düşürür. Ek olarak, jelize PCR reaksiyonları partiler halinde kalite için üretilebilir ve kontrol edilebilir, böylece zamandan tasarruf edilir ve rutin PCR reaksiyonları çalıştırılırken yaygın operatör hatalarından kaçınılabilir.

Introduction

Chagas hastalığı, 20. yüzyılın başlarında, yoksulluğun yaygın olduğu Brezilya'nın kırsal bölgelerinde keşfedildi 1,2. Bugün bile, hastalık Amerika'da sağlığın sosyal ve ekonomik belirleyicilerine bağlı olmaya devam etmektedir. Chagas hastalığı bifaziktir, akut ve kronik bir fazdan oluşur. Trypanosoma cruzi parazitinin enfeksiyonundan kaynaklanır, böcek vektörleri tarafından bulaşır, konjenital yolla kan transfüzyonu veya kontamine gıdaların oral alımı 3,4.

Chagas hastalığının teşhisi, klinik semptomların (özellikle Romaña belirtisi), kan yayma mikroskobu, seroloji ve gerçek zamanlı PCR (qPCR) veya izotermal amplifikasyon 4,5,6,7,8,9 gibi moleküler testlerin gözlemlenmesiyle yapılabilir. Klinik semptomlar ve kan yayma mikroskobu şüpheli akut enfeksiyon vakalarında kullanılırken, asemptomatik hastalarda antikor arayışı tarama aracı olarak kullanılmaktadır. Duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle, qPCR'nin kronik hastalar için bir izleme aracı olarak, kandaki parazit yükünü ölçen tedavi gören akut hastalar için ve terapötik başarısızlığın vekil bir belirteci olarak kullanılması önerilmiştir 6,8,10,11,12 . Şu anda mevcut testlerden daha hassas ve spesifik olmasına rağmen, qPCR'nin nakliye ve depolama için donma sıcaklıklarının gerekliliği nedeniyle dünya çapında imtiyazsız bölgelerde tanılama araçları olarak bilinmesi etkili bir şekilde engellenmiştir13,14,15.

Bu engeli aşmak için, liyofilizasyon ve jelleştirme gibi koruma teknikleri araştırılmıştır16,17. Liyofilizasyon yıllarca koruma sağlarken, enzim stabilizasyonu / konservasyonu için yaygın olarak kullanılan gliserol varlığı olmadan özel olarak yapılmış reaktifler gerektirir18. Jelleşmenin aylarca koruma sağladığı gösterilmiş olsa da, düzenli reaktiflerin kullanılmasına izin verir19. Jelifikasyon çözeltisi, her biri proseste belirli rollere sahip dört bileşenden oluşur: şekerler trehaloz ve melozitoz, çözeltideki serbest su moleküllerini azaltarak kuruma işlemi sırasında biyomolekülleri korur, glikojen daha geniş bir koruyucu matris üretir ve amino asit lizini, biyomolekülün karboksili arasındaki oksitleyici reaksiyonları inhibe etmek için serbest radikal temizleyici olarak kullanılır, amino ve fosfat grupları. Bu bileşenler, kuruma işlemi sırasında üçüncül veya kuaterner yapının kaybını önleyen bir sol-jel karışımı tanımlar, böylece biyomoleküllerin rehidrasyon üzerine aktivitesini korumaya yardımcı olur19. Reaksiyon tüplerinin içinde stabilize edildikten sonra, reaksiyonlar normal -20 ° C yerine 2-8 ° C'de birkaç ay veya 21-23 ° C'de birkaç hafta saklanabilir. Bu yaklaşım, Chagas hastalığı, sıtma, leishmaniasis, tüberküloz ve siklosporiyazis13,14,15,20 gibi hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için tasarlanmış testlere dahil edilmiştir.

Bu çalışma, jelleştirme prosedürü için gerekli çözümleri hazırlamak için tüm adımları, süreçteki tuzakları ve sekiz tüplü şeritler içinde kullanıma hazır jelleştirilmiş bir qPCR'nin beklenen son yönünü açıklamaktadır. Aynı protokol tek tüpler veya 96 delikli plakalar için uyarlanabilir. Son olarak, T. cruzi DNA'sının tespiti bir kontrol çalışması olarak gösterilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stok çözeltilerinin ve jelifikasyon karışımının hazırlanması

NOT: Dört stok çözeltisi hazırlanacak (400 mg/mL melezitoz, 400 mg/mL trehaloz, 0.75 mg/mL lizin ve 200 mg/mL glikojen) ve jelleşme karışımını üretmek için Tablo 1'de gösterilen orana göre karıştırılacaktır. Protokol 10 mL'lik stok çözümleri üretimini tanımlasa da, daha düşük veya daha yüksek hacimler için uyarlanabilir.

