Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å visualisere og måle aktinringer og andre komponenter i membran periodisk skjelett av axon innledende segmentet ved hjelp av dyrkede rotte hippocampal nevroner og 3D-strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM).
Abstract
Axon-innledende segmentet (AIS) er stedet der handlingspotensialer initierer og utgjør et transportfilter og diffusjonsbarriere som bidrar til vedlikehold av nevronal polaritet ved å sortere somato-dendritisk last. Et membran periodisk skjelett (MPS) bestående av periodiske aktinringer gir et stillas for forankring av ulike AIS-proteiner, inkludert strukturelle proteiner og forskjellige ionkanaler. Selv om nylige proteomiske tilnærminger har identifisert et betydelig antall nye AIS-komponenter, mangler detaljer om strukturen til MPS og rollene til de enkelte komponentene. Avstanden mellom individuelle aktinringer i MPS (~ 190 nm) krever ansettelse av mikroskopiteknikker med superoppløsning for å løse de strukturelle detaljene i MPS. Denne protokollen beskriver en metode for bruk av kultivert rotte hippocampal nevroner for å undersøke nøyaktig lokalisering av et AIS-protein i MPS i forhold til submembranøse aktinringer ved hjelp av 3D-strukturert belysningsmikroskopi (3D-SIM). I tillegg beskrives også en analytisk tilnærming til kvantumsvurdering av periodiciteten til individuelle komponenter og deres posisjon i forhold til aktinringer.
Introduction
Axon innledende segmentet (AIS) er en kort, unikt spesialisert region av proksimal axon av virveldyr neurons1. AIS består av et transportfilter og diffusjonsbarriere som er avgjørende for å opprettholde nevron polaritet ved å sortere somato-dendritisk last2,3,4,5,6,7. I tillegg gjør den unike strukturen til AIS det mulig å imøtekomme klynger av spenningsportede ionkanaler som letter funksjonen som handlingspotensialinitiering8. Et svært stabilt strukturelt kompleks ligger til grunn for de unike funksjonene i AIS. Forskning i løpet av det siste tiåret har avslørt tilstedeværelsen av et membran periodisk skjelett (MPS) som inneholder aktinringer forbundet med spektrrin og gir et stillas for forankring av ulike AIS-proteiner9,10.
Avstanden mellom aktinringer i MPS (~190 nm)9,10 er under oppløsningsgrensen for konvensjonell lysmikroskopi. Tidlige forsøk på å bruke elektronmikroskopi for å visualisere MPS var ikke vellykket, da de harde forberedelsesprosedyrene som var involvert, ikke klarte å bevare strukturen til MPS. Dermed har mikroskopiteknikker med superoppløsning vist seg å være uvurderlige for å belyse noen av de strukturelle detaljene i MPS11. Imidlertid er forståelsen av AIS strukturkomplekset, identiteten og funksjonene til komponentene, og dens romlige regulering fortsatt ufullstendig. Nyere proteomiske studier lyktes i å skape en betydelig liste over proteiner som lokaliserer til AIS nær strukturelle komponenter i AIS12,13. Likevel mangler detaljer om deres funksjon og presise plass i AIS-komplekset. Dermed fungerer mikroskopiteknikker med superoppløsning som et viktig verktøy for å undersøke de nøyaktige posisjonene til disse proteinene i forhold til andre MPS-komponenter og undersøke deres funksjoner. Flere lysmikroskopiteknikker kan oppnå oppløsninger høyere enn diffraksjonsgrensen for lys, noen til og med i stand til å lokalisere enkeltmolekyler. Imidlertid krever mange av disse teknikkene vanligvis spesialiserte fluoroforer eller bildebuffere, og bildeanskaffelse er ofte tidkrevende14.
3D-strukturert belysningsmikroskopi (3D-SIM), på grunn av brukervennlighet og enkle prøveforberedelseskrav, krever ingen spesielle reagenser for avbildning eller prøvepreparering, fungerer bra med et bredt spekter av fluoroforer og prøver, kan lett implementeres i flere farger, og er i stand til levende celleavbildning15. Mens den best mulige oppløsningen SIM tilbyr (~ 120 nm) er lav sammenlignet med mange andre superoppløsningsteknikker, er det tilstrekkelig for mange applikasjoner (for eksempel for å løse komponentene i MPS i nevroner). Dermed er det viktig å vurdere kravet til spesifikke applikasjoner for å avgjøre om SIM er et passende valg eller om en enda høyere oppløsning er nødvendig. Her er en protokoll beskrevet for bruk av kultiverte hippocampale nevroner og 3D-strukturert belysningsmikroskopi (3D-SIM) for å undersøke posisjonen og organiseringen av putative AIS-proteiner i forhold til aktinringer i MPS, som implementert i Abouelezz et al.16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Primære hippocampale nevroner som ble brukt i disse eksperimentene ble høstet16 fra embryonal dag 17 Wistar rotte embryoer av begge kjønn under de etiske retningslinjene til Universitetet i Helsinki og finsk lov.
