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Biology

सामयिक अनुप्रयोग Bioassay मच्छरों और फल मक्खियों के लिए कीटनाशक विषाक्तता की मात्रा निर्धारित करने के लिए

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63391
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Center for Evolution and Medicine, School of Life Sciences, Arizona State University, 2United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology

Summary

हम मच्छरों और फल मक्खियों में कीटनाशक संवेदनशीलता को मापने के लिए सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे की कार्यप्रणाली और महत्व का वर्णन करते हैं। प्रस्तुत परख उच्च throughput है, कीट द्रव्यमान का उपयोग करता है-इस प्रकार एकाग्रता के बजाय एक बड़े पैमाने पर relativized घातक खुराक की गणना के लिए अनुमति देता है-और संभावना अन्य इसी तरह के तरीकों की तुलना में कम परिवर्तनशीलता है.

Abstract

सार्वजनिक स्वास्थ्य और कृषि के लिए कीटनाशकों के निरंतर उपयोग ने व्यापक कीटनाशक प्रतिरोध और नियंत्रण विधियों को बाधित करने के लिए प्रेरित किया है। मच्छरों की आबादी की कीटनाशक प्रतिरोध निगरानी आमतौर पर रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) बोतल बायोएसेस या विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ट्यूब परीक्षणों के माध्यम से की जाती है। हालांकि, इन तरीकों के परिणामस्वरूप कीट के साथ चर कीटनाशक संपर्क के कारण मृत्यु दर के आंकड़ों में परिवर्तनशीलता की एक उच्च डिग्री हो सकती है, परीक्षण किए गए जीवों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या, आबादी के बीच द्रव्यमान में व्यापक भिन्नता, और लगातार बदलती पर्यावरणीय स्थितियों, चर परिणामों के लिए अग्रणी। यह पेपर सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे प्रस्तुत करता है, जो मच्छरों और फल मक्खियों दोनों के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिक बायोएसे के रूप में अनुकूलित है, ताकि कीटनाशक सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ बड़ी संख्या में कीड़ों का परीक्षण किया जा सके।

यह परख 1) हर जीव के साथ लगातार उपचार और कीटनाशक संपर्क सुनिश्चित करता है, 2) अत्यधिक विशिष्ट खुराक-प्रतिक्रिया घटता है कि उपभेदों और लिंगों के बीच औसत द्रव्यमान में अंतर के लिए खाते का उत्पादन करता है (जो क्षेत्र-एकत्र जीवों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है), और 3) सांख्यिकीय रूप से कठोर औसत घातक खुराक (एलडी50) की गणना के लिए अनुमति देता है ), जो प्रतिरोध अनुपात तुलना के लिए आवश्यक हैं- नैदानिक खुराक मृत्यु दर से एक वैकल्पिक निगरानी दृष्टिकोण, जिसका उपयोग लार्विसाइड प्रतिरोध निगरानी के लिए भी किया जाता है। इस परख सटीक phenotyping मच्छर आबादी के लिए एक पूरक उपकरण होगा और, के रूप में फल मक्खियों का उपयोग कर सचित्र, आसानी से अन्य कीड़ों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय है. हम तर्क देते हैं कि यह परख कई कीट प्रजातियों में जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक कीटनाशक प्रतिरोध के बीच के अंतर को भरने में मदद करेगी।

Introduction

मच्छर हर साल 700,000 से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार होते हैं, जो वे मनुष्यों को प्रसारित करते हैं, अकेले मलेरिया के कारण होने वाली मौतों में से आधे सेअधिक। मलेरिया और अन्य वेक्टर जनित रोगों के संचरण के खिलाफ मुख्य निवारक विधि कीटनाशकों का उपयोग है, अक्सर लंबे समय तक चलने वाले कीटनाशक जाल या इनडोर-अवशिष्ट छिड़काव के रूप में। हालांकि, कीटनाशक प्रतिरोध मच्छरों और अन्य कीट वैक्टरों के साथ-साथ कृषि कीटों के बीच व्यापक है, साथ ही साथ कृषि कीट 3,4। प्रतिरोध को प्रभावी ढंग से प्रबंधित करने के लिए, निगरानी महत्वपूर्ण महत्व की है5। इसके लिए, अत्यधिक सटीक और उच्च-थ्रूपुट प्रतिरोध का पता लगाने के तरीकों की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, मच्छरों के लिए सबसे व्यापक कीटनाशक प्रतिरोध निगरानी उपकरण डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट6 और सीडीसी बोतल बायोएसे7 हैं। फल मक्खियों के लिए अवशिष्ट संपर्क आवेदन विधि (सीडीसी बोतल bioassay के समान) एक आमतौर पर इस्तेमाल किया कीटनाशक bioassay 8,9,10 है. हालांकि, इन तरीकों से डेटा में परिवर्तनशीलता आमतौर पर उच्च होती है, सीडीसी बोतल एसेस में ~ 20-70% मृत्यु दर और डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षणों में 0-50% तक एक ही प्रयोगशाला मच्छर तनाव के माप के साथ जब सबलेथल खुराक11 के संपर्क में आता है। इस तरह की भिन्नता आश्चर्यजनक है क्योंकि अधिकांश प्रयोगशाला उपभेदों में सीमित आनुवंशिक भिन्नता से आबादी में सीमित कीटनाशक संवेदनशीलता भिन्नता होने की उम्मीद है। फिर भी, वहाँ अभी भी भिन्नता का एक उच्च स्तर bioassay परिणामों में मनाया जाता है.

इस भिन्नता के संभावित स्रोत सतह के माध्यम से अप्रत्यक्ष कीटनाशक जोखिम, विषम पर्यावरणीय प्रभाव, एक ही जीनोटाइप के व्यक्तियों के बीच सामान्य जैविक भिन्नता, और एक ही आबादी के नमूनों के द्रव्यमान में भिन्नता के कारण बायोएसे के भीतर नमूनों के बीच विषम कीटनाशक जोखिम का परिणाम हो सकते हैं। . उच्च replicability के साथ एक अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली विधि सामयिक अनुप्रयोग bioassay है। इस परख में, कीटनाशक सीधे प्रत्येक कीट13,14 पर लागू किया जाता है, एक ही परख के भीतर विभिन्न नमूनों के विषम जोखिम के कारक को हटाने. हालांकि, इस विधि की धीमी-थ्रूपुट प्रकृति के कारण, यह नियमित रूप से मच्छर आबादी के लिए कीटनाशक संवेदनशीलता निगरानी उपकरण के रूप में उपयोग नहीं किया जाता है। यह पेपर सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो उच्च-थ्रूपुट एक्सपोज़र के लिए अनुमति देता है, जबकि कीट द्रव्यमान में भिन्नता के लिए भी सही करता है, एक पैरामीटर जो कीटनाशक संवेदनशीलता12 में परिवर्तन से संबंधित है। चर कीटनाशक जोखिम से मृत्यु दर के आंकड़ों में शोर और बड़े पैमाने पर संबद्ध भिन्नता में कमी अधिक सटीक तकनीकी प्रतिरोध निगरानी11,15 के लिए अनुमति देगी। इस तरह के डेटा का उपयोग आनुवंशिक मार्करों, फिटनेस पैरामीटर और / या वेक्टर क्षमता के साथ फेनोटाइपिक प्रतिरोध को अधिक सटीक रूप से जोड़ने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे इस परख को आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है फल मक्खियों पर सामयिक अनुप्रयोग bioassay का उपयोग करके, एक छोटे शरीर कीट प्रजातियों.

उपर्युक्त अवशिष्ट संपर्क अनुप्रयोगों की मुख्य सीमा यह है कि कीटनाशक जोखिम एक ही परख के भीतर नमूने से नमूने तक भिन्न हो सकता है। सीडीसी बोतल bioassays और संपर्क विधि के मामले में, कीटनाशक जोखिम एक ही परख की प्रतिकृति के बीच भिन्न हो सकता है. कीटों को कीटनाशक के संपर्क में लाया जाता है जो या तो कांच की बोतल (सीडीसी बोतल बायोएसे और संपर्क विधि) के अंदर या गर्भवती कागजों (डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट) पर वितरित किया जाता है। दोनों सतहों (कांच और कागज) पर कीटनाशक की एकाग्रता ज्ञात जीनोटाइप की विभिन्न प्रजातियों की स्क्रीनिंग द्वारा ज्ञात और पूर्व निर्धारित की जाती है। हालांकि, संभावित रूप से कीट द्वारा अवशोषित करने के लिए उपलब्ध राशि उपयोग की गई सतह, कीटनाशक मिश्रण घटकों के आधार पर बहुत भिन्न हो सकती है, और कीटनाशक को सतह सामग्री16,17 में कैसे सजातीय रूप से वितरित किया जाता है। सीडीसी बोतल बायोएसे में, बोतल के अंदर कीटनाशक कोटिंग प्रत्येक प्रयोगशाला और उपयोगकर्ता द्वारा नियोजित प्रक्रियाओं पर निर्भर करती है। डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट में, कीटनाशक-उपचारित कागजात केंद्रीय रूप से उत्पादित होते हैं और इस प्रकार प्रयोगशालाओं में काफी सजातीय होने की संभावना होती है। हालांकि, डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट में, एक्सपोजर ट्यूब नमूनों को गैर-कीटनाशक-उजागर धातु जाल पर उतरने और आराम करने की अनुमति देती है, जिससे प्रत्येक परीक्षण के भीतर नमूनों के बीच संभावित विषम कीटनाशक जोखिम होता है। कीटनाशक की वास्तविक मात्रा को उठाया गया और प्रत्येक विधि के माध्यम से नमूनों द्वारा अवशोषित किया गया, अभी भी आगे18 का पता लगाने की आवश्यकता है।

इसके अतिरिक्त, सीडीसी बोतल bioassay, WHO ट्यूब टेस्ट, और संपर्क विधि सबसे अधिक सीमा assays केवल एक पूर्व निर्धारित कीटनाशक एकाग्रता का परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। यह दृष्टिकोण प्रतिरोध की उपस्थिति का सटीक रूप से पता लगा सकता है और प्रतिरोध निगरानी के लिए मूल्यवान है (खासकर जब प्रतिरोध फैल रहा है)। हालांकि, थ्रेशोल्ड एसेस प्रतिरोध की ताकत को निर्धारित नहीं कर सकता है, जो हस्तक्षेप उपकरणों की प्रभावकारिता का अधिक पूर्वानुमान हो सकता है। यदि इन विधियों के साथ कई कीटनाशक सांद्रता का उपयोग किया जाता है, तो उनका उपयोग तीव्रता के रूप में किया जा सकता है। सीडीसी बोतल bioassay और डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षण के लिए तीव्रता assays निगरानी 6,19 में इस अंतर को संबोधित करने के लिए 5x और 10x पूर्वनिर्धारित भेदभाव dosages का परीक्षण करके पेश किया गया है। प्रतिरोधी आबादी के बीच अंतर करने की अधिक क्षमता प्रदान करते हुए, 3-5 (पूर्व निर्धारित) खुराक घातक सांद्रता की गणना करने के लिए सीमित संकल्प प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न आकारों के मच्छरों का उपयोग इस तरह के assays में किया जाता है। फिर भी, द्रव्यमान को मापना महत्वपूर्ण है क्योंकि बड़े नमूनों को मारने के लिए उच्च खुराक की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि द्रव्यमान की प्रति इकाई प्रभावी खुराक एक छोटे जीव12 की तुलना में बहुत कम होगी। एक बड़े पैमाने पर सापेक्षीकृत घातक खुराक (प्रति कीट द्रव्यमान कीटनाशक की मात्रा) की गणना अधिक सामान्य घातक एकाग्रता (उदाहरण के लिए, प्रति सतह क्षेत्र कीटनाशक की मात्रा) की तुलना में अधिक उपयोगी मीट्रिक होगी क्योंकि यह लिंगों, आबादी और जीनोटाइप के बीच कीट द्रव्यमान की भिन्नता पर विचार करता है। इस तरह के डेटा प्रयोगशाला और क्षेत्र के भीतर जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक प्रतिरोध के बीच के अंतर को भरने में मदद करेंगे और ज्ञात औसत द्रव्यमान के कीड़ों की आबादी का इलाज करने के लिए आवश्यक आवेदन एकाग्रता की गणना करने का एक आसान तरीका भी प्रदान कर सकते हैं।

