Summary
Le présent travail décrit les étapes de production d’une qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de T. cruzi qui peut être préchargée sur la cuve de réaction et conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois.
Abstract
La PCR en temps réel (qPCR) est une technique remarquablement sensible et précise qui permet d’amplifier des quantités infimes de cibles d’acides nucléiques à partir d’une multitude d’échantillons. Il a été largement utilisé dans de nombreux domaines de recherche et a atteint une application industrielle dans des domaines tels que le diagnostic humain et la sélection de caractères dans les cultures d’organismes génétiquement modifiés (OGM). Cependant, la qPCR n’est pas une technique à l’épreuve des erreurs. Le mélange de tous les réactifs en un seul mélange maître distribué par la suite sur 96 puits d’une plaque qPCR ordinaire peut entraîner des erreurs de l’opérateur telles qu’un mélange incorrect des réactifs ou une distribution inexacte dans les puits. Ici, une technique appelée gélification est présentée, par laquelle la majeure partie de l’eau présente dans le mélange maître est remplacée par des réactifs qui forment un mélange sol-gel lorsqu’ils sont soumis à un vide. En conséquence, les réactifs qPCR sont efficacement conservés pendant quelques semaines à température ambiante ou quelques mois à 2-8 °C. Les détails de la préparation de chaque solution sont présentés ici avec l’aspect attendu d’une réaction gélifiée conçue pour détecter l’ADN satellite de T. cruzi (ADNsatellite). Une procédure similaire peut être appliquée pour détecter d’autres organismes. Le démarrage d’une qPCR gélifiée est aussi simple que de retirer la plaque du réfrigérateur, d’ajouter les échantillons à leurs puits respectifs et de commencer l’exécution, réduisant ainsi le temps de configuration d’une réaction sur plaque complète au temps nécessaire pour charger les échantillons. De plus, les réactions PCR gélifiées peuvent être produites et contrôlées pour la qualité par lots, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs courantes de l’opérateur lors de l’exécution de réactions PCR de routine.
Introduction
La maladie de Chagas a été découverte au début du 20èmesiècle dans les régions rurales du Brésil, où la pauvreté était répandue 1,2. Même aujourd’hui, la maladie continue d’être liée aux déterminants sociaux et économiques de la santé dans les Amériques. La maladie de Chagas est biphasique, comprenant une phase aiguë et une phase chronique. Elle est causée par une infection par le parasite Trypanosoma cruzi, transmise par des insectes vecteurs, des transfusions sanguines par voie congénitale ou l’ingestion orale d’aliments contaminés 3,4.
Le diagnostic de la maladie de Chagas peut être effectué par l’observation des symptômes cliniques (en particulier le signe Romaña), la microscopie par frottis sanguin, la sérologie et les tests moléculaires tels que la PCR en temps réel (qPCR) ou l’amplification isotherme 4,5,6,7,8,9. Les symptômes cliniques et la microscopie par frottis sanguin sont utilisés dans les cas suspects d’infections aiguës, tandis que la recherche d’anticorps est utilisée comme outil de dépistage chez les patients asymptomatiques. En raison de sa sensibilité et de sa spécificité, il a été suggéré que la qPCR soit utilisée comme outil de surveillance pour les patients chroniques, pour les patients en phase aiguë subissant un traitement mesurant la charge parasitaire dans le sang et comme marqueur de substitution de l’échec thérapeutique 6,8,10,11,12 . Bien que plus sensibles et spécifiques que les tests actuellement disponibles, la qPCR est effectivement empêchée d’être connue comme outil de diagnostic dans les régions défavorisées du monde entier en raison de l’exigence de températures de congélation pour le transport et le stockage13,14,15.
