Summary
이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.
Abstract
유선의 분지 구조는 매우 역동적이며 출생 후 성장과 리모델링의 여러 단계를 거칩니다. 피부 플랩 수술 또는 이미징 창문의 이식과 함께 생체 내 현미경 검사는 다양한 발달 단계에서 건강한 유선의 역학을 연구하는 데 사용되었습니다. 대부분의 유방 영상 기술은 수시간에서 며칠의 기간으로 제한되는 반면, 유선 리모델링 과정의 대부분은 며칠에서 몇 주까지의 시간 프레임으로 발생합니다. 유선의 리모델링을 연구하기 위해서는 연장된 기간 동안 관심 조직에 광학적으로 접근할 수 있는 방법이 필요하다. 여기에서, 교체 가능한 뚜껑(R.MIW)을 갖는 티타늄 유방 이미징 윈도우의 개선된 버전이 최대 몇 주 동안 세포 해상도로 유선의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 것에 대해 설명한다. 중요하게도, R.MIW는 생체내 영상화 실험의 전체 기간에 걸쳐 조직 접근을 제공하며, 따라서 국소 조직 조작, 표지, 약물 투여 또는 이미지 유도 미세 해부에 사용될 수 있다. 종합하면, R.MIW는 유선 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 가능하게합니다.
Introduction
유방 상피는 포유류에 존재하는 독특한 분비 기관으로, 자손에게 영양을 공급하기 위해 우유를 생산하고 분비합니다. 평생 동안, 유선은 조직의 구조적 및 기능적 변화를 동반하는 여러 차례의 발달과 성장을 겪습니다1. 발달 단계에 따라 조직 리모델링에 기여하는 세포 유형은 덕트 트리 내의 위치뿐만 아니라 다릅니다.
다중 광자 내 생명 현미경 (IVM)은 네이티브 및 최소 교란 설정 2,3,4에서 생체 내에서 유방 세포 역학의 연구를 허용합니다. 유선에 대한 시각적 접근을 얻기 위해, 사춘 기 4,5,6,7, 성인기 2,8, 수유9,10,11,12 및 종양 역학 13,14를 포함하여 유선 발달의 여러 단계에서 몇 가지 일시적인 생체 외 또는 피부 플랩 이미징 기술이 발표되었습니다. ,15. 이러한 기술은 유방 세포 역학의 공간적 및 시간적으로 해결 된 높은 이미징을 초래하지만, 대부분의 유선의 리모델링 과정은 며칠에서 몇 주가 걸리는 반면, 시간 프레임은 시간으로 제한됩니다. 따라서, 연장된 시간 프레임 동안 관심 조직에 대한 광학적 접근을 허용하는 방법이 요구된다. 수년에 걸쳐, 티타늄 유방 영상 창 (MIW)2,3,19를 포함하여 유방 종양 이미징 15,16,17,18을 위해 몇 가지 영구 이미징 창이 개발되었습니다. 유방 종양 성장을 연구하는 데 매우 유용하지만, 건강한 유선 구조의 시각화는 며칠로 제한되었습니다. 최근에는 유연한 실리콘 이미징 창이 개발되어20 주 동안 사춘기 유선을 시각화 할 수 있습니다. 그러나 유선은 지방세포가 풍부한 지방 패드에 매립되어 광범위한 광산란을 일으키고 결과적으로 유방 덕트 구조의 가시성을 제한합니다. 따라서 유선에서 장기간에 걸친 조직 역학을 시각화하기 위해서는 항상 우수한 이미징 조건이 필요합니다. 고전적인 MIW나 유연한 실리콘 창은 수술 및 이식 후 창이 닫힌 시스템을 형성하기 때문에 이미징 전에 조직 조작 또는 물리적 조직 위치 최적화를 허용하지 않습니다. 결과적으로, 근본적인 유방 조직에 대한 최적의 광학 접근은 더 긴 기간에 걸쳐 배제 될 가능성이 큽니다. 대조적으로, 피부 플랩 기술은 이미징 세션 동안 조직의 최적화 및 재배치를 허용하고, 피부 플랩은2회 여러 번 반복될 수 있다. 그러나 피부 플랩을 통한 반복적 인 이미징 세션은 피부의 회복을 허용하기 위해 수술 사이에 충분한 시간 (최소 7 일)이 할당 될 때만 가능하므로 더 긴 시간 척도에서 프로세스를 연구하는 데 주로 적합합니다. 또한, 침습적 인 성격과 상처 폐쇄시 감염 및 흉터의 위험이 크기 때문에이 절차를 여러 번 수행하지 않는 것이 좋습니다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 즉 고주파에서 장기간 동안 최적의 이미징 조건을 보장함과 동시에 조직 조작을 허용하기 위해, 교체 가능한 뚜껑(R.MIW)을 갖는 MIW의 개선된 티타늄 버전은 2주까지 여러 날에서2 주에 걸쳐 건강하고 병든 유선을 시각화하도록 설계되었다(도 1A, B). R.MIW는 IVM 실험의 전체 기간 동안 직접 조직 조작을 가능하게하는 최적의 조직 접근을 제공하도록 맞춤 설계되었으므로 장기간에 걸쳐 적절한 시간과 장소에서 유선의 시각화를 허용합니다. R.MIW가 닫히면 기존 MIW에 필적하는 밀폐 시스템을 형성합니다(그림 1C). 무균 조건 하에서 개방될 때, R.MIW는 국소 조직 조작을 허용하여 광학 접근을 개선하고, 또한 경로 억제제 또는 작용제와 같은 물질의 국소 투여, 암 세포 또는 면역 세포 집단과 같은 관심있는 다른 세포 유형의 주입 또는 조직 표지 염료의 첨가를 가능하게 한다. 뚜껑은 이미징 세션 사이에 언제든지 열 수 있으며 기본 조직에 손상을 입히지 않습니다.
