Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera och mäta aktin ringar och andra komponenter i membranet periodiska skelettet i axon inledande segmentet med hjälp av odlade råtta hippocampal nervceller och 3D-strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM).
Abstract
Axon initiala segmentet (AIS) är den plats där aktionspotentialer initierar och utgör ett transportfilter och diffusionsbarriär som bidrar till upprätthållandet av neuronal polaritet genom sortering av somato-dendritisk last. Ett membran periodiskt skelett (MPS) bestående av periodiska aktinringar ger en byggnadsställning för förankring av olika AIS-proteiner, inklusive strukturella proteiner och olika jonkanaler. Även om de senaste proteomiska metoderna har identifierat ett betydande antal nya AIS-komponenter, saknas detaljer om mps struktur och rollerna för dess enskilda komponenter. Avståndet mellan enskilda aktinringar i MPS (~190 nm) kräver anställning av superupplösningsmikroskopitekniker för att lösa de strukturella detaljerna i MPS. Detta protokoll beskriver en metod för att använda odlade råtta hippocampal nervceller för att undersöka den exakta lokaliseringen av ett AIS-protein i MPS i förhållande till sub-membranous aktin ringar med hjälp av 3D-strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM). Dessutom beskrivs en analytisk metod för att kvantitativt bedöma perioditeten hos enskilda komponenter och deras position i förhållande till aktinringar.
Introduction
Axon initiala segmentet (AIS) är en kort, unikt specialiserad region av proximal axon av ryggradsdjur nervceller1. AIS består av ett transportfilter och diffusionsbarriär som är avgörande för att upprätthålla neuronal polaritet genom att sortera somato-dendritisk last2,3,4,5,6,7. Dessutom gör AIS unika struktur det möjligt att rymma kluster av spänningsgrindade jonkanaler som underlättar dess funktion som platsen för åtgärdspotentialinitiering8. Ett mycket stabilt strukturellt komplex ligger till grund för AIS unika funktioner. Forskning under det senaste decenniet har visat närvaron av ett membran periodiskt skelett (MPS) som innehåller aktinringar kopplade med spektrin och ger en byggnadsställning för förankring av olika AIS-proteiner9,10.
Avståndet mellan aktinringar i MPS (~190 nm)9,10 ligger under upplösningsgränsen för konventionell ljusmikroskopi. Tidiga försök att använda elektronmikroskopi för att visualisera MPS var inte framgångsrika, eftersom de hårda förberedelseförfarandena misslyckades med att bevara MPS struktur. Således har superupplösningsmikroskopitekniker visat sig vara ovärderliga för att klargöra några av de strukturella detaljerna i MPS11. Förståelsen av AIS strukturella komplex, identiteten och funktionerna hos dess komponenter och dess spatiotemporal reglering är dock fortfarande ofullständig. Nyligen proteomiska studier lyckades skapa en betydande lista över proteiner som lokaliseras till AIS nära strukturella komponenter i AIS12,13. Ändå saknas detaljer om deras funktion och exakta plats i AIS-komplexet. Således fungerar superupplösningsmikroskopitekniker som ett viktigt verktyg för att undersöka dessa proteiners exakta positioner i förhållande till andra MPS-komponenter och undersöka deras funktioner. Flera lätta mikroskopitekniker kan uppnå upplösningar högre än ljusets diffraktiongräns, vissa kan till och med lokalisera enskilda molekyler. Många av dessa tekniker kräver dock vanligtvis specialiserade fluoroforer eller bildbuffertar, och bildförvärv är ofta tidsintensivt14.
3D strukturerad belysningsmikroskopi (3D-SIM), på grund av dess användarvänlighet och enkla krav på provberedning, kräver inga speciella reagenser för avbildning eller provberedning, fungerar bra med ett brett utbud av fluoroforer och prover, kan enkelt implementeras i flera färger och kan live-cellsavbildning15. Medan den bästa möjliga upplösning SIM-erbjudandet (~ 120 nm) är låg jämfört med många andra superupplösningstekniker, är det tillräckligt för många applikationer (till exempel för att lösa komponenterna i MPS i neuroner). Därför är det viktigt att överväga kravet på specifika applikationer för att avgöra om SIM är ett lämpligt val eller om en ännu högre upplösning är nödvändig. Här beskrivs ett protokoll för användning av odlade hippocampala nervceller och 3D-strukturerad belysningsmikroskopi (3D-SIM) för att undersöka positionen och organisationen av förmodade AIS-proteiner i förhållande till aktinringar i MPS, som implementeras i Abouelezz et al.16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Primära hippocampala nervceller som användes i dessa experiment skördades16 från embryonala dag 17 Wistar-råttembryon av båda könen enligt Helsingfors universitets etiska riktlinjer och finsk lag.
