Summary
O presente trabalho descreve as etapas para a produção de qPCR pronta para uso para detecção de DNA de T. cruzi que pode ser pré-carregada no vaso de reação e armazenada na geladeira por vários meses.
Abstract
A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica notavelmente sensível e precisa que permite amplificar quantidades minúsculas de alvos de ácido nucleico a partir de uma infinidade de amostras. Tem sido amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa e alcançou aplicação industrial em campos como diagnóstico humano e seleção de características em culturas de culturas de culturas de organismos geneticamente modificados (OGM). No entanto, a qPCR não é uma técnica à prova de erros. A mistura de todos os reagentes em uma única mistura mestra subsequentemente distribuída em 96 poços de uma placa qPCR regular pode levar a erros do operador, como mistura incorreta de reagentes ou dispensação imprecisa nos poços. Aqui, é apresentada uma técnica chamada gelificação, em que a maior parte da água presente na mistura mestre é substituída por reagentes que formam uma mistura sol-gel quando submetida a vácuo. Como resultado, os reagentes de qPCR são efetivamente preservados por algumas semanas à temperatura ambiente ou alguns meses a 2-8 o C. Os detalhes da preparação de cada solução são mostrados aqui, juntamente com o aspecto esperado de uma reação gelificada projetada para detectar oDNA satélite de T. cruzi (satDNA). Um procedimento semelhante pode ser aplicado para detectar outros organismos. Iniciar uma corrida de qPCR gelificada é tão simples quanto remover a placa da geladeira, adicionar as amostras aos seus respectivos poços e iniciar a corrida, diminuindo assim o tempo de configuração de uma reação de placa cheia para o tempo que leva para carregar as amostras. Além disso, as reações de PCR gelificadas podem ser produzidas e controladas quanto à qualidade em lotes, economizando tempo e evitando erros comuns do operador durante a execução de reações de PCR de rotina.
Introduction
A doença de Chagas foi descoberta no início doséculo 20 em regiões rurais do Brasil, onde a pobreza era generalizada 1,2. Ainda hoje, a doença continua ligada aos determinantes sociais e econômicos da saúde nas Américas. A doença de Chagas é bifásica, compreendendo uma fase aguda e uma crônica. É causada pela infecção pelo parasita Trypanosoma cruzi, sendo transmitida por insetos vetores, transfusões de sangue por via congênita ou ingestão oral de alimentos contaminados 3,4.
O diagnóstico da doença de Chagas pode ser feito por meio da observação de sintomas clínicos (especialmente o sinal de Romaña), baciloscopia sanguínea, sorologia e testes moleculares como PCR em tempo real (qPCR) ou amplificação isotérmica 4,5,6,7,8,9. Os sintomas clínicos e a baciloscopia de sangue são utilizados em casos suspeitos de infecções agudas, enquanto a busca de anticorpos é utilizada como ferramenta de triagem em pacientes assintomáticos. Devido à sua sensibilidade e especificidade, a qPCR tem sido sugerida para ser utilizada como ferramenta de monitoramento para pacientes crônicos, para pacientes agudos submetidos a tratamento medindo a carga parasitária no sangue e como marcador substituto de falha terapêutica 6,8,10,11,12 . Embora mais sensível e específica do que os testes atualmente disponíveis, a qPCR é efetivamente impedida de ser conhecida como ferramenta diagnóstica em regiões desfavorecidas em todo o mundo devido à exigência de temperaturas de congelamento para transporte e armazenamento13,14,15.
Para contornar esse obstáculo, técnicas de conservação como a liofilização e a gelificação têm sido exploradas16,17. Embora a liofilização proporcione conservação por anos, requer reagentes especialmente feitos sem a presença de glicerol, que é comumente usado para estabilização/conservação enzimática18. Embora a gelificação tenha demonstrado proporcionar conservação por meses, ela permite o uso de reagentes regulares19. A solução de gelificação compreende quatro componentes, cada um com papéis específicos no processo: os açúcares trealose e melezitose protegem as biomoléculas durante o processo de dessecação, reduzindo as moléculas de água livre na solução, o glicogênio produz uma matriz protetora mais ampla e o aminoácido lisina é usado como um eliminador de radicais livres para inibir as reações oxidantes entre o carboxila da biomolécula, grupos amino e fosfato. Esses componentes definem uma mistura sol-gel que evita a perda da estrutura terciária ou quaternária durante o processo de dessecação, ajudando a manter a atividade das biomoléculas na reidratação19. Uma vez estabilizadas dentro dos tubos de reação, as reações podem ser armazenadas por alguns meses a 2-8 °C ou algumas semanas a 21-23 °C em vez do regular -20 °C. Essa abordagem já foi incorporada em testes destinados a auxiliar no diagnóstico de doenças como doença de Chagas, malária, leishmaniose, tuberculose e ciclosporíase13,14,15,20.
O presente trabalho descreve todas as etapas para preparar as soluções necessárias para o procedimento de gelificação, as armadilhas no processo e o aspecto final esperado de uma qPCR gelificada pronta para uso dentro de tiras de oito tubos. O mesmo protocolo pode ser adaptado para tubos únicos ou placas de 96 poços. Finalmente, a detecção do DNA de T. cruzi será mostrada como uma corrida de controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de soluções-mãe e mistura de gelificação
NOTA: Quatro soluções-estoque serão preparadas (400 mg/mL de melezitose, 400 mg/mL de trealose, 0,75 mg/mL de lisina e 200 mg/mL de glicogênio) e misturadas de acordo com a proporção mostrada na Tabela 1 para produzir a mistura de gelificação. Embora o protocolo descreva 10 mL de produção de soluções de estoque, ele pode ser adaptado para volumes menores ou maiores.
- Solução de Melezitose
- Pesar 4 g de melezitose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo). - Perfazer o volume final até 10 mL com água livre de nuclease. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 6 meses.
- Pesar 4 g de melezitose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
- Solução de trealose
- Pesar 4 g de trealose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo). - Perfazer o volume até 10 ml com água isenta de nuclease e filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 6 meses.
- Pesar 4 g de trealose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
- Solução de glicogênio
- Pesar 2 g de glicogênio em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo). - Mantenha a solução em repouso a 2-8 °C por 8-12 h porque a solubilização do glicogênio produz muitas bolhas (Figura 1). Completar o volume até 10 ml com água isenta de nuclease. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 6 meses.
- Pesar 2 g de glicogênio em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
- Solução de lisina
- Pesar 7,5 mg de lisina em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease. Vórtice à velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo). - Perfazer o volume até 10 ml com água isenta de nuclease e filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm. Transferir a solução para um balão de âmbar ou protegê-la da luz. Rotule e armazene a 2-8 °C graus por até 6 meses.
- Pesar 7,5 mg de lisina em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease. Vórtice à velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado.
- Mistura de gelificação (GM)
- Em um tubo plástico de 50 mL, misture os volumes de soluções-estoque de acordo com a Tabela 1.
- Misture os reagentes por dez inversões de ponta a ponta do tubo.
NOTA: Não há necessidade de uma etapa de filtragem se esta etapa for executada em um exaustor de segurança de fluxo laminar. Se esta etapa não for executada num ambiente limpo, filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm antes de a transferir para um balão de âmbar. - Transferir a solução para um balão de âmbar ou protegê-la da luz. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 3 meses.
NOTA: Como etapa de controle de qualidade para a preparação da mistura de gelificação, certifique-se de que os valores medidos de pH, condutividade e densidade estejam dentro das seguintes faixas: pH 5,55-6,66; condutividade 0,630-0,757 mS/cm; e densidade 1,08-1,11 g/cm3. Todas as medições devem ser efectuadas a 25 °C.
2. Preparação da mistura mestre de qPCR para gelificação
NOTA: Nesta etapa, a mistura mestre de qPCR para gelificação é preparada. Assim, a água não é adicionada à mistura, mas em vez disso, a mistura de gelificação é adicionada (Tabela 2).
- Descongelar os reagentes em um recipiente refrigerado. Misture os reagentes em um tubo de 1,5 mL de acordo com a Tabela 2. Um exemplo de uma reação com um volume final de 25 μL contendo 5 μL de amostra de DNA é mostrado aqui.
NOTA: A amostra de ADN não é adicionada à mistura neste passo; ele é usado aqui apenas para calcular os volumes finais de cada reagente do master mix qPCR. Amostras de DNA devem ser adicionadas logo antes de iniciar a corrida (veja a etapa 4 abaixo).
3. Gelificação dos reagentes nos recipientes de reacção
- Multiplique adequadamente os volumes mostrados na Tabela 2 para a preparação de uma tira de oito tubos ou de uma placa de 96 poços.
- Pipetar 18,5 μL da mistura mestra de gelificação mostrada na Tabela 2 em cada poço de reação.
NOTA: Este volume representa os volumes de mistura de oligonucleotídeos, tampão de PCR e mistura de gelificação usados para uma reação (de acordo com a Tabela 2) e variará dependendo da concentração dos reagentes e do volume necessário para uma reação. O volume final na mistura mestra de gelificação é diferente do volume em uma mistura mestra regular porque a água não é adicionada. - Coloque os tubos/placa no suporte condutor de calor (por exemplo, alumínio) dentro do forno a vácuo.
NOTA: O suporte condutor de calor é opcional. O operador deve certificar-se de que o fundo dos tubos está em contacto com a prateleira do forno a vácuo para permitir um rápido equilíbrio térmico. - Coloque um saco de argila bentonítica para cada duas placas de 96 poços.
NOTA: Os sacos de argila bentonítica são usados para absorver a água removida da mistura mestra de gelificação pela pressão diferencial exercida pelo vácuo. Sacos de argila bentonítica foram considerados desnecessários para menos de duas placas de 96 poços. - Submeter os tubos/placas que contêm a mistura mestra de gelificação a três ciclos de vácuo (30 ± 5 mBar) de 30 min cada, alternando com a libertação de vácuo até atingir a pressão atmosférica (900-930 mBar), sob temperatura controlada (30 °C ± 1 °C) (Figura 2).
NOTA: O instrumento usa software para controlar os parâmetros, e um exemplo do ciclo é mostrado na Figura 2. O usuário deve criar o perfil para a execução, indicando os parâmetros escolhidos. - Quando o ciclo estiver concluído, verifique os tubos/placas quanto à gelificação adequada dos reagentes, certificando-se de que o volume está visivelmente reduzido (Figura 3) e que os líquidos não se movem ao bater nos tubos/placas com os dedos.
NOTA: Se a gelificação não ocorresse, a solução respingaria nas paredes do tubo quando os tubos fossem grampeados (Figura 3). - Selar e armazenar os tubos/placas a 2-8 °C durante 8-12 h antes da utilização.
4. Usando um qPCR gelificado
- Remova a tira de tubo ou a placa do frigorífico e abra-a numa estação de trabalho para manipulação da amostra. Adicione 15 μL de água livre de nuclease a cada vaso de reação.
NOTA: O volume de reagentes gelificados é considerado de cerca de 5 μL. Assim, juntamente com o volume da amostra de DNA (veja abaixo), o volume de reação final é de 25 μL. - Adicionar 5 μL de amostra de ADN.
NOTA: Qualquer modelo de DNA de qualidade qPCR pode ser usado. No presente trabalho, o DNA foi extraído de 108 epimastigotas de T. cruzi (cepa Dm28c) e diluído em série na proporção de 1:10 usando tampão TE. - Sele os tubos/placas e prossiga para o equipamento de sua escolha. Execute o experimento e prossiga para a análise regular dos dados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Três dos reagentes que formam a mistura de gelificação são facilmente solubilizados após vórtices vigorosos. No entanto, o glicogênio requer vórtice cuidadoso para garantir que o pó tenha sido completamente solubilizado. Infelizmente, o vórtice vigoroso produz muitas bolhas, o que dificulta a determinação do volume real da solução (Figura 1A-B). Portanto, é essencial deixar a solução de glicogênio descansar na geladeira até que a maior parte da solução presa dentro das bolhas tenha se movido para o corpo da solução principal. Considerando os protocolos de produção e a rotina laboratorial, as placas gelificadas são mantidas na geladeira durante a noite (ou em torno de 8-12 h), resultando no assentamento da maioria das bolhas, facilitando assim a determinação do volume correto e o ajuste ao volume final desejado (Figura 1C). Observe a diferença no volume de bolhas entre os tubos de glicogênio nas Figuras 1B-C, respectivamente, logo após a solubilização e após o assentamento noturno.
Uma vez que a mistura de gelificação é adicionada à mistura mestre de qPCR em substituição à água (Tabela 2), as tiras ou placas do tubo estão prontas para ir para o forno a vácuo. As prateleiras do forno a vácuo contêm um elemento de aquecimento Peltier, garantindo que todos os tubos que estão em contato com ele permaneçam na mesma temperatura. No presente protocolo, a temperatura no interior da câmara é mantida constante a 30 °C, enquanto a pressão varia entre 910-930 mBar (pressão atmosférica) e 30 mBar (quase vácuo). A Figura 2 mostra essas duas variáveis plotadas ao longo do tempo, mostrando a temperatura constante (linha verde, painel superior) e a variação de pressão (linha vermelha, painel inferior). Após o término dos ciclos, a mistura mestra no interior do poço diminui de volume e fica gelificada no fundo, ou seja, sem se mover ou espirrar quando os tubos são batidos com os dedos (Figura 3). Os tubos podem agora ser tampados e armazenados a 2-8 °C. As reações não conseguirão gelificar se a mistura de gelificação (Tabela 1) for preparada incorretamente; a etapa de controle de qualidade proposta deve ver a falha antes de misturar a mistura de gelificação com reagentes de qPCR.
Para serem utilizados, os reagentes gelificados no interior dos tubos/placas devem ser ressuspensos em água isenta de nuclease e a amostra de ADN diluída normalmente em água ou tampão TE. A ressuspensão dos reagentes da mistura sol-gel é alcançada durante a primeira etapa de desnaturação do protocolo térmico qPCR (geralmente, 5-10 min a 95 °C), portanto, nenhuma etapa extra é necessária. A Figura 4A mostra traços representativos da detecção de qPCR do DNA de T. cruzi usando sequências de oligonucleotídeos publicadas15. Os resultados abaixo do ideal incluem perda de sensibilidade, que pode ser testada com uma curva de diluição de uma solução com uma concentração conhecida de alvos genômicos e perda de especificidade, que pode ser testada com um painel de organismos tripanossomídeos relacionados. A Figura 4B mostra a perda de sensibilidade que pode surgir quando o processo de gelificação não é executado corretamente ou quando a reação perde sua estabilidade após ser armazenada a 2-8 °C por mais de 6 meses.
Figura 1: A solubilização do glicogênio produz muitas bolhas. Como o glicogênio produz muitas bolhas durante a solubilização, a solução de glicogênio deve ser mantida em repouso antes de se ajustar ao volume final. (A) Bolhas formadas durante o vórtice. (B) Todo o pó foi solubilizado, mas não é possível determinar o volume final devido ao excesso de bolhas. (C) Após 12 h no refrigerador (tubo no meio), o volume de bolhas é reduzido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ciclo de vácuo (painel inferior) e controle de temperatura (painel superior). Traços representativos da variação de temperatura (painel superior) e pressão (painel inferior) são mostrados. As linhas pretas representam as variações programadas, enquanto as linhas verde e vermelha representam as leituras reais do instrumento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aspectos da mistura mestra gelificada dentro de uma tira de oito tubos . (A) misturas mestras de qPCR antes da exposição ao vácuo. (B) Splatters líquidos nas paredes do tubo devido à gelificação incompleta (apenas um ciclo de vácuo). (C) Reagentes de qPCR gelificados com uma clara redução visível do volume. O líquido não respinga nas paredes quando os tubos são batidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Traços representativos de misturas mestras gelificadas detectando DNA de epimastigotas de T. cruzi. O DNA extraído de epimastigotas de T. cruzi (108 células) foi diluído em série na proporção de 1:10, e as concentrações de DNA variando entre 104 e 100 células foram submetidas à detecção por meio de qPCR gelificada. (A) O resultado esperado da qPCR corretamente gelificada (B) Detecção das mesmas amostras utilizando uma placa onde a gelificação não foi executada adequadamente, resultando em perda de sensibilidade. Note-se que as concentrações mais baixas são detectadas com menos frequência no painel B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Concentração de existências | Volume |
| Melezitose | 400 mg/mL | 3 mL |
| Treahlose | 400 mg/mL | 6 mL |
| Lisina | 0,75 mg/mL | 3 mL |
| Glicogénio | 200 mg/mL | 3 mL |
| Água isenta de nuclease | NA | q.s.p. 20 mL |
Tabela 1: Concentrações de estoque e volumes de soluções utilizadas para produzir 20 mL da mistura de gelificação. O volume de cada solução-mãe deve ser ajustado proporcionalmente para produzir volumes finais inferiores ou superiores da mistura de gelificação.
| Reagente de Mistura de Reação | Mastermix regular | Mastermix de gelificação |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| Buffer de PCR (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Mistura de Gelificação* | - | 5 μL |
| Água isenta de nuclease | 6,5 μL | - |
| Amostra de DNA* | 5 μL | 5 μL |
| *máximo de 20% do volume final de reação | ||
Tabela 2: Volumes de reagentes para produzir misturas mestras de qPCR para reações regulares ou gelificadas. A diferença entre as duas misturas mestras é que a água é adicionada à mistura mestra regular, enquanto a mistura de gelificação é adicionada (ou seja, em vez de água) à mistura mestre de gelificação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os últimos anos têm destacado a necessidade de encontrar tecnologias mais sensíveis e específicas para ajudar a diagnosticar doenças tropicais e negligenciadas. Embora importantes para o controle epidemiológico, os testes parasitológicos (microscopia óptica) e sorológicos apresentam limitações, principalmente no que se refere à sensibilidade e aplicabilidade no local de atendimento. Técnicas de amplificação de DNA, como PCR, amplificação isotérmica e respectivas variações, têm sido usadas há muito tempo em ambientes de laboratório, mas os obstáculos tecnológicos impedem que ela seja usada em ambientes de campo. Um dos principais obstáculos é a necessidade de temperaturas de -20 °C para transporte e armazenamento dos reagentes. Para remediar essa situação, técnicas como liofilização e gelificação têm sido utilizadas para armazenar reações de PCR fora do freezer16,18,19.
O presente trabalho mostra todas as etapas necessárias para gelificar uma reação qPCR para detectar o DNA de T. cruzi dentro do vaso de reação, sejam tubos, tiras de tubos, chips microfluídicos ou placas. Estudos preliminares utilizando uma reação RT-LAMP sugerem que a técnica de gelificação também pode ser usada para preservar e blindar outras enzimas de amplificação e modificação do ácido nucleico, conforme descrito por Rosado et al. 19. Embora relativamente simples, as duas etapas que causam a maioria dos erros do operador nas rotinas de qPCR são (a) a preparação de soluções de glicogênio e melezitose e (b) o cálculo do volume da mistura de reação a ser adicionada a cada tubo de reação antes da etapa de vácuo. Primeiro, a solução de glicogênio deve ser refrigerada durante a noite antes do ajuste final do volume, e a solução de melezitose deve ser vigorosamente vórtice (possivelmente com aquecimento suave a 50 °C) para solubilização completa. Em segundo lugar, o pesquisador que planeja o experimento deve estar ciente de que os volumes calculados pré-vácuo dos reagentes podem ser desiguais, uma vez que a água não é adicionada para arredondar até o volume de reação. O volume real de reação será obtido quando a reação gelificada for resolubilizada pela adição de amostra e água, antes de executar a PCR.
A maior limitação do método é a estabilidade das reações, que é em torno de 6-8 meses a 2-8 °C14,15; é consideravelmente mais curta do que as reações liofilizadas, que podem permanecer estáveis por18 anos. Dependendo da especificidade das sequências de oligonucleotídeos, pode ocorrer ligação e amplificação inespecíficas, o que deve ser cuidadosamente examinado pelos pesquisadores. Por exemplo, Costa e colaboradores relatam que a temperatura de recozimento da qPCR gelificada para detecção de C. cayetanensis teve que ser ajustada em +1 °C para evitar amplificações inespecíficas15,21. Da mesma forma, os pesquisadores devem evitar o uso de enzimas que possam ser reguladas ou usar os componentes de gelificação como substratos.
A técnica de gelificação é particularmente útil devido à sua facilidade de uso na rotina laboratorial, bem como à introdução em uma linha de produção16,19,22, permitindo um controle de qualidade suave; este último, por sua vez, permite dados robustos e comparáveis em vários operadores e elimina efetivamente erros comuns do operador em etapas cruciais, com o bônus de eliminar os requisitos de temperatura de congelamento durante o transporte e o armazenamento. Estudos preliminares sugerem que a eliminação da cadeia de frio resultaria em uma redução geral do custo em até 20% para um teste de qPCR14. A eliminação da cadeia de frio também viabiliza a implementação da qPCR como teste confirmatório para doenças negligenciadas, como a doença de Chagas, em regiões subdesenvolvidas, favorecendo seu controle epidemiológico23.
Por fim, o protocolo de gelificação agiliza o uso de testes de qPCR, pois exige apenas que o usuário adicione água e o DNA extraído de T. cruzi , evitando erros durante o manuseio do reagente e diminuindo o tempo de set-up, bem como a possibilidade de contaminação do reagente. Tais características proporcionam eficiência para um laboratório de diagnóstico de rotina, agilizando a entrega de resultados aos pacientes e aumentando a confiabilidade do diagnóstico. Por fim, como dispensa a necessidade de uma cadeia de frio de -20 °C, é adequado para uso diagnóstico em ambientes com poucos recursos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Aline Burda Farias pela assistência técnica com o forno a vácuo, bem como à administração do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir o acesso aos referidos equipamentos. Este trabalho foi parcialmente financiado pela bolsa CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