बड़े पैमाने पर सापेक्षीकृत घातक खुराक का उपयोग जो 50% नमूनों (एलडी50) को मारता है, इसमें कई अन्य लाभ भी शामिल हैं। मिलीग्राम / किग्रा (= एनजी / मिलीग्राम) में एक विशिष्ट यौगिक की विषाक्तता का आकलन मानव और पशु चिकित्सा विष विज्ञान14 में मानक है, और एलडी50 मान सामग्री सुरक्षा डेटा शीट पर पाए जाते हैं। घातक खुराक भी एक विशेष प्रजाति की ओर विभिन्न रसायनों या विभिन्न प्रजातियों की ओर एक ही रसायन के बीच विषाक्तता की सीधी तुलना की अनुमति देतेहैं 20, साथ ही उपन्यास कीटनाशकों और रसायनों के उच्च गुणवत्ता वाले मूल्यांकन13। इसके अतिरिक्त, एलडी50 नैदानिक खुराक मृत्यु दर परिणामों से व्युत्पन्न लोगों की तुलना में अधिक सार्थक और सटीक प्रतिरोध अनुपात प्रदान कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आबादी में मौजूद प्रतिरोध स्तर का एक अतिरेक हो सकता है। इसलिए, इस परख अन्य bioassays21 के लिए अनुशंसित की तुलना में अधिक नमूनों से व्युत्पन्न बड़े पैमाने पर relativized घातक खुराक के आधार पर अधिक कठोर प्रतिरोध निगरानी प्रदान करके नियमित निगरानी कार्यक्रमों के लिए उपयुक्त होगा.

सामयिक अनुप्रयोग विधि का उपयोग मच्छरों और मक्खियों के लिए कीटनाशक संवेदनशीलता निगरानी में मानक कीटनाशक संवेदनशीलता बायोएसेस के विकल्प के रूप में किया गया है जब प्रतिरोध पहले से ही ज्ञात या संदिग्ध22,23 है, साथ ही साथ कुछ कीट कीटों में निगरानी के लिए24 अधिक सटीक रूप से प्रतिरोध प्रोफाइल और कीटनाशक आंतरिक विषाक्तता का आकलन करनेके लिए 21 . सामयिक अनुप्रयोग bioassays में, कीटनाशक प्रत्येक जीव के लिए लागू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कीटनाशक जोखिम में न्यूनतम भिन्नता होती है। यह पेपर थोड़ा अनुकूलित और बेहतर विधि प्रस्तुत करता है जो कीटनाशक जोखिम को कम अवधि में बड़ी संख्या में कीड़ों पर लागू करने की अनुमति देता है, जबकि कीट द्रव्यमान22 के लिए भी नियंत्रित करता है। replicability के अच्छे स्तर के साथ इस उच्च-थ्रूपुट विधि नियमित कीटनाशक संवेदनशीलता निगरानी के लिए एक उपयोगी अतिरिक्त उपकरण हो सकता है।

Protocol

नोट: कीटनाशक मानव, पशु और पर्यावरणीय खतरों का कारण बन सकतेहैं। सावधानी, प्रशिक्षण और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण अत्यधिक सलाह दी जाती है। उपयोग किए गए सभी कीटनाशकों और सॉल्वैंट्स के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा शीट का पालन करना सुनिश्चित करें।

1. रियर नमूने

  1. 3-5 दिन पुराने वयस्क मच्छरों को पालें।
    नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल एडीज एजिप्टी पालन के लिए शर्तों को दर्शाता है, संयुक्त राष्ट्र के दिशानिर्देशों के खाद्य और कृषि संगठन का बारीकी से पालन करताहै।
    1. 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस और 75 ± 12:12 घंटे प्रकाश और अंधेरे साइकिल चालन के साथ 5% सापेक्ष आर्द्रता पर सभी जीवन चरणों के पीछे मच्छरों।
    2. विआयनीकृत पानी में डुबोकर और खमीर26 जोड़कर मच्छर के अंडे को हैच करें, या 30 मिनट के लिए वैक्यूम चैंबर के अंदर जलमग्न अंडे रखें।
      नोट: दोनों तरीके पानी के भीतर ऑक्सीजन सामग्री को कम करते हैं और हैचिंग27 बढ़ाते हैं।
    3. ट्रे के भीतर नए हैच किए गए लार्वा मछली के भोजन (या एक समकक्ष आहार जैसे ग्राउंड कैट किबल) को खिलाएं और लार्वा घनत्व को ट्रे के बीच यथासंभव समान रखें क्योंकि लार्वा घनत्व विकासको प्रभावित करता है 12 (उदाहरण के लिए, 200-250 लार्वा प्रति ट्रे जिसमें कुल 1.5 लीटर पानी होता है)।
    4. लार्वा को हर दूसरे दिन तब तक खिलाएं जब तक कि वे पिल्ला चरण (लगभग 7-10 दिन) तक नहीं पहुंच जाते, जिससे आवश्यकतानुसार भोजन की मात्रा बढ़ जाती है।
      नोट: जब बहुत कम खिलाया जाता है, तो लार्वा विकास अवरुद्ध हो जाएगा, और लार्वा एक दूसरे को खा सकते हैं। जब बहुत अधिक खिलाया जाता है, तो लार्वा मर सकता है, जिससे पानी खराब हो जाता है।
    5. एक बार प्यूपे विकसित होने के बाद, उन्हें वयस्क मच्छर पिंजरों में एक पानी के कटोरे में दैनिक रूप से स्थानांतरित करें और 10% सुक्रोज समाधान विज्ञापन लिबिटम प्रदान करें।
    6. वयस्क उद्भव के पहले दिन रिकॉर्ड करें। उभरने के शुरू होने के 2 दिन बाद पिंजरे से शेष प्यूपे को हटा दें।
      नोट: पुरुष मच्छर तेजी से उभरते हैं। पुरुषों और महिलाओं के उद्भव को अलग-अलग नोट करें और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक परीक्षण के लिए पर्याप्त पुरुष और महिलाएं उपलब्ध हैं।
    7. परीक्षण के लिए 3-5-दिन पुराने मच्छरों को प्राप्त करने के लिए प्यूपे को हटाने के बाद 3 दिनों तक प्रतीक्षा करें।
  2. रियर फल मक्खियों (ज़्यूरिखविश्वविद्यालय 28 के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ढीले)।
    1. रियर ड्रोसोफिला 23 ± 1 डिग्री सेल्सियस और 60 पर स्टॉक बोतलों में उपभेदों 12:12 घंटे प्रकाश और अंधेरे साइकिल चालन के साथ 5% सापेक्ष आर्द्रता ±।
      नोट: ड्रोसोफिला स्टॉक बोतलों में एक मानक मक्खी माध्यम का 75 मिलीलीटर होना चाहिए, जिसे पहले बोतलों के तल में तरल के रूप में डाला जाता है और फिर रात भर को ठोस करने की अनुमति दी जाती है।
    2. ओवरपॉपुलेशन और मोल्ड विकास को रोकने के लिए हर दो सप्ताह में ताजा भोजन के साथ नई स्टॉक बोतलों में कॉलोनियों को स्थानांतरित करें। ऐसा करने के लिए, हाथ से आयोजित कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) डिस्पेंसर का उपयोग करके मक्खियों को नीचे गिराएं, एक आइस पैक या चिल टेबल पर वजन वाले कागज पर एनेस्थेटिक मक्खियों को स्थानांतरित करें, और मक्खियों को एक अच्छी तरह से इत्तला देने वाले पेंटब्रश का उपयोग करके एक ताजा स्टॉक बोतल में ब्रश करें। इस प्रक्रिया के दौरान मक्खियों को भोजन में गिरने और डूबने से रोकने के लिए बोतलों को अपने किनारों पर रखना सुनिश्चित करें।