1. Provberedning
- På högkvalitativa glasöverdrag, låt rått hippocampala nervceller växa under glesa odlingsförhållanden (~ 5 000-10 000 celler / cm2) i 14 dagar (14 dagar i vitro).
OBS: Att använda glesa kulturer minskar risken för överlappande neuriter, vilket hjälper till att kvantifiera MPS. - Fixera nervceller med 4% paraformaldehyd i 12 min vid rumstemperatur. Tvätta täckslipet en gång i 0,2% BSA i PBS (BSA-PBS) och inkubera sedan i 10 min i en 1% lösning av Triton-X i PBS vid rumstemperatur. Tvätta en gång i BSA-PBS.
- Späd anti-ankyrin G antikroppar (1:200) i BSA-PBS. Tillsätt antikroppslösning till täckslipet och inkubera över natten vid 4 °C. Tillsätt valfritt anti-MAP2-antikroppar (se Materialtabell) till antikroppslösningen för att avgränsa den somato-dendritiska domänen.
- Tvätta cellerna en gång i BSA-PBS, följt av 0,1% Triton-X i PBS, gör sedan en slutlig tvätt i BSA-PBS.
- Späd fluorofor-märkta antimus sekundära antikroppar (1:200) (se Tabell över material) i BSA-PBS, lägg till täckslipet och inkubera i 1 h vid rumstemperatur. Tvätta cellerna en gång i BSA-PBS, en gång i 0,1% Triton-X i PBS, sedan en gång i PBS.
- Förbered en 1 μM-lösning av taggat falloidin i PBS (se Materialtabell) och lägg till den i cellerna. Inkubera i 2 h vid rumstemperatur. Tvätta cellerna en gång i PBS, en gång i 0,1% Triton-X i PBS, sedan en gång i PBS.
OBS: AlexaFluor488-taggad falloidin användes här, men andra taggar fungerar också. - För montering av täcket på en glasrutschbana, applicera en droppe monteringsmedia på en glasrutschbana, doppa täcket i avjoniserat vatten och doppa med en mjuk pappershandduk (för att ta bort överflödigt vatten).
- Placera täcket på glasrutschbanan. Inkubera vid rumstemperatur i 24 timmar.
OBS: Inga negativa effekter på provet observerades med hjälp av hårt inställt monteringsmedium (brytningsindex 1,47 efter härdning).
- Placera täcket på glasrutschbanan. Inkubera vid rumstemperatur i 24 timmar.
2. Bildbehandling
- Rådgör om möjligt med mikroskopianläggningens personal innan avbildning. Använd en nedsänkningsoljekalkylator (se Tabell över material) för att välja den nedsänkningsolja som är lämplig för provet.
- När proverna är klara, se till att täcksläparna är rena och fria från rester eller överflödiga monteringsmedier. Använd vid behov en bomullsspets doppad i vatten eller etanol för att rengöra. Placera provet i ett 3D SIM-kompatibelt mikroskop (se Materialtabell) och hitta en cell till bild.
- Justera effekten hos de relevanta laserlinjerna och exponeringstiderna för att maximera signal-till-brus-förhållandet utan att avsevärt bleka provet.
OBS: Ett bra signal-till-brus-förhållande kommer att visa ett tydligt rutnätsliknande utseende fokuserat på provet och leda till exakta högupplösta rekonstruktioner. 488 nm och 640 nm laser linjer användes för att visualisera F-aktin respektive ankyrin G. - Ange de övre och nedre gränserna för exemplet i z-dimensionen och fortsätt att hämta en stapel.
OBS: z-steg storlek på 125 nm användes här. - För framgångsrik SIM-rekonstruktion, se till att mikroskopiprogramvaran (se Tabell över material) har en optisk överföringsfil (OTF) lämplig för de använda färgämnena.
