Summary
העבודה הנוכחית מתארת את השלבים לייצור qPCR מוכן לשימוש עבור זיהוי DNA T. cruzi שניתן לטעון מראש על כלי התגובה ולאחסן במקרר במשך מספר חודשים.
Abstract
PCR בזמן אמת (qPCR) היא טכניקה רגישה ומדויקת להפליא המאפשרת להגביר כמויות זעירות של מטרות חומצות גרעין משלל דגימות. הוא היה בשימוש נרחב בתחומי מחקר רבים והשיג יישום תעשייתי בתחומים כגון אבחון אנושי ובחירת תכונות בגידולים של אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO). עם זאת, qPCR אינה טכניקה חסינת שגיאות. ערבוב כל הריאגנטים לתערובת ראשית אחת המופצת לאחר מכן על 96 בארות של צלחת qPCR רגילה עלול להוביל לטעויות מפעיל כגון ערבוב שגוי של ריאגנטים או חלוקה לא מדויקת לבארות. כאן מוצגת טכניקה הנקראת ג'ליפיקציה, לפיה רוב המים הנמצאים בתערובת האב מוחלפים על ידי ריאגנטים היוצרים תערובת סול-ג'ל כאשר הם מוגשים לוואקום. כתוצאה מכך, ריאגנטים qPCR נשמרים ביעילות במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר או כמה חודשים ב 2-8 oC. פרטים על הכנת כל פתרון מוצגים כאן יחד עם ההיבט הצפוי של תגובה ג'לסית שנועדה לזהות דנ"א לווייני T. cruzi (satDNA). הליך דומה יכול להיות מיושם כדי לזהות אורגניזמים אחרים. התחלת ריצת qPCR ג'ל היא פשוטה כמו הוצאת הצלחת מהמקרר, הוספת הדגימות לבארות המתאימות והתחלת הריצה, ובכך להקטין את זמן ההתקנה של תגובת צלחת מלאה לזמן שלוקח לטעון את הדגימות. בנוסף, ניתן לייצר ולשלוט בתגובות PCR ג'לריות לאיכות בקבוצות, ובכך לחסוך זמן ולהימנע מטעויות נפוצות של המפעיל תוך הפעלת תגובות PCR שגרתיות.
Introduction
מחלת צ'אגאס התגלתה בתחילת המאהה-20 באזורים הכפריים של ברזיל, שם העוני היה נפוץ 1,2. גם כיום, המחלה ממשיכה להיות קשורה לגורמים חברתיים וכלכליים של בריאות ביבשת אמריקה. מחלת צ'אגאס היא דו-פאזית, המורכבת משלב חריף וכרוני. זה נגרם על ידי זיהום על ידי טפיל Tripanosoma cruzi, להיות מועבר על ידי וקטורים חרקים, עירויי דם דרך נתיב מולד, או בליעה אוראלית של מזון מזוהם 3,4.
אבחון של מחלת Chagas יכול להיעשות באמצעות תצפית של סימפטומים קליניים (במיוחד סימן Romaña), מיקרוסקופיה כתם דם, סרולוגיה, ובדיקות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת (qPCR) או הגברה איזותרמית 4,5,6,7,8,9. תסמינים קליניים ומיקרוסקופיה של מריחת דם משמשים במקרים חשודים של זיהומים חריפים, בעוד החיפוש אחר נוגדנים משמש ככלי סינון בחולים אסימפטומטיים. בשל רגישותו וספציפיותו, הוצע כי qPCR ישמש ככלי ניטור לחולים כרוניים, לחולים אקוטיים העוברים טיפול המודד את עומס הטפילים בדם, וכסמן פונדקאי לכישלון טיפולי 6,8,10,11,12 . למרות שהוא רגיש וספציפי יותר מהבדיקות הזמינות כיום, qPCR נמנע למעשה מלהיות מוכר ככלי אבחון באזורים מוחלשים ברחבי העולם בשל הדרישה להקפאת טמפרטורות להובלה ואחסון13,14,15.