  1. Melezitoz çözeltisi
    1. 15 mL'lik plastik bir tüpte 4 g melezitoz tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar cihazın maksimum hızında vorteks yapın.
      NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).
    2. Son hacmi nükleaz içermeyen su ile 10 mL'ye kadar yapın. 2-8 °C'de 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.
  2. Trehaloz çözeltisi
    1. 15 mL'lik plastik bir tüpte 4 g trehaloz tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar cihazın maksimum hızında vorteks yapın.
      NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).
    2. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün. 2-8 °C'de 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.
  3. Glikojen çözeltisi
    1. 15 mL'lik plastik bir tüpte 2 g glikojen tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar cihazın maksimum hızında vorteks yapın.
      NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).
    2. Çözeltiyi 8-12 saat boyunca 2-8 ° C'de dinlendirin, çünkü glikojen çözünürse çok fazla kabarcık üretir (Şekil 1). Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin. 2-8 °C'de 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.
  4. Lizin çözeltisi
    1. 15 mL'lik plastik bir tüpte 7,5 mg lizin tartın, 6 mL nükleaz içermeyen su ekleyin. Toz çözünene kadar aletin maksimum hızında vorteks.
      NOT: Son hacmi aşmamaya özen göstererek çözünürlüğü kolaylaştırmak için daha fazla su eklenebilir (aşağıya bakınız).
    2. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün. Çözeltiyi kehribar renkli bir şişeye aktarın veya ışıktan koruyun. 2-8 °C derecelerde 6 aya kadar etiketleyin ve saklayın.
  5. Jelleşme Karışımı (GM)
    1. 50 mL'lik plastik bir tüpte, stok çözeltilerinin hacimlerini Tablo 1'e göre karıştırın.
    2. Reaktifleri, tüpün uçtan uca on ters çevrilmesiyle karıştırın.
      NOT: Bu adım laminer akış güvenlik başlığında gerçekleştiriliyorsa filtreleme adımına gerek yoktur. Bu adım temiz bir ortamda gerçekleştirilmezse, çözeltiyi sarı bir şişeye aktarmadan önce 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.
    3. Çözeltiyi kehribar renkli bir şişeye aktarın veya ışıktan koruyun. 2-8 °C'de 3 aya kadar etiketleyin ve saklayın.
      NOT: Jelifikasyon karışımını hazırlamak için bir kalite kontrol adımı olarak, ölçülen pH, iletkenlik ve yoğunluk değerlerinin aşağıdaki aralıklarda olduğundan emin olun: pH 5,55-6,66; iletkenlik 0.630-0.757 mS/cm; ve yoğunluk 1.08-1.11 g /cm3. Tüm ölçümler 25 °C'de alınmalıdır.

2. Jelleştirme için qPCR ana karışımının hazırlanması

NOT: Bu adımda, jelleştirme için qPCR ana karışımı hazırlanır. Bu nedenle, karışıma su eklenmez, bunun yerine jelleşme karışımı eklenir (Tablo 2).

  1. Reaktifleri soğutulmuş bir kapta çözün. Reaktifleri Tablo 2'ye göre 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın. 5 μL DNA örneği içeren 25 μL'lik bir son hacme sahip bir reaksiyon örneği burada gösterilmiştir.
    NOT: DNA örneği bu adımda karışıma eklenmez; burada yalnızca qPCR ana karışımının her bir reaktifinin son hacimlerini hesaplamak için kullanılır. DNA örnekleri koşuya başlamadan hemen önce eklenmelidir (aşağıdaki adım 4'e bakın).