Pour contourner cet obstacle, des techniques de conservation telles que la lyophilisation et la gélification ont été explorées16,17. Bien que la lyophilisation assure la conservation pendant des années, elle nécessite des réactifs spécialement fabriqués sans la présence de glycérol, qui est couramment utilisé pour la stabilisation / conservation des enzymes18. Bien qu’il ait été démontré que la gélification assure la conservation pendant des mois, elle permet l’utilisation de réactifs réguliers19. La solution de gélification comprend quatre composants, chacun ayant des rôles spécifiques dans le processus: les sucres tréhalose et mélézitose protègent les biomolécules pendant le processus de dessiccation en réduisant les molécules d’eau libre dans la solution, le glycogène produit une matrice protectrice plus large et l’acide aminé lysine est utilisé comme piégeur de radicaux libres pour inhiber les réactions oxydantes entre le carboxyle de la biomolécule, groupes amino et phosphate. Ces composants définissent un mélange sol-gel qui empêche la perte de la structure tertiaire ou quaternaire pendant le processus de dessiccation, aidant ainsi à maintenir l’activité des biomolécules lors de la réhydratation19. Une fois stabilisées à l’intérieur des tubes de réaction, les réactions peuvent être conservées pendant quelques mois à 2-8 °C ou quelques semaines à 21-23 °C au lieu des -20 °C normales. Cette approche a déjà été intégrée dans des tests conçus pour aider à diagnostiquer des maladies telles que la maladie de Chagas, le paludisme, la leishmaniose, la tuberculose et la cyclosporose13,14,15,20.
Le présent travail décrit toutes les étapes pour préparer les solutions requises pour la procédure de gélification, les pièges du processus et l’aspect final attendu d’une qPCR gélifiée prête à l’emploi à l’intérieur de bandes à huit tubes. Le même protocole peut être adapté pour les tubes simples ou les plaques à 96 puits. Enfin, la détection de l’ADN de T. cruzi sera présentée sous forme de contrôle.
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Protocol
1. Préparation des solutions mères et du mélange de gélification
REMARQUE : Quatre solutions mères seront préparées (400 mg/mL de mélezitose, 400 mg/mL de tréhalose, 0,75 mg/mL de lysine et 200 mg/mL de glycogène) et mélangées selon la proportion indiquée au tableau 1 pour produire le mélange de gélification. Bien que le protocole décrive 10 ml de production de solutions mères, il peut être adapté à des volumes plus ou moins élevés.
- Solution de mélezitose
- Peser 4 g de mélezitose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vorter à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Porter le volume final à 10 mL avec de l’eau sans nucléase. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.
- Peser 4 g de mélezitose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vorter à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Solution de tréhalose
- Peser 4 g de tréhalose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.
- Peser 4 g de tréhalose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Solution de glycogène
- Peser 2 g de glycogène dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Maintenir la solution au repos à 2-8 °C pendant 8-12 h car la solubilisation du glycogène produit beaucoup de bulles (Figure 1). Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.
- Peser 2 g de glycogène dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Solution de lysine
- Peser 7,5 mg de lysine dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau sans nucléase. Vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Transférer la solution dans une fiole ambrée ou la protéger de la lumière. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C pendant une période allant jusqu’à 6 mois.
- Peser 7,5 mg de lysine dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau sans nucléase. Vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Mélange de gélification (GM)
- Dans un tube en plastique de 50 mL, mélanger les volumes de solutions mères conformément au tableau 1.
- Mélanger les réactifs par dix inversions bout à bout du tube.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’effectuer une étape de filtration si cette étape est effectuée dans une hotte de sécurité à flux laminaire. Si cette étape n’est pas effectuée dans un environnement propre, filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm avant de la transférer dans une fiole ambrée. - Transférer la solution dans une fiole ambrée ou la protéger de la lumière. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 3 mois.
REMARQUE : À titre d’étape de contrôle de la qualité pour la préparation du mélange de gélification, s’assurer que les valeurs mesurées de pH, de conductivité et de densité se situent dans les plages suivantes : pH 5,55-6,66; conductivité 0,630-0,757 mS/cm; et densité 1,08-1,11 g/cm3. Toutes les mesures doivent être effectuées à 25 °C.