OBS: Dessa skapas och underhålls vanligtvis av specialiserad personal. I avsaknad av en funktionell OTF finns det också verktyg med öppen källkod för att utföra rekonstruktioner baserade på uppskattningar17. I detta arbete användes uppdaterade OTF filer kontrolleras av specialiserad personal. - Kör rekonstruktionsalgoritmen på stacken för att få en superupplöst rekonstruktion. Kontrollera rekonstruktionerna för kända artefakter och justera vid behov parametrarna för att korrigera dem.
Standardalgoritmparametrarna ger vanligtvis korrekta resultat. Många av dessa artefakter involverar några upprepade mönster: randiga linjer tillsammans med flera riktningar på ett z-plan, "ghosting" (upprepade funktioner som förekommer i olika z-plan) eller ett sexkantigt "bikake" mönster som dyker upp i vissa områden. Dessa artefakter kan ofta fixas med bättre provberedning, ett bättre signal-till-brus-förhållande, justera parametrarna för rekonstruktionsalgoritmen eller se till att brytningsindexet för den valda nedsänkningsoljan är lämpligt för monteringsmediet och provet. För en mer detaljerad diskussion om SIM-artefakter och ett fritt tillgängligt verktyg för att kontrollera förekomsten av artefakter, se Ball et al. 18 - Jämför SIM-rekonstruktionen med en bredfältsbild för att observera förbättringar i upplösningen.
- När du utför flerfärgs-SIM-kort använder du justeringsalgoritmen för att justera de olika kanalerna korrekt när en tillfredsställande rekonstruktion är klar.
OBS: Justeringsalgoritmen använder en justeringsreferensfil som genereras med hjälp av en mikrosfärpärlapreparat enligt mikroskoptillverkarens instruktioner.
3. Bildanalys
- Aktinringar i MPS har ett distinkt periodiskt utseende. Använd bildanalysprogramvara (se Tabell över material) och skapa en maximal projektionsbild med hjälp av alla brännplan där aktinringar är synliga.
- På den maximala projektionsbilden för maximal intensitet ritar du en vinkelrät linje över synliga intilliggande ringar och registrerar fluorescensintensiteten tillsammans med programvarans linje "Plot Profile"-funktion.
- För att beräkna det genomsnittliga avståndet mellan topparna, notera den lokala maximan i linjeprofilen och mät avståndet mellan enskilda intilliggande fluorescerande intensitetstoppar.
OBS: Detta kan enkelt beräknas, till exempel med hjälp av funktionen "findpeaks" i MATLAB eller (öppen källkod) GNU Octave-plattformen. - För att utvärdera colocalization av olika proteiner med aktinringar i MPS, kör en colocalization analys förfarande19,20,21 på SIM-rekonstruktioner av aktin och kandidatproteinet. Rita manuellt ett urval för att definiera AIS som en region av intresse för EzColocalization-pluginet i programvaruplattformen19 och kör analysen för att beräkna Pearsons korrelationskoefficient (PCC) för samlokalisering19,20,21. Ett PCC-värde nära 1 indikerar stark colocalization.
OBS: Detta protokoll sammanfattas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av odlade råtta hippocampal nervceller och 3D-SIM beskrivs ett protokoll för att visualisera och mäta aktin ringar och andra komponenter i MPS i AIS. Rekonstruktioner av bild stackar visade tydlig periodicitet av aktin ringar (figur 2A). I våra händer var det genomsnittliga inter-peak avståndet av aktin ringar i MPS, visualiserat med Alexa 488-taggade falloidin, 190,36 ± 1,7 nm (medelvärde ± SEM). Detta är i linje med det tidigare rapporterade genomsnittliga avståndet på ~ 190 nm mellan aktinringar i MPS. På samma sätt användes en anti-ankyrin G antikropp för att visualisera ankyrin G (figur 2B). Colocalization av ankyrin G och F-aktin testades i AIS med hjälp av en colocalization analys förfarande för att beräkna PCC av samlokalisering19,20,21. PCC för colocalization av ankyrin G och F-aktin fluorescens var 0,36 ± 0,03 (medelvärde ± SEM, figur 2B). Eftersom ankyrin G och aktinringar binder βIV-spektrin på olika domäner visar de inte signifikant colocalization. Dessa uppgifter har anpassats från Abouelezz et al.16