2. gravimetric दृष्टिकोण का उपयोग कर कीटनाशक योगों तैयार

  1. एक धुएं हुड के अंदर 0.1 मिलीग्राम सटीकता के साथ एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग करके ग्रेविमेट्रिक दृष्टिकोण के बाद पहला स्टॉक समाधान बनाएं।
    नोट: gravimetric दृष्टिकोण कीटनाशक और विलायक जोड़ा की मात्रा को मापने के लिए द्रव्यमान का उपयोग करता है। मानक अभ्यास (वॉल्यूमेट्रिक दृष्टिकोण) को पहले स्टॉक समाधान तैयार होने पर जोड़े गए (ठोस) कीटनाशक की मात्रा को मापने के लिए एक विश्लेषणात्मक पैमाने की आवश्यकता होगी; हालांकि, विलायक की मात्रा को जोड़ा गया और निम्नलिखित सभी dilutions केवल मात्रा से मापा जाता है। ग्रेविमेट्रिक दृष्टिकोण में उच्च स्तर की सटीकता होती है और इसलिए इसे पसंद किया जाता है।
    1. पहले स्टॉक समाधान के लिए लक्ष्य कीटनाशक एकाग्रता और लक्ष्य मात्रा निर्धारित करें (अधिकतम 10 मिलीलीटर की सिफारिश की जाती है यदि फ्रीजर में भंडारण करते समय स्पिलेज को रोकने के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग करके 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग किया जाता है) और गणना करें कि Eq (1) का उपयोग करके जोड़ने के लिए कितना कीटनाशक सक्रिय घटक (एआई):
       Equation 1 (1)
    2. एक भंडारण ट्यूब (15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बड़ी मात्रा के लिए अनुशंसित, 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्क्रू कैप ट्यूब ों को 1 एमएल या उससे कम की मात्रा के लिए अनुशंसित) और कीटनाशक और विलायक नाम, लक्ष्य एकाग्रता और तैयारी की तारीख के साथ लेबल तैयार करें। एक रैक या धारक के भीतर पैमाने पर ट्यूब और ढक्कन रखें और पैमाने को तारे करें।
    3. चरण 2.1.1 से निर्धारित ठोस या तरल कीटनाशक एआई की वांछित मात्रा का वजन करें। (उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि डेटा के लिए उपयोग किए जाने वाले डेल्टामेथ्रिन) ट्यूब में और द्रव्यमान को रिकॉर्ड करते हैं।
    4. पैमाने पर तारे और विलायक की वांछित मात्रा (लक्ष्य मात्रा के बराबर) ट्यूब में जोड़ें, ढक्कन को तुरंत बंद करें, और द्रव्यमान रिकॉर्ड करें। वाष्पीकरण से बचने के लिए विलायक (यहां उपयोग किए जाने वाले एसीटोन) को जोड़ने के तुरंत बाद ट्यूब के ढक्कन को बंद करें और समाधान को मिलाएं।
    5. कमरे का तापमान रिकॉर्ड करें। कुछ सॉल्वैंट्स, जैसे एसीटोन, तापमान के आधार पर मात्रा (और परिणामस्वरूप घनत्व) में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकते हैं।
    6. यदि तुरंत संग्रहीत किया जाता है, तो ट्यूब के ढक्कन को पैराफिल्म में लपेटें (वाष्पीकरण को कम करने के लिए), इसे एक ट्यूब रैक / धारक में रखें (सीधे रखने और रिसाव को रोकने के लिए), पन्नी में कवर करें (यूवी एक्सपोजर को रोकने के लिए), इसे एक रीसीलेबल प्लास्टिक बैग में रखें (वाष्पीकरण को कम करने के लिए), और बैग को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। यदि तुरंत संग्रहीत नहीं किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि ढक्कन सुरक्षित है और पन्नी या प्रकाश-संरक्षित कंटेनर में कवर किया गया है।
    7. जोड़े गए विलायक की मात्रा द्वारा जोड़े गए कीटनाशक एआई के द्रव्यमान को विभाजित करके स्टॉक समाधान की वास्तविक सांद्रता (मिलीग्राम / एमएल) की गणना करें (और तरल रूप में कीटनाशक की मात्रा जोड़ी गई है)। जोड़े गए विलायक (या तरल कीटनाशक) की मात्रा की गणना करने के लिए, ज्ञात घनत्व द्वारा जोड़े गए द्रव्यमान को विभाजित करें जो रिकॉर्ड किए गए तापमान के लिए उपयुक्त है।
    8. कुल जोड़े गए द्रव्यमान (कीटनाशक और विलायक) को जोड़े गए कुल आयतन (विलायक और कीटनाशक, यदि तरल रूप में हो) से विभाजित करके स्टॉक समाधान के घनत्व (जी / एमएल) की गणना करें। तरल द्रव्यमान को वॉल्यूम में कनवर्ट करने के लिए चरण 2.1.7 देखें।
  2. क्रमिक रूप से 10% dilutions के माध्यम से प्रारंभिक स्टॉक समाधान पतला. यदि आवश्यक हो, तो बायोएसे के लिए कीटनाशक सांद्रता की लक्ष्य सीमा की पहचान करने के लिए एक प्रारंभिक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र बनाने के लिए इन सीरियल dilutions का उपयोग करें।
    1. प्रत्येक ट्यूब में जोड़ने के लिए कीटनाशक स्टॉक समाधान और विलायक की मात्रा की गणना करें (उदाहरण के लिए, पिछली एकाग्रता के 10% के 10 मिलीलीटर कमजोर पड़ने के लिए विलायक के 9 मिलीलीटर में पतला कीटनाशक स्टॉक समाधान का 1 एमएल)।
    2. भंवर 10 s के लिए स्टॉक समाधान. तराजू पर एक पूर्व लेबल पहले कमजोर पड़ने ट्यूब तारे. एक पिपेट का उपयोग करके पहले कमजोर पड़ने ट्यूब के लिए स्टॉक समाधान की आवश्यक मात्रा जोड़ें। तुरंत दोनों ट्यूबों के ढक्कन को बंद करें और पहले कमजोर पड़ने वाली ट्यूब में द्रव्यमान रिकॉर्ड करें।
    3. Tare पहली कमजोर पड़ने ट्यूब फिर से और विलायक की आवश्यक मात्रा जोड़ें. ढक्कन को तुरंत बंद करें, जोड़े गए विलायक के द्रव्यमान को रिकॉर्ड करें, और 10 सेकंड के लिए पहला कमजोर पड़ने वाला भंवर करें।
    4. शेष dilutions के लिए चरण 2.2.2 और 2.2.3 दोहराएँ।
    5. चरण 2.1.6 में ऊपर वर्णित के रूप में सभी dilutions संग्रहीत करें।
    6. चरण 2.1.7 का पालन करके dilutions की वास्तविक सांद्रता की गणना करें।
    7. जोड़े गए कुल द्रव्यमान (कीटनाशक समाधान और विलायक) को जोड़े गए कुल आयतन (कीटनाशक समाधान और विलायक) से विभाजित करके प्रत्येक कीटनाशक तनुकरण के घनत्व की गणना करें। प्रत्येक सीरियल कमजोर पड़ने के लिए, Eq (2) के बाद नए कमजोर पड़ने के घनत्व की गणना करने के लिए पिछले कीटनाशक स्टॉक कमजोर पड़ने के घनत्व का उपयोग करें:
      Equation 2 (2)
  3. वैकल्पिक: सीरियल कमजोर पड़ने से छोटे वेतन वृद्धि के साथ कीटनाशक dilutions बनाएँ।
    1. प्रारंभिक सीरियल dilutions, पिछले परीक्षणों, या प्रकाशित साहित्य की खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की सहायता से बनाने के लिए प्रत्येक नए समाधान की सांद्रता और मात्रा का चयन करें।
      नोट: चयनित सांद्रता के परिणामस्वरूप प्रोबिट विश्लेषण की अनुमति देने के लिए इस सीमा से न्यूनतम तीन सांद्रता के साथ 0-100% की मृत्यु दर सीमा होनी चाहिए।
    2. प्रत्येक नए कमजोर पड़ने के लिए स्टॉक समाधान के रूप में सीरियल dilutions का उपयोग करें और 10-गुना dilutions के बीच नए dilutions बनाने के लिए चरण 2.2 का पालन करें।
  4. वैकल्पिक: कीटनाशक समाधान एलीकोट. यदि कीटनाशक समाधानों की बड़ी मात्रा बनाई जाती है, तो संदूषण, वाष्पीकरण और स्टॉक समाधानों के क्षरण से बचने के लिए समाधानों को 1.5 मिलीलीटर स्क्रू-कैप ट्यूबों में एलीकोट करें, जो लगातार हैंडलिंग और प्रकाश के संपर्क में आते हैं।
    1. समाधान ों को एलीकोट करें, सबसे कम एकाग्रता से शुरू करें और संभावित संदूषण को कम करने के लिए उच्चतम एकाग्रता की ओर काम करें। खोलने से पहले 10 s के लिए भंवर द्वारा प्रत्येक स्टॉक समाधान मिश्रण और वांछित मात्रा (जैसे, 0.5 मिलीलीटर) एक prelabeled पेंच टोपी ट्यूब में pipetting.
    2. एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक प्रकाश प्रतिरोधी कंटेनर में ऐलीकोट स्टोर करें।
      नोट: यह नियमित रूप से (मासिक) स्टॉक कीटनाशक dilutions से सीधे लिया छोटे नए एलीकोट के साथ ऐलीकोट को बदलने की सिफारिश की है। यह वाष्पीकरण या यूवी गिरावट के कारण संदूषण को अन्य प्रयोगों या परिवर्तनों में ले जाने की क्षमता को सीमित करेगा, जबकि नमूनों का उपयोग बेंच पर किया जाता है। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और वर्षों बाद भी पुनरारंभ किया जा सकता है, जब तक कि कीटनाशक समाधान ठीक से संग्रहीत किए जाते हैं (चरण 2.1.6 देखें) और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जाता है।
  5. विलायक वाष्पीकरण की निगरानी करने के लिए भंडारण से पहले मेनिस्कस को चिह्नित करने के लिए एक स्थायी मार्कर पेन का उपयोग करें। ऐलीकोट बनाने के लिए कीटनाशक समाधान को हटाते समय, हर बार समाधान को हटाने पर मेनिस्कस को चिह्नित करें।

3. सामयिक आवेदन bioassay कार्यस्थान तैयार करें

नोट: मच्छरों या मक्खियों से बचने के आसान कैप्चर के लिए एक बेंचटॉप कीट हैंडलिंग तम्बू में काम करने की सिफारिश की जाती है। एक कीट हैंडलिंग तम्बू की छवियों के लिए पूरक चित्रा S1 देखें।

  1. फ्रीजर, भंवर से आवश्यक कीटनाशक समाधानों को तुरंत हटा दें, और उपयोग करने से पहले कीटनाशकों को कमरे के तापमान पर गर्म करने के लिए उन्हें कमरे के तापमान पर एक प्रकाश प्रतिरोधी कंटेनर में रखें।
    नोट: कीटनाशक एआई कूलर तापमान पर विलायक से अलग हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एसीटोन की मात्रा तापमान के साथ बदलती है, जो लागू कीटनाशक खुराक को बदल सकती है। समाधानों को मिलाना और उन्हें कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति देने से कीटनाशक समाधानों का उपयोग करते समय स्थिरता सुनिश्चित करने में मदद मिलती है।
  2. सामग्री की तालिका में संदर्भित के रूप में कीट हैंडलिंग तम्बू में सामयिक आवेदन परख के लिए सभी आवश्यक उपकरण और सामग्री सेट करें।
  3. एसीटोन एलीकोट प्रति 5 धोने को पूरा करके विश्लेषणात्मक ग्रेड एसीटोन के साथ सिरिंज बैरल और सुई को साफ करें। कुल 25 धोने के लिए 5 अलग-अलग ऐलीकोट के साथ इसे पूरा करें। सिरिंज और पुनरावर्तक पिपेटर भागों के लिए पूरक चित्रा S2 देखें।
    1. एसीटोन प्रत्येक के 0.5 मिलीलीटर के साथ 5 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब सेट करें।
    2. पहली ट्यूब से एसीटोन के 0.025 मिलीलीटर के साथ सिरिंज बैरल भरें और फिर प्लंजर पर तेजी से नीचे धकेलकर एसीटोन को अपशिष्ट कंटेनर में निष्कासित करें। एक ही एसीटोन एलीकोट से कुल पांच एसीटोन वॉश को पूरा करने के लिए चार और बार दोहराएं। फिर, सिरिंज बैरल को पूरी तरह से हवा से भरें और अपशिष्ट कंटेनर में हवा और संभावित एसीटोन अवशेषों को निष्कासित करें। हवा के साथ तीन "धोने" को पूरा करने के लिए दो और बार दोहराएं।
    3. एसीटोन के शेष 4 ट्यूबों के लिए चरण 3.3.2 को दोहराएँ।
    4. सिरिंज प्लंजर और सुई के शीर्ष के बीच बैरल के भीतर एक हवा की जेब बनाएँ, बैरल (~ 5 मिमी) में प्लंजर को थोड़ा ऊपर खींचकर।
      नोट: यह एयर पॉकेट प्लंजर को कीटनाशक समाधानों से संपर्क करने से बचाता है और कीटनाशक कैरीओवर को कम करता है।
    5. सामयिक अनुप्रयोग के लिए उपयोग करने के लिए तैयार होने तक सिरिंज को एक तरफ सेट करें।
  4. लागू करने के लिए खुराक युक्त एक कुंजी बनाएँ और यादृच्छिक संख्या या पत्र जनरेटर के बाद यादृच्छिक आईडी असाइन करें ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  5. ब्लाइंड मृत्यु दर मूल्यांकन के लिए यादृच्छिक आईडी के साथ प्लास्टिक होल्डिंग कप लेबल करें।
    नोट:: यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और बाद के दिन और समय पर पुनरारंभ किया जा सकता है। यदि रुकने के दौरान कुछ घंटे से अधिक समय बीत जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए चरण 3.3 को दोहराने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है कि सिरिंज साफ है और कीटनाशक समाधानों को कीड़ों को खुराक देने से पहले लगभग एक घंटे तक फ्रीजर में वापस रखने के लिए और फिर चरण 3.1 को दोहराने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।