3. Reaksiyon kaplarındaki reaktiflerin jelifikasyonu

  1. Sekiz tüplü bir şeridin veya 96 delikli bir plakanın hazırlanması için Tablo 2'de gösterilen hacimleri uygun şekilde çarpın.
  2. Pipet 18.5 μL'lik jelifikasyon ana karışımı Tablo 2'de gösterilen her reaksiyon kuyusu üzerine yerleştirilir.
    NOT: Bu hacim, bir reaksiyon için kullanılan oligonükleotid karışımı, PCR tamponu ve jelifikasyon karışımının hacimlerini temsil eder ( Tablo 2'ye göre) ve reaktiflerin konsantrasyonuna ve bir reaksiyon için gereken hacme bağlı olarak değişecektir. Jelifikasyon ana karışımındaki son hacim, normal bir ana karışımdaki hacimden farklıdır, çünkü su eklenmez.
  3. Tüpleri/plakayı vakumlu fırının içindeki ısı iletken desteğe (örneğin alüminyum) yerleştirin.
    NOT: Isı iletken destek isteğe bağlıdır. Operatör, hızlı termal denge sağlamak için tüplerin tabanının vakumlu fırın rafı ile temas halinde olduğundan emin olmalıdır.
  4. Her iki 96 kuyucuklu plaka için bir bentonit kil torbası yerleştirin.
    NOT: Bentonit kil torbalar, jelifikasyon ana karışımından çıkarılan suyu, vakum tarafından uygulanan fark basıncı ile emmek için kullanılır. Bentonit kil torbalarının ikiden az 96 kuyucuklu plaka için gereksiz olduğu bulundu.
  5. Jelifikasyon ana karışımını içeren tüpleri/plakayı, atmosferik basınç elde edilene kadar (900-930 mBar), kontrollü sıcaklık altında (30 °C ± 1 °C) vakum salınımı ile dönüşümlü olarak her biri 30 dakikalık üç vakum döngüsüne (30 ± 5 mBar) maruz bırakın (Şekil 2).
    NOT: Cihaz parametreleri kontrol etmek için yazılım kullanır ve döngünün bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Kullanıcı, seçilen parametreleri belirterek çalıştırma için profil oluşturmalıdır.
  6. Döngü tamamlandığında, hacmin gözle görülür şekilde azaldığından (Şekil 3) ve tüplere/plakalara parmaklarla dokunulduğunda sıvıların hareket etmediğinden emin olarak tüplerin/plakaların reaktiflerin uygun jelifikasyonu için kontrol edin.
    NOT: Jelleşme gerçekleşmediyse, tüplere dokunulduğunda çözelti tüp duvarlarına sıçrayacaktır (Şekil 3).
  7. Tüpleri/plakaları kullanmadan önce 2-8 °C'de 8-12 saat boyunca kapatın ve saklayın.

4. Jelleştirilmiş qPCR kullanma

  1. Tüp şeridini veya plakasını buzdolabından çıkarın ve numune manipülasyonu için bir iş istasyonunda açın. Her reaksiyon kabına 15 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
    NOT: Jelleşmiş reaktiflerin hacminin yaklaşık 5 μL olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, DNA numune hacmi ile birlikte (aşağıya bakınız), nihai reaksiyon hacmi 25 μL'dir.
  2. 5 μL DNA örneği ekleyin.
    NOT: Herhangi bir qPCR kalitesinde DNA şablonu kullanılabilir. Bu çalışmada, DNA 108T. cruzi epimastigotlarından (Dm28c suşu) çıkarıldı ve TE tamponu kullanılarak 1:10 oranında seri olarak seyreltildi.
  3. Tüpleri/plakaları kapatın ve seçtiğiniz ekipmana geçin. Denemeyi çalıştırın ve düzenli veri analizine geçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Jelleşme karışımını oluşturan reaktiflerden üçü, kuvvetli vorteks üzerinde kolayca çözünür. Bununla birlikte, glikojen tozun tamamen çözündüğünden emin olmak için dikkatli bir vorteks gerektirir. Ne yazık ki, güçlü vorteks, çözeltinin gerçek hacmini belirlemeyi zorlaştıran çok sayıda kabarcık üretir (Şekil 1A-B). Bu nedenle, glikojen çözeltisinin, kabarcıkların içinde sıkışmış çözeltinin çoğu ana çözelti gövdesine taşınana kadar buzdolabında dinlenmesine izin vermek önemlidir. Üretim protokolleri ve laboratuvar rutini göz önüne alındığında, jelize plakalar buzdolabında gece boyunca (veya yaklaşık 8-12 saat) tutulur, bu da kabarcıkların çoğunun yerleşmesine neden olur, böylece doğru hacmi belirlemeyi ve istenen son hacme ayarlamayı kolaylaştırır (Şekil 1C). Şekil 1B-C'deki glikojen tüpleri arasındaki kabarcıkların hacmindeki farkı, sırasıyla, çözünürlükten hemen sonra ve gece boyunca çökeltmeden sonra not edin.