그림 1: 교체 가능한 뚜껑이 있는 유방 이미징 창 디자인. (A) 링에 접착된 10mm 커버글래스가 있는 유방 이미징 창의 교체 가능한 뚜껑의 상단도 및 측면도. (b) 지갑 끈 봉합사를 사용하여 마우스의 피부 내에 창을 고정시키기 위해 외부 링과 그 사이에 홈이있는 내부 링으로 구성된 유방 이미징 창의 상면도 및 측면도. 외부 링에는 뚜껑의 네 개의 돌기 (팔)에 맞는 작은 홈이 있습니다. (C) 뚜껑의 개폐 메커니즘을 보여주는 만화 및 그림. 기울어진 돌출부는 뚜껑이 창틀 내부에 고정되어 있는지 확인합니다. 이 그림은 Messal et al. 2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 R.MIW의 설계 및 이식 절차뿐만 아니라 세포 해상도에서 동일한 유방 덕트 및 시각화를 다시 방문하기위한 종단 IVM 전략을 설명합니다. R.MIW는 다양한 형광 리포터 마우스 모델에서 유선의 다양한 발달 단계에서 세포 분열 및 형태 학적 변화를 따라갈 수 있습니다. 종합하면, R.MIW는 유선의 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 용이하게합니다.
Protocol
이 논문에 설명 된 모든 절차는 IACUC 및 KU Leuven의 지침에 따라 수행되었으며 승인 된 프로젝트 응용 프로그램 P160 / 2020의 맥락에서 수행되었습니다. 이 프로토콜을 실행하기 전에 기관 수의사와 함께 진통 전략을 검토하고 기관 지침에 따라 수술 전후 진통제를 관리하십시오.
1. R.MIW의 제조 (추정 타이밍 : 2 시간)
참고 : R.MIW 건설을 위해서는 특별한 도구와 전문 지식이 필요하므로 티타늄과 같은 단단한 재료로 작업하는 것을 전문으로하는 현지 제조업체를 찾는 것이 좋습니다. 티타늄 보철물의 설계 및 제조를 전문으로하는 워크샵은 일반적으로 R.MIW 부품을 생산하기위한 기계와 전문 지식을 갖추고 있습니다.
- R.MIW의 뚜껑을 뚜껑의 바깥쪽이 위쪽을 향하도록 멸균 된 표면에 놓습니다 (그리고 뚜껑의 팔은 아래쪽으로 기울어 져 있습니다. 그림 1A).
- 시아 노 아크릴레이트 접착제 접착제를 뚜껑의 전체 테두리 주위에 적용하고 뚜껑 위에 조심스럽게 10mm 둥근 유리 커버 슬립을 놓습니다.
주: 수술 중 항상 유리 커버슬립을 백업으로 사용하여 여분의 뚜껑을 준비하십시오. - 멸균 된 나무 스틱을 사용하여 유리 커버 슬립을 배치하고 아래로 밀어 내려 유리 커버 슬립과 뚜껑의 프레임 사이에 밀폐 된 씰을 보장합니다. 뚜껑의 팔에있는 구멍이 유리로 덮여 있지 않은지 확인하십시오.
- 뚜껑과 R.MIW를 닫힌 페트리 접시에 적어도 30분 동안 80% 에탄올에 담그고 소독한다.
참고: 시아노아크릴레이트 접착제가 용해되지 않도록 뚜껑을 80% 에탄올에 1시간 이상 두지 마십시오. - 아세톤에 담근 면 팁을 사용하여 유리 커버슬립으로부터 과량의 시아노아크릴레이트 접착제를 제거한다.
- 뚜껑과 R.MIW는 추가로 사용할 때까지 멸균 환경에 보관하십시오.
참고: R.MIW 프레임과 뚜껑은 멸균 튜브 또는 가방에 최대 1주 동안 보관할 수 있습니다. 실험을 재개 할 때 프로토콜을 진행하기 전에 유리 커버 슬립이 뚜껑에 여전히 제대로 부착되어 있는지 항상 검사하십시오.
2. 수술 준비 (예상 시간 : 15 분)
참고: R.MIW 이식 절차의 경우, 모든 균주의 암컷 마우스(>3.5주령)를 사용할 수 있습니다.
- 멸균 장갑을 사용하여 멸균을 유지하고 마우스와 접촉 할 모든 항목을 멸균하십시오. 수술 도구를 물과 순한 비누로 세척하고, 공기 건조시키고, 노출된 모서리 또는 모서리가 없는 알루미늄 호일로 감싸고, 수술 전에 120°C에서 20분 동안 오토클레이브를 사용하여 멸균한다.
- 멸균 수술 플랫폼을 준비하고 80 % 에탄올로 표면을 살균하십시오.
참고 : 불임을 보장하기 위해 수술은 흐름 캐비닛에서 수행 할 수 있습니다. - 가열 패드를 켜고 매트를 멸균 커튼으로 덮으십시오. 멸균 드라페 위에 멸균 기구를 배치하고 R.MIW 및 최소 두 개의 유리로 덮인 뚜껑을 페트리 접시의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 놓습니다(외부 오염을 피하기 위해 뚜껑을 닫으십시오).
- 3% 이소플루란/O2 혼합물을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취시킨다. 동물이 쉽게 조작되고 투쟁없이 코 마스크로 옮겨 질 수있을만큼 충분히 편안하게하십시오.
- 마우스를 유도 챔버에서 마취 코 마스크로 옮기고 이소플루란 수준을 1.5% - 2% 이소플루란/O2 혼합물로 감소시킨다. 발 금단 검사를 수행하여 완전한 마취를 확인하십시오.
- 발 금단 테스트를 수행하려면 손톱이나 무딘 끝 포셉을 사용하여 동물의 발을 단단히 꼬집습니다. 근육 반사가없는 경우, 동물을 무의식으로 간주하고 외과 적 준비를 진행하십시오. 동물 조작 전에이 검사를 수행하고 마취를 확인하기 위해 마취 및 외과 적 절차 중에 정기적으로 반복하십시오.
- 각막 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
- 면도날을 사용하여 4번째 유선(유선) 주변 영역을 면도합니다(그림 2A). 4번째 젖꼭지를 랜드 마크로 사용하십시오. 끈적 끈적한 테이프를 사용하여 느슨한 머리카락을 제거하십시오.