4. सामयिक bioassay के लिए नमूने तैयार करें. एक प्रक्रियात्मक अवलोकन के लिए चित्र 1 देखें

  1. छांटें और मच्छरों का वजन
    1. साँस लेने से सक्शन द्वारा संचालित एक एस्पिरेटर का उपयोग करते हुए, परख के लिए आवश्यक 3-5-दिन पुराने वयस्क मच्छरों की वांछित संख्या को एस्पिरेट करें, जिसमें क्षतिग्रस्त व्यक्तियों के लिए खाते में अतिरिक्त शामिल है। मच्छरों को एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें (प्रति ट्यूब 100 मच्छरों तक) एस्पिरेटर की नोक को टिप के चारों ओर लपेटे हुए कपास के साथ ट्यूब में रखकर और धीरे से साँस छोड़ें और एस्पिरेटर को टैप करें। जब एस्पिरेटर टिप को हटा दिया जाता है और फिर ढक्कन के साथ कैप किया जाता है तो ट्यूब को प्लग करने के लिए कपास का उपयोग करें। एक बार में बहुत सारे मच्छरों के साथ एस्पिरेटर और ट्यूबों को भरने से बचें, क्योंकि यह मच्छरों पर अतिरिक्त तनाव जोड़ता है और मृत्यु का कारण बन सकता है।
    2. संक्षेप में ट्यूबों में मच्छरों को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट के लिए रखकर या उन्हें बर्फ की ट्रे में बर्फ के नीचे दफन करके दस्तक दें।
      नोट: मच्छरों को कम से कम मृत्यु दर29 के साथ कई घंटों के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा सकता है; हालांकि, संभावित नकारात्मक प्रभावों को कम करने के लिए मच्छरों के बर्फ पर होने की अवधि को कम करना सबसे अच्छा है।
    3. कीट हैंडलिंग तम्बू के लिए नीचे दस्तक मच्छरों को स्थानांतरित करें और ध्यान से बर्फ पर रखे गए प्लास्टिक ट्रे (जैसे, पेट्री डिश) पर मच्छरों को टिप दें। एक समय में केवल 50 मच्छरों को डालें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक इसके नीचे शांत ट्रे को छूता है और नीचे खटखटाया जाता है।
    4. मच्छरों को धीरे-धीरे उन्हें संदंश के साथ पैर (ओं) (या पंखों) द्वारा उठाकर सेक्स द्वारा सॉर्ट करें और प्रत्येक सेक्स को एक अलग होल्डिंग कप में रखें। छँटाई करते समय प्रत्येक लिंग के मच्छरों की संख्या की गणना करें और वांछित संख्या तक पहुंचने पर रोकें। छँटाई करते समय, किसी भी मच्छर को हटा दें जो घायल हो जाते हैं (उदाहरण के लिए, लापता पैर) या अतिरिक्त बड़े (जैसे, असामान्य रूप से बढ़े हुए पेट) या छोटे होते हैं (आसानी से नग्न आंखों के साथ उस आबादी के औसत मच्छर के आकार से छोटे के रूप में प्रतिष्ठित)।
      नोट: उपांगों द्वारा मच्छरों को संभालने से उनके नरम प्राथमिक निकायों (जैसे, पेट) को संरचनात्मक क्षति कम हो जाती है।
    5. 0.1 मिलीग्राम परिशुद्धता के साथ एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग करके मच्छरों के प्रत्येक कप के वजन को रिकॉर्ड करें।
      1. पैमाने पर एक ढक्कन के रूप में एक पेट्री डिश के साथ एक खाली कप रखें और पैमाने पर तारे। कंटेनर में मच्छरों को डालें, ढक्कन को शीर्ष पर रखें, और कंटेनर को पैमाने पर रखें।
      2. स्कोर शीट पर संयुक्त वजन और नमूनों की संख्या रिकॉर्ड करें ( पूरक फ़ाइल 2 देखें)। नमूनों के कप को तुरंत बर्फ पर वापस रखें ताकि उन्हें स्थिर रखा जा सके।
      3. चरणों को 4.1.5.1-4.1.5.2 दोहराएं जब तक कि नमूनों के सभी कप ों का वजन न हो जाए।
    6. तैयार मच्छरों को यादृच्छिक आईडी के साथ लेबल किए गए बर्फ पर रखे गए अलग-अलग कपों में 20-25 के समूहों में विभाजित करें। मच्छरों को स्थानांतरित करते समय, संदंश के कारण तनाव और शारीरिक क्षति को कम करने का लक्ष्य रखें। आदर्श रूप से, मच्छरों को संदंश का उपयोग करके केवल 1-2 बार चुनें: एक बार छँटाई / वजन के लिए और प्रयोगात्मक कप में स्थानांतरित करने के लिए संभावित दूसरी बार।
      नोट: प्रति कप मच्छरों की एक आदर्श संख्या 20-25 है, जो एक प्रतिकृति के लिए पर्याप्त है, मृत्यु दर का आकलन करने के लिए उचित है, और कप में घनत्व-प्रेरित तनाव / मृत्यु के परिणामस्वरूप नहीं होना चाहिए।
  2. सॉर्ट करें और फल मक्खियों का वजन करें
    1. 7 s के लिए CO2 का उपयोग कर मक्खियों anesthetize.
      नोट: यदि मक्खियों को 7 सेकंड से अधिक समय के लिए सीओ2 के संपर्क में लाया जाता है, तो उन्हें30 जागने पर रेंगने और उड़ान भरने में परेशानी हो सकती है।
    2. मक्खियों को बेंच पेपर में लपेटे गए आइस पैक पर डालें और पुरुषों और महिलाओं को अलग करने और गिनने के लिए एक ठीक-ठीक इत्तलादार पेंटब्रश का उपयोग करें।
    3. पेंटब्रश का उपयोग धीरे से चुने गए मक्खियों को लेने और उन्हें एक साफ, खाली स्टॉक बोतल में रखने के लिए करें। नर और मादा फल मक्खियों (जैसे, 15 पुरुषों और 15 मादाओं) की समान संख्या चुनें और स्टॉक बोतलों को स्ट्रेन नाम और फल मक्खी कुल (जैसे, कैंटन-एस, 30 मक्खियों) के साथ लेबल करें।
      नोट: मादा और नर फल मक्खियों की समान संख्या होना महत्वपूर्ण है क्योंकि नर फल मक्खियों कोमादाओं की उपस्थिति से हटाए जाने के बाद एक-दूसरे के प्रति बढ़ती आक्रामकता का अनुभव हो सकता है। इसलिए, गैर-कीटनाशक मृत्यु दर या चोटों से बचने के लिए, पुरुषों और महिलाओं की समान संख्या होना सबसे अच्छा है (या नर फल मक्खियों को पूरी तरह से छोड़ दें)।
    4. एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग करके फल मक्खियों की प्रत्येक बोतल का वजन रिकॉर्ड करें।
      1. एक खाली शीशी रखें (एक यादृच्छिक आईडी के साथ लेबल किया गया, चरण 3.4 को देखें) एक पेट्री डिश के साथ पैमाने पर ढक्कन के रूप में और पैमाने को तारे के रूप में।
        नोट: फल मक्खियों के साथ उपयोग के लिए ग्लास शीशियों की सिफारिश की जाती है क्योंकि वे स्थैतिक को काफी कम करते हैं।
      2. 7 s के लिए सीओ2 का उपयोग करके शीशी की यादृच्छिक आईडी के अनुरूप फल मक्खियों की बोतल को एनेस्थेटिक करें।
      3. फल मक्खियों को वजन कागज पर डालें और शीशी में मक्खियों को पेश करने के लिए एक फ़नल के रूप में कागज का उपयोग करें। फल मक्खियों की शीशी के ऊपर पेट्री डिश ढक्कन रखें और इसे पैमाने पर रखें।
      4. स्कोर शीट पर संयुक्त वजन और नमूनों की संख्या रिकॉर्ड करें और फिर तुरंत फल मक्खियों की शीशी को बर्फ की ट्रे में रखें, ढक्कन अभी भी शीर्ष पर मक्खियों को भागने से रोकने के लिए।
      5. फल मक्खियों की प्रत्येक बोतल के लिए चरण 4.2.4.1-4.2.4.4 दोहराएँ।
  3. जब उपर्युक्त चरण पूर्ण हो जाते हैं, तो तुरंत अगले अनुभाग पर जाएं।

