Summary
Det foreliggende arbeidet beskriver trinnene for å produsere klar til bruk qPCR for T. cruzi DNA-deteksjon som kan forhåndslastes på reaksjonsbeholderen og lagres i kjøleskapet i flere måneder.
Abstract
Real-time PCR (qPCR) er en bemerkelsesverdig følsom og presis teknikk som gjør det mulig å forsterke små mengder nukleinsyremål fra en rekke prøver. Det har blitt mye brukt i mange forskningsområder og oppnådd industriell anvendelse på områder som menneskelig diagnostikk og egenskapsvalg i avlinger av genmodifiserte organismer (GMO) avlinger. qPCR er imidlertid ikke en feilsikker teknikk. Blanding av alle reagenser i en enkelt masterblanding som deretter distribueres på 96 brønner i en vanlig qPCR-plate, kan føre til operatørfeil som feil blanding av reagenser eller unøyaktig dispensering i brønnene. Her presenteres en teknikk som kalles gelifisering, hvorved det meste av vannet som er tilstede i masterblandingen erstattes av reagenser som danner en sol-gelblanding når den sendes til et vakuum. Som et resultat blir qPCR-reagenser effektivt bevart i noen uker ved romtemperatur eller noen måneder ved 2-8 oC. Detaljer om fremstilling av hver løsning vises her sammen med det forventede aspektet av en gelifisert reaksjon designet for å oppdage T. cruzi satellitt-DNA (satDNA). En lignende prosedyre kan brukes til å oppdage andre organismer. Å starte en gelifisert qPCR-kjøring er så enkelt som å fjerne platen fra kjøleskapet, legge prøvene til deres respektive brønner og starte kjøringen, og dermed redusere oppsettstiden for en fullplatereaksjon på tiden det tar å laste prøvene. I tillegg kan gelifiserte PCR-reaksjoner produseres og kontrolleres for kvalitet i batcher, noe som sparer tid og unngår vanlige operatørfeil mens du kjører rutinemessige PCR-reaksjoner.
Introduction
Chagas sykdom ble oppdaget tidligi det 20. århundre i landlige regioner i Brasil, hvor fattigdom var utbredt 1,2. Selv i dag fortsetter sykdommen å være knyttet til sosiale og økonomiske determinanter for helse i Amerika. Chagas sykdom er bifasisk, bestående av en akutt og kronisk fase. Det er forårsaket av infeksjon av Trypanosoma cruzi parasitten, overføres av insektvektorer, blodtransfusjoner via medfødt rute, eller oral inntak av forurenset mat 3,4.
Diagnosen av Chagas sykdom kan gjøres gjennom observasjon av kliniske symptomer (spesielt Romaña-tegnet), blodutstrykmikroskopi, serologi og molekylære tester som sanntids PCR (qPCR) eller isotermisk forsterkning 4,5,6,7,8,9. Kliniske symptomer og blodutstrykmikroskopi brukes ved mistanke om akutte infeksjoner, mens søk etter antistoffer brukes som screeningverktøy hos asymptomatiske pasienter. På grunn av sin følsomhet og spesifisitet har qPCR blitt foreslått å bli brukt som et overvåkingsverktøy for kroniske pasienter, for akutte pasienter som gjennomgår behandling som måler parasittbelastningen i blodet, og som surrogatmarkør for terapeutisk svikt 6,8,10,11,12 . Selv om det er mer følsomt og spesifikt enn dagens tilgjengelige tester, er qPCR effektivt forhindret fra å bli kjent som diagnostiske verktøy i underprivilegerte regioner over hele verden på grunn av kravet om frysende temperaturer for transport og lagring13,14,15.
For å omgå denne hindringen har bevaringsteknikker som lyofilisering og gelifisering blitt utforsket16,17. Mens lyofilisering gir bevaring i årevis, krever det spesiallagde reagenser uten tilstedeværelse av glyserol, som ofte brukes til enzymstabilisering / bevaring18. Mens gelifisering har vist seg å gi bevaring i flere måneder, tillater det bruk av vanlige reagenser19. Gelifiseringsløsningen består av fire komponenter, hver med spesifikke roller i prosessen: sukkertrehalose og melezitose beskytter biomolekylene under uttørkingsprosessen ved å redusere frie vannmolekyler i løsningen, glykogen produserer en bredere beskyttende matrise, og aminosyren lysin brukes som en fri radikalscavenger for å hemme oksidasjonsreaksjonene mellom biomolekylets karboksyl, amino- og fosfatgrupper. Disse komponentene definerer en sol-gelblanding som forhindrer tap av tertiær eller kvaternær struktur under uttørkingsprosessen, og bidrar dermed til å opprettholde biomolekylenes aktivitet ved rehydrering19. Når reaksjonsrørene er stabilisert, kan reaksjonene lagres i noen måneder ved 2-8 °C eller noen uker ved 21-23 °C i stedet for de vanlige -20 °C. Denne tilnærmingen er allerede innarbeidet i tester som er utformet for å diagnostisere sykdommer som Chagas sykdom, malaria, leishmaniasis, tuberkulose og ciklosporiasis13,14,15,20.
Det nåværende arbeidet beskriver alle trinnene for å forberede de nødvendige løsningene for gelifiseringsprosedyren, fallgruvene i prosessen og det forventede endelige aspektet av en bruksklar gelifisert qPCR inne i åtte-rørsstrimler. Den samme protokollen kan tilpasses for enkeltrør eller 96-brønnsplater. Til slutt vil deteksjonen av T. cruzi DNA bli vist som en kontrollkjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av stamløsninger og gelifiseringsblanding
MERK: Fire stamløsninger vil bli fremstilt (400 mg/ml melezitose, 400 mg/ml trehalose, 0,75 mg/ml lysin og 200 mg/ml glykogen) og blandet i henhold til andelen vist i tabell 1 for å produsere gelifiseringsblandingen. Selv om protokollen beskriver 10 ml lagerløsningsproduksjon, kan den tilpasses for lavere eller høyere volumer.
- Melezitose løsning
- Vei 4 g melezitose i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann og virvel ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
MERK: Mer vann kan tilsettes for å lette oppløseliggjøring, pass på at du ikke overskrider det endelige volumet (se nedenfor). - Gjør opp det endelige volumet til 10 ml med nukleasefritt vann. Merk og oppbevar ved 2-8 °C i opptil 6 måneder.
- Vei 4 g melezitose i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann og virvel ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
- Trehalose løsning
- Vei 4 g trehalose i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann og virvel ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
MERK: Mer vann kan tilsettes for å lette oppløseliggjøring, pass på at du ikke overskrider det endelige volumet (se nedenfor). - Gjør opp volumet til 10 ml med nukleasefritt vann og filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm filter. Merk og oppbevar ved 2-8 °C i opptil 6 måneder.
- Vei 4 g trehalose i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann og virvel ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
- Glykogen løsning
- Vei 2 g glykogen i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann og virvel ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
MERK: Mer vann kan tilsettes for å lette oppløseliggjøring, pass på at du ikke overskrider det endelige volumet (se nedenfor). - Hold oppløsningen i ro ved 2-8 °C i 8-12 timer fordi oppløseliggjøring av glykogen gir mange bobler (figur 1). Gjør opp volumet til 10 ml med nukleasefritt vann. Merk og oppbevar ved 2-8 °C i opptil 6 måneder.
- Vei 2 g glykogen i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann og virvel ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
- Lysin løsning
- Vei 7,5 mg lysin i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann. Vortex ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
MERK: Mer vann kan tilsettes for å lette oppløseliggjøring, pass på at du ikke overskrider det endelige volumet (se nedenfor). - Gjør opp volumet til 10 ml med nukleasefritt vann og filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm filter. Overfør løsningen til en gul kolbe eller beskytt den mot lys. Merk og oppbevar ved 2-8 °C grader i opptil 6 måneder.
- Vei 7,5 mg lysin i et 15 ml plastrør, tilsett 6 ml nukleasefritt vann. Vortex ved instrumentets maksimale hastighet til pulveret er oppløselig.
- Gelifiseringsblanding (GM)
- I et 50 ml plastrør blandes volumene av lagerløsninger i henhold til tabell 1.
- Bland reagensene med ti ende-til-ende inversjoner av røret.
MERK: Det er ikke behov for et filtreringstrinn hvis dette trinnet utføres i en laminær strømningssikkerhetshette. Hvis dette trinnet ikke utføres i et rent miljø, filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm filter før du overfører det til en gul kolbe. - Overfør løsningen til en gul kolbe eller beskytt den mot lys. Merk og oppbevar ved 2-8 °C i opptil 3 måneder.
NOTAT: Som et kvalitetskontrolltrinn for fremstilling av gelifiseringsblandingen, må du sørge for at de målte pH-, konduktivitets- og tetthetsverdiene er innenfor følgende områder: pH 5,55-6,66; konduktivitet 0,630-0,757 mS / cm; og tetthet 1,08-1,11 g/cm3. Alle målinger skal gjøres ved 25 °C.
2. Fremstilling av qPCR masterblanding for gelifisering
MERK: I dette trinnet fremstilles qPCR-masterblandingen for gelifisering. Derfor tilsettes ikke vann til blandingen, men i stedet tilsettes gelifiseringsblandingen (tabell 2).
- Tine reagensene i en kjølebeholder. Bland reagensene i et 1,5 ml rør i henhold til tabell 2. Et eksempel på en reaksjon med et endelig volum på 25 μL som inneholder 5 μL DNA-prøve er vist her.
MERK: DNA-prøven blir ikke tilsatt til blandingen i dette trinnet; den brukes her utelukkende til å beregne de endelige volumene av hvert reagens av qPCR-masterblandingen. DNA-prøver bør tilsettes rett før løpeturen starter (se trinn 4 nedenfor).
3. Gelifisering av reagensene på reaksjonsbeholderne
- Multipliser volumene vist i tabell 2 på riktig måte for fremstilling av en åtte-rørs stripe eller en 96-brønns plate.
- Pipet 18,5 μL av gelifiseringsmasterblandingen vist i tabell 2 på hver reaksjonsbrønn.
MERK: Dette volumet representerer volumene oligonukleotidblanding, PCR-buffer og gelifiseringsblanding som brukes til en reaksjon (i henhold til tabell 2) og vil variere avhengig av konsentrasjonen av reagensene og volumet som trengs for en reaksjon. Det endelige volumet i gelifiseringsmasterblandingen er forskjellig fra volumet i en vanlig masterblanding fordi vann ikke tilsettes. - Plasser rørene/platen i den varmeledende støtten (f.eks. aluminium) inne i vakuumovnen.
NOTAT: Den varmeledende støtten er valgfri. Operatøren må sørge for at bunnen av rørene er i kontakt med vakuumovnhyllen for å muliggjøre rask termisk likevekt. - Plasser en bentonitt leirepose for hver to 96-brønns plater.
MERK: Bentonittleireposer brukes til å absorbere det fjernede vannet fra gelifiseringsmasterblandingen av differansetrykket som utøves av vakuumet. Bentonitt leire poser ble funnet å være unødvendig for mindre enn to 96-brønns plater. - Undersett rørene/platen som inneholder gelifiseringsmasterblandingen til tre vakuumsykluser (30 ± 5 mBar) på 30 minutter hver, vekslende med vakuumutløsning til atmosfæretrykket er oppnådd (900-930 mBar), under kontrollert temperatur (30 °C ± 1 °C) (figur 2).
MERK: Instrumentet bruker programvare for å kontrollere parametrene, og et eksempel på syklusen er vist i figur 2. Brukeren må opprette profilen for kjøringen, som angir de valgte parameterne. - Når syklusen er fullført, kontroller rørene/platene for riktig gelifisering av reagensene ved å sikre at volumet er synlig redusert (figur 3) og at væskene ikke beveger seg når du tapper rørene/platene med fingrene.
MERK: Hvis gelifisering ikke oppstod, ville løsningen sprute på rørveggene når rørene tappes (figur 3). - Forsegl og oppbevar rørene/platene ved 2-8 °C i 8-12 timer før bruk.
4. Bruk en gelifisert qPCR
- Fjern rørstrimmelen eller platen fra kjøleskapet og åpne den i en arbeidsstasjon for prøvemanipulering. Tilsett 15 μL nukleasefritt vann til hvert reaksjonsbeholder.
MERK: Volumet av gelifiserte reagenser anses å være ca. 5 μL. Så, sammen med DNA-prøvevolumet (se nedenfor), er det endelige reaksjonsvolumet 25 μL. - Tilsett 5 μL DNA-prøve.
MERK: Enhver qPCR-kvalitet DNA-mal kan brukes. I det foreliggende arbeidet ble DNA ekstrahert fra 108T. cruzi epimastigoter (stamme Dm28c) og ble serielt fortynnet i forholdet 1:10 ved bruk av TE-buffer. - Forsegl rørene / platene og fortsett til det valgte utstyret. Kjør eksperimentet og fortsett til vanlig dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre av reagensene som danner gelifiseringsblandingen, oppløses lett ved kraftig vortexing. Glykogen krever imidlertid forsiktig vortexing for å sikre at pulveret er fullstendig oppløselig. Dessverre produserer kraftig vortexing mange bobler, noe som gjør det vanskelig å bestemme det faktiske volumet av løsningen (figur 1A-B). Derfor er det viktig å la glykogenoppløsningen hvile i kjøleskapet til det meste av løsningen fanget i boblene har flyttet ned til hovedoppløsningen. Med tanke på produksjonsprotokollene og laboratorierutinen oppbevares gelifiserte plater i kjøleskapet over natten (eller rundt 8-12 timer), noe som resulterer i sedimentering av de fleste boblene, noe som gjør det lettere å bestemme riktig volum og justere til ønsket sluttvolum (figur 1C). Legg merke til forskjellen i volumet av bobler mellom glykogenrørene i henholdsvis figur 1B-C, rett etter oppløseliggjøringen og etter nattens sedimentering.
Når gelifiseringsblandingen er tilsatt qPCR-masterblandingen i erstatning for vann (tabell 2), er rørstrimlene eller platene klare til å gå til vakuumovnen. Hyllene i vakuumovnen inneholder et Peltier-varmeelement, slik at eventuelle rør som er i kontakt med den forblir ved samme temperatur. I denne protokollen holdes temperaturen inne i kammeret konstant ved 30 °C, mens trykket varierer mellom 910-930 mBar (atmosfærisk trykk) og 30 mBar (nærvakuum). Figur 2 viser disse to variablene plottet over tid, som viser konstant temperatur (grønn linje, øvre panel) og variasjon av trykk (rød linje, nedre panel). Etter at syklusene er ferdige, reduseres masterblandingen inne i brønnen i volum og blir gelifisert nederst, dvs. uten å bevege seg eller sprute når rørene tappes med fingrene (figur 3). Rørene kan nå kappes og lagres ved 2-8 °C. Reaksjonene vil ikke gelifisere hvis gelifiseringsblandingen (tabell 1) er feil fremstilt; det foreslåtte kvalitetskontrolltrinnet skal se feilen før gelifiseringsblandingen blandes med qPCR-reagenser.
For bruk må de gelifiserte reagensene inne i rørene/platene resuspenderes i nukleasefritt vann og DNA-prøven fortynnes vanligvis i vann eller TE-buffer. Resuspendering av reagensene til sol-gel-blandingen oppnås under det første trinnet med denaturering av qPCR-termisk protokoll (vanligvis 5-10 minutter ved 95 ° C), så det er ikke nødvendig med ekstra trinn. Figur 4A viser representative spor av qPCR-påvisning av T. cruzi DNA ved bruk av publiserte oligonukleotidsekvenser15. Suboptimale resultater inkluderer tap av følsomhet, som kan testes med en fortynningskurve av en løsning med en kjent konsentrasjon av genomiske mål og tap av spesifisitet, som kan testes med et panel av relaterte trypanosomatidorganismer. Figur 4B viser tap av følsomhet som kan oppstå når gelifiseringsprosessen ikke utføres riktig eller når reaksjonen mister stabiliteten etter å ha blitt lagret ved 2-8 °C i mer enn 6 måneder.
Figur 1: Solubilisering av glykogen gir mange bobler. Fordi glykogen produserer for mange bobler under oppløseliggjøring, må glykogenoppløsningen holdes i ro før den justeres til det endelige volumet. (A) Bobler dannet under vortexing. (B) Alt pulveret ble oppløselig, men det er ikke mulig å bestemme det endelige volumet på grunn av overskytende bobler. (C) Etter 12 timer i kjøleskapet (rør i midten), reduseres volumet av bobler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vakuumsykling (nedre panel) og temperaturkontroll (øvre panel). Representative spor av temperatur (øvre panel) og trykk (nedre panel) variasjon vises. Svarte linjer representerer de programmerte variasjonene, mens de grønne og røde linjene representerer faktiske avlesninger av instrumentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Aspekter ved gelifisert masterblanding inne i en åtte-rørs stripe . (A) qPCR-masterblandinger før vakuumeksponeringen. (B) Flytende sprut på rørveggene på grunn av ufullstendig gelifisering (kun en vakuumsyklus). (C) Gelifiserte qPCR-reagenser med en tydelig synlig volumreduksjon. Væsken spruter ikke på veggene når rørene tappes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative spor av gelifiserte masterblandinger som påviser DNA fra T. cruzi epimastigoter. DNA ekstrahert fra T. cruzi epimastigoter (108 celler) ble serielt fortynnet i forholdet 1:10, og DNA-konsentrasjonene mellom 104 og 100 celler ble gjenstand for deteksjon ved hjelp av en gelifisert qPCR. (A) Det forventede resultatet av korrekt gelifisert qPCR (B) Påvisning av de samme prøvene ved bruk av en plate der gelifiseringen ikke ble riktig utført, noe som resulterte i tap av følsomhet. Merk at de lavere konsentrasjonene oppdages sjeldnere i panel B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Lager konsentrasjon | Volum |
| Melezitose | 400 mg/ml | 3 ml |
| Treahlose | 400 mg/ml | 6 ml |
| Lysin | 0,75 mg/ml | 3 ml |
| Glykogen | 200 mg/ml | 3 ml |
| Nukleasefritt vann | NA | q.s.p. 20 ml |
Tabell 1: Lagerkonsentrasjoner og volumer av løsninger som brukes til å produsere 20 ml av gelifiseringsblandingen. Volumet av hver stamløsning må justeres proporsjonalt for å produsere lavere eller høyere endelige volumer av gelifiseringsblandingen.
| Reaksjon Mix Reagens | Vanlig mastermix | Gelifisering mastermix |
| Oligomix (25X) | 1 mikroliter | 1 mikroliter |
| PCR-buffer (2X) | 12,5 mikroliter | 12,5 mikroliter |
| Gelifiseringsblanding* | - | 5 mikroliter |
| Nukleasefritt vann | 6,5 mikroliter | - |
| DNA-prøve* | 5 mikroliter | 5 mikroliter |
| *maksimalt 20 % av det endelige reaksjonsvolumet | ||
Tabell 2: Volumer av reagenser for å produsere qPCR-masterblandinger for vanlige eller gelifiserte reaksjoner. Forskjellen mellom de to masterblandingene er at vann tilsettes den vanlige masterblandingen mens gelifiseringsblandingen tilsettes (dvs. i stedet for vann) til gelifiseringsmesterblandingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De siste årene har fremhevet behovet for å finne mer følsomme og spesifikke teknologier for å diagnostisere tropiske og forsømte sykdommer. Selv om det er viktig for epidemiologisk kontroll, har parasitologiske (optisk mikroskopi) og serologiske tester begrensninger, spesielt når det gjelder følsomhet og pasientnær anvendelighet. DNA-amplifikasjonsteknikker som PCR, isotermisk forsterkning og respektive variasjoner har lenge vært brukt i laboratorieinnstillinger, men teknologiske hindringer utelukker at den brukes i feltinnstillinger. En av de største hindringene er behovet for temperaturer på -20 °C for transport og lagring av reagensene. For å avhjelpe denne situasjonen har teknikker som lyofilisering og gelifisering blitt brukt til å lagre PCR-reaksjoner ut av fryseren16,18,19.
Det nåværende arbeidet viser alle trinnene som er nødvendige for å gelifisere en qPCR-reaksjon for å oppdage T. cruzi DNA inne i reaksjonsbeholderen, det være seg rør, rørstrimler, mikrofluidiske chips eller plater. Foreløpige studier ved bruk av en RT-LAMP-reaksjon tyder på at gelifiseringsteknikken også kan brukes til å bevare og skjerme andre nukleinsyreforsterknings- og modifikasjonsenzymer, som beskrevet av Rosado et al. 19. Selv om det er relativt enkelt, er de to trinnene som forårsaker de fleste operatørfeilene i qPCR-rutiner (a) fremstilling av glykogen- og melezitoseløsninger og (b) beregning av volumet av reaksjonsblandingen som skal tilsettes hvert reaksjonsrør før vakuumtrinnet. Først må glykogenoppløsningen oppbevares i kjøleskap over natten før den endelige volumjusteringen, og melezitoseoppløsningen må virvles kraftig (eventuelt med mild oppvarming ved 50 °C) for fullstendig oppløsning. For det andre må forskeren som planlegger eksperimentet være klar over at reagensvolumene beregnet forvakuum kan være ujevne siden vann ikke tilsettes for å runde opp til reaksjonsvolumet. Det faktiske reaksjonsvolumet vil bli oppnådd når den gelifiserte reaksjonen oppløses ved tilsetning av prøve og vann, før PCR kjøres.
Den største begrensningen av metoden er stabiliteten av reaksjonene, som er rundt 6-8 måneder ved 2-8 ° C14,15; Det er betydelig kortere enn lyofiliserte reaksjoner, som kan forbli stabile i år18. Avhengig av spesifisiteten til oligonukleotidsekvensene, kan det oppstå uspesifikk binding og forsterkning, som bør undersøkes nøye av forskerne. For eksempel rapporterer Costa og medarbeidere at glødetemperaturen til den gelifiserte qPCR for påvisning av C. cayetanensis måtte justeres i +1 °C for å unngå uspesifikke forsterkninger15,21. På samme måte bør forskere unngå å bruke enzymer som kan reguleres av eller bruke gelifiseringskomponentene som substrater.
Gelifiseringsteknikken er spesielt nyttig på grunn av brukervennligheten i laboratorierutinen, samt en innføring i en produksjonslinje16,19,22 som gir jevn kvalitetskontroll; Sistnevnte muliggjør i sin tur robuste og sammenlignbare data på tvers av flere operatører og eliminerer effektivt vanlige operatørfeil i viktige trinn, med en bonus for å eliminere frysetemperaturkrav under transport og lagring. Foreløpige studier tyder på at eliminering av kjølekjeden vil resultere i en samlet reduksjon av kostnadene med opptil 20% for en qPCR-test14. Eliminering av kjølekjeden gjør det også mulig å implementere qPCR som en bekreftende test for forsømte sykdommer som Chagas sykdom i underutviklede regioner, og dermed favorisere deres epidemiologiske kontroll23.
Endelig effektiviserer gelifiseringsprotokollen bruken av qPCR-tester, da den bare krever at brukeren tilsetter vann og det ekstraherte T. cruzi DNA, unngår feil under reagenshåndtering og reduserer oppsettstiden samt muligheten for reagensens forurensning. Slike egenskaper gir effektivitet for et rutinemessig diagnostisk laboratorium, fremskynder levering av resultater til pasienter og øker påliteligheten av diagnosen. Til slutt, fordi den dispenserer behovet for en -20 ° C kjølekjede, er den egnet for diagnostisk bruk i miljøer med lav ressurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å uttrykke sin takknemlighet til Aline Burda Farias for teknisk assistanse med vakuumovnen, samt til administrasjonen ved Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasil) for å gi tilgang til nevnte utstyr. Dette arbeidet ble delvis finansiert av tilskudd CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