Jelifikasyon karışımı, qPCR ana karışımına su yerine eklendikten sonra (Tablo 2), tüp şeritleri veya plakaları vakumlu fırına gitmeye hazırdır. Vakumlu fırının rafları, onunla temas eden tüplerin aynı sıcaklıkta kalmasını sağlayan bir Peltier ısıtma elemanı içerir. Mevcut protokolde, oda içindeki sıcaklık 30 ° C'de sabit tutulurken, basınç 910-930 mBar (atmosferik basınç) ile 30 mBar (vakuma yakın) arasında değişmektedir. Şekil 2 , zaman içinde çizilen bu iki değişkeni, sabit sıcaklığı (yeşil çizgi, üst panel) ve basınç değişimini (kırmızı çizgi, alt panel) gösterir. Döngüler bittikten sonra, kuyunun içindeki ana karışım hacim olarak azalır ve altta, yani tüplere parmaklarla dokunulduğunda hareket etmeden veya sıçramadan jelleşir (Şekil 3). Tüpler artık 2-8 ° C'de kapatılabilir ve saklanabilir. Jelleşme karışımı (Tablo 1) yanlış hazırlanırsa reaksiyonlar jelleşmez; Önerilen kalite kontrol adımı, jelifikasyon karışımını qPCR reaktifleri ile karıştırmadan önce hatayı görmelidir.

Kullanılmak için, tüplerin / plakaların içindeki jelize reaktifler nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alınmalı ve DNA örneği genellikle su veya TE tamponunda seyreltilmelidir. Sol-jel karışımının reaktiflerinin yeniden süspansiyonu, qPCR termal protokolünün denatürasyonunun ilk adımı sırasında (genellikle, 95 ° C'de 5-10 dakika) elde edilir, bu nedenle ekstra bir adım gerekmez. Şekil 4A, yayınlanmış oligonükleotid dizileri15 kullanılarak T. cruzi DNA'sının qPCR tespitinin temsili izlerini göstermektedir. Optimal olmayan sonuçlar, bilinen bir genomik hedef konsantrasyonuna sahip bir çözeltinin seyreltme eğrisi ile test edilebilen duyarlılık kaybını ve ilgili tripanosomatid organizmaların bir paneli ile test edilebilen özgüllük kaybını içerir. Şekil 4B, jelleştirme işlemi doğru bir şekilde gerçekleştirilmediğinde veya reaksiyon 6 aydan fazla bir süre 2-8 ° C'de saklandıktan sonra stabilitesini kaybettiğinde ortaya çıkabilecek hassasiyet kaybını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Glikojen çözünmesi çok sayıda kabarcık üretir. Glikojen çözünürlük sırasında çok fazla kabarcık ürettiğinden, glikojen çözeltisi son hacme ayarlanmadan önce hareketsiz tutulmalıdır. (A) Girdap sırasında oluşan kabarcıklar. (B) Tozun tamamı çözündürülmüştür, ancak aşırı kabarcıklar nedeniyle nihai hacmi belirlemek mümkün değildir. (C) Buzdolabında 12 saat sonra (ortadaki tüp), kabarcıkların hacmi azalır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Vakum döngüsü (alt panel) ve sıcaklık kontrolü (üst panel). Sıcaklık (üst panel) ve basınç (alt panel) değişiminin temsili izleri gösterilmiştir. Siyah çizgiler programlanmış varyasyonları temsil ederken, yeşil ve kırmızı çizgiler enstrümanın gerçek okumalarını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sekiz tüplü bir şerit içinde jelleştirilmiş ana karışımın yönleri . (A) qPCR master karışımları vakuma maruz kalmadan önce karışır. (B) Eksik jelleşme nedeniyle tüp duvarlarına sıvı sıçrar (sadece bir vakum döngüsü). (C) Hacimde gözle görülür bir azalma ile jelleştirilmiş qPCR reaktifleri. Tüplere dokunulduğunda sıvı duvarlara sıçramaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: T. cruzi epimastigotlarından DNA tespit eden jelize master karışımlarının temsili izleri. T. cruzi epimastigotlarından (108 hücre) ekstrakte edilen DNA, 1:10 oranında seri olarak seyreltildi ve 104 ila 100 hücre arasında değişen DNA konsantrasyonları, jelize bir qPCR kullanılarak tespit edildi. (A) Doğru jelleştirilmiş qPCR'nin beklenen sonucu (B) Jelleştirmenin düzgün bir şekilde yürütülmediği bir plaka kullanılarak aynı numunelerin tespiti ve hassasiyet kaybına neden olur. Düşük konsantrasyonların B panelinde daha az sıklıkla tespit edildiğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çözüm Stok konsantrasyonu Hacim
Melezitoz 400 mg/mL 3 mL
Treahlose 400 mg/mL 6 mL
Lizin 0.75 mg/mL 3 mL
Glikojen 200 mg/mL 3 mL
Nükleaz içermeyen su NA q.s.p. 20 mL