5. खुराक के नमूने

  1. उचित कीटनाशक एकाग्रता के साथ सिरिंज लोड करें। कम से कम केंद्रित खुराक के साथ शुरू करें और जीवों के प्रत्येक समूह के साथ सबसे केंद्रित खुराक की ओर काम करें। अपशिष्ट को रोकने के लिए, केवल कीटनाशक की आवश्यक मात्रा के साथ सिरिंज को लोड करें और साथ ही एक अनुशंसित अतिरिक्त 2 μL।
  2. बर्फ पर एक ट्रे के ऊपर रखे गए वजन वाले कागज (ओं) पर नमूनों को टिप दें। उन नमूनों को अलग करें जो एक साफ, कीटनाशक-मुक्त पेंटब्रश या कपास झाड़ू का उपयोग करके एक साथ करीब हैं ताकि खुराक के लिए प्रत्येक नमूने तक आसान पहुंच की अनुमति मिल सके। मच्छरों के लिए, पेंटब्रश का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए भी करें कि प्रत्येक नमूना अपने डोरसम पर बिछा रहा है और उनकी वेंट्रल सतह का सामना करना पड़ रहा है।
  3. सिरिंज का उपयोग करते हुए, मच्छरों के लिए वेंट्रल वक्ष और पेट क्षेत्र और फल मक्खियों के लिए डोरसम में कीटनाशक समाधान (या नियंत्रण के लिए एसीटोन) की एक बूंद लागू करें। छोटे आकार के कीड़ों जैसे फल मक्खियों और मच्छरों के लिए 0.5 μL बूंद (जिसके लिए 25 μL सिरिंज की आवश्यकता होती है) जैसे छोटे आकार के कीड़ों के लिए एक 0.2 μL बूंद (जिसके लिए 10 μL सिरिंज की आवश्यकता होती है) लागू करें।
    नोट: कीटनाशक संवेदनशीलता उपांगों (जैसे पंख, पैर, या सूंड) की तुलना में प्राथमिक शरीर के अंगों (जैसे सिर, छाती और पेट) के बीच काफी भिन्न नहीं होती है। इसलिए, आवेदन साइट के रूप में खुराक बूंद प्राथमिक शरीर के लिए लागू किया जाता है के रूप में लंबे समय तक सटीक होना आवश्यक नहीं है। वेंट्रल वक्ष और पेट क्षेत्र को मच्छरों के लिए चुना जाता है क्योंकि वे अक्सर अपने पृष्ठीय पक्ष पर लेटते हैं जब नीचे खटखटाया जाता है, जबकि डोरसम को फल मक्खियों के लिए चुना जाता है क्योंकि वे अक्सर खटखटाए जाने पर अपने वेंट्रल पक्ष पर लेटते हैं। अनुप्रयोग साइट की यह कम विशिष्टता इस विधि के थ्रूपुट को बढ़ाने में मदद करती है।
  4. तुरंत नमूनों को लेबल किए गए प्लास्टिक कप में वापस डालें और कप को नेटिंग और रबर बैंड के साथ कवर करें। कप को एक होल्डिंग ट्रे में रखें और कप पर किसी भी नमूने को नोट करें जो इस प्रक्रिया में मारे गए, क्षतिग्रस्त या बच गए थे (उन्हें उस कप में नमूनों की अंतिम गिनती में बाहर करने के लिए)। पहले कप के लिए, उस समय को रिकॉर्ड करें जब खुराक पूरी हो जाती है।
  5. वजन वाले कागज (ओं) को बदलें जिस पर नमूनों को खुराक के बीच कीटनाशक संदूषण से बचने के लिए रखा जाता है।
  6. प्रत्येक कप के लिए खुराक को दोहराएं जब तक कि सभी नमूनों को उचित कीटनाशक सांद्रता के साथ खुराक नहीं दी जाती है और अंत के समय को रिकॉर्ड किया जाता है जब सभी नमूनों को खुराक दी जाती है।
  7. एक भिगोए हुए कपास की गेंद के माध्यम से प्रत्येक कप के लिए 10% सुक्रोज समाधान प्रदान करें और अगले दिन मृत्यु दर का आकलन होने तक कप को अलग रखें। मच्छरों को 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 75 ± 5% सापेक्ष आर्द्रता 5 के साथ स्टोर करें और फल 60 ±5 % सापेक्ष आर्द्रता के साथ 23 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर उड़ता है।
    नोट: oversaturation या undersaturation से बचने के लिए कपास गेंदों निचोड़ते समय सावधान रहना. कपास की गेंदों को नम होना चाहिए लेकिन टपकाव नहीं होना चाहिए। कप में चीनी पानी टपकने से नमूनों की मृत्यु हो सकती है और इस प्रकार कीटनाशक की मृत्यु दर के आकलन को प्रभावित किया जा सकता है।

6. मृत्यु दर का आकलन

  1. कीटनाशक जोखिम की शुरुआत के बाद 24 घंटे में रिकॉर्ड नमूना मृत्यु दर। मच्छरों को जीवित के रूप में वर्गीकृत करें यदि वे उड़ सकते हैं और खुद को सीधा पकड़ सकते हैं; मृत के रूप में यदि वे अचल या ataxic हैं (खड़े होने या उड़ान के लिए उड़ान भरने में असमर्थ), जैसा कि डब्ल्यूएचओ6 द्वारा वर्णित है। फल मक्खियों 8,33 के लिए एक ही मृत्यु दर के आकलन का पालन करें।
    नोट: विलंबित मृत्यु दर का आकलन करने के लिए, दैनिक चीनी पानी के परिवर्तन के साथ 48 और 72 घंटे के बाद मृत्यु दर का मूल्यांकन किया जा सकता है।
  2. मृत्यु दर दर्ज होने के बाद, नमूनों के सभी कप को कम से कम 1 घंटे के लिए फ्रीजर में एक निहित बैग में रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी नमूने निपटान या बाद के उपयोग से पहले मृत हैं (उदाहरण के लिए, आणविक या रासायनिक विश्लेषण)।

7. प्रतिकृति निष्पादित करें

  1. नमूनों के एक नए सेट पर चरण 3-6 को दोहराएं, प्रत्येक दिन एक ही समय में प्रतिकृति करने के लिए देखभाल करें, क्योंकि कीटनाशक संवेदनशीलता दिन34 के समय के आधार पर बदल सकती है।
  2. घातक खुराक के सटीक अनुमान के लिए प्रत्येक एकाग्रता के लिए कम से कम 3 प्रतिकृति सुनिश्चित करें जो 50% नमूनों को मारता है (एलडी50)। यदि परिवर्तनशीलता का एक उच्च स्तर मनाया जाता है, तो अधिक प्रतिकृतियों को शामिल करें।
  3. सभी डेटा एकत्र करने के बाद विश्लेषण पूरा करें।

8. परिणामों का विश्लेषण करें

  1. किसी स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा रिकॉर्ड करें और डेटा को अनमास्क करने के लिए यादृच्छिक ID कुंजी का उपयोग करें (संदर्भ चरण 3.4). सांख्यिकीय प्रोग्राम R35 (पूरक फ़ाइल 4 में उदाहरण R कोड देखें) या पसंद 36 के अन्य सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण के लिए डेटा को पाठ फ़ाइल के रूप में सहेजें (पूरक फ़ाइल 3 में उदाहरण डेटा देखें).
  2. सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम के भीतर, निम्नलिखित विश्लेषण पूरा करें। एक उदाहरण R कोड के लिए पूरक फ़ाइल 4 देखें।
    1. नीचे दिए गए Eq (3) के बाद प्रति नमूना द्रव्यमान (mg) कीटनाशक (ng) की खुराक की गणना कीजिये:
      Equation 3 (3)
    2. मृत्यु दर की गणना करें और प्रत्येक नियंत्रण37 में देखी गई मृत्यु दर के सापेक्ष मृत्यु दर को सही करने के लिए एबॉट के सूत्र37 को लागू करें। वैकल्पिक रूप से, मृत्यु दर को सही करने के लिए श्नाइडर-ओरेली (1947) सूत्र का उपयोगकरें। या तो सूत्र के साथ, प्रत्येक नियंत्रण में मृत्यु दर की परवाह किए बिना सभी डेटा पर सुधार लागू करें, जैसा कि पहलेवर्णित 37 और39 को लागू किया गया था, जब तक कि नियंत्रण डेटा असामान्य रूप से उच्च न हो (नीचे चर्चा देखें)।
      नोट: एबॉट के सूत्र और समकक्ष विकल्प, जैसे कि श्नाइडर-ओरेली सूत्र, नियंत्रणों में नहीं देखी गई मृत्यु दर की सीमा तक आनुपातिक रूप से मृत्यु दर के मूल्यों को समायोजित करते हैं और उन कपों के लिए मृत्यु दर में कमी का कारण नहीं बनेंगे जिनमें 100% मृत्यु दर थी। अधिक जानकारी के लिए, इन सूत्रों के लिए उद्धृत संदर्भ देखें.
    3. सही मृत्यु दर डेटा को प्रोबिट (संभावना इकाई) मान40 में बदलें और कीटनाशक खुराक और परिवर्तित मृत्यु दर डेटा के बीच रैखिक प्रतिगमन करें। रैखिक मॉडल (ओं) के फिट का आकलन करने के लिए ची-स्क्वायर परीक्षण का उपयोग करें।
      नोट: 0 (0% मृत्यु दर) या 1 (100% मृत्यु दर) की मृत्यु दर मान प्रोबिट परिवर्तन को पूरा करने से पहले डेटा से निकाल दिए जाते हैं। यह प्रोबिट परिवर्तन की प्रकृति के कारण आवश्यक है। जैसे, ग्राफ किए गए डेटा में सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण या कोई अन्य डेटा शामिल नहीं होगा जिसके परिणामस्वरूप 0% या 100% मृत्यु दर (एबॉट के सुधार को लागू करने के बाद) हुई थी।
    4. एलडी50 और 95% विश्वास अंतराल (सीआई) प्रति नमूना तनाव, जनसंख्या, और / या लिंग पहले से प्रकाशित विधियों 39,41,42 के बाद गणना करें।
    5. नोट: यदि दो उपभेदों के 95% सीआई ओवरलैप नहीं करते हैं, तो उपभेदों में काफी अलग खुराक प्रतिक्रियाएं होती हैं।
    6. यदि लागू हो, तो संदर्भ /नियंत्रण तनाव के LD 50 द्वारा ब्याज के तनाव के LD50 को विभाजित करके प्रतिरोध अनुपात (RRs ) की गणना करें।

Figure 1
चित्रा 1: सामयिक आवेदन परख प्रोटोकॉल आरेख. सामयिक आवेदन परख प्रोटोकॉल (ए) बर्फ पर नमूनों को छँटाई के साथ शुरू होता है, इसके बाद (बी) एक विश्लेषणात्मक पैमाने पर नमूनों का वजन, (सी) कीटनाशक समाधान (ओं) के साथ नमूनों की खुराक, और (डी) 24 एच प्रतीक्षा अवधि पोस्ट कीटनाशक एक्सपोजर 10% सुक्रोज समाधान विज्ञापन लिबिटम (एक भिगोया हुआ कपास की गेंद के माध्यम से) तक पहुंच के साथ, मृत्यु दर मूल्यांकन के बाद। लाल तीर मच्छरों (बाएं) और फल मक्खियों (दाएं) के लिए लक्ष्य कीटनाशक आवेदन स्थान का संकेत देते हैं। ध्यान दें कि छवि स्केल करने के लिए नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

इन प्रतिनिधि परिणामों में Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) के दो अलग-अलग उपभेदों और ज्ञात नॉकडाउन प्रतिरोध उत्परिवर्तन F1534C और V1016I (IICC जीनोटाइप) के साथ फ्लोरिडा से एक अलग क्षेत्र तनाव शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (कैंटन: एस स्ट्रेन) को चित्रित किया गया है।

चित्रा 2 और चित्रा 3 उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए तनाव और लिंग परीक्षण द्वारा प्रत्येक जीव की खुराक प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं। चूंकि प्रत्येक तनाव के भीतर नर और मादा मच्छरों की खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था (टी = 1.70, पी = 0.098 रॉक के लिए और टी = 0.64, पी = 0.527 आईआईसीसी के लिए), प्रत्येक मच्छर तनाव के भीतर दोनों लिंगों से डेटा पूल किया गया था। ROCK और IICC के लिए द्रव्यमान-सापेक्षीकृत LD50 क्रमशः 0.008 ng/mg (95% CI: 0-0.104) और 0.336 ng/mg (95% CI: 0.235-0.438) हैं। इन मूल्यों के 95% सीआई ओवरलैप नहीं होते हैं, जो उपभेदों की काफी अलग खुराक प्रतिक्रियाओं को दर्शाते हैं। आईआईसीसी स्ट्रेन का आरआर (रॉक स्ट्रेन के सापेक्ष) 41.7 है, जिसे डब्ल्यूएचओ के अनुसार, अत्यधिक प्रतिरोधीमाना जाता है। कैंटन-एस फल मक्खियों के लिए, द्रव्यमान-सापेक्षीकृत एलडी50 0.213 एनजी / मिलीग्राम (95% सीआई: 0-0.490) है।