참고 : 또는 탈모 크림을 사용하여 머리카락을 제거 할 수 있습니다. - 노출 된 피부를 80 % 에탄올 또는 포비돈 요오드로 소독하고 주둥이로 뒤쪽의 멸균 수술 부위에 마우스를 1.5 % 이소플루란 /O2 혼합물을 사용하여 마취 코 마스크에 넣으십시오.
- 종이 테이프를 사용하여 마우스의 앞다리와 뒷다리를 고정하십시오.
참고 : 마취 및 회복 마우스를 가능한 한 가열 패드에 두고, 수술 중 및 수술 후에 두십시오. - 미리 절단된 멸균 수술 드레이프 또는 거즈를 사용하여 수술 영역을 노출시키면서 마우스를 덮으십시오.
3. R.MIW 이식 (예상 타이밍 : 30 분)
- 발 금단 검사를 수행하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 미세한 Graefe 포셉을 사용하여 피부를 부드럽게 들어 올리고 4번째 젖꼭지를 방향점으로 사용하여 4번째 유방 지방 패드 위에 있는 피부에 작은 스프링 가위를 사용하여 10-15mm 대각선 절개를 만듭니다(그림 2A). 복막이나 유선을 자르거나 손상시키지 않도록하십시오.
- 림프절 또는 종양 병변의 위치를 포함하는 유방 조직의 거시적 특징에 기초하여 관심 영역(ROI)을 정의하고, 절개와 관련하여 ROI를 중앙으로 유지하려고 노력한다.
- 절개 라인 주위에 최대 5-8mm의 무딘 해부를 사용하여 유방 지방 패드와 하부 조직층에서 피부를 분리하여 R.MIW 프레임에 맞는 포켓을 만듭니다 (그림 2BI).
- 멸균 포셉을 사용하여 R.MIW를 집어 들고 절개가 창을 삽입하기에 충분히 큰지 테스트하십시오. 필요한 경우 R.MIW가 들어갈 때까지 절개를 약간 확대하십시오.
- R.MIW를 제거하고 5-0 실크 봉합사 (꼰 것, 재 흡수 불가능)를 사용하여 절개 주위에 지갑 끈 봉합사를 놓습니다. 절개의 꼬리 끝에서 시작하여 외부에서 피부 안쪽으로 절개 가장자리에서 1-2mm 봉합사를 놓습니다.
- 절개를 따라 약 5mm 위로 움직이고 봉합사 실을 안쪽에서 외부로 피부를 통과시킵니다. 절개 가장자리를 따라 이 절차를 반복하여 5-6개의 루프로 구성된 원형 봉합사를 만듭니다(그림 2BII). 봉합사 실의 최종 출구는 첫 번째 입구에서 약 2-5mm 떨어진 곳에 위치해야합니다.
참고: 봉합사를 절개 가장자리에 너무 가깝게 놓으면 피부 찢어질 위험이 높아지지 않도록 주의하십시오. 봉합사를 절개 가장자리에서 너무 멀리 놓으면 과도한 피부와 R.MIW의 홈 사이에 감염 될 위험이 높아집니다. - 절개 안에 R.MIW를 끼우고 Graefe 포셉을 사용하여 조심스럽게 R.MIW의 홈에 피부를 놓습니다. 봉합사의 루프를 바깥에 두십시오.
- 지갑 끈 봉합사의 루프를 당기고 봉합사의 양쪽 끝을 부드럽게 잡아당겨 R.MIW의 홈에 있는 봉합사를 조입니다(그림 2BIII). 외과 용 매듭으로 묶고 과도한 실을 잘라냅니다.
- 이쑤시개를 사용하여 R.MIW의 내부 테두리에 석유 젤리를 바르고 기본 조직을 피하십시오. 멸균된 포셉 또는 두 손가락 끝으로 창 프레임을 아래쪽으로 부드럽게 밀고 뚜껑을 R.MIW 프레임에 놓습니다(그림 1B). 이렇게하면 유선과 R.MIW 뚜껑 사이에 공기가 많이 들어가는 것을 피할 수 있습니다.
- 얇은 포셉 끝을 뚜껑 팔의 구멍을 통해 놓고 뚜껑을 시계 방향(약 5°)으로 돌려 뚜껑을 조입니다(그림 1C 및 그림 2BIV).
- R.MIW 뚜껑을 조인 후에도 일부 공기가 남아 있으면 멸균 인슐린 바늘을 사용하여 과도한 공기를 제거하십시오. 바늘을 피부를 통해 유방 조직과 뚜껑 사이의 구멍에 넣고 천천히 플런저를 꺼내어 유선 조직과 R.MIW 뚜껑 사이에 진공을 만듭니다.
- 피하 주사로 부프레노르핀 (멸균 0.9 % NaCl로 희석 된 0.1 mg / kg)과 같은 진통제, 수술 후 진통제를 투여하십시오. 수술 후 8 h 및 16 h에서 buprenorphine으로 피하 주사를 반복하십시오.
- 마우스를 케이지에 다시 넣어 완전히 깨어날 때까지 회복하고 면밀히 모니터링하거나 즉각적인 이미징을 위해 4 단계를 진행하십시오.
- 이 수술 후 단계에서 호흡, 반응성, 행동, 자세 및 체중과 같은 중요한 매개 변수를 기반으로 불편 함이나 합병증의 징후가 있는지 마우스를 면밀히 모니터링하십시오. 창문 주위의 피부를 조심스럽게 모니터링하여 염증과 괴사의 징후가 있는지 확인하십시오. 합병증이 발생하지 않으면 R.MIW는 이식 후 몇 주에 걸쳐 반복적 인 IVM 세션을 허용합니다.