1. Prøvepreparering
- På high-fidelity glass coverlips, tillate rotte hippocampal nevroner å vokse i sparsomme kulturforhold (~ 5,000-10,000 celler / cm2) i 14 dager (14 dager-i-vitro).
MERK: Bruk av sparsomme kulturer reduserer sjansene for overlappende nevritter, noe som bidrar til å kvantifisere MPS. - Fest nevroner ved hjelp av 4% paraformaldehyd i 12 min ved romtemperatur. Vask dekslene én gang i 0,2 % BSA i PBS (BSA-PBS), og inkuber deretter i 10 minutter i en 1 % løsning av Triton-X i PBS ved romtemperatur. Vask en gang i BSA-PBS.
- Fortynn anti-ankyrin G antistoffer (1:200) i BSA-PBS. Tilsett antistoffoppløsning på dekslene og inkuber over natten ved 4 °C. Eventuelt, tilsett kylling anti-MAP2 antistoffer (se Tabell over materialer) til antistoffløsningen for å avgrense det somato-dendrittiske domenet.
- Vask celler en gang i BSA-PBS, etterfulgt av 0,1% Triton-X i PBS, og gjør deretter en sluttvask i BSA-PBS.
- Fortynn fluorofor-merkede antimus sekundære antistoffer (1:200) (se Materialtabell) i BSA-PBS, legg til dekslene og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask cellene en gang i BSA-PBS, en gang i 0,1% Triton-X i PBS, deretter en gang i PBS.
- Forbered en 1 μM løsning av merket falloidin i PBS (se Materialfortegnelse) og legg den til cellene. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur. Vask celler en gang i PBS, en gang i 0,1% Triton-X i PBS, deretter en gang i PBS.
MERK: AlexaFluor488-tagget falloidin ble brukt her, men andre tagger vil også fungere. - For montering av dekslene på en glasssklie, bruk en dråpe monteringsmedier på en glasssklie, dypp dekslene i deionisert vann og dab ved hjelp av et mykt papirhåndkle (for å fjerne overflødig vann).
- Plasser dekslene på glasssklie. Inkuber ved romtemperatur i 24 timer.
MERK: Ingen bivirkninger på prøven ble observert ved bruk av hardinnstillingsmonteringsmedier (brytningsindeks 1.47 etter herding).
- Plasser dekslene på glasssklie. Inkuber ved romtemperatur i 24 timer.
2. Bildebehandling
- Rådfør deg om mulig med mikroskopianleggets personell før avbildning. Bruk en nedsenkningsoljekalkulator (se Materialfortegnelse) for å velge nedsenkningsolje som passer for prøven.
- Når prøvene er klare, må du sørge for at dekslene er rene og fri for rester eller overflødige monteringsmedier. Bruk om nødvendig en bomullsspiss dyppet i vann eller etanol for å rengjøre. Plasser prøven i et 3D SIM-kompatibelt mikroskop (se Materialfortegnelse) og finn en celle til bilde.
- Juster kraften til de relevante laserlinjene og eksponeringstidene for å maksimere signal-til-støy-forholdet uten å bleke prøven betydelig.
MERK: Et godt signal-til-støy-forhold vil vise et klart rutenettlignende utseende fokusert på prøven og føre til nøyaktige rekonstruksjoner med høy oppløsning. 488 nm og 640 nm laserlinjer ble brukt til å visualisere henholdsvis F-aktin og ankyrin G. - Angi øvre og nedre grense for prøven i z-dimensjonen, og fortsett med å hente en stabel.
MERK: Z-trinns størrelse på 125 nm ble brukt her. - For vellykket SIM-rekonstruksjon må du sørge for at mikroskopiprogramvaren (se Materialliste) har en optisk overføringsfil (OTF) som passer for de brukte fargestoffene.
MERK: Disse opprettes og vedlikeholdes vanligvis av spesialisert personell. I mangel av en funksjonell OTF er åpen kildekode-verktøy også tilgjengelige for å utføre rekonstruksjoner basert på estimater17. I dette arbeidet ble oppdaterte OTF-filer brukt kontrollert av spesialisert personell. - Kjør rekonstruksjonsalgoritmen på stakken for å få en super-løst rekonstruksjon. Kontroller rekonstruksjonene for kjente artefakter, og juster om nødvendig parametrene for å korrigere dem.