כדי לעקוף מכשול זה, נחקרו טכניקות שימור כגון ליופיליזציה וג'ליפיקציה16,17. בעוד שליאופיליזציה מספקת שימור במשך שנים, היא דורשת ריאגנטים מיוצרים במיוחד ללא נוכחות של גליצרול, המשמש בדרך כלל לייצוב/שימור אנזימים18. אמנם הודגם כי ג'ליפיקציה מספקת שימור במשך חודשים, אך היא מאפשרת שימוש בריאגנטיםרגילים 19. תמיסת הג'ליפיקציה מורכבת מארבעה מרכיבים, שלכל אחד מהם תפקידים ספציפיים בתהליך: הסוכרים טרהלוז ומלזיטוז מגנים על הביומולקולות בתהליך הדסיקציה על ידי הפחתת מולקולות מים חופשיים בתמיסה, גליקוגן מייצר מטריצת הגנה רחבה יותר, וחומצת האמינו ליזין משמשת כמנטרלת רדיקלים חופשיים כדי לעכב את התגובות המחמצנות בין קרבוקסיל של הביומולקולה, קבוצות אמינו ופוספטים. רכיבים אלה מגדירים תערובת סול-ג'ל המונעת את אובדן המבנה השלישוני או הרבעוני במהלך תהליך הייבוש, ובכך מסייעים בשמירה על פעילות הביומולקולות עם התייבשות19. לאחר התייצבותן בתוך צינורות התגובה, ניתן לאחסן את התגובות במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס או מספר שבועות בטמפרטורה של 21-23 מעלות צלזיוס במקום 20 מעלות צלזיוס רגילות. גישה זו כבר שולבה בבדיקות שנועדו לסייע באבחון מחלות כגון מחלת צ'אגאס, מלריה, לישמניאזיס, שחפת וציקלוספוריזיס13,14,15,20.
העבודה הנוכחית מתארת את כל השלבים להכנת הפתרונות הנדרשים להליך הג'ליפיקציה, את המלכודות בתהליך ואת ההיבט הסופי הצפוי של qPCR ג'ל מוכן לשימוש בתוך רצועות של שמונה צינורות. ניתן להתאים את אותו פרוטוקול לצינורות בודדים או לצלחות 96 בארות. לבסוף, זיהוי הדנ"א של T. cruzi יוצג כריצת בקרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תמיסות מלאי ותערובת ג'ליפיקציה
הערה: ארבעה תמיסות מלאי יוכנו (400 מ"ג/מ"ל של מלזיטוז, 400 מ"ג/מ"ל של טרהלוז, 0.75 מ"ג/מ"ל של ליזין ו-200 מ"ג/מ"ל של גליקוגן) ויתערבבו בהתאם לשיעור המוצג בטבלה 1 כדי לייצר את תערובת הג'ליפיקציה. למרות שהפרוטוקול מתאר 10 מ"ל של ייצור פתרונות מלאי, ניתן להתאים אותו לנפחים נמוכים או גבוהים יותר.
- פתרון מלזיטוז
- שוקלים 4 גרם של מלזיטוז בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מסיסה.
הערה: ניתן להוסיף יותר מים כדי להקל על הפריחה, תוך הקפדה שלא לחרוג מהנפח הסופי (ראה להלן). - הרכיבו את הנפח הסופי ל-10 מ"ל עם מים נטולי נוקלאזות. יש לתייג ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים.
- שוקלים 4 גרם של מלזיטוז בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מסיסה.
- תמיסת טרהלוז
- שוקלים 4 גרם של טרהלוז בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מתפרקת.
הערה: ניתן להוסיף יותר מים כדי להקל על הפריחה, תוך הקפדה שלא לחרוג מהנפח הסופי (ראה להלן). - השלם את הנפח ל-10 מ"ל עם מים נטולי נוקלאז וסנן את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. יש לתייג ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים.
- שוקלים 4 גרם של טרהלוז בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מתפרקת.
- תמיסת גליקוגן
- שוקלים 2 גרם של גליקוגן בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מסיסה.