그림 2: 수술 절차 및 창 이식에 대한 개요 . (A) 암컷 마우스의 4번째 젖꼭지 근처에서 대각선 절개가 이루어지며 무딘 해부로 피부와 기저 조직이 분리됩니다. (b) 지방 패드의 사타구니 림프절 및 모양은 조직 (I)의 올바른 배향을 위해 사용될 수 있다. 지갑 끈 봉합사는 절개 (II) 주위의 피부에 배치되고, 창틀에 끼워 넣은 후, 봉합사를 홈에 조여서 창틀을 고정하고 수술 매듭 (III)에 의해 고정시킨다. 마지막 단계는 뚜껑을 창 프레임 (IV)에 삽입하고 잠그는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. R.MIW를 통한 반복 생체 내 현미경 검사
참고 : 여기에 설명 된 반복적 인 IVM 전략은 35.8 ° C의 전동 스테이지와 어두운 기후 챔버가 장착 된 반전 된 다중 광자 공초점 시스템에 최적화되었습니다.
- 3% 이소플루란/O2 혼합물을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취시킨다. 발 금단 테스트를 수행하여 의식 상실을 확인합니다 (단계 2.6에서 설명). 이미징 세션 중에 각막 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
- 봉합사의 안정성 또는 뚜껑의 잠재적 손상을 포함하여 R.MIW 프레임과 뚜껑의 상태를 검사합니다. 뚜껑이 손상된 경우 단계 5에 설명된 대로 뚜껑을 교체할 수 있습니다.
- 마우스를 예열(37°C), 맞춤형 이미징 박스(그림 3A)로 옮기고 머리가 있는 마우스를 코 콘에 넣습니다. 이미징 박스는 현미경의 자동화 된 단계에 맞는 프레임으로 구성됩니다. 이 프레임은 R.MIW 직경의 구멍이 있는 맞춤형 인레이를 고정하도록 설계되었습니다(그림 3A).
- 노즈 콘이있는 입구는 상자 전면에 연결되어 2 % -3 % 이소플루란/ O2 혼합물을 사용하여 이소플루란 기화기 스테이션에 부착됩니다. 출구는 순환을 보장하고 상자에 이소플루란의 축적을 방지하기 위해 마취 청소 장치에 연결됩니다. 이미징 박스는 투명한 뚜껑을 사용하여 닫을 수 있습니다.
- R.MIW가 이미징 박스 인레이의 구멍에 떨어지도록 마우스를 인레이에 놓습니다(그림 3A). 파라필름과 종이 테이프를 마우스 뒤쪽에 발라서 마우스를 안정시키고 호흡으로 인한 조직 움직임을 줄입니다.
- 뚜껑으로 이미징 상자를 닫고 이미징 상자를 현미경 단계에 삽입합니다.
- 안정하지만 표면 마취 (일반적으로 1.5 % -0.8 % 이소플루란 /O2 혼합물 사이)를 유지하기 위해 이미징 세션 과정에서 이소플루란 용량을 점진적으로 줄입니다.
- 아래에 설명 된대로 이미징 중에 적절한 영양을 섭취하십시오.
- <3시간 이미징 세션의 경우, 마우스를 수화를 위해 200-300 μL의 멸균 PBS와 함께 피하 주사한다.
- 이미징 세션 >3h의 경우 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
- 장기간 이미징을 위해서는 마우스에 영양분을 주입하십시오. 이를 위해, 아미노산 및 글루코스를 함유하는 시판되는 멸균 주입 혼합물을 사용한다. 유연한 바늘을 마우스의 목에 피하 놓고 종이 테이프로 고정하십시오.
- 준비된 영양소 믹스와 함께 10 mL 주사기를 유연한 실리콘 튜브에 부착하고 튜브 끝에 도달 할 때까지 영양 믹스를 밀어 넣으십시오.
- 실리콘 튜브를 유연한 바늘에 연결하십시오. 튜브의 끝을 가져 와서 이미징 박스의 구멍 중 하나를 통해 놓습니다 (내부에서 외부로, 바늘 부착면을 상자에 남겨 둡니다).
- 30분마다 50μL의 주입액을 주입한다.
- 현미경의 단계에서 이미징 박스를 고정하고 현미경의 epifluorescence 모드를 사용하여 관심 영역을 정의합니다.
- 마우스 모델에 따라 원하는 현미경 설정을 적용합니다(그림 3B). 혈관 구조, 콜라겐 패턴(초고조파 생성에 의해 시각화됨) 및 사타구니 림프절을 포함하는 다른 안정한 해부학적 구조물은 랜드마크로서 사용될 수 있다. 12비트 깊이에서 반전된 다중 광자 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득하고, 1.0 ~ 4.0μm의 Z-스텝 크기(총 z-스택 범위 150 ~ 800μm)를 사용하여 25x 물 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득합니다. 1024 x 1024 형식, 600Hz 스캔 속도, 양방향 모드와 같은 표준 설정을 적용합니다.
- 860nm의 여기 파장과 425-435nm에서 검출을 사용하여 초고조파 생성을 수행하여 콜라겐 I 섬유를 시각화합니다. 상이한 형광단에 대한 여기 및 검출 파장은 표 1에 나타내었다.
표 1. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
- 이미징 소프트웨어 네비게이터 모드에서 나선형 기능을 사용하여 조직의 참조 맵을 생성하기 위해 큰 개요 타일스캔을 생성합니다(그림 3B). 나선형 개요 내에서 ROI를 정의하고 위쪽 및 아래쪽 Z 평면을 정의하여 Z 스택을 결정합니다. 시작 을 눌러 조직의 자세한 입체(xyz) 또는 사차원 Z-스택(xyzt)을 가져옵니다.
참고: 전체 이미징 실험 중에 마우스를 면밀히 모니터링해야 합니다. 긴 이미징 세션의 경우 산소 포화도 측정기와 온도 프로브를 사용하는 것이 좋습니다. 마우스의 호흡은 규칙적이고 동일한 속도로 이루어져야합니다. 마우스가 헐떡이는 징후를 보이기 시작하면 이소플루란의 양을 줄여야합니다. - 각 이미징 세션이 끝나면 완전히 깨어날 때까지 마우스를 가열 패드에 두십시오. 마우스가 불편 함이나 이동성 저하의 징후를 보이면 케이지를 가열 패드에 더 오래 보관하고 일반 차우 대신 영양 젤을 제공하십시오.