Figure 2
चित्रा 2: सामयिक अनुप्रयोग bioassay का उपयोग कर मच्छरों के प्रतिनिधि डेटा. डेल्टामेथ्रिन और मच्छरों का उपयोग करके उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे से प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया डेटा: (ए) मादा एई एजिप्टी रॉक (एन = 880) और आईआईसीसी (एन = 550) उपभेदों, (बी) पुरुष एई एजिप्टी रॉक (एन = 880) और आईआईसीसी (एन = 569) उपभेदों। डेल्टामेथ्रिन परीक्षण सांद्रता 0.00075 एनजी / μL से 9.68705 एनजी / μL तक थी, और डेल्टामेथ्रिन की खुराक प्रति औसत मच्छर द्रव्यमान (मिलीग्राम) लागू (एनजी) एक्स-अक्ष पर परिलक्षित होती है। मृत्यु दर को y-अक्ष पर एक अनुपात के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक डेटा बिंदु क्लस्टर के माध्यम से काली रेखा तनाव और लिंग-विशिष्ट रैखिक प्रतिगमन का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फल मक्खियों के प्रतिनिधि डेटा सामयिक आवेदन bioassay का उपयोग कर. डेल्टामेथ्रिन और फल मक्खियों का उपयोग करके उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सामयिक अनुप्रयोग बायोएसेसे प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया डेटा: डी मेलानोगास्टर कैंटन-एस तनाव (एन = 1014)। Deltamethrin परीक्षण सांद्रता 0.00499 से 5.02876 ng / μL तक थी, और डेल्टामेथ्रिन की खुराक लागू (एनजी) प्रति औसत फल मक्खी द्रव्यमान (मिलीग्राम) एक्स-अक्ष पर परिलक्षित होती है। मृत्यु दर को y-अक्ष पर एक अनुपात के रूप में दिखाया गया है। काली रेखा रैखिक प्रतिगमन का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: बेंचटॉप कीट हैंडलिंग तम्बू. Benchtop कीट हैंडलिंग तम्बू सामयिक आवेदन परख के दौरान मच्छरों या मक्खियों से बचने के आसान कब्जा के लिए प्रयोग किया जाता है। संरचना को A में बंद किया जाता है और B में खुला होता है। इस संरचना को पीवीसी पाइप और ठीक-जाल कपड़े के साथ बनाया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: सिरिंज और पुनरावर्तक applicator इकाई. सिरिंज और पुनरावर्तक एप्लिकेटर इकाई का उपयोग कीटों को खुराक देने के लिए किया जाता है। मुख्य भागों में 1) सुई, 2) सिरिंज बैरल, 3) प्लंजर, 4) रिपीटर, और 5) रिपीटर बटन शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: यादृच्छिककरण स्क्रिप्ट: प्रत्येक प्रयोग के सभी कप के लिए गैर-पक्षपाती लेबल बनाने के लिए यादृच्छिकीकरण स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: मृत्यु दर स्कोर शीट: मृत्यु दर के मूल्यांकन में सहायता के लिए मृत्यु दर स्कोर शीट। शीट में रिकॉर्ड करने के लिए अन्य सभी महत्वपूर्ण जानकारी रिकॉर्ड करने के लिए स्थान भी शामिल हैं, जैसा कि प्रोटोकॉल में संदर्भित है, जैसे कि कीटनाशक अनुप्रयोग प्रारंभ और अंत समय। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3: उदाहरण मृत्यु दर डेटा: चित्र 2 बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली उदाहरण डेटा फ़ाइल. स्तंभ शीर्षक विवरण निम्नानुसार हैं: "id" = प्रत्येक डेटा बिंदु का पहचान कोड; "प्रजाति" = प्रजातियों का नाम (उदाहरण के लिए, एडीज एजिप्टी); "कीटनाशक" = कीटनाशक का नाम शीर्ष रूप से लागू किया जाता है (उदाहरण के लिए, डेल्टामेथ्रिन); "तनाव" = मच्छर तनाव का नाम (उदाहरण के लिए, रॉक); "दिनांक" = प्रारंभ दिनांक सामयिक आवेदन; "सेक्स" = मच्छरों का लिंग; "उम्र" = मच्छरों की उम्र (युवा = 3-5-दिन की उम्र; बूढ़ा = 4 सप्ताह पुराना); "total.mosq" = बैच में तौले गए मच्छरों की कुल संख्या; "वजन" = बैच के भीतर सभी मच्छरों का वजन (मिलीग्राम); "एकाग्रता" = कीटनाशक की एकाग्रता (μg / mL); "सिरिंज" = सिरिंज की बूंद मात्रा (एमएल); "खुराक" = प्रत्येक मच्छर (एनजी) पर लागू कीटनाशक सक्रिय घटक की मात्रा; "कुल" = प्रत्येक कप में मच्छरों की संख्या; "मृत" = प्रत्येक कप में मृत मच्छरों की संख्या। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 4: आर विश्लेषण कोड: उदाहरण R कोड जिसका उपयोग Probit विश्लेषण को पूरा करने के लिए किया जा सकता है (जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 8 में वर्णित है)। प्रतिनिधि परिणाम (पूरक उदाहरण डेटा फ़ाइल के माध्यम से सुलभ) इस आर कोड के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

यह पेपर मच्छरों और फल मक्खियों के लिए सामयिक आवेदन परख के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया को आसानी से क्षेत्र में और अन्य जीवों के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि इसके लिए न्यूनतम विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। नीचे संबोधित इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों, संभावित संशोधनों, समस्या निवारण सलाह, विधि की सीमाओं, और इस विधि के महत्व हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण: प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण चरण हैं, जो गलत तरीके से पूरा होने पर, बायोएसे के परिणामों को काफी प्रभावित कर सकते हैं: कीटनाशक एकाग्रता सटीकता, नमूना नॉकडाउन और मृत्यु दर मूल्यांकन।

कीटनाशक एकाग्रता सटीकता:
replicable खुराक प्रतिक्रिया घटता और सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए सटीक कीटनाशक समाधान होना बेहद महत्वपूर्ण है। कीटनाशक समाधान की तैयारी के लिए वॉल्यूमेट्रिक दृष्टिकोण सीडीसी बोतल बायोएसे7 और सामयिक अनुप्रयोगों13,14,43 दोनों के लिए साहित्य के भीतर अधिक आम है। हालांकि, यहां वर्णित गुरुत्वाकर्षण दृष्टिकोण (तापमान-विशिष्ट) घनत्व को शामिल करने के माध्यम से तापमान के विचार के कारण स्वाभाविक रूप से अधिक सटीक है, जिससे अधिक सटीक सूत्रीकरण तैयारी होती है।

नमूना नॉकडाउन:
नमूनों को नीचे गिराना इस विधि का एक महत्वपूर्ण घटक है और कीटनाशक और वजन माप के सटीक प्रशासन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, जीवों को खटखटाने में अनिवार्य रूप से शारीरिक तनाव और क्षति का खतरा होता है, जैसा कि पहले दिखाया गया था30। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए नमूनों को खटखटाते समय सतर्क और सावधान रहें कि i) प्रत्येक नमूने को एक समान अवधि के लिए खटखटाया जाता है, ii) नॉकडाउन की लंबाई को न्यूनतम रखा जाता है, और iii) नॉकडाउन की विधि को सभी नमूनों में सुसंगत रखा जाता है। इसके अतिरिक्त, कीटनाशक आवेदन से पहले नॉकडाउन विधि का अलग से परीक्षण करने की सलाह दी जाती है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि विधि सफल है और 10% से अधिक नियंत्रण मृत्यु दर को प्रेरित नहीं करती है। प्रारंभिक परीक्षण में अनुभवहीन उपयोगकर्ता के लिए अधिक समय लग सकता है, जिससे लंबे समय तक नॉकडाउन समय हो सकता है। इसलिए, पहले assays से परिणामों की व्याख्या करते समय सावधान रहें।

मृत्यु दर का आकलन:
मृत्यु दर का आकलन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब कीटनाशक पूरी तरह से नहीं मारता है, लेकिन केवल मच्छर या मक्खी को नीचे गिराता है या मारता है। इसलिए, इस बात से अवगत होना महत्वपूर्ण है कि कीटनाशक लक्ष्य जीव को कैसे प्रभावित करता है और शुरू करने से पहले "मृत" (या खटखटाया गया) जीवों के लिए एक स्पष्ट परिभाषा है। इसके अतिरिक्त, यह सिफारिश की जाती है कि एक ही व्यक्ति को भिन्नता को कम करने के लिए खुराक और प्रतिकृति के बीच मृत्यु दर का आकलन किया जाए।

प्रोटोकॉल संशोधन: नीचे वर्णित कई संशोधनों को इसकी बहुमुखी प्रतिभा और पहुंच में सुधार करने के लिए इस प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है।

छोटे या बड़े आकार के कीड़ों के लिए परख अनुकूलन:
छोटे या बड़े नमूनों का उपयोग करते समय, क्रमशः कीटनाशक की एक छोटी या बड़ी खुराक की मात्रा को लागू करने की सलाह दी जाती है। एक उदाहरण के रूप में, हमने 0.5 μL खुराक को 0.2 μL खुराक के लिए कम करके फल मक्खियों के लिए मच्छर प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। सुनिश्चित करें कि सही सिरिंज आकार चुना खुराक मात्रा के लिए चुना गया है।

क्षेत्र कीड़े के लिए परख अनुकूलन:
क्षेत्र कीटों का उपयोग करते समय, कीट के आकार में अधिक भिन्नता हो सकती है। इसलिए, छोटे समूहों (जैसे, प्रति कप) में कीड़ों का वजन एक बड़े समूह के बजाय अनुशंसित किया जाएगा (उदाहरण के लिए, एक प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी कीड़े)। यह क्षेत्र कीट द्रव्यमान में अंतर के साथ जुड़े कीटनाशक संवेदनशीलता में संभावित भिन्नता को पकड़ने में मदद कर सकता है।

उपकरण संशोधन:
कीट हैंडलिंग तम्बू: नमूने की खुराक को एक कीट हैंडलिंग तम्बू के तहत पूरा किया जा सकता है जो बस पीवीसी पाइप और मच्छर जाल के साथ बनाया गया है। यह एक संलग्न कमरे (जैसे, कीट) का एक विकल्प हो सकता है और उन क्षेत्रों में संभावित कीटनाशक संदूषण को खत्म करने में मदद कर सकता है जहां कीट पालन हो सकता है। इस कीट हैंडलिंग तम्बू का निर्माण करना आसान है और कम लागत (~ $ 70)। वैकल्पिक रूप से, पिंजरे को संभालने वाला एक कीट खरीदा जा सकता है (~ $ 425)।

चिल टेबल: बर्फ पैक या बर्फ की ट्रे का उपयोग नमूने को खटखटाने और / या नमूने को गिराने के लिए किया जा सकता है।

इनक्यूबेटर: इनक्यूबेटर को नमूने को पालने और कीटनाशक उपचार के बाद 24 घंटे के लिए नमूने को पकड़ने के लिए अनुशंसित किया जाता है। यदि एक इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है, तो इसका निर्माण किया जा सकता है। इनक्यूबेटर बनाने के लिए आवश्यक उपकरणों में एक अछूता कंटेनर, ह्यूमिडिफायर, गर्मी केबल, आर्द्रता और तापमान नियंत्रक, और एक प्रकाश शामिल है, जिसे ~ $ 170 की कुल लागत तक जोड़ना चाहिए, पिछले तरीकों के बाद और विस्तार करनाचाहिए।