Tablo 1: Jelleştirme karışımının 20 mL'sini üretmek için kullanılan stok konsantrasyonları ve çözelti hacimleri. Her stok çözeltisinin hacmi, jelleştirme karışımının daha düşük veya daha yüksek nihai hacimlerini üretmek için orantılı olarak ayarlanmalıdır.

Reaksiyon Karışımı Reaktifi Düzenli mastermix Jelifikasyon mastermix
Oligomix (25X) 1 μL 1 μL
PCR tamponu (2X) 12,5 μL 12,5 μL
Jelleştirme Karışımı* - 5 μL
Nükleaz içermeyen su 6,5 μL -
DNA örneği* 5 μL 5 μL
*nihai reaksiyon hacminin maksimum% 20'si

Tablo 2: Düzenli veya jelize reaksiyonlar için qPCR ana karışımları üretmek için reaktif hacimleri. İki ana karışım arasındaki fark, normal ana karışıma su eklenirken, jelleştirme karışımının jelleştirme ana karışımına (yani su yerine) eklenmesidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Son yıllarda, tropikal ve ihmal edilmiş hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için daha hassas ve spesifik teknolojiler bulma ihtiyacı vurgulanmıştır. Epidemiyolojik kontrol için önemli olmakla birlikte, parazitolojik (optik mikroskopi) ve serolojik testlerin özellikle duyarlılık ve bakım noktası uygulanabilirliği açısından sınırlamaları vardır. PCR, izotermal amplifikasyon ve ilgili varyasyonlar gibi DNA amplifikasyon teknikleri laboratuvar ortamlarında uzun zamandır kullanılmaktadır, ancak teknolojik engeller saha ortamlarında kullanılmasını engellemektedir. Ana engellerden biri, reaktiflerin taşınması ve depolanması için -20 °C sıcaklıklara ihtiyaç duyulmasıdır. Bu durumu düzeltmek için, PCR reaksiyonlarını dondurucudan16,18,19 dışında saklamak için liyofilizasyon ve jelleştirme gibi teknikler kullanılmıştır.

Mevcut çalışma, tüpler, tüp şeritleri, mikroakışkan çipler veya plakalar olsun, reaksiyon kabının içindeki T. cruzi DNA'sını tespit etmek için bir qPCR reaksiyonunu jelleştirmek için gerekli tüm adımları göstermektedir. RT-LAMP reaksiyonu kullanan ön çalışmalar, jelleştirme tekniğinin, Rosado ve ark. tarafından tanımlandığı gibi, diğer nükleik asit amplifikasyon ve modifikasyon enzimlerini korumak ve korumak için de kullanılabileceğini düşündürmektedir. 19. Nispeten basit olmasına rağmen, qPCR rutinlerinde operatör hatalarının çoğuna neden olan iki adım, (a) glikojen ve melozitoz çözeltilerinin hazırlanması ve (b) vakum adımından önce her reaksiyon tüpüne eklenecek reaksiyon karışımının hacminin hesaplanmasıdır. İlk olarak, glikojen çözeltisi son hacim ayarından önce gece boyunca soğutulmalı ve melezitoz çözeltisi tam çözünürlük için kuvvetli bir şekilde vortekslenmelidir (muhtemelen 50 ° C'de hafif ısıtma ile). İkincisi, deneyi planlayan araştırmacı, reaksiyon hacmine yuvarlamak için su eklenmediğinden, prevakum hesaplanan reaktiflerin hacimlerinin düzensiz olabileceğinin farkında olmalıdır. Gerçek reaksiyon hacmi, jelize reaksiyon, PCR'yi çalıştırmadan önce numune ve su ilavesiyle yeniden çözünürleştirildiğinde elde edilecektir.