참고: 이미징 세션 사이에 마우스는 음식 및 물 소비 감소, 빠른 호흡, 움직임 감소, 떨림, 비정상적인 신체 자세 또는 유지되지 않은 모피와 같은 불편 함의 징후가 있는지 면밀히 모니터링해야합니다. 불편 함의 명백한 징후가있는 경우, 동물 복지에 관한 제도적 지침을 따르고 인도적 종점에 도달하면 실험을 종료하십시오. - 반복되는 모든 이미징 세션에 대해 4.1-4.12단계를 반복하고 개요 타일스캔을 사용하여 여러 시점에 걸쳐 동일한 위치를 되돌립니다(그림 3B). 이미징 빈도는 연구 질문 및 연구 과정의 타이밍에 따라 다르며 일반적으로 이미징 세션에서 하루에 두 번에서 일주일에 한 번까지 다양합니다.
- 원하는 실험 기간이 끝나면 이소플루란으로 깊은 마취를 한 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 이식 된 R.MIW로 동물을 안락사시킵니다. 원하는 경우, 추가 생체 외 분석을 위해 관심있는 기관을 해부하십시오.
- 또는 미래의 생체 내 분석을 위해 동물을 살아 있게 유지하십시오. 이 경우 스프링 가위로 절단하여 R.MIW를 고정하고있는 파우치 봉합사를 제거하고 무딘 포셉을 사용하여 마우스 피부에서 창 링을 조심스럽게 분리하십시오. 이전에 창문을 잡았던 피부의 가장자리를 청소하고 간단한 연속 봉합사 (폴리 글리콜 산과 같은 흡수 가능한 물질)로 진행하십시오.
- 피부가 닫히면 시작과 끝 봉합사 실을 두 개의 사각형 매듭 (4 회 던지기)으로 묶으십시오. 조직 허혈을 최소화하려면 매듭이 피부 가장자리에서 혈류를 허용할만큼 느슨해야합니다. 염증을 예방하고 피부의 치유를 촉진하기 위해 포비돈 요오드로 상처를 소독하십시오.
그림 3: 종방향 IVM 워크플로우. (a) 전형적인 다일 IVM 실험의 개략적인 묘사. (B) 성인 유선내 종양형성 영역의 영상화. 각 이미징 세션 전에, 저해상도 개요 타일스캔(상부 패널)은 후속 이미징 일 동안 관심 영역(들)의 식별을 용이하게 할 수 있다. 콜라겐 I 패턴(초고조파 생성, 마젠타), 조직 구조 및 형광 단백질(녹색, 황색 및 적색으로 묘사됨)으로 차등적으로 표지된 세포의 패턴은 동일한 조직 영역을 되짚어내는데 사용될 수 있다. 스케일 바는 1mm(개요 타일스캔) 및 100μm(하단 패널)를 나타냅니다. (C) R26-Confetti 리포터 구성물의 개략적 표현. 타목시펜-유도된 Cre-재조합시, Confetti 작제물은 확률적으로 재조합되어, 네 개의 형광단(nGFP, YFP, RFP, 또는 mCFP) 중 하나의 발현을 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 이미징 세션 사이에 R.MIW의 뚜껑을 열고 닫기
- 멸균 장갑을 사용하여 멸균을 유지하고 마우스와 접촉 할 모든 항목을 멸균하십시오. 수술 전에 수술 도구를 오토클레이브 합니다(자세한 내용은 2단계 참조).
- 가열 패드를 켜고 매트를 멸균 드레이프로 덮고 3 %의 이소플루란 /O2 혼합물을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하십시오. 발 금단 반사 검사를 수행하여 적절한 마취를 확인하십시오.
- 마우스를 유도 챔버에서 마취 코 마스크로 옮기고 이소플루란 수준을 1.5%-2% 이소플루란/O2 혼합물로 감소시킨다.
- 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔에있는 구멍을 통해 놓고 뚜껑을 시계 반대 방향으로 비틀어 뚜껑을 느슨하게하십시오. 필요한 경우, 뚜껑의 풀림을 촉진하기 위해 창문에 일부 예열된 멸균 PBS(37°C)를 적용한다.
- R.MIW의 뚜껑을 추가 사용 시까지 멸균 PBS가 있는 멸균 접시에 넣습니다. 뚜껑의 커버 글라스를 데미 워터와 80 % 에탄올로 닦으십시오. 추가 사용 시까지 뚜껑을 멸균 PBS에 보관하십시오.
- 조직 표면에 멸균 PBS의 일부 방울을 첨가하여 노출된 조직이 건조되는 것을 방지한다.
- 노출된 조직에 관심있는 물질 또는 세포를 적용 또는 주입하면, 최대 부피 50 μL가 사용될 수 있다. 액체가 조직에 흡수 될 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 대안적으로, 조직은 특정 ROI에 대한 이미징 조건을 최적화하기 위해 멸균된 둔탁 포셉을 사용하여 조작되거나 재배치될 수 있다.
- 석유 젤리를 R.MIW의 내부 테두리에 바르면 기본 조직이 피하십시오. 단계 3.9에서 설명한 대로 뚜껑을 R.MIW 프레임에 넣고, 뚜껑 팔의 구멍을 통해 얇은 포셉 끝을 놓고, 뚜껑을 시계 방향(약 5°)으로 돌려 뚜껑을 조입니다.
Representative Results
유선의 상이한 발달 단계 동안 유방 상피 세포의 증식 역학을 연구하기 위해 기술된 프로토콜이 수행되었다. R.MIW의 설계는 그림 1에 묘사되어 있으며, R.MIW를 이식하는 절차는 그림 2에 요약되어 있습니다. R.MIW는 유선과 피부 사이에 외과 적으로 이식됩니다. 봉합사는 창 링 내에 고정하고 마우스가 봉합사를 당기는 것을 방지하는 데 사용됩니다 (그림 2). R.MIW를 보유하고있는 봉합사는 비 흡수성 실크로 만들어져 저자 극성 특성과 부드러운 질감을 가지고 있으며 다루기 쉽습니다. R.MIW 링은 이식 후 염증이나 괴사를 촉진하지 않는 가장 생체 적합성이 높은 물질 중 하나 인 티타늄으로 만들어집니다21. 무균 상태를 따르고 봉합사가 잘 실행되면 R.MIW 유선이식은 수술 후 합병증의 위험이 낮습니다. 더욱이, 복부 이미징 창 이식(22)과는 달리, R.MIW 이식은 유선이 중요한 기관이 아니며 윤리적 프로토콜에 명시된 한계까지 매일 이미징을 허용하기 때문에 마우스 생존을 위한 제한 인자가 아니다. 창 이식 기간을 제한하는 유일한 요인은 피부의 항상성 회전율이며, 결국 4-6 주 후에 봉합사가 빠져 나옵니다. 따라서 봉합사의 안정성을 정기적으로 검사하는 것이 중요합니다. 원하는 경우, 봉합사는 창 안정성을 보장하기 위해 무균 조건 (단계 3.5 - 3.8에서 설명한 바와 같이) 하에서 새로운 지갑 끈 봉합사로 제거되고 대체 될 수 있습니다.
여러 날 이미징 접근 방식을 사용할 때 가장 큰 과제는 연속된 날에 ROI를 회수하는 것입니다. 이를 위해 ROI를 선택하기 전에 빠른 개요 스캔을 포함 할 수 있습니다 (그림 3B). 여러 조직 랜드마크를 사용하여 콜라겐 네트워크 신호(초고조파 생성에 의해 시각화됨), 조직 구조뿐만 아니라 염료 또는 형광 단백질로 차등적으로 또는 확률적으로 표지된 세포의 국소 패턴을 포함하는 조직의 동일한 영역을 리트레이킹할 수 있다(도 3B). 이 대표적인 예에서, R.MIW는 MMTV-PyMT의 4번째 유선에 이식되었다 ; R26-CreERT2헤트; R26-Confettihet 여성 마우스는 만질 수있는 종양 형성의 시작시에. 이어서, 확률적 재조합은 1.5 mg 타목시펜의 주사에 의해 유도되었고, 그 결과 일부 세포에서 Confetti 작제물의 재조합이 초래되었다(도 3C). 재조합된 종양 세포를 20일의 기간 동안 추적하였다(도 3B, C). 연속된 날에 걸친 유선의 동일한 영역의 영상화가 배제되는 경우, 무균 환경(단계 5.1에서 설명된 바와 같이)에서 창을 열어 가시성 및 이미지 획득을 개선하기 위해 조직을 추가로 정리하고 재배치할 수 있다(도 3A).
이 방법을 사용하여, 사춘기 동안 유선이 발달하는 것을 단일 세포 수준에서 추적하였다. R.MIW를 통한 IVM 반복은 R26-CreERT2het를 사용하여 수행되었고; R26-mTmGhet 암컷 마우스는 4-6주령 사이에 모든 세포가 막 tdTomato로 표지된다(도 4A)23. 마우스에 저용량의 타목시펜 (0.2 mg / 25 g 체중)을 주사하여 mTmG 구축물을 산발적으로 재조합하여 유선을 포함한 모든 조직의 일부 세포에서 적색에서 녹색으로 변화시켰다 (그림 4B). 동일한 ROI를 여러 날에 걸쳐 재검토하여 세포 분해능에서 덕트 신장과 덕트 분지화(그림 4C)를 포함한 유선의 형태학적 변화를 시각화했습니다. 중요하게도, 확률적 세포 표지와 다일 IVM의 이러한 조합은 또한 연장 및 분지 덕트를 둘러싸고 있는 스트로마에서의 단일 세포의 역학(도 4D)뿐만 아니라 사타구니 림프절 내의 세포 역학(도 4E)과 같은 덕트 환경의 동적 변화를 시각화할 수 있게 한다.
도 4: 사춘기 분지 형태형성의 다일 IVM. (A) 사춘기 R26-CreERT2; 4-6 주 사이의 생후 R26-mTmG 마우스에 R26-mTmG 대립유전자의 Cre 매개 재조합을 유도하는 저용량의 타목시펜을 주사하고, 유선의 발달에 대한 동적 변화를 따르기 위해 제1일, 3일 및 5일에 영상화하였다. (b) 비재결합 조건에서 막 tdTomato (mT)의 유비쿼터스 발현을 초래하는 R26-mTmG 마우스 구축물의 개략적인 표현. Cre-매개된 재조합시, mT는 막 eGFP (mG) 발현을 위해 전환된다. (c) R26-CreERT2에서 R.MIW를 통해 이미지화된 여러 날에 걸친 길쭉하고 분지된 유방 덕트의 3D 렌더링 ; R26-mTmG 암컷 마우스는 6주령에 있다. (D) 분기 팁(상단 패널)과 길쭉한 브랜치(하단 패널)의 단일 Z-평면 이미지. mT는 적색으로 표시되고, mG는 시안색으로, 스케일 바는 100μm(A 및 B)를 나타낸다. 스트로마의 단일 세포는 흰색 별표로 강조 표시됩니다. 신호 강도는 스트로마에서 단일 세포를 강조하기 위해 수동으로 증가하여 유방 상피 세포의 약간 과다 노출 된 출현으로 이어졌습니다. (e) R26-CreERT2의 사타구니 림프절의 대표적인 이미지 ; R.MIW를 통해 이미지화된 R26-mTmG 암 마우스는 개요 타일 스캔(왼쪽 패널), 단일 Z-평면의 확대/축소 이미지(오른쪽 패널) 및 3D 렌더링(하단)을 보여줍니다. 두 번째 고조파 생성 (콜라겐 I)은 녹색으로, mT는 빨간색으로, mG는 시안색으로 표시됩니다. 배율 막대는 500μm(개요 타일스캔) 및 100μm(확대/축소 이미지)를 나타냅니다. 도 패널 C 및 D는 Messal et al. 2로부터 변형된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마찬가지로, 성인 유선에서 제안 된 R.MIW 접근법은 타협하지 않은 가시성으로 여러 날에 걸쳐 동일한 덕트 구조를 시각화 할 수 있습니다. Cdh1-mCFP(Ecadherin-mCFP) 마우스 모델과 같은 덜 밝은 형광 리포터 모델(24)을 사용하더라도 세포 분해능에서 덕트 안정성 및 미묘한 형태학적 변화의 시각화를 가능하게 한다(도 5). 3일차와 5일째 사이의 가시성은 조직 재배치 후 크게 개선되었습니다(그림 5).
도 5: 성인 유선의 다일 영상. 3D 렌더링된 이미지들은 수일 연속으로 성인 여성 Cdh1-mCFP (시안, 에카데린 양성 발광 세포 발현을 표시함) 마우스의 유관 구조의 이미지이다. 콜라겐 I 패턴(초고조파 생성, 마젠타)을 사용하여 동일한 ROI를 되돌렸고, Cdh1-mCFP 신호를 사용하여 덕트(루미날) 세포를 표시하였다. 3일째 이후의 가시성은 R.MIW 뚜껑을 열고 조직을 재배치함으로써 개선되었다. 배율 막대는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단일 세포 수준에서 호르몬 주기 동안 유방 상피 세포의 증식성 이질성을 평가하기 위해, KikGR 단백질의 유비쿼터스 발현을 갖는 광전환성 키쿠메 그린-레드(KikGR) 리포터 마우스 모델 25,26이 사용되었다. KikGR은 보라색 빛에 노출되면 녹색에서 적색으로 전환되는 밝은 형광단이며 적색 / 녹색 비율은 세포2의 증식 활성에 대한 프록시로 사용할 수 있습니다 (그림 6A, B). R.MIW 접근법을 사용하여, 우리는 며칠 동안 성인 유선의 덕트 트리 내에서 동일한 세포를 추적했고, 덕트 트리 전체에 걸쳐 이전에 예상치 못한 증식성 이질성을 발견했다 (도 6C). 높은 증식성 및 낮은 증식성 세포는 상이한 변환된 영역에 걸쳐 동등하게 분포되었다(도 6C, D). 놀랍게도, 국소 수준에서 이웃 세포는 적색 / 녹색 비율에 큰 차이를 보였다 (그림 6C, D). 광변환 후 10 일 후에 다른 세포의 적색 / 녹색 비율 (증식 활성의 대리자로서)을 정량화하면 동일한 덕트 미세 환경 내에서 일부 세포의 매우 가변적 인 희석률이 나타났습니다 (그림 6E). 함께,이 데이터는 성인 유선에서 주목할만한 국소 증식 이질성을 보여 주며 동시에 전 세계적으로 균일 한 회전율을 보여줍니다.
도 6: KikGR 마우스 모델을 사용하여 성인 유선에서의 증식성 이질성의 종방향 IVM . (A) KikGR 마우스는 보라색 빛에 노출되기 전과 후의 0일째에 영상화되었다. 이미징 세션은 변환 후 2일, 6일, 10일에 반복되었다. (B) 증식 후 KikGR 유방 상피 세포의 광변환에 따른 가설적 결과의 개략적 묘사 (왼쪽 패널) 및 증식 없음 (오른쪽 패널) 시간의 함수. (C) 유선의 동일한 영역은 10 일 동안 R.MIW를 통해 이미지화되었다. 더 작은 영역은 0일째에 광변환되었고, 시간에 따른 키쿠메 적색 신호의 유사한 희석률을 보이며, 이는 상피 전체에 걸쳐 동일한 회전율을 나타낸다. (d) 패널 C에서 지시된 영역의 줌 이미지(단일 Z-평면)는 광변환 후 6일 및 10일 후에 세포 수준에서 증식성 이질성을 나타낸다. 스케일 바는 100μm(패널 C) 및 10μm(패널 D)를 나타냅니다. (E) 세 개의 광변환 영역에서 무작위로 선택된 세포 (n = 48 세포)의 적색 / 녹색 비율의 정량화. 높은 적색 / 녹색 비율은 낮은 희석 속도와 낮은 증식 활성을 나타내는 반면, 낮은 적색 / 녹색 비율은 높은 희석 속도와 증식을 나타냅니다. 도 패널 C-E는 Messal et al. 2로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
R.MIW는 원산지 및 최소한의 교란 환경에서 건강하고 병든 유선의 종방향 이미징을 허용하고 다양한 발달 단계에서 유선의 반복적 인 시각화를 허용합니다. R.MIW 설계를 사용하면 실험 중 언제든지 창을 열 수 있습니다. 관심 조직에 대한 장기간의 시각적 접근은, 예를 들어, 커버슬립 상의 세포 파편의 축적에 의해 방해될 수 있다. 이러한 경우, R.MIW는 이미징 세션 전후에 열리면 전체 가시적 인 조직 영역과 뚜껑을 청소할 수 있습니다. 탈착식 뚜껑은 또한 조직의 조작뿐만 아니라 특정 억제제 및 치료법, 라벨링 염료 또는 관심있는 특정 세포 유형과 같은 물질의 국소 적용을 허용합니다.