MERK: Standard algoritmeparametere gir vanligvis nøyaktige resultater. Mange av disse gjenstandene involverer noen gjentatte mønstre: stripete linjer sammen med flere retninger på ett z-plan, 'ghosting' (gjentatte funksjoner som vises i forskjellige z-fly), eller et sekskantet 'honeycomb' mønster som dukker opp i noen områder. Disse artefaktene kan ofte løses med bedre prøvepreparering, et bedre signal-til-støy-forhold, justering av parametrene til rekonstruksjonsalgoritmen, eller sikre at brytningsindeksen til den valgte nedsenkningsoljen er egnet for monteringsmediet og prøven. Hvis du vil ha en mer detaljert beskrivelse av SIM-artefakter og et fritt tilgjengelig verktøy for å se etter gjenstander, kan du se Ball et al. 18 - Sammenlign SIM-rekonstruksjonen med et bredfeltsbilde for å observere forbedringer i oppløsningen.
- Når du utfører flerfarget SIM-kort, bruker du justeringsalgoritmen til å justere de forskjellige kanalene riktig når en tilfredsstillende rekonstruksjon er klar.
MERK: Justeringsalgoritmen bruker en justeringsreferansefil generert ved hjelp av en mikrosfæreperleforberedelse i henhold til instruksjon fra mikroskopprodusenten.
3. Bildeanalyse
- Actin ringer i MPS har et særegent periodisk utseende. Bruk programvare for bildeanalyse (se Materialfortegnelse), lag et bilde med maksimal intensitetsprojeksjon ved hjelp av alle fokusplanene der aktinringer er synlige.
- På bildet med maksimal intensitetsprojeksjon tegner du en vinkelrett linje over synlige tilstøtende ringer og registrerer fluorescensintensiteten sammen med programvarens linje 'Plot Profile' -funksjon.
- For å beregne gjennomsnittlig avstand mellom toppen, noter den lokale maksimen i linjeprofilen og mål avstanden mellom individuelle tilstøtende fluorescerende intensitetstopper.
MERK: Dette kan enkelt beregnes, for eksempel ved hjelp av 'findpeaks' -funksjonen i MATLAB eller (åpen kildekode) GNU Octave-plattformen. - For å evaluere colokaliseringen av forskjellige proteiner med aktinringer i MPS, kjør en colokaliseringsanalyseprosedyre19,20,21 på SIM-rekonstruksjoner av aktin og kandidatproteinet. Tegn et valg manuelt for å definere AIS som en interesseregion for plugin-modulen EzColocalization i programvareplattformen19, og kjør analysen for å beregne Pearsons korrelasjonskoeffisient (PCC) for samlokalisering19,20,21. En PCC-verdi nær 1 indikerer sterk colokalisering.
MERK: Denne protokollen er oppsummert i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av kultiverte rotte hippocampal nevroner og 3D-SIM, er en protokoll beskrevet for å visualisere og måle aktinringer og andre komponenter av MPS i AIS. Rekonstruksjoner av bildestakker viste klar periodicitet av aktinringer (figur 2A). I våre hender var den gjennomsnittlige inter-peak avstanden til aktinringer i MPS, visualisert ved hjelp av Alexa 488-merket falloidin, 190,36 ± 1,7 nm (gjennomsnittlig ± SEM). Dette er i tråd med den tidligere rapporterte gjennomsnittlige avstanden på ~ 190 nm mellom aktinringer i MPS. På samme måte ble et anti-ankyrin G antistoff brukt til å visualisere ankyrin G (figur 2B). Colokaliseringen av ankyrin G og F-aktin ble testet i AIS ved hjelp av en colokaliseringsanalyseprosedyre for å beregne PCC for samlokalisering19,20,21. PCC for colokalisering av ankyrin G og F-aktinfluorescens var 0,36 ± 0,03 (gjennomsnittlig ± SEM, figur 2B). Som ankyrin G og aktin ringer binde βIV-spectrin på ulike domener, de viser ikke betydelig colocalization. Disse dataene ble tilpasset fra Abouelezz et al.16
Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollen for prøvepreparering for 3D-SIM-bildebehandling. Hippocampal nevroner høstes fra rotteembryoer, dissosieres og får lov til å vokse på glassdeksler i kultur i 14 dager. Celler festes deretter og farges ved hjelp av merket falloidin og passende antistoffer, deretter montert på glasssklier for 3D-SIM-avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 3D-SIM-rekonstruksjon av membranens periodiske skjelett (MPS) i det aksoninledende segmentet (AIS). (A) F-aktin (grønn) og ankyrin G (magenta) viser en vanlig fordeling i AIS, visualisert av 3D-SIM. Skalastang = 1 μm. (B) Pearsons korrelasjonskoeffisienter (PCC) for colokalisering av ankyrin G med F-aktin i MPS i AIS. Gjennomsnittlig PCC av ankyrin G var 0,36 (svart sirkel). Grå romber representerer enkeltceller (n = 16), midtlinje representerer medianen, feilfelt representerer 25. Dataene er tilpasset fra Abouelezz et al.16Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her, gir en metode for visualisering og måling av MPS-proteiner ved hjelp av superoppløsningsteknikken. Ettersom aktinringer og andre MPS-komponenter viser en periodicitet på ~ 190 nm9,10, kan konvensjonelle diffraksjonsbegrensede bildebehandlingsmetoder ikke avsløre detaljene i MPS. Flere mikroskopioppsett kan løse diffraksjonsbegrensede strukturer i superoppløsning, og SIM representerer et robust og ukomplisert alternativ. Det er viktig at SIM-kortet er kompatibelt med de mest brukte fluoroforene, noe som gir betydelig fleksibilitet. Videre er SIM effektiv i å visualisere potensielt svake strukturer i MPS, for eksempel aktinringer i latrunculin-behandlede nevroner22, samt levende nevroner15.
Et viktig aspekt for suksessen til denne protokollen er å bevare integriteten til MPS i utgangspunktet. De mest kritiske trinnene for vellykket SIM-bildebehandling skjer under prøveforberedelse. For eksempel gir moderat fiksering (4% PFA i 12 minutter ved romtemperatur) og sterk permeabilisering (1% Triton-X i 10 minutter) de beste resultatene. Det er viktig å huske på at harde behandlinger som kan være nødvendige for spesifikke preparater, kan ha en negativ effekt på MPS' strukturelle integritet. Derfor er det kanskje best å vurdere å endre slike behandlinger for å maksimere bevaringen av MPS.
Den andre avgjørende faktoren å vurdere når du forbereder prøver for avbildning er å maksimere merkingstettheten. Ideelt sett ville hvert molekyl bli merket og oppdaget. For eksempel brukes anti-ankyrin G-antistoffet som brukes i dette eksperimentet ofte til å merke AIS. Det gir fremragende ytelse i konvensjonell fluorescensmikroskopi, selv når den brukes ved en fortynning på 1:1000 og inkuberes i bare 1 time ved romtemperatur. For å oppnå god merkingstetthet for mikroskopi med superoppløsning, er det imidlertid svært effektivt å bruke 5 ganger den konsentrasjonen (1:200) og inkubere antistoffet over natten ved 4 °C. Selv om de spesifikke kravene til hvert antistoff eller merkingsteknikk vil variere og må bestemmes eksperimentelt, er det kanskje nyttig å huske på dette.
I tillegg er det viktig å merke seg at å oppnå et høyt signal-til-støy-forhold gir seg godt til nøyaktige og vellykkede SIM-rekonstruksjoner. En god tommelfingerregel er at rutenettmønsteret skal være synlig i de enkelte bildene når SIM-modaliteten er engasjert. Dette er imidlertid ikke alltid mulig.
Til slutt er det viktig å merke seg at SIM er blant de svakeste superoppløsningsteknikkene for å løse power14. Selv om det generelt er tilstrekkelig for å avsløre periodicitet og generell organisering av MPS-proteiner, er det betydelig mindre i stand til å gi detaljer om deres interaksjoner enn stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM)10. Videre er teknikkens verktøy beskrevet her begrenset til studiet av proteiner som et spesifikt, velpresterende antistoff er tilgjengelig for. Dette kan imidlertid delvis omgås gjennom eksogent uttrykk for taggede proteiner15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dr. Pirta Hotulainen er anerkjent for sine kritiske kommentarer, uvurderlig for å forberede dette manuskriptet. Dr. Rimante Minkeviciene er anerkjent for sin hjelp til å forberede nevronkulturene som brukes til de opprinnelige eksperimentene. All avbildning ble utført i Biomedicum Imaging Unit. Dette arbeidet ble støttet av Finlands akademi (D.M., SA 266351) og doktorgradsprogrammet Brain &Mind (A.A.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