הערה: ניתן להוסיף יותר מים כדי להקל על הפריחה, תוך הקפדה שלא לחרוג מהנפח הסופי (ראה להלן). - שמרו על התמיסה במנוחה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך 8-12 שעות, מאחר שהסולוביזציה של גליקוגן מייצרת הרבה בועות (איור 1). הרכיבו את הנפח ל-10 מ"ל עם מים נטולי נוקלאזות. יש לתייג ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים.
- שוקלים 2 גרם של גליקוגן בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מסיסה.
- תמיסת ליזין
- שוקלים 7.5 מ"ג ליזין בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז. מערבולת במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מסיסה.
הערה: ניתן להוסיף יותר מים כדי להקל על הפריחה, תוך הקפדה שלא לחרוג מהנפח הסופי (ראה להלן). - השלם את הנפח ל-10 מ"ל עם מים נטולי נוקלאז וסנן את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. העבירו את התמיסה לבקבוקון ענבר או הגנו עליו מפני אור. יש לסמן ולאחסן ב-2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
- שוקלים 7.5 מ"ג ליזין בצינור פלסטיק של 15 מ"ל, מוסיפים 6 מ"ל של מים נטולי נוקלאז. מערבולת במהירות המרבית של המכשיר עד שהאבקה מסיסה.
- תערובת ג'ליפציה (GM)
- בצינור פלסטיק של 50 מ"ל, ערבבו את נפחי פתרונות המלאי לפי טבלה 1.
- מערבבים את הריאגנטים על ידי עשרה היפוכים מקצה לקצה של הצינור.
הערה: אין צורך בשלב סינון אם שלב זה מבוצע במכסה בטיחות של זרימה למינרית. אם שלב זה אינו מבוצע בסביבה נקייה, סנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לפני העברתו לבקבוקון ענבר. - העבירו את התמיסה לבקבוקון ענבר או הגנו עליו מפני אור. יש לתייג ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 3 חודשים.
הערה: כשלב בקרת איכות להכנת תערובת הג'ליפיקציה, ודא שערכי ה- pH, המוליכות והצפיפות הנמדדים נמצאים בטווחים הבאים: pH 5.55-6.66; מוליכות 0.630-0.757 mS/cm; וצפיפות 1.08-1.11 גרם/ס"מ3. כל המדידות צריכות להילקח ב 25 מעלות צלזיוס.
2. הכנת תערובת מאסטר qPCR לג'לציה
הערה: בשלב זה, מכינים את תערובת המאסטר qPCR לג'לציה. לפיכך, לא מוסיפים מים לתערובת אלא מוסיפים את תערובת הג'ליפיקציה (טבלה 2).
- הפשירו את הריאגנטים במיכל קירור. ערבבו את הריאגנטים בשפופרת של 1.5 מ"ל לפי טבלה 2. דוגמה לתגובה עם נפח סופי של 25 μL המכילה 5 μL של דגימת DNA מוצגת כאן.
הערה: דגימת הדנ"א אינה מתווספת לתערובת בשלב זה; הוא משמש כאן אך ורק כדי לחשב את הכרכים הסופיים של כל מגיב של תערובת מאסטר qPCR. יש להוסיף דגימות דנ"א ממש לפני תחילת הריצה (ראה שלב 4 להלן).
3. ג'ליפיקציה של הריאגנטים על כלי התגובה
- הכפל כראוי את הנפחים המוצגים בטבלה 2 להכנת רצועת שמונה צינורות או לוח של 96 בארות.
- Pipet 18.5 μL של תערובת מאסטר ג'ליפיקציה המוצגת בטבלה 2 על כל תגובה היטב.
הערה: נפח זה מייצג את הנפחים של תערובת אוליגונוקלאוטידים, מאגר PCR ותערובת ג'ליפיקציה המשמשת לתגובה אחת (לפי טבלה 2) והוא ישתנה בהתאם לריכוז הריאגנטים ולנפח הדרוש לתגובה אחת. הנפח הסופי בתערובת מאסטר ג'ליפיקציה שונה מהנפח בתערובת מאסטר רגילה מכיוון שלא מוסיפים מים. - הניחו את הצינורות/צלחת בתמיכה מוליכת חום (למשל, אלומיניום) בתוך תנור הוואקום.