Bild 1: Schematisk representation av protokollet för provberedning för 3D-SIM-avbildning. Hippocampala nervceller skördas från råttembryon, dissocieras och får växa på glasöverdrag i kultur i 14 dagar. Cellerna fixeras och färgas sedan med hjälp av taggat falloidin och lämpliga antikroppar, sedan monterade på glasglas för 3D-SIM-avbildning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: 3D-SIM-rekonstruktion av membranet periodiska skelett (MPS) i axon initiala segmentet (AIS). (A) F-aktin (grön) och ankyrin G (magenta) visar en regelbunden fördelning i AIS, visualiserad av 3D-SIM. Skalstång = 1 μm. (B) Pearsons korrelationskoefficienter (PCC) för colocalization av ankyrin G med F-aktin i MPS i AIS. Medelvärdet PCC för ankyrin G var 0,36 (svart cirkel). Grå diamanter representerar enskilda celler (n = 16), mittlinjen representerar medianen, felstaplar representerar 25:e och 75:e percentilen. Uppgifterna är anpassade från Abouelezz et al.16Please klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en metod för att visualisera och mäta MPS-proteiner med hjälp av superupplösningstekniken. Eftersom aktinringar och andra MPS-komponenter visar en periodicitet på ~ 190 nm9,10, kan konventionella diffraktionsbegränsade avbildningsmetoder inte avslöja detaljerna i MPS. Flera mikroskopiinställningar kan lösa diffraktionsbegränsade strukturer i superupplösning, och SIM representerar ett robust och okomplicerat alternativ. Viktigt är att SIM är kompatibelt med de mest använda fluoroforerna, vilket ger betydande flexibilitet. Dessutom är SIM effektivt för att visualisera potentiellt dim strukturer i MPS, såsom aktinringar i latrunculinbehandlade nervceller22, liksom levande nervceller15.
En viktig aspekt för att detta protokoll skall lyckas är att bevara mps integritet i första hand. De mest kritiska stegen för lyckad SIM-avbildning sker under provberedningen. Till exempel ger måttlig fixering (4% PFA i 12 min vid rumstemperatur) och stark permeabilisering (1% Triton-X i 10 min) bästa resultat. Det är viktigt att komma ihåg att hårda behandlingar som kan krävas för specifika preparat kan ha en negativ effekt på mps strukturella integritet. Därför är det kanske bäst att överväga att ändra sådana behandlingar för att maximera bevarandet av MPS.
Den andra avgörande faktorn att tänka på när du förbereder prover för avbildning är att maximera märkningstätheten. Helst skulle varje molekyl märkas och detekteras. Till exempel används den anti-ankyrin G-antikropp som används i detta experiment ofta för att märka AIS. Det ger enastående prestanda i konventionell fluorescensmikroskopi, även när den används vid en utspädning på 1:1000 och inkuberas i bara 1 h vid rumstemperatur. För att få god märkningstäthet för superupplösningsmikroskopi är det dock mycket effektivt att använda 5-faldig den koncentrationen (1:200) och inkubera antikroppen över natten vid 4 °C. Även om de specifika kraven för varje antikropp eller märkningsteknik kommer att variera och måste bestämmas experimentellt, är det kanske bra att ha detta i åtanke.
Dessutom är det viktigt att notera att uppnåendet av ett högt signal-till-brus-förhållande lämpar sig väl för exakta och framgångsrika SIM-rekonstruktioner. En bra tumregel är att rutnätsmönstret ska vara synligt i de enskilda bilderna när SIM-modaliteten är engagerad. Detta är dock inte alltid möjligt.
Slutligen är det viktigt att notera att SIM är bland de svagaste superupplösningsteknikerna för att lösa kraft14. Således, medan det i allmänhet är tillräckligt för att avslöja periodicitet och övergripande organisation av MPS-proteiner, är det betydligt mindre kapabelt att ge detaljer om deras interaktioner än stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM)10. Dessutom är teknikens användbarhet som beskrivs här begränsad till studier av proteiner för vilka en specifik, välfungerande antikropp finns tillgänglig. Detta kan dock delvis kringgås genom exogena uttryck av taggade proteiner15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Dr Pirta Hotulainen är erkänd för sina kritiska kommentarer, ovärderliga för att förbereda detta manuskript. Dr. Rimante Minkeviciene är erkänd för sin hjälp med att förbereda de neuronala kulturer som används för de ursprungliga experimenten. All bildbehandling utfördes i Biomedicum Imaging Unit. Detta arbete stöddes av Finlands Akademi (D.M., SA 266351) och doktorandprogrammet Brain & Mind (A.A.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