Yöntemin en büyük sınırlaması, 2-8 °C14,15'te yaklaşık 6-8 ay olan reaksiyonların stabilitesidir; 18 yıl boyunca stabil kalabilen liyofilize reaksiyonlardan önemli ölçüde daha kısadır. Oligonükleotid dizilerinin özgüllüğüne bağlı olarak, araştırmacılar tarafından dikkatlice incelenmesi gereken spesifik olmayan bağlanma ve amplifikasyon meydana gelebilir. Örneğin, Costa ve işbirlikçileri, C. cayetanensis'in tespiti için jelleştirilmiş qPCR'nin tavlama sıcaklığının, spesifik olmayan amplifikasyonları önlemek için +1 ° C'de ayarlanması gerektiğini bildirmektedir 15,21. Benzer şekilde, araştırmacılar jelleşme bileşenleri tarafından düzenlenebilecek enzimleri kullanmaktan veya substrat olarak kullanmaktan kaçınmalıdır.

Jelatifikasyon tekniği, laboratuvar rutininde kullanım kolaylığının yanı sıra sorunsuz kalite kontrolü sağlayan 16,19,22 üretim hattına girişi nedeniyle özellikle yararlıdır; ikincisi de birden fazla operatör arasında sağlam ve karşılaştırılabilir veriler sağlar ve nakliye ve depolama sırasında donma sıcaklığı gereksinimlerini ortadan kaldırma bonusu ile önemli adımlarda yaygın operatör hatalarını etkili bir şekilde ortadan kaldırır. Ön çalışmalar, soğuk zincirin ortadan kaldırılmasının, bir qPCR testi14 için maliyetin genel olarak% 20'ye kadar azalmasına neden olacağını göstermektedir. Soğuk zincirin ortadan kaldırılması, qPCR'nin az gelişmiş bölgelerde Chagas hastalığı gibi ihmal edilmiş hastalıklar için doğrulayıcı bir test olarak uygulanmasını mümkün kılar, böylece epidemiyolojik kontrollerini destekler23.

Son olarak, jelleştirme protokolü, qPCR testlerinin kullanımını kolaylaştırır, çünkü kullanıcının yalnızca su ve ekstrakte edilen T. cruzi DNA'sını eklemesini, reaktif kullanımı sırasında hataları önlemesini ve kurulum süresini ve reaktifin kontaminasyon olasılığını azaltır. Bu özellikler, rutin bir tanı laboratuvarı için verimlilik sağlar, sonuçların hastalara ulaştırılmasını hızlandırır ve tanının güvenilirliğini arttırır. Son olarak, -20 °C soğuk zincir ihtiyacını ortadan kaldırdığı için, düşük kaynaklı ortamlarda teşhis amaçlı kullanım için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, vakumlu fırınla ilgili teknik yardım için Aline Burda Farias'a ve söz konusu ekipmana erişime izin verdikleri için Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brezilya) yönetimine şükranlarını sunmak isterler. Bu çalışma kısmen hibe CNPq 445954/2020-5 tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bentonite clay bags (activated) Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) 026157/STD Not to be confused with silica gel packs
Glycogen Amersham Bioscience Cat# US16445
Lysine Acros Organic Cat# 365650250
Melezitoze Sigma-Aldrich Cat# 63620
Nuclease-free water preferred vendor
Oligonucleotides preferred vendor
PCR mastermix preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) Chagas NAT kit
PCR thermocycler preferred vendor
software for vacuum oven Memmert Gmbh Celsius v10.0
Trehalose Sigma-Aldrich Cat# T9531
Trypanosoma cruzi DNA from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC
Vacuum oven Memmert Gmbh VO-400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
  2. Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
  3. Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
  4. Tanowitz, H. B., et al. Chagas' disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
  5. Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
  6. Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
  7. Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
  8. Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
  9. Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
  10. Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
  11. Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
  12. Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
  13. de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
  14. Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
  15. Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
  16. Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
  17. Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
  18. Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
  19. Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
  20. Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
  21. Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
  22. Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
  23. Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).

Tags

Biyokimya Sayı 179 kullanıma hazır PCR teşhis Tripanozom laboratuvar rutini ihmal edilen hastalıklar tropikal hastalıklar
<em>Trypanosoma cruzi</em> veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Costa, A. D. T., Amadei, S. S.,… More

Costa, A. D. T., Amadei, S. S., Bertão-Santos, A., Rodrigues, T. Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms. J. Vis. Exp. (179), e63316, doi:10.3791/63316 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter