Summary
يصف هذا العمل خطوات إنتاج qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي T. cruzi الذي يمكن تحميله مسبقا على وعاء التفاعل وتخزينه في الثلاجة لعدة أشهر.
Abstract
يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) تقنية حساسة ودقيقة بشكل ملحوظ تسمح بتضخيم كميات دقيقة من أهداف الحمض النووي من العديد من العينات. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث وحقق التطبيق الصناعي في مجالات مثل التشخيص البشري واختيار السمات في محاصيل الكائنات المعدلة وراثيا (GMO). ومع ذلك ، فإن qPCR ليست تقنية مقاومة للخطأ. قد يؤدي خلط جميع الكواشف في مزيج رئيسي واحد يتم توزيعه لاحقا على 96 بئرا من لوحة qPCR العادية إلى أخطاء المشغل مثل الخلط غير الصحيح للكواشف أو التوزيع غير الدقيق في الآبار. هنا ، يتم تقديم تقنية تسمى الهلام ، حيث يتم استبدال معظم الماء الموجود في المزيج الرئيسي بالكواشف التي تشكل خليط سول جل عند تقديمه إلى فراغ. نتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كواشف qPCR بشكل فعال لبضعة أسابيع في درجة حرارة الغرفة أو بضعة أشهر عند 2-8 درجةمئوية. يتم عرض تفاصيل تحضير كل محلول هنا جنبا إلى جنب مع الجانب المتوقع من تفاعل هلامي مصمم للكشف عن الحمض النووي للأقمار الصناعية T. cruzi (satDNA). يمكن تطبيق إجراء مماثل للكشف عن الكائنات الحية الأخرى. يعد بدء تشغيل qPCR الهلامي أمرا بسيطا مثل إزالة اللوحة من الثلاجة ، وإضافة العينات إلى الآبار الخاصة بها ، وبدء التشغيل ، وبالتالي تقليل وقت إعداد تفاعل اللوحة الكاملة إلى الوقت المستغرق لتحميل العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج تفاعلات PCR الهلامية والتحكم فيها من أجل الجودة على دفعات ، مما يوفر الوقت وتجنب أخطاء المشغل الشائعة أثناء تشغيل تفاعلات PCR الروتينية.
Introduction
تم اكتشاف مرض شاغاس فيأوائل القرن العشرين في المناطق الريفية في البرازيل ، حيث كان الفقر منتشرا على نطاق واسع 1,2. وحتى اليوم، لا يزال المرض مرتبطا بالمحددات الاجتماعية والاقتصادية للصحة في الأمريكتين. مرض شاغاس ثنائي الطور ، ويتألف من مرحلة حادة ومزمنة. وهو ناتج عن العدوى بطفيلي المثقبية الكروزية ، الذي ينتقل عن طريق ناقلات الحشرات ، أو نقل الدم عبر الطريق الخلقي ، أو الابتلاع الفموي للأغذية الملوثة 3,4.
يمكن إجراء تشخيص مرض شاغاس من خلال ملاحظة الأعراض السريرية (خاصة علامة رومانا) ، والفحص المجهري لطاخة الدم ، والأمصال ، والاختبارات الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) أو التضخيم متساوي الحرارة4،5،6،7،8،9. تستخدم الأعراض السريرية والفحص المجهري لطاخة الدم في الحالات المشتبه في إصابتها بالعدوى الحادة ، بينما يستخدم البحث عن الأجسام المضادة كأداة فحص في المرضى الذين لا تظهر عليهم أعراض. نظرا لحساسيته وخصوصيته ، فقد تم اقتراح استخدام qPCR كأداة مراقبة للمرضى المزمنين ، للمرضى الحادين الذين يخضعون للعلاج لقياس حمل الطفيلي في الدم ، وكعلامة بديلة للفشل العلاجي6،8،10،11،12 . على الرغم من أنه أكثر حساسية وتحديدا من الاختبارات المتاحة حاليا ، إلا أن qPCR يمنع بشكل فعال من أن يعرف كأدوات تشخيصية في المناطق المحرومة في جميع أنحاء العالم بسبب متطلبات درجات الحرارة المتجمدة للنقل والتخزين13،14،15.
للتحايل على هذه العقبة ، تم استكشاف تقنيات الحفظ مثل التجفيد والهلام16,17. في حين أن التجفيد يوفر الحفظ لسنوات ، فإنه يتطلب كواشف مصنوعة خصيصا دون وجود الجلسرين ، والذي يستخدم عادة لتثبيت / حفظ الإنزيم18. بينما ثبت أن الهلام يوفر الحفظ لعدة أشهر ، فإنه يسمح باستخدام الكواشف العادية19. يتكون محلول الهلام من أربعة مكونات ، لكل منها أدوار محددة في العملية: السكريات trehalose و melezitose تحمي الجزيئات الحيوية أثناء عملية التجفيف عن طريق تقليل جزيئات الماء الحرة في المحلول ، ينتج الجليكوجين مصفوفة واقية أوسع ، ويستخدم ليسين الأحماض الأمينية ككاسح للجذور الحرة لمنع التفاعلات المؤكسدة بين كربوكسيل الجزيء الحيوي ، المجموعات الأمينية والفوسفات. تحدد هذه المكونات خليط سول جل يمنع فقدان البنية الثلاثية أو الرباعية أثناء عملية التجفيف ، مما يساعد على الحفاظ على نشاط الجزيئات الحيوية عند الإماهة19. بمجرد الاستقرار داخل أنابيب التفاعل ، يمكن تخزين التفاعلات لبضعة أشهر عند 2-8 درجة مئوية أو بضعة أسابيع عند 21-23 درجة مئوية بدلا من -20 درجة مئوية العادية. تم بالفعل دمج هذا النهج في الاختبارات المصممة للمساعدة في تشخيص أمراض مثل مرض شاغاس والملاريا وداء الليشمانيات والسل وداء السيكلوسبوريا13،14،15،20.
يصف هذا العمل جميع الخطوات لإعداد الحلول المطلوبة لإجراء الهلام ، والمزالق في العملية ، والجانب النهائي المتوقع من qPCR الهلامي الجاهز للاستخدام داخل شرائط ثمانية أنابيب. يمكن تكييف نفس البروتوكول مع الأنابيب المفردة أو ألواح 96 بئرا. أخيرا ، سيتم عرض اكتشاف الحمض النووي T. cruzi كتشغيل تحكم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير محاليل المخزون وخليط الهلام
ملاحظة: سيتم تحضير أربعة محاليل مخزون (400 ملغم/مل من ميليزيتوز، 400 ملغم/مل من تريهالوز، 0.75 ملغم/مل من اللايسين، و200 ملغم/مل من الجليكوجين) وخلطها وفقا للنسبة المبينة في الجدول 1 لإنتاج خليط الهلام. على الرغم من أن البروتوكول يصف 10 مل من إنتاج حلول المخزون ، إلا أنه يمكن تكييفه لأحجام أقل أو أعلى.
- حل ميليزيتوز
- قم بوزن 4 جم من melezitose في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه). - اصنع الحجم النهائي إلى 10 مل بالماء الخالي من النيوكلياز. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- قم بوزن 4 جم من melezitose في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
- حل تريهالوز
- قم بوزن 4 جم من التريهالوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه). - قم بتكوين الحجم إلى 10 مل بماء خال من النيوكلياز وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- قم بوزن 4 جم من التريهالوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
- محلول الجليكوجين
- قم بوزن 2 جم من الجليكوجين في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه). - حافظ على المحلول في حالة راحة عند 2-8 درجة مئوية لمدة 8-12 ساعة لأن إذابة الجليكوجين تنتج الكثير من الفقاعات (الشكل 1). اصنع الحجم إلى 10 مل بالماء الخالي من النيوكلياز. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- قم بوزن 2 جم من الجليكوجين في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
- حل ليسين
- تزن 7.5 ملغ من ليسين في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، أضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. دوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يتم إذابة المسحوق.
ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه). - قم بتكوين الحجم إلى 10 مل بماء خال من النيوكلياز وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. انقل المحلول إلى قارورة كهرمانية أو قم بحمايته من الضوء. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- تزن 7.5 ملغ من ليسين في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، أضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. دوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يتم إذابة المسحوق.
- خليط الهلام (GM)
- في أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل ، امزج أحجام محاليل المخزون وفقا للجدول 1.
- امزج الكواشف بعشرة انعكاسات من طرف إلى طرف للأنبوب.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لخطوة ترشيح إذا تم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء أمان التدفق الرقائقي. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة في بيئة نظيفة ، فقم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر قبل نقله إلى قارورة كهرمانية. - انقل المحلول إلى قارورة كهرمانية أو قم بحمايته من الضوء. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
ملاحظة: كخطوة لمراقبة الجودة لإعداد خليط الهلام ، تأكد من أن قيم الأس الهيدروجيني والتوصيل والكثافة المقاسة ضمن النطاقات التالية: الرقم الهيدروجيني 5.55-6.66 ؛ الموصلية 0.630-0.757 مللي ثانية / سم ؛ والكثافة 1.08-1.11 جم / سم3. يجب أن تؤخذ جميع القياسات عند 25 درجة مئوية.
2. تحضير مزيج qPCR الرئيسي للهلام
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم تحضير مزيج qPCR الرئيسي للهلام. وبالتالي ، لا يضاف الماء إلى المزيج ولكن بدلا من ذلك ، يضاف خليط الهلام (الجدول 2).
- قم بإذابة الكواشف في حاوية مبردة. امزج الكواشف في أنبوب سعة 1.5 مل وفقا للجدول 2. يوضح هنا مثال على تفاعل حجمه النهائي 25 μL يحتوي على 5 μL من عينة الحمض النووي (DNA).
ملاحظة: لا تضاف عينة الحمض النووي إلى الخليط في هذه الخطوة. يتم استخدامه هنا فقط لحساب الأحجام النهائية لكل كاشف من مزيج qPCR الرئيسي. يجب إضافة عينات الحمض النووي مباشرة قبل بدء التشغيل (انظر الخطوة 4 أدناه).
3. هلام الكواشف على أوعية التفاعل
- اضرب بشكل مناسب الأحجام الموضحة في الجدول 2 لإعداد شريط من ثمانية أنابيب أو لوحة 96 بئر.
- ماصة 18.5 ميكرولتر من مزيج الهلام الرئيسي الموضح في الجدول 2 على كل بئر تفاعل.
ملاحظة: يمثل هذا الحجم أحجام مزيج قليل النوكليوتيد ، ومخزن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وخليط الهلام المستخدم في تفاعل واحد (وفقا للجدول 2) وسيختلف اعتمادا على تركيز الكواشف والحجم اللازم لتفاعل واحد. يختلف الحجم النهائي في المزيج الرئيسي للهلام عن الحجم الموجود في المزيج الرئيسي العادي لأنه لا يتم إضافة الماء. - ضع الأنابيب / اللوحة في الدعامة الموصلة للحرارة (مثل الألومنيوم) داخل فرن التفريغ.
ملاحظة: الدعم الموصل للحرارة اختياري. يجب على المشغل التأكد من أن الجزء السفلي من الأنابيب ملامس لرف الفرن المفرغ للسماح بالتوازن الحراري السريع. - ضع كيسا واحدا من طين البنتونيت لكل طبقين من 96 بئرا.
ملاحظة: تستخدم أكياس طين البنتونيت لامتصاص الماء الذي تمت إزالته من مزيج الهلام الرئيسي عن طريق الضغط التفاضلي الذي يمارسه الفراغ. تم العثور على أكياس الطين البنتونيت لتكون غير ضرورية لأقل من اثنين من لوحات 96 بئر. - إخضاع الأنابيب / اللوحة التي تحتوي على مزيج الهلام الرئيسي لثلاث دورات مفرغة (30 ± 5 مللي بار) مدة كل منها 30 دقيقة ، بالتناوب مع إطلاق الفراغ حتى يتم تحقيق الضغط الجوي (900-930 مللي بار) ، تحت درجة حرارة مضبوطة (30 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) (الشكل 2).
ملاحظة: تستخدم الأداة برنامجا للتحكم في المعلمات ، ويظهر مثال للدورة في الشكل 2. يجب على المستخدم إنشاء ملف تعريف للتشغيل ، مع الإشارة إلى المعلمات المختارة. - عند اكتمال الدورة ، تحقق من الأنابيب / الألواح بحثا عن الهلام المناسب للكواشف من خلال التأكد من تقليل الحجم بشكل واضح (الشكل 3) وأن السوائل لا تتحرك عند النقر على الأنابيب / الألواح بالأصابع.
ملاحظة: إذا لم يحدث الهلام ، فسوف يتناثر المحلول على جدران الأنبوب عند النقر على الأنابيب (الشكل 3). - أغلق وخزن الأنابيب / الألواح في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة 8-12 ساعة قبل الاستخدام.
4. استخدام qPCR هلامي
- أخرج شريط الأنبوب أو اللوحة من الثلاجة وافتحه في محطة عمل لمعالجة العينات. أضف 15 μL من الماء الخالي من النيوكلياز إلى كل وعاء تفاعل.
ملاحظة: يعتبر حجم الكواشف الهلامية حوالي 5 ميكرولتر. إذن، مع حجم عينة الحمض النووي (انظر أدناه)، حجم التفاعل النهائي هو 25 ميكرولتر. - أضف 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي.
ملاحظة: يمكن استخدام أي قالب DNA بجودة qPCR. في العمل الحالي ، تم استخراج الحمض النووي من 108T. cruzi epimastigotes (سلالة Dm28c) وتم تخفيفه بشكل متسلسل بنسبة 1:10 باستخدام محلول TE. - أغلق الأنابيب / الألواح وانتقل إلى المعدات التي تختارها. قم بتشغيل التجربة وانتقل إلى تحليل البيانات المنتظم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ثلاثة من الكواشف التي تشكل خليط الهلام يمكن إذابتها بسهولة عند الدوامة القوية. ومع ذلك ، يتطلب الجليكوجين دوامة دقيقة لضمان ذوبان المسحوق تماما. لسوء الحظ ، تنتج الدوامة القوية الكثير من الفقاعات ، مما يجعل من الصعب تحديد الحجم الفعلي للمحلول (الشكل 1A-B). لذلك ، من الضروري ترك محلول الجليكوجين في الثلاجة حتى ينتقل معظم المحلول المحبوس داخل الفقاعات إلى جسم المحلول الرئيسي. بالنظر إلى بروتوكولات الإنتاج وروتين المختبر ، يتم الاحتفاظ بالأطباق الهلامية في الثلاجة طوال الليل (أو حوالي 8-12 ساعة) ، مما يؤدي إلى تسوية معظم الفقاعات ، مما يسهل تحديد الحجم الصحيح والتكيف مع الحجم النهائي المطلوب (الشكل 1 ج). لاحظ الفرق في حجم الفقاعات بين أنابيب الجليكوجين في الأشكال 1B-C ، على التوالي ، مباشرة بعد الذوبان وبعد الاستقرار طوال الليل.
بمجرد إضافة خليط الهلام إلى مزيج qPCR الرئيسي بدلا من الماء (الجدول 2) ، تكون شرائط أو ألواح الأنبوب جاهزة للذهاب إلى فرن التفريغ. تحتوي أرفف فرن التفريغ على عنصر تسخين بلتيير ، مما يضمن بقاء أي أنابيب ملامسة له في نفس درجة الحرارة. في البروتوكول الحالي ، تظل درجة الحرارة داخل الغرفة ثابتة عند 30 درجة مئوية ، بينما يتراوح الضغط بين 910-930 ملي بار (الضغط الجوي) و 30 مللي بار (شبه فراغ). يوضح الشكل 2 هذين المتغيرين المرسومين بمرور الوقت ، ويظهران درجة الحرارة الثابتة (الخط الأخضر ، اللوحة العلوية) وتغير الضغط (الخط الأحمر ، اللوحة السفلية). بعد الانتهاء من الدورات ، يتناقص حجم المزيج الرئيسي داخل البئر ويصبح هلاميا في القاع ، أي دون تحريك أو تناثر عند النقر على الأنابيب بالأصابع (الشكل 3). يمكن الآن تغطية الأنابيب وتخزينها عند 2-8 درجة مئوية. ستفشل التفاعلات في الهلام إذا تم تحضير خليط الهلام (الجدول 1) بشكل غير صحيح ؛ يجب أن ترى خطوة مراقبة الجودة المقترحة الخطأ قبل خلط خليط الهلام مع كواشف qPCR.
لاستخدامها ، يجب إعادة تعليق الكواشف الهلامية داخل الأنابيب / الألواح في ماء خال من النيوكلياز وعينة الحمض النووي المخففة عادة في الماء أو المخزن المؤقت TE. يتم تحقيق إعادة تعليق كواشف خليط سول جل خلال الخطوة الأولى من تمسخ البروتوكول الحراري qPCR (عادة ، 5-10 دقائق عند 95 درجة مئوية) ، لذلك لا يلزم اتخاذ خطوة إضافية. يوضح الشكل 4A آثارا تمثيلية للكشف عن qPCR للحمض النووي T. cruzi باستخدام تسلسلات قليلة النوكليوتيد المنشورة15. تشمل النتائج دون المستوى الأمثل فقدان الحساسية ، والتي يمكن اختبارها بمنحنى تخفيف لمحلول بتركيز معروف للأهداف الجينومية وفقدان النوعية ، والتي يمكن اختبارها باستخدام مجموعة من الكائنات الحية المثقبوبة ذات الصلة. يوضح الشكل 4B فقدان الحساسية الذي قد ينشأ عندما لا يتم تنفيذ عملية الهلام بشكل صحيح أو عندما يفقد التفاعل ثباته بعد تخزينه في 2-8 درجة مئوية لأكثر من 6 أشهر.
الشكل 1: إذابة الجليكوجين تنتج الكثير من الفقاعات. ونظرا لأن الجليكوجين ينتج الكثير من الفقاعات أثناء الذوبان، يجب إبقاء محلول الجليكوجين في حالة سكون قبل التكيف مع الحجم النهائي. أ: تكون الفقاعات أثناء الدوامة. (ب) ذوب المسحوق بالكامل، لكن لا يمكن تحديد الحجم النهائي بسبب الفقاعات الزائدة. (ج) بعد 12 ساعة في الثلاجة (الأنبوب في المنتصف) ، يقل حجم الفقاعات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: ركوب الدراجات الفراغية (اللوحة السفلية) والتحكم في درجة الحرارة (اللوحة العلوية). يتم عرض آثار تمثيلية لدرجة الحرارة (اللوحة العلوية) وتغير الضغط (اللوحة السفلية). تمثل الخطوط السوداء الاختلافات المبرمجة ، بينما تمثل الخطوط الخضراء والحمراء القراءات الفعلية للأداة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: جوانب المزيج الرئيسي الهلامي داخل شريط مكون من ثمانية أنابيب . (أ) يمزج qPCR الرئيسي قبل التعرض للفراغ. (ب) تناثر السائل على جدران الأنبوب بسبب الهلام غير المكتمل (دورة فراغ واحدة فقط). (ج) كواشف qPCR الهلامية مع انخفاض واضح في الحجم. لا يتناثر السائل على الجدران عند النقر على الأنابيب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: آثار تمثيلية للخلطات الرئيسية الهلامية التي تكتشف الحمض النووي من T. cruzi epimastigotes. تم تخفيف الحمض النووي المستخرج من T. cruzi epimastigotes (108 خلايا) بشكل متسلسل بنسبة 1:10 ، وتم إخضاع تركيزات الحمض النووي التي تتراوح بين 104 و 100 خلية للكشف باستخدام qPCR هلامي. (أ) النتيجة المتوقعة ل qPCR الهلامي بشكل صحيح (ب) الكشف عن نفس العينات باستخدام لوحة حيث لم يتم تنفيذ الهلام بشكل صحيح ، مما أدى إلى فقدان الحساسية. لاحظ أن التركيزات المنخفضة يتم اكتشافها بشكل أقل تكرارا في اللوحة B. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| حل | تركيز المخزون | حجم |
| ميليزيتوز | 400 ملغم / مل | 3 مل |
| تريهلوز | 400 ملغم / مل | 6 مل |
| ليسين | 0.75 مجم / مل | 3 مل |
| الجليكوجين | 200 ملغم / مل | 3 مل |
| مياه خالية من النيوكلياز | غير متوفر | q.s.p. 20 مل |
الجدول 1: تركيزات المخزون وأحجام المحاليل المستخدمة لإنتاج 20 مل من خليط الهلام. يجب تعديل حجم كل محلول مخزون بشكل متناسب لإنتاج أحجام نهائية أقل أو أعلى من خليط الهلام.
| كاشف مزيج التفاعل | ماستر ميكس العادية | ماستر ميكس الهلام |
| أوليغوميكس (25X) | 1 ميكرولتر | 1 ميكرولتر |
| مخزن PCR (2X) | 12.5 ميكرولتر | 12.5 ميكرولتر |
| خليط الهلام* | - | 5 ميكرولتر |
| مياه خالية من النيوكلياز | 6.5 ميكرولتر | - |
| عينة الحمض النووي* | 5 ميكرولتر | 5 ميكرولتر |
| * بحد أقصى 20٪ من حجم التفاعل النهائي | ||
الجدول 2: أحجام الكواشف لإنتاج خلطات qPCR الرئيسية للتفاعلات العادية أو الهلامية. الفرق بين الخلطين الرئيسيين هو أن الماء يضاف إلى المزيج الرئيسي العادي بينما يضاف خليط الهلام (أي بدلا من الماء) إلى المزيج الرئيسي للهلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أبرزت السنوات الأخيرة الحاجة إلى إيجاد تكنولوجيات أكثر حساسية وتحديدا للمساعدة في تشخيص الأمراض المدارية والمهملة. على الرغم من أهمية الاختبارات الطفيلية (المجهر الضوئي) والاختبارات المصلية للمكافحة الوبائية ، إلا أن لها قيودا ، خاصة فيما يتعلق بالحساسية وقابلية التطبيق في نقطة الرعاية. لطالما استخدمت تقنيات تضخيم الحمض النووي مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل والتضخيم متساوي الحرارة والاختلافات ذات الصلة في البيئات المختبرية ، لكن العقبات التكنولوجية تحول دون استخدامها في البيئات الميدانية. واحدة من العقبات الرئيسية هي الحاجة إلى درجات حرارة -20 درجة مئوية لنقل وتخزين الكواشف. لعلاج هذا الموقف ، تم استخدام تقنيات مثل التجفيد والهلام لتخزين تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل خارج الفريزر16،18،19.
يوضح العمل الحالي جميع الخطوات اللازمة لتحفيز تفاعل qPCR للكشف عن الحمض النووي ل T. cruzi داخل وعاء التفاعل ، سواء كان أنابيب أو شرائط أنبوبية أو رقائق موائع دقيقة أو ألواح. تشير الدراسات الأولية التي تستخدم تفاعل RT-LAMP إلى أنه يمكن أيضا استخدام تقنية الهلام للحفاظ على إنزيمات تضخيم وتعديل الحمض النووي الأخرى وحمايتها ، كما وصفها Rosado et al. 19. على الرغم من أن الخطوتين اللتان تسببان معظم أخطاء المشغل في إجراءات qPCR هما (أ) تحضير محاليل الجليكوجين والميليزيتوز و (ب) حساب حجم مزيج التفاعل الذي سيتم إضافته إلى كل أنبوب تفاعل قبل خطوة التفريغ. أولا ، يجب تبريد محلول الجليكوجين طوال الليل قبل تعديل الحجم النهائي ، ويجب أن يكون محلول الميليزيتوز دوامة قوية (ربما مع تسخين معتدل عند 50 درجة مئوية) للذوبان الكامل. ثانيا ، يجب أن يدرك الباحث الذي يخطط للتجربة أن أحجام الكواشف المحسوبة قبل الفراغ قد تكون غير متساوية حيث لا يتم إضافة الماء لتقريب حجم التفاعل. سيتم الحصول على حجم التفاعل الفعلي عندما يتم إعادة إذابة التفاعل الهلامي عن طريق إضافة العينة والماء ، قبل تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
أكبر قيود الطريقة هو استقرار التفاعلات ، والتي هي حوالي 6-8 أشهر عند 2-8 °C14,15 ؛ إنه أقصر بكثير من التفاعلات المجففة بالتجميد ، والتي قد تظل مستقرة لسنوات18. اعتمادا على خصوصية تسلسل قليل النوكليوتيد ، قد يحدث ارتباط وتضخيم غير محددين ، والذي يجب فحصه بعناية من قبل الباحثين. على سبيل المثال ، أفاد كوستا والمتعاونون أنه يجب تعديل درجة حرارة التلدين ل qPCR الهلامي للكشف عن C. cayetanensis في +1 °C لتجنب التضخيم غير المحدد15,21. وبالمثل ، يجب على الباحثين تجنب استخدام الإنزيمات التي قد يتم تنظيمها أو استخدام مكونات الهلام كركائز.
تقنية الهلام مفيدة بشكل خاص بسبب سهولة استخدامها في روتين المختبر بالإضافة إلى إدخالها في خط الإنتاج16،19،22 مما يسمح بمراقبة الجودة بسلاسة ؛ وهذا الأخير بدوره يتيح بيانات قوية وقابلة للمقارنة عبر العديد من المشغلين ويزيل بشكل فعال أخطاء المشغل الشائعة في الخطوات الحاسمة، مع مكافأة تتمثل في التخلص من متطلبات درجة حرارة التجمد أثناء النقل والتخزين. تشير الدراسات الأولية إلى أن التخلص من سلسلة التبريد سيؤدي إلى انخفاض إجمالي في التكلفة بنسبة تصل إلى 20٪ لاختبار qPCR14. كما أن القضاء على سلسلة التبريد يجعل من الممكن تنفيذ qPCR كاختبار تأكيدي للأمراض المهملة مثل مرض شاغاس في المناطق المتخلفة ، وبالتالي تفضيل مكافحتها الوبائية23.
أخيرا ، يبسط بروتوكول الهلام استخدام اختبارات qPCR لأنه يتطلب فقط من المستخدم إضافة الماء والحمض النووي T. cruzi المستخرج ، وتجنب الأخطاء أثناء التعامل مع الكاشف ، وتقليل وقت الإعداد وكذلك إمكانية تلوث الكاشف. توفر هذه الخصائص الكفاءة لمختبر التشخيص الروتيني ، مما يسرع تسليم النتائج للمرضى ويزيد من موثوقية التشخيص. أخيرا ، نظرا لأنه يستغني عن الحاجة إلى سلسلة تبريد -20 درجة مئوية ، فهو مناسب للاستخدام التشخيصي في البيئات منخفضة الموارد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يعربوا عن امتنانهم لألين بوردا فارياس للمساعدة التقنية في فرن التفريغ ، وكذلك للإدارة في معهد البيولوجيا الجزيئية في بارانا (IBMP ، كوريتيبا ، البرازيل) للسماح بالوصول إلى المعدات المذكورة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منحة CNPq 445954 / 2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