2. Préparation du mélange maître qPCR pour la gélification
REMARQUE: Dans cette étape, le mélange maître qPCR pour la gélification est préparé. Par conséquent, de l’eau n’est pas ajoutée au mélange, mais le mélange de gélification est ajouté (tableau 2).
- Décongeler les réactifs dans un contenant réfrigéré. Mélanger les réactifs dans un tube de 1,5 mL conformément au tableau 2. Un exemple de réaction avec un volume final de 25 μL contenant 5 μL d’échantillon d’ADN est montré ici.
NOTE: L’échantillon d’ADN n’est pas ajouté au mélange à cette étape; il est utilisé ici uniquement pour calculer les volumes finaux de chaque réactif du mélange maître qPCR. Des échantillons d’ADN doivent être ajoutés juste avant le début de l’exécution (voir l’étape 4 ci-dessous).
3. Gélification des réactifs sur les cuves de réaction
- Multiplier de façon appropriée les volumes indiqués au tableau 2 pour la préparation d’une bande à huit tubes ou d’une plaque à 96 puits.
- Piper 18,5 μL du mélange maître de gélification illustré au tableau 2 sur chaque puits de réaction.
REMARQUE : Ce volume représente les volumes de mélange d’oligonucléotides, de tampon PCR et de mélange de gélification utilisés pour une réaction (selon le tableau 2) et varie en fonction de la concentration des réactifs et du volume nécessaire pour une réaction. Le volume final du mélange principal de gélification est différent du volume d’un mélange maître régulier parce que de l’eau n’est pas ajoutée. - Placez les tubes ou la plaque dans le support conducteur de chaleur (p. ex. aluminium) à l’intérieur du four à vide.
REMARQUE: Le support thermoconducteur est facultatif. L’opérateur doit s’assurer que le fond des tubes est en contact avec l’étagère du four à vide pour permettre un équilibre thermique rapide. - Placez un sac d’argile bentonite pour deux assiettes de 96 puits.
NOTE: Les sacs d’argile bentonite sont utilisés pour absorber l’eau retirée du mélange principal de gélification par la pression différentielle exercée par le vide. Les sacs d’argile bentonite se sont avérés inutiles pour moins de deux plaques de 96 puits. - Soumettre les tubes/plaques contenant le mélange principal de gélification à trois cycles de vide (30 ± 5 mBar) de 30 min chacun, en alternance avec la libération sous vide jusqu’à ce que la pression atmosphérique soit atteinte (900-930 mBar), sous température contrôlée (30 °C ± 1 °C) (figure 2).
REMARQUE : L’instrument utilise un logiciel pour contrôler les paramètres, et un exemple du cycle est illustré à la figure 2. L’utilisateur doit créer le profil pour l’exécution, en indiquant les paramètres choisis. - Une fois le cycle terminé, vérifier la gélification des réactifs dans les tubes/plaques en s’assurant que le volume est visiblement réduit (Figure 3) et que les liquides ne bougent pas en tapotant les tubes/plaques avec les doigts.
REMARQUE : Si aucune gélification ne se produisait, la solution éclaboussait les parois des tubes lorsque les tubes sont taraudés (figure 3). - Sceller et conserver les tubes/plaques à 2-8 °C pendant 8-12 h avant utilisation.
4. Utilisation d’une qPCR gélifiée
- Retirez la bande ou la plaque tubulaire du réfrigérateur et ouvrez-la dans un poste de travail pour la manipulation des échantillons. Ajouter 15 μL d’eau exempte de nucléases dans chaque cuve de réaction.
NOTE: Le volume de réactifs gélifiés est considéré comme étant d’environ 5 μL. Ainsi, avec le volume de l’échantillon d’ADN (voir ci-dessous), le volume de réaction final est de 25 μL. - Ajouter 5 μL d’échantillon d’ADN.
REMARQUE: N’importe quel modèle d’ADN de qualité qPCR peut être utilisé. Dans le présent travail, l’ADN a été extrait de 10 épimastigotesdeT. cruzi (souche Dm28c) et a été dilué en série à un rapport de 1:10 à l’aide d’un tampon TE. - Scellez les tubes/plaques et passez à l’équipement de votre choix. Exécutez l’expérience et procédez à une analyse régulière des données.
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Representative Results
Trois des réactifs qui forment le mélange de gélification sont facilement solubilisés lors d’un tourbillon vigoureux. Cependant, le glycogène nécessite un tourbillon minutieux pour s’assurer que la poudre a été complètement solubilisée. Malheureusement, un tourbillon vigoureux produit beaucoup de bulles, ce qui rend difficile la détermination du volume réel de la solution (Figure 1A-B). Par conséquent, il est essentiel de laisser la solution de glycogène reposer au réfrigérateur jusqu’à ce que la majeure partie de la solution piégée dans les bulles soit descendue vers le corps de la solution principale. Compte tenu des protocoles de production et de la routine de laboratoire, les plaques gélifiées sont conservées au réfrigérateur pendant la nuit (ou environ 8-12 h), ce qui entraîne le dépôt de la plupart des bulles, ce qui facilite la détermination du volume correct et l’ajustement au volume final souhaité (Figure 1C). Notez la différence de volume de bulles entre les tubes de glycogène dans les figures 1B à C, respectivement, juste après la solubilisation et après la décantation nocturne.
Une fois que le mélange de gélification est ajouté au mélange maître qPCR en remplacement de l’eau (tableau 2), les bandes ou plaques tubulaires sont prêtes à être acheminées vers l’étuve à vide. Les étagères du four à vide contiennent un élément chauffant Peltier, garantissant que tous les tubes en contact avec celui-ci restent à la même température. Dans le protocole actuel, la température à l’intérieur de la chambre est maintenue constante à 30 °C, tandis que la pression varie entre 910-930 mBar (pression atmosphérique) et 30 mBar (quasi-vide). La figure 2 montre ces deux variables tracées dans le temps, montrant la température constante (ligne verte, panneau supérieur) et la variation de pression (ligne rouge, panneau inférieur). Une fois les cycles terminés, le mélange principal à l’intérieur du puits diminue de volume et devient gélifié au fond, c’est-à-dire sans bouger ni éclabousser lorsque les tubes sont tapotés avec les doigts (Figure 3). Les tubes peuvent maintenant être bouchés et stockés à une température de 2 à 8 °C. Les réactions ne se gélifieront pas si le mélange de gélification (tableau 1) est mal préparé; l’étape de contrôle de la qualité proposée devrait voir le défaut avant de mélanger le mélange de gélification avec des réactifs qPCR.
Pour être utilisés, les réactifs gélifiés à l’intérieur des tubes/plaques doivent être remis en suspension dans de l’eau exempte de nucléases et l’échantillon d’ADN dilué généralement dans de l’eau ou un tampon TE. La remise en suspension des réactifs du mélange sol-gel est réalisée lors de la première étape de dénaturation du protocole thermique qPCR (généralement, 5-10 min à 95 °C), donc aucune étape supplémentaire n’est nécessaire. La figure 4A montre des traces représentatives de la détection qPCR de l’ADN de T. cruzi à l’aide de séquences d’oligonucléotides publiées15. Les résultats sous-optimaux comprennent la perte de sensibilité, qui peut être testée avec une courbe de dilution d’une solution avec une concentration connue de cibles génomiques et une perte de spécificité, qui peut être testée avec un panel d’organismes trypanosomatides apparentés. La figure 4B montre la perte de sensibilité qui peut survenir lorsque le processus de gélification n’est pas correctement exécuté ou lorsque la réaction perd sa stabilité après avoir été conservée entre 2 et 8 °C pendant plus de 6 mois.