이 방법은 하나의 이미징 세션으로 제한되는 앞서 설명한 유방 스킨플랩 절차 4,7,8,13의 한계를 극복하고 분지화 형태형성(그림 5), 항상성 조직 회전율(그림 6) 또는 세포 수준에서의 종양 성장(그림 3B)과 같은 과정을 시각화할 수 있습니다. ). 그러나 동시에, R.MIW는 이미징 세션 사이에 조직의 로컬 조작을 허용하며, 이는 이전에 공개된 MIW 3,18 및 다른 모든 이미징 윈도우20,22에 비해 R.MIW의 큰 자산을 포함한다. R.MIW를 열 때 감염원을 예방하기 위해 항상 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 무균 환경에서 R.MIW를 열 수 있는 기능은 모든 이미징 세션 전에 이미징 조건을 최적화할 수 있게 해주며, 이는 관심 조직에 대한 장기적인 시각적 접근을 크게 향상시킵니다. 특히, 지방세포가 풍부한 스트로마에 매립 된 유선에서 이것은 큰 가치가 있습니다. 더욱이, 교체가능한 뚜껑은 IVM 실험을 종료할 필요 없이 치료제, 상이한 세포 유형, 라벨링 염료, 이미지-유도 미세 해부 또는 임의의 다른 국소 조직의 국소 조작의 국소 투여를 고유하게 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 종양 개시를 연구하기 위해, 특정 암 세포 집단은 R.MIW 링을 통해 ROI에 접근 가능한 한, 결정된 IVM 시점 및 정확한 유선(mammary gland) 위치에서 덕트 트리 또는 스트로마에 직접 주사될 수 있다. 종양 진행을 연구하기 위해, 특정 암 세포 집단 (특정 위치에서, 특정 미세 환경에서, 또는 특정 거동을 가진)은 IVM 세션 동안 광-마킹될 수 있고, 이어서 R.MIW의 개봉 후에 형광 해부 현미경을 사용하여 미세 해부될 수 있었다. 단리된 세포는 (단일세포) mRNA 시퀀싱과 같은 하류 분석을 위해 추가로 처리될 수 있었다. 이러한 접근법을 사용함으로써, 생체내 세포 거동을 분자 발현 프로파일에 결합시킬 수 있다. R.MIW에 의해 활성화된 국소 약물 투여의 이점은 치료 전후에 조직을 영상화할 수 있게 한다. 이미징 박스로부터 마우스를 제거하고 R.MIW 뚜껑을 연 후 국소 약물 투여를 후속적으로 수행하는 데 필요한 간격은 몇 분 안에 수행될 수 있으며, 이는 빠른 작용 약물의 즉각적인 위상 포획을 허용한다.
우리는 R.MIW를 통한 유선의 IVM이 많은 상이한 형광 리포터 마우스 모델과 양립가능하다는 것을 보여준다. 지방이 풍부한 환경은 이미지에 어려움을 겪고 있으므로 밝은 형광단을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 여기에 나타낸 바와 같이, mCFP와 같은 덜 밝은 형광단은 최적의 이미징 조건에서 R.MIW를 통해 시각화될 수 있다. 필연적으로, 지방 패드는 더 깊은 덕트 구조의 이미징을 배제하고 이미징을보다 피상적 인 덕트로 제한합니다. 각 IVM 실험 시작 시 저해상도 개요 이미지는 고해상도 이미징에 충분히 피상적인 관심 있는 덕트 구조를 식별하는 데 도움이 됩니다. R.MIW를 연 후 국소 조직 조작, 결합 조직 제거 또는 지방 조직의 재배치는 지방 조직에 의해 오버레이되는 특정 ROI에 대해 IVM을 최적화 할 수 있습니다. 이는 이전의 모든 창 설계에 비해 중요한 장점으로, 이러한 조작을 수행 할 수 없으며 창 자체를 완전히 제거해야합니다. 특히, 사타구니 림프절의 시각화를 위해, 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 가능하게하는 위에 놓인 지방 조직을 부드럽게 제거하는 것이 좋습니다. 조직을 조작 할 때 IVM 실험 중에 연구되는 과정에 영향을 줄 수 있으므로 항상 무균 상태를 유지하고 출혈이나 조직의 심각한 손상을 예방하십시오.
R.MIW는 관절이나 뼈 판과 같은 경질 조직을 대체하기 위해 임상 실습에서 일반적으로 사용되는 물질인 티타늄으로 만들어졌습니다. 티타늄은 가볍고 불활성 인 문자21을 포함하여 강철 창문에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 최근에, 가요성 실리콘 윈도우(20)를 포함하는 신규한 이미징 윈도우 타입들을 생성하기 위해 몇몇 다른 재료들이 사용되었다. R.MIW와는 달리, 유연한 창은 이식을 위해 봉합사를 필요로하지 않으며 거의 모든 해부학 적 위치, 특히 부드럽고 깨지기 쉬운 조직의 경우에 적합합니다. 실리콘 창은 가볍고 변형 가능한 특성으로 인해 동물의 운동성에 최소한의 영향을 미치며 빠른 조직 확장 및 성장을 연구하는 실험에 더 적합 할 수 있습니다20. 티타늄 버전에 비해 또 다른 장점은 실리콘 윈도우가 자기 공명 이미징20,27을 포함한 다른 이미징 양식과 호환된다는 것입니다. 그러나 목표는 0.17mm 유리 커버 슬립에 최적화되어 있음을 명심하는 것이 중요합니다. 또한, 유방 조직은 호흡 운동에 취약하며, 특히 거꾸로 된 현미경을 사용할 때 유연한 창을 사용하여 제한하기가 어렵습니다. 호흡 아티팩트는 R.MIW 설계와 이미징 박스의 인레이에 R.MIW의 고정에 의해 최소화됩니다. 결과적으로 제안된 R.MIW 설정을 사용하여 획득한 이미지는 호흡 아티팩트로 인해 왜곡되지 않습니다. 그러나, 조직 국소화에서 경미한 드리프트가 발생할 수 있으며, 이는 일반적으로 점진적이며, 사후 획득 모션 보정 소프트웨어(28)를 사용하여 보정될 수 있다. IVM 기술2,20의 툴박스가 증가함에 따라, 각 실험에 대한 특정 요건은 결국 관심 조직의 생체내 시각화의 가장 좋은 방법을 결정할 것이다. 다른 창 디자인은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있으며 연구 질문, 사용 가능한 현미경 설정, 필요한 공간 및 시간 분해능 및 연구 된 프로세스의 총 시간 범위에 따라 최적의 접근 방식을 결정해야합니다.
요약하면, R.MIW는 수일에서 수주에 걸쳐 유선 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 용이하게합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 연구 재단 플랑드르 (M.C.에 기초 연구 11L7222N을 수여하는 박사 학위), Boehringer Ingelheim Foundation (C.L.G.J.S.에 박사 펠로우십), EMBO 박사 후 펠로우십 (ALTF 1035-2020을 C.L.G.J.S.에 부여), Josef Steiner Award (J.V.R)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
| 10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
| 5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
| 80% Ethanol | homemade | NA | |
| Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
| Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
| Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
| Eye ointment | Duratears | NA | |
| Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
| Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
| Imaging box | Custom made | NA | |
| Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
| Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
| Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
| Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
| Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
| Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |
References
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