הערה: התמיכה במוליך חום היא אופציונלית. על המפעיל לוודא כי תחתית הצינורות נמצאת במגע עם מדף תנור הוואקום כדי לאפשר שיווי משקל תרמי מהיר. - מניחים שקית חימר בנטוניט אחת לכל שתי צלחות 96 בארות.
הערה: שקיות חימר בנטוניט משמשות לספיגת המים שהוסרו מתערובת מאסטר הג'ליפיקציה על ידי הלחץ הדיפרנציאלי המופעל על ידי הוואקום. שקיות חימר בנטוניט נמצאו מיותרות עבור פחות משתי צלחות 96 בארות. - העבירו את הצינורות/צלחת המכילה את תערובת מאסטר הג'ליפיקציה לשלושה מחזורי ואקום (30 ± 5 מ"ר) של 30 דקות כל אחד, לסירוגין עם שחרור ואקום עד להשגת הלחץ האטמוספרי (900-930 mBar), תחת טמפרטורה מבוקרת (30 °C ± 1 °C) (איור 2).
הערה: המכשיר משתמש בתוכנה כדי לשלוט בפרמטרים, ודוגמה למחזור מוצגת באיור 2. על המשתמש ליצור את הפרופיל עבור ההפעלה, המציין את הפרמטרים שנבחרו. - בסיום המחזור, בדקו את הצינורות/הצלחות לג'לציה נכונה של הריאגנטים על ידי כך שתוודאו שהנפח מופחת באופן נראה לעין (איור 3) ושהנוזלים לא זזים בהקשה על הצינורות/הצלחות באצבעות.
הערה: אם לא התרחשה ג'לציה, התמיסה הייתה מתיזה על דפנות הצינורות כאשר מקישים על צינורות (איור 3). - יש לאטום ולאחסן את הצינורות/צלחות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך 8-12 שעות לפני השימוש.
4. שימוש ב-qPCR ג'ל
- הסר את רצועת הצינור או הצלחת מהמקרר ופתח אותה בתחנת עבודה למניפולציה לדוגמה. הוסיפו 15 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לכל כלי תגובה.
הערה: נפח הריאגנטים הג'ליים נחשב לכ-5 μL. לכן, יחד עם נפח דגימת הדנ"א (ראה להלן), נפח התגובה הסופי הוא 25 μL. - הוסף 5 μL של דגימת DNA.
הערה: ניתן להשתמש בכל תבנית DNA באיכות qPCR. בעבודה הנוכחית, דנ"א הופק מ-10 8T. cruzi epimastigotes (זן Dm28c) ודולל באופן סדרתי ביחס של 1:10 באמצעות חיץ TE. - אטמו את הצינורות/צלחות והמשיכו לציוד המועדף. הפעל את הניסוי והמשך לניתוח נתונים רגיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה מהריאגנטים היוצרים את תערובת הג'ליפיקציה מתמוססים בקלות במערבולת נמרצת. עם זאת, גליקוגן דורש מערבולות זהירות כדי להבטיח שהאבקה עברה סיכה מלאה. לרוע המזל, מערבולות נמרצות מייצרות הרבה בועות, מה שמקשה על קביעת הנפח האמיתי של התמיסה (איור 1A-B). לכן, חיוני לתת לתמיסת הגליקוגן לנוח במקרר עד שרוב התמיסה הכלואה בתוך הבועות עברה לגוף התמיסה הראשי. בהתחשב בפרוטוקולי הייצור ובשגרת המעבדה, צלחות ג'ל נשמרות במקרר למשך הלילה (או בסביבות 8-12 שעות), וכתוצאה מכך הן שוקעות את רוב הבועות, ובכך מקלות על קביעת עוצמת הקול הנכונה והתאמה לנפח הסופי הרצוי (איור 1C). שימו לב להבדל בנפח הבועות בין צינורות הגליקוגן באיורים 1B-C, בהתאמה, מיד לאחר הסולביזציה ולאחר שקיעה של לילה.