Figure 1 : La solubilisation du glycogène produit beaucoup de bulles. Parce que le glycogène produit trop de bulles pendant la solubilisation, la solution de glycogène doit être maintenue au repos avant de s’ajuster au volume final. (A) Bulles formées pendant le vortex. (B) Toute la poudre a été solubilisée, mais il n’est pas possible de déterminer le volume final en raison de l’excès de bulles. (C) Après 12 h au réfrigérateur (tube au milieu), le volume de bulles est réduit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cycle du vide (panneau inférieur) et contrôle de la température (panneau supérieur). Des traces représentatives de variation de température (panneau supérieur) et de pression (panneau inférieur) sont montrées. Les lignes noires représentent les variations programmées, tandis que les lignes vertes et rouges représentent les lectures réelles de l’instrument. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Aspects du mélange principal gélifié à l’intérieur d’une bande de huit tubes. (A) qPCR mélanges maîtres avant l’exposition sous vide. (B) Éclaboussures liquides sur les parois du tube en raison d’une gélification incomplète (un seul cycle de vide). (C) Réactifs qPCR gélifiés avec une nette réduction visible du volume. Le liquide n’éclabousse pas les parois lorsque les tubes sont taraudés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Traces représentatives de mélanges maîtres gélifiés détectant l’ADN des épimastigotes de T. cruzi. L’ADN extrait des épimastigotes de T. cruzi (10 à 8 cellules) a été dilué en série dans un rapport de 1:10, et les concentrations d’ADN comprises entre 104 et 100 cellules ont été soumises à une détectionà l’aide d’une qPCR gélifiée. (A) Le résultat attendu d’une qPCR correctement gélifiée (B) Détection des mêmes échantillons à l’aide d’une plaque où la gélification n’a pas été correctement exécutée, entraînant une perte de sensibilité. Notez que les concentrations les plus faibles sont détectées moins fréquemment dans le panneau B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Concentration des stocks | Volume |
| Mélezitose | 400 mg/mL | 3 mL |
| Treahlose | 400 mg/mL | 6 mL |
| Lysine | 0,75 mg/mL | 3 mL |
| Glycogène | 200 mg/mL | 3 mL |
| Eau sans nucléase | NA | p.q. 20 mL |
Tableau 1 : Concentrations dans les stocks et volumes des solutions utilisées pour produire 20 mL du mélange de gélification. Le volume de chaque solution mère doit être ajusté proportionnellement pour produire des volumes finaux inférieurs ou supérieurs du mélange de gélification.
| Réactif de mélange réactionnel | Mastermix régulier | Mastermix de gélification |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| Tampon PCR (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Mélange de gélification* | - | 5 μL |
| Eau sans nucléase | 6,5 μL | - |
| Échantillon d’ADN* | 5 μL | 5 μL |
| *maximum de 20 % du volume final de réaction | ||
Tableau 2 : Volumes de réactifs pour produire des mélanges maîtres qPCR pour les réactions régulières ou gélifiées. La différence entre les deux mélanges maîtres est que de l’eau est ajoutée au mélange maître régulier alors que le mélange de gélification est ajouté (c.-à-d. à la place de l’eau) au mélange maître de gélification.
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Discussion
Ces dernières années ont mis en évidence la nécessité de trouver des technologies plus sensibles et spécifiques pour aider à diagnostiquer les maladies tropicales et négligées. Bien qu’importants pour le contrôle épidémiologique, les tests parasitologiques (microscopie optique) et sérologiques ont des limites, en particulier en ce qui concerne la sensibilité et l’applicabilité au point de service. Les techniques d’amplification de l’ADN telles que la PCR, l’amplification isotherme et les variations respectives sont utilisées depuis longtemps en laboratoire, mais des obstacles technologiques empêchent son utilisation sur le terrain. L’un des principaux obstacles est la nécessité de températures de -20 °C pour le transport et le stockage des réactifs. Pour remédier à cette situation, des techniques telles que la lyophilisation et la gélification ont été utilisées pour stocker les réactions PCR hors du congélateur16,18,19.