कप पकड़ना: हालांकि प्लास्टिक के कप का उपयोग उपचारित नमूने को क्रमबद्ध करने और पकड़ने के लिए किया जाता है, मोम-पंक्तिबद्ध पेपर कप या कांच के कंटेनर उपयुक्त विकल्प होंगे।

जीव और जीवन चरण संशोधन:
यह विधि अन्य वैक्टर, कीड़े, और / या आर्थ्रोपोड्स जैसे कि क्यूलेक्स क्विंकफेसिएटस मच्छर32,घर मक्खियों 32, और तिलचट्टे45, साथ ही साथ गैर-वयस्क जीवन चरणों के साथ उपयोग के लिए बहुत अनुकूलहै, जैसे कि मच्छर लार्वा46।

सामयिक अनुप्रयोग स्थान संशोधन:
यह विधि मच्छरों के लिए वेंट्रल वक्ष और पेट क्षेत्र में कीटनाशक को लागू करने का वर्णन करती है (और फल मक्खियों के लिए डोरसम)। हालाँकि, अन्य अनुप्रयोग स्थानों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि एक्सपोज़र साइट सुसंगत न हो। स्थिरता महत्वपूर्ण है क्योंकि कीटनाशक संवेदनशीलता आवेदन स्थान32 के आधार पर भिन्न हो सकती है।

समस्या निवारण सलाह: इस विधि में कई चरण हैं जो शुरू में चुनौतीपूर्ण हैं। नीचे वर्णित सबसे आम मुद्दों में से कुछ हैं जो एक मुठभेड़ कर सकते हैं।

कीटनाशक समाधान ों का रिसाव/वाष्पीकरण:
कीटनाशकों को आमतौर पर एसीटोन में भंग कर दिया जाता है, जो एक अत्यधिक वाष्पशील यौगिक है। इसका मतलब है कि एसीटोन कमरे के तापमान पर जल्दी से वाष्पित हो जाता है, जिससे समय के साथ कीटनाशक सांद्रता बढ़ जाती है। यदि कीटनाशक समाधान लीक या वाष्पीकरण प्रतीत होते हैं, तो समाधानों को रीमेक करें, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब का ढक्कन कसकर चालू है, और डबल-चेक करें कि भंडारण प्रोटोकॉल का ठीक से पालन किया जा रहा है (उदाहरण के लिए, पैराफिल्म का उपयोग किया जा रहा है, और ट्यूबों को सीधे संग्रहीत किया जाता है)। यदि लीक जारी रहता है, तो विभिन्न तापमानों पर एसीटोन अनुभवों की मात्रा में परिवर्तन के लिए अधिक जगह की अनुमति देने के लिए ट्यूबों को कम मात्रा में भरने का प्रयास करें। इसके अतिरिक्त, यदि विलायक के रूप में एसीटोन का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि ट्यूबों को एसीटोन भंडारण (जैसे, एफईपी, टीएफई और पीएफए प्लास्टिक) के लिए रेट किया गया है। यदि हाइड्रोफोबिक कीटनाशकों का उपयोग कर रहे हैं, तो समाधानों को कांच की शीशियों में संग्रहीत करें (जैसा कि हाइड्रोफोबिक कीटनाशक प्लास्टिक से कम कांच का पालन करते हैं)। वाष्पीकरण की निगरानी करने के लिए भंडारण से पहले समाधान के मेनिस्कस को चिह्नित करना भी अच्छा अभ्यास है।

जीवों का वजन करते समय माइक्रोबैलेंस पर बहने वाला वजन:
यदि पैमाने पर वजन पढ़ना बह रहा है (धीरे-धीरे ऊपर या नीचे जा रहा है), तो यह स्थिर के कारण हो सकता है। बहाव अक्सर तब होता है जब प्लास्टिक की वस्तुओं में जीवों का वजन होता है, क्योंकि प्लास्टिक आसानी से एक स्थिर चार्ज पकड़ सकता है। इससे बचने के लिए, वजन वाले प्लास्टिक कंटेनर के नीचे एक वजन कागज रखा जा सकता है, या कांच जैसे गैर-प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग किया जा सकता है।

असामान्य मृत्यु दर के परिणाम:
ऐसे कई तरीके हैं जिनके द्वारा मृत्यु दर के परिणाम असामान्य लग सकते हैं, जैसे नियंत्रण में उच्च मृत्यु दर या सभी कीटनाशक खुराकों में उच्च / कम मृत्यु दर का निरीक्षण करना। प्रत्येक परिदृश्य समस्या निवारण के लिए निम्न मामलों की समीक्षा करें।

उच्च नियंत्रण मृत्यु दर
यदि नियंत्रण समूह (10% या उससे अधिक) में उच्च मृत्यु दर है, तो नॉकडाउन विधि और नमूनों को खटखटाए जाने के समय की लंबाई का मूल्यांकन करें। यदि संभव हो, तो उस समय की लंबाई को कम करें जिसके लिए नमूनों को खटखटाया जाता है। नियंत्रण में उच्च मृत्यु दर पर विचार करने के लिए अन्य संभावित कारकों में शामिल हैं i) यह जांचना कि क्या इनक्यूबेटर सेटिंग्स सही हैं- असामान्य तापमान और / या आर्द्रता मृत्यु दर में वृद्धि हो सकती है। तापमान और आर्द्रता को एक स्वतंत्र डेटा लकड़हारा के साथ जांचा जाना चाहिए। ii) कीट हैंडलिंग का आकलन करना। कीड़ों को बहुत अधिक या बहुत मोटे तौर पर संभालने से उच्च मृत्यु दर हो सकती है। iii) यह जांचना कि क्या नियंत्रण समूह के इलाज के लिए उपयोग किए जाने वाले 100% एसीटोन में या इंस्ट्रूमेंटेशन पर कोई कीटनाशक संदूषण नहीं है। एसीटोन को बदलें और एसीटोन या इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों को साफ करें। बार-बार दस्ताने को बदलकर, स्पिलेज को रोककर, और उपकरणों की सफाई करके संदूषण से बचें। ध्यान दें कि पूरक फ़ाइल 3 में, नियंत्रण (एसीटोन-केवल) कप के भीतर अधिकतम दो मच्छरों की मृत्यु हो गई। मृत्यु दर के इस स्तर को उच्च नहीं माना जाता है (यह 10% से कम है), और इसलिए, चिंता का कोई कारण नहीं था।

सभी उजागर समूहों में उच्च मृत्यु दर (लेकिन नियंत्रण समूहों में नहीं)
परीक्षण के लिए कम कीटनाशक सांद्रता या छोटी खुराक की मात्रा का उपयोग करें। उपयोग की जाने वाली खुराक न्यूनतम खुराक से ऊपर हो सकती है जो मृत्यु दर को प्रेरित नहीं करेगी। सही खुराक सीमा की पहचान करने के लिए कई 10-गुना dilutions का उपयोग करें, और संदूषण को बाहर निकालें। संदूषण से बचने के लिए, सबसे कम एकाग्रता के साथ खुराक शुरू करें और उच्चतम एकाग्रता की ओर काम करें। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को नियमित रूप से एसीटोन और / या इथेनॉल के साथ साफ किया जाता है, नमूने पर लागू खुराक बहुत छोटी होती है, और यहां तक कि थोड़ा सा भी क्रॉस-संदूषण परिणामों को प्रभावित कर सकता है।

सभी उजागर समूहों में कम मृत्यु दर
उच्च कीटनाशक सांद्रता का उपयोग करें। उपयोग की जाने वाली खुराक सभी आबादी में मृत्यु दर का कारण बनने के लिए बहुत कम हो सकती हैं। सही खुराक सीमा की पहचान करने के लिए, नमूनों को कई और 10 गुना केंद्रित खुराक के लिए उजागर करें। सुनिश्चित करें कि कीटनाशक समाधान समाप्त या अवक्रमित नहीं हुए हैं (संभावित रूप से उच्च तापमान या प्रकाश जोखिम के कारण)। यदि समाधान समाप्त हो गए हैं या अपमानित होने का संदेह है, तो समाधानों को रीमेक करें और सुनिश्चित करें कि उचित भंडारण स्थितियों का पालन किया जाए।

प्रतिकृतियों/दिनों के बीच असंगत मृत्यु दर
दिन का वह समय जब कीड़े कीटनाशक के संपर्क में आते हैं, तो व्यक्त प्रतिरोध के स्तर को प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से चयापचय प्रतिरोध34 के लिए। मृत्यु दर में परिवर्तन में योगदान करने वाले संभावित चर के रूप में दिन के समय से बचने के लिए प्रत्येक दिन समय की एक ही खिड़की के दौरान इस प्रोटोकॉल को दोहराएं। प्रतिकृतियों के बीच असंगत मृत्यु दर में योगदान करने वाले अन्य संभावित कारकों में शामिल हैं i) नमूनों को प्रयोगों के बीच अलग-अलग पाला जा रहा है। सुनिश्चित करें कि सभी नमूने एक ही आयु सीमा के हैं, एक ही तापमान और समान घनत्व और भोजन की उपलब्धता पर पाले जाते हैं। ii) कीटनाशक सांद्रता समय के साथ अपमानजनक या एसीटोन वाष्पीकरण के कारण अधिक केंद्रित हो रही है। समाधान रीमेक और उचित भंडारण की स्थिति सुनिश्चित करें। iii) असंगत मृत्यु दर स्कोरिंग। सुनिश्चित करें कि एक ही व्यक्ति मृत्यु दर स्कोर करता है या टीम में लगातार उपयोग करने के लिए एक स्पष्ट प्रोटोकॉल विकसित करता है। मृत्यु दर स्कोरिंग में पूर्वाग्रह को कम करने के लिए अंधा स्कोरिंग का उपयोग करें।

सॉर्टिंग ट्रे की सतह से चिपके कीड़े:
एसीटोन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लास्टिक पर प्रतिक्रिया करता है, जैसे कि पेट्री व्यंजन। नमूना संभवतः सतह का पालन करेगा यदि पेट्री व्यंजन या इसी तरह की प्लास्टिक की सतहों पर एसीटोन का उपयोग कर रहा है। इस आसंजन को वजन कागज के साथ छँटाई ट्रे को अस्तर करके या गैर-प्लास्टिक सॉर्टिंग ट्रे का उपयोग करके टाला जा सकता है। इसके अतिरिक्त, छँटाई ट्रे या कप धारण करने में प्लास्टिक की सतह पर संघनन से संघनन कीटों को संक्षेपण का पालन करने का कारण बन सकता है, या नमूना बहुत ठंडा हो सकता है और सतह पर संभावित रूप से फ्रीज हो सकता है। संक्षेपण को कम करने के लिए नॉकडाउन विधि को समायोजित करें, जबकि नमूनों को बहुत ठंडा / जमे हुए होने से रोकता है (उदाहरण के लिए, नमूनों और प्लास्टिक सॉर्टिंग ट्रे के बीच वजन वाले कागज को रखें)।