לאחר הוספת תערובת הג'ליפיקציה לתערובת הראשית qPCR כתחליף למים (טבלה 2), רצועות הצינור או הצלחות מוכנות לעבור לתנור הוואקום. המדפים של תנור הוואקום מכילים גוף חימום Peltier, המבטיח כי כל צינורות כי הם במגע עם זה להישאר באותה טמפרטורה. בפרוטוקול הנוכחי, הטמפרטורה בתוך התא נשמרת קבועה ב -30 מעלות צלזיוס, בעוד הלחץ משתנה בין 910-930 mBar (לחץ אטמוספרי) ו 30 mBar (כמעט ואקום). איור 2 מציג את שני המשתנים האלה ששורטטו לאורך זמן, ומראה את הטמפרטורה הקבועה (הקו הירוק, הפאנל העליון) ואת השונות בלחץ (קו אדום, פאנל תחתון). לאחר סיום המחזורים, התערובת הראשית בתוך הבאר פוחתת בנפחה והופכת לג'ל בתחתית, כלומר מבלי לזוז או להתיז כאשר מקישים על הצינורות באצבעות (איור 3). כעת ניתן לכסות את הצינורות ולאחסן אותם בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. התגובות לא יצליחו להתגמש אם תערובת הג'ליפיקציה (טבלה 1) מוכנה בצורה לא נכונה; שלב בקרת האיכות המוצע אמור לראות את התקלה לפני ערבוב תערובת הג'ליפיקציה עם ריאגנטים qPCR.
כדי להשתמש בהם, יש להחיות את הריאגנטים הג'ליים בתוך הצינורות/צלחות במים נטולי נוקלאז ואת דגימת הדנ"א מדוללת בדרך כלל במים או במאגר TE. חידוש הריאגנטים של תערובת סול-ג'ל מושג במהלך השלב הראשון של דנטורציה של הפרוטוקול התרמי qPCR (בדרך כלל, 5-10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס), ולכן אין צורך בשלב נוסף. איור 4A מראה עקבות מייצגים של זיהוי qPCR של דנ"א T. cruzi באמצעות רצפי אוליגונוקלאוטידיםשפורסמו 15. תוצאות לא אופטימליות כוללות אובדן רגישות, אשר ניתן לבדוק עם עקומת דילול של תמיסה עם ריכוז ידוע של מטרות גנומיות ואובדן ספציפיות, אשר ניתן לבדוק עם פאנל של אורגניזמים טריפנוזומטידים קשורים. איור 4B מראה את אובדן הרגישות שעלול להיווצר כאשר תהליך הג'ליפיקציה אינו מבוצע כראוי או כאשר התגובה מאבדת את יציבותה לאחר שאוחסנה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס במשך יותר מ-6 חודשים.
איור 1: סולוביזציה של גליקוגן מייצרת הרבה בועות. מאחר שגליקוגן מייצר יותר מדי בועות במהלך הסולביליזציה, יש לשמור את תמיסת הגליקוגן במנוחה לפני ההסתגלות לנפח הסופי. (A) בועות שנוצרו במהלך מערבולת. (B) כל האבקה הייתה מסיסה, אך לא ניתן לקבוע את הנפח הסופי בגלל הבועות העודפות. (C) לאחר 12 שעות במקרר (צינור באמצע), נפח הבועות מצטמצם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מחזור ואקום (פאנל תחתון) ובקרת טמפרטורה (פאנל עליון). עקבות מייצגים של טמפרטורה (פאנל עליון) ולחץ (פאנל תחתון) וריאציה מוצגים. קווים שחורים מייצגים את הווריאציות המתוכנתות, ואילו הקווים הירוקים והאדומים מייצגים את הקריאות בפועל של הכלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: היבטים של תערובת מאסטר ג'לסית בתוך רצועת שמונה צינורות . (A) תערובות מאסטר qPCR לפני החשיפה לוואקום. (B) נוזלים ניתזים על דפנות הצינור בגלל ג'ליפיקציה לא שלמה (מחזור ואקום אחד בלבד). (C) ריאגנטים ג'ליים של qPCR עם הפחתה ברורה בנפח. הנוזל אינו מתיז על הקירות כאשר מקישים על הצינורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: עקבות מייצגים של תערובות מאסטר ג'ליות המזהות דנ"א מאפימסטיגוטים של T. cruzi. דנ"א שהופק מאפימסטיגוטים של T. cruzi (108 תאים) דולל באופן סדרתי ביחס של 1:10, וריכוזי הדנ"א שנעו בין 104 ל-10 0 תאים היו נתונים לזיהוי באמצעות qPCR ג'לי. (A) התוצאה הצפויה של qPCR (B) ג'לציה נכונה של אותן דגימות באמצעות צלחת שבה הג'ליפיקציה לא בוצעה כראוי, וכתוצאה מכך אובדן רגישות. שים לב שהריכוזים הנמוכים מזוהים בתדירות נמוכה יותר בלוח B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| תמיסה | ריכוז מניות | נפח |
| מלזיטוז | 400 מ"ג/מ"ל | 3 מ"ל |
| טראהלוז | 400 מ"ג/מ"ל | 6 מ"ל |
| ליזין | 0.75 מ"ג/מ"ל | 3 מ"ל |
| גליקוגן | 200 מ"ג/מ"ל | 3 מ"ל |
| מים נטולי נוקלאז | נה | q.s.p. 20 מ"ל |
טבלה 1: ריכוזי מלאי ונפחים של תמיסות המשמשות לייצור 20 מ"ל של תערובת הג'ליפיקציה. הנפח של כל תמיסת מלאי חייב להיות מותאם באופן יחסי כדי לייצר כמויות סופיות נמוכות או גבוהות יותר של תערובת הג'ליפיקציה.
| ריאגנט מיקס תגובה | מאסטרמיקס רגיל | ג'ליפיקציה מאסטרמיקס |
| אוליגומיקס (25X) | 1 מיקרון | 1 מיקרון |
| מאגר PCR (2X) | 12.5 מיקרון | 12.5 מיקרון |
| תערובת ג'ליפיקציה* | - | 5 מיקרון |
| מים נטולי נוקלאז | 6.5 מיקרון | - |
| דגימת דנ"א* | 5 מיקרון | 5 מיקרון |
| *מקסימום 20% מנפח התגובה הסופית | ||
טבלה 2: נפחים של ריאגנטים לייצור תערובות מאסטר qPCR לתגובות רגילות או ג'ליות. ההבדל בין שתי תערובות המאסטר הוא שמוסיפים מים לתערובת הראשית הרגילה ואילו תערובת הג'ליפיקציה מתווספת (כלומר, במקום מים) לתערובת הראשית לג'ליפיקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השנים האחרונות הדגישו את הצורך במציאת טכנולוגיות רגישות וספציפיות יותר שיסייעו באבחון מחלות טרופיות ומוזנחות. למרות חשיבותן לבקרה אפידמיולוגית, לבדיקות פרזיטולוגיות (מיקרוסקופיה אופטית) וסרולוגיות יש מגבלות, במיוחד לגבי רגישות וישימות נקודתית. טכניקות הגברה של דנ"א כגון PCR, הגברה איזותרמית ווריאציות בהתאמה נמצאות בשימוש זה מכבר בסביבות מעבדה, אך מכשולים טכנולוגיים מונעים ממנו לשמש בהגדרות שדה. אחד המכשולים העיקריים הוא הצורך בטמפרטורות של -20 מעלות צלזיוס להובלה ואחסון של הריאגנטים. כדי לתקן מצב זה, נעשה שימוש בטכניקות כגון ליופיליזציה וג'ליפיקציה לאחסון תגובות PCR מתוך המקפיא16,18,19.