Le présent travail montre toutes les étapes nécessaires pour gélifier une réaction qPCR afin de détecter l’ADN de T. cruzi à l’intérieur du récipient de réaction, qu’il s’agisse de tubes, de bandes tubulaires, de puces microfluidiques ou de plaques. Des études préliminaires utilisant une réaction RT-LAMP suggèrent que la technique de gélification peut également être utilisée pour préserver et protéger d’autres enzymes d’amplification et de modification des acides nucléiques, comme décrit par Rosado et al. 19. Bien que relativement simples, les deux étapes qui causent la plupart des erreurs de l’opérateur dans les routines de qPCR sont (a) la préparation de solutions de glycogène et de mélezitose et (b) le calcul du volume du mélange réactionnel à ajouter à chaque tube de réaction avant l’étape du vide. Tout d’abord, la solution de glycogène doit être réfrigérée pendant une nuit avant le réglage final du volume, et la solution de mélezitose doit être vigoureusement vortée (éventuellement avec un chauffage doux à 50 °C) pour une solubilisation complète. Deuxièmement, le chercheur qui planifie l’expérience doit être conscient que les volumes de réactifs calculés avant le vide peuvent être inégaux puisque de l’eau n’est pas ajoutée pour arrondir au volume de réaction. Le volume de réaction réel sera obtenu lorsque la réaction gélifiée sera resolubilisée par l’ajout d’échantillon et d’eau, avant l’exécution de la PCR.
La plus grande limitation de la méthode est la stabilité des réactions, qui est d’environ 6-8 mois à 2-8 °C14,15; Elle est considérablement plus courte que les réactions lyophilisées, qui peuvent rester stables pendantles années 18. Selon la spécificité des séquences d’oligonucléotides, une liaison et une amplification non spécifiques peuvent se produire, ce qui devrait être soigneusement examiné par les chercheurs. Par exemple, Costa et ses collaborateurs rapportent que la température de recuit de la qPCR gélifiée pour la détection de C. cayetanensis a dû être ajustée à +1 °C pour éviter des amplifications non spécifiques15,21. De même, les chercheurs devraient éviter d’utiliser des enzymes qui pourraient être régulées par ou utiliser les composants de gélification comme substrats.
La technique de gélification est particulièrement utile en raison de sa facilité d’utilisation dans la routine de laboratoire ainsi que d’une introduction dans une ligne de production16,19,22 permettant un contrôle de qualité en douceur; Ce dernier permet à son tour d’obtenir des données robustes et comparables entre plusieurs opérateurs et élimine efficacement les erreurs courantes des opérateurs à des étapes cruciales, avec en prime l’élimination des exigences de température de congélation pendant le transport et le stockage. Des études préliminaires suggèrent que l’élimination de la chaîne du froid entraînerait une réduction globale des coûts allant jusqu’à 20% pour un test qPCR14. L’élimination de la chaîne du froid permet également de mettre en œuvre la qPCR comme test de confirmation des maladies négligées telles que la maladie de Chagas dans les régions sous-développées, favorisant ainsi leur contrôle épidémiologique23.
Enfin, le protocole de gélification rationalise l’utilisation des tests qPCR car il ne nécessite que l’utilisateur d’ajouter de l’eau et l’ADN de T. cruzi extrait, évitant ainsi les erreurs lors de la manipulation du réactif et diminuant le temps de configuration ainsi que la possibilité de contamination du réactif. De telles caractéristiques assurent l’efficacité d’un laboratoire de diagnostic de routine, accélérant la livraison des résultats aux patients et augmentant la fiabilité du diagnostic. Enfin, parce qu’il dispense d’une chaîne du froid de -20 °C, il convient à une utilisation diagnostique dans des environnements à faibles ressources.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à Aline Burda Farias pour l’assistance technique avec le four à vide, ainsi qu’à l’administration de l’Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brésil) pour avoir permis l’accès audit équipement. Ces travaux ont été partiellement financés par la subvention CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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