R विश्लेषण त्रुटियाँ:
एक बार मृत्यु दर डेटा एकत्र होने के बाद, विश्लेषण के दौरान विभिन्न प्रकार की जटिलताएं हो सकती हैं। एक R कोड डेटा फ़ाइल के लिए क्रियाओं को पूरा नहीं कर सकता है सबसे आम कारण यह है कि डेटा स्वरूप कोड से मेल नहीं खाता है (उदाहरण के लिए, स्तंभ शीर्षक और / या रिक्त कक्ष)। यदि अधिक गंभीर जटिलताएं उत्पन्न होती हैं, तो Rstudio35 में निर्मित R सहायता पृष्ठों को देखें।

उपर्युक्त-वर्णित सामयिक अनुप्रयोग विधि की सीमाएँ:
सामयिक अनुप्रयोग विधि के माध्यम से कीटनाशक अवशोषण प्राकृतिक जोखिम की नकल नहीं करता है:
प्राथमिक शरीर पर सामयिक अनुप्रयोग कीटनाशक अवशोषण का प्राकृतिक तरीका नहीं है। क्षेत्र में, कीड़े ज्यादातर अपने पैरों के माध्यम से कीटनाशकों को अवशोषित करते हैं, जो कि वे कीटनाशक-उपचारित सतह के संपर्क में होते हैं या छोटे एयरोसोलकणों के माध्यम से अपने पंखों पर 47,48 होते हैं, न कि वेंट्रल सतह पर तेजी से एक्सपोजर के। हालांकि, एक ज्ञात कीटनाशक खुराक का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग कीटनाशकों के लिए एक फेनोटाइपिक प्रतिक्रिया को सटीक रूप से स्थापित करेगा, जो आनुवंशिक और विकासवादी अध्ययन या अंतरिक्ष या समय में कीटनाशक संवेदनशीलता की तुलना के लिए आवश्यक है। इसलिए, यह दृष्टिकोण तकनीकी प्रतिरोध के परीक्षण के लिए फायदेमंद है, लेकिन सीधे व्यावहारिक प्रतिरोध को मापने नहीं होगा (एक क्षेत्र सेटिंग15 में वास्तविक हस्तक्षेप उपकरण की प्रभावकारिता)। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वर्तमान मानक तरीके (उदाहरण के लिए, डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षण और सीडीसी बोतल बायोएसेस) भी क्षेत्र में एयरोसोल (यानी, फॉगिंग द्वारा) कीटनाशक एक्सपोजर को कैप्चर या नकल नहीं कर सकते हैं।

सामयिक आवेदन assays केवल संपर्क अवशोषण कीटनाशकों का आकलन कर सकते हैं:
यह विधि कीटनाशकों के लिए अभिप्रेत है जो कीटनाशक के संपर्क और अवशोषण के माध्यम से काम करते हैं और मौखिक कीटनाशकों के साथ उपयोग के लिए नहीं, जैसे कि बोरिक एसिड आमतौर पर आकर्षक विषाक्त चीनी चारा49 में उपयोग किया जाता है।

विधि का महत्व:
सामयिक अनुप्रयोग विधि घातक खुराक (एकाग्रता नहीं) की गणना करके और तकनीकी (व्यावहारिक नहीं) प्रतिरोध को मापने के द्वारा कीटनाशक बायोएसेस के लिए अच्छी तरह से स्थापित मानकों पर फैलतीहै। नीचे दिए गए फायदे और मौजूदा कीटनाशक संवेदनशीलता assays पर इस विधि के नुकसान हैं.

घातक खुराक गणना:
यह विधि कीटनाशक की घातक खुराक को निर्धारित करती है, बजाय घातक एकाग्रता के जो सीडीसी और डब्ल्यूएचओ बायोएसेस भेदभावपूर्ण खुराक11 को स्थापित करने के लिए उपयोग करते हैं। घातक खुराक अधिक सार्थक है क्योंकि यह कीटनाशक की एक मात्रा मात्रा है जो मृत्यु दर को प्राप्त करने के लिए जानी जाती है। इसके विपरीत, घातक एकाग्रता इस बात पर विचार नहीं करती है कि जीव वास्तव में कितना कीटनाशक प्राप्त करता है। घातक खुराक गणना का उपयोग करते समय, लिंग- या आकार-निर्भर संवेदनशीलता प्रोफाइल के बीच के अंतर को अधिक सटीक रूप से देखा और परिमाणित किया जा सकता है, जिससे यह माप और भी बहुमुखी हो जाता है।

तकनीकी प्रतिरोध:
यह विधि तकनीकी प्रतिरोध का आकलन करती है, जो मानकीकृत, नियंत्रित वातावरण के तहत मापा जाने वाला प्रतिरोध है। इस तरह के माप कीटनाशक प्रतिरोध के प्रसार की निगरानी और संभावित मार्करों के साथ फेनोटाइपिक प्रतिरोध को जोड़नेके लिए उपयुक्त हैं। सामयिक अनुप्रयोग bioassay के परिणामस्वरूप मृत्यु दर में कमी की भिन्नता के कारण, यह नए प्रतिरोध मार्करों की बेहतर पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, मच्छर के लिए कीटनाशकों के अप्राकृतिक जोखिम के कारण, यह परख एक विशिष्ट आबादी में एक विशिष्ट हस्तक्षेप की प्रभावकारिता के अनुमान के लिए उपयुक्त नहीं है। इस तरह के व्यावहारिक प्रतिरोध15 के माप के लिए अन्य assays की आवश्यकता होती है।

नमूना अनुकूलन क्षमता:
इस विधि को अन्य महत्वपूर्ण आर्थ्रोपोड्स जैसे फसल कीटों (जैसे, कोलोराडो आलू बीटल), घर के कीटों (जैसे, कॉकरोच और बिस्तर कीड़े), या परागणकर्ताओं (जैसे, मधुमक्खियों) पर नॉकडाउन दृष्टिकोण और / या कीटनाशक खुराक, मात्रा, और / या एकाग्रता (जैसा कि ऊपर वर्णित है) में सरल परिवर्तन के साथ अभ्यास किया जा सकता है। अनुकूलन क्षमता की आसानी विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में कीटनाशक प्रतिरोध अनुसंधान को एनालॉग करने में मदद कर सकती है। एक घातक एकाग्रता के बजाय एक एलडी 50 मूल्य का उपयोग जो50 % नमूनों को मारता है (एलसी50) प्रजातियों में सटीक तुलना की अनुमति देता है।

क़ीमत:
सीडीसी बोतल bioassays और डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षणों के समान, सामयिक आवेदन परख चलाने के लिए लागत न्यूनतम हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। उपकरणों के आवश्यक टुकड़े सिरिंज (लगभग $ 70) और डिस्पेंसर (लगभग $ 100) हैं, जो assays में पुन: प्रयोज्य हैं।

आवश्यक नमूनों की संख्या:
20-25 नमूनों की एक न्यूनतम सामयिक आवेदन परख कप प्रति इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कम से कम पांच कीटनाशक सांद्रता का प्रति प्रयोग परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें प्रक्रिया के लिए अनुशंसित कम से कम तीन प्रतिकृतियां होती हैं। कुल मिलाकर, यह एक पूर्ण परीक्षण के लिए आवश्यक न्यूनतम 300-375 नमूनों में परिणाम देता है, जो डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षण या सीडीसी बोतल बायोएसेज़ का उपयोग करके प्रतिरोध तीव्रता परीक्षण करने के लिए आवश्यक नमूनों की संख्या के बराबर है। हालांकि, यदि कम परिवर्तनशीलता को सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे के साथ प्राप्त किया जाता है, तो नमूनों की समान संख्या अंतरिक्ष या समय में संवेदनशीलता डेटा की तुलना करने के लिए अधिक सांख्यिकीय शक्ति का कारण बन सकती है।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा एसएच को पुरस्कार संख्या 2047572 के तहत एक कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। हम फल मक्खी पालन और सामयिक आवेदन परख के लिए तैयारी में उनकी सहायता के लिए डेमियन रिवेरा को धन्यवाद देते हैं, विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में डॉ. गनेट्स्की अपने कैंटन-एस फल मक्खी तनाव को साझा करने के लिए, रॉकफेलर तनाव को साझा करने के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र, और आईआईसीसी आइसोलाइन तनाव को साझा करने के लिए चिकित्सा कृषि और पशु चिकित्सा एंटोमोलॉजी के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि केंद्र। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Thomas Scientific 20A00L068 Acetone aliquot storage
1.5 mL screw cap tubes Thomas Scientific 1182K23 Insecticide dilution storage
15 mL conical tubes VWR 339651 Insecticide dilution storage
20 mL glass scintillation vials Fisher Scientific 0334125D Fruit fly weighing
25 μL syringe Fisher Scientific 14815288 Topical applicator
Acetone Fisher Scientific AC423240040 ACS 99.6%, 4 L
Aedes aegypti (IICC strain) USDA CMAVE NA Insecticide resistant
Aedes aegypti (Rockefeller strain) CDC NA Insecticide susceptible
Analytical scale Fisher Scientific 14-557-409 Precision up to 0.1 mg
Aspirator Amazon 6.49986E+11 Mosquito collection device
Bench paper VWR 89126-794 Place under workspace
Cotton swabs Amazon B092S8JVQN Use for sorting insects
Cotton wool balls Amazon B0769MKZWT Use for sucrose solution
Dispenser Fisher Scientific 1482225 Repeater pipettor
Drosophila melanogaster (Canton-S strain) University of Wisconsin-Madison NA Insecticide susceptible
Fine-tipped paint brushes Amazon B07KT2X1BK Use for sorting insects
Fruit fly stock bottles Fisher Scientific AS355 Use for rearing and sorting fruit flies
Hand-held CO2 dispenser Fisher Scientific NC1710679 Use for knocking down insects
Holding cups Amazon B08DXG7V1S Clear plastic
Ice pack Amazon B08QDWMMW5 Use for knocking down fruit flies
Ice trays Amazon 9301085269 Use for knocking down insects
Insect forceps Amazon B07B4767WR Insect forceps
Insecticide Sigma-Aldrich Inc 45423-250MG Deltamethrin
Labeling stickers Amazon B07Q4X9GWX 3/4" Color dot stickers
Labeling tape Amazon B00X6A1GYK White tape
Netting Amazon B07F2PHHWV Use for covering holding cups and insect handling tent
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712H371 100 mm x 15 mm
PVC Pipe Lowe’s 23971 Insect handling tent materials
Rubber bands Amazon B00006IBRU Use for securing mesh/net on cups
Sucrose Amazon B01J78INO0 Granulated White Sugar
Weighing paper VWR 12578-165 4" x 4"

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References

  1. World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases (2020).
  2. World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/44846 (2012).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
  4. Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
  5. World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/204588 (2016).
  6. World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241511575/en/ (2016).
  7. McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , https://www.cdc.gov/zika/pdfs/CONUS-508.pdf (2020).
  8. Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
  9. Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
  10. Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
  11. Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
  12. Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
  13. Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
  14. Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
  15. Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
  16. Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
  17. Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
  18. Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
  19. Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
  20. Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
  21. World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/70070 (2009).
  22. Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
  23. Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
  24. Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
  25. Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
  26. Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
  27. Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
  28. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
  29. Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
  30. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
  31. Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
  32. Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
  33. Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
  34. Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
  35. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , https://www.