העבודה הנוכחית מציגה את כל השלבים הדרושים כדי לג'ל תגובת qPCR כדי לזהות דנ"א T. cruzi בתוך כלי התגובה, בין אם זה צינורות, רצועות צינור, שבבים microfluidic, או צלחות. מחקרים ראשוניים המשתמשים בתגובת RT-LAMP מצביעים על כך שטכניקת הג'ליפיקציה עשויה לשמש גם לשימור והגנה על אנזימי הגברה ושינוי של חומצות גרעין אחרות, כפי שתואר על ידי Rosado et al. 19. למרות שהם פשוטים יחסית, שני השלבים שגורמים לרוב טעויות המפעיל בשגרות qPCR הם (א) הכנת תמיסות גליקוגן ומלזיטוז ו-(ב) חישוב נפח תערובת התגובה שתתווסף לכל צינור תגובה לפני שלב הוואקום. ראשית, יש לקרר את תמיסת הגליקוגן למשך הלילה לפני התאמת הנפח הסופית, ותמיסת המליזיטוז חייבת להיות מעורבבת במרץ (אולי עם חימום מתון בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס) לסוביזציה מלאה. שנית, על החוקר המתכנן את הניסוי להיות מודע לכך שנפחי הריאגנטים המחושבים לפני הוואקום עשויים להיות לא אחידים מכיוון שלא מוסיפים מים כדי לעגל את נפח התגובה. נפח התגובה בפועל יתקבל כאשר התגובה הג'לסית מסולפת מחדש על ידי תוספת של דגימה ומים, לפני הפעלת ה- PCR.
המגבלה הגדולה ביותר של השיטה היא יציבות התגובות, שהיא סביב 6-8 חודשים ב 2-8 מעלות צלזיוס14,15; הוא קצר משמעותית מתגובות ליופיליות, שעשויות להישאר יציבות במשך שנים18. בהתאם לספציפיות של רצפי אוליגונוקלאוטידים, קשירה והגברה לא ספציפיות עשויות להתרחש, אשר יש לבחון בקפידה על ידי החוקרים. לדוגמה, קוסטה ומשתפי פעולה מדווחים כי טמפרטורת החישול של qPCR ג'ל לזיהוי C. cayetanensis היה צריך להיות מותאם ב +1 °C כדי למנוע הגברה לא ספציפית15,21. באופן דומה, חוקרים צריכים להימנע משימוש באנזימים שעשויים להיות מוסדרים על ידי או להשתמש ברכיבי הג'ליפיקציה כמצעים.
טכניקת הג'ליפיקציה שימושית במיוחד בגלל קלות השימוש בה בשגרת המעבדה, כמו גם הכנסתה לפס ייצור16,19,22 המאפשר בקרת איכות חלקה; האחרון בתורו מאפשר נתונים חזקים וברי השוואה בין מפעילים מרובים ומבטל ביעילות טעויות מפעיל נפוצות בשלבים מכריעים, עם בונוס של ביטול דרישות טמפרטורה מקפיאות במהלך ההובלה והאחסון. מחקרים ראשוניים מצביעים על כך שביטול שרשרת הקירור יביא להפחתה כוללת של העלות בעד 20% עבור בדיקת qPCR14. חיסול שרשרת הקור גם מאפשר ליישם qPCR כמבחן מאשר למחלות מוזנחות כגון מחלת צ'אגאס באזורים לא מפותחים, ובכך להעדיף את השליטה האפידמיולוגית שלהם23.
לבסוף, פרוטוקול הג'ליפיקציה מייעל את השימוש בבדיקות qPCR מכיוון שהוא רק דורש מהמשתמש להוסיף מים ואת ה- DNA של T. cruzi שחולץ, תוך הימנעות משגיאות במהלך טיפול במגיבים, והקטנת זמן ההגדרה, כמו גם האפשרות לזיהום המגיב. מאפיינים אלה מספקים יעילות למעבדת אבחון שגרתית, מזרזים את מסירת התוצאות לחולים ומגבירים את אמינות האבחנה. לבסוף, מכיוון שהוא מוותר על הצורך בשרשרת קרה של -20 מעלות צלזיוס, הוא מתאים לשימוש אבחוני בסביבות דלות משאבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להביע את תודתם לאלין בורדה פאריאס על הסיוע הטכני עם תנור הוואקום, כמו גם לממשל במכון הביולוגי המולקולרי דו פרנה (IBMP, קוריטיבה, ברזיל) על שאיפשר גישה לציוד האמור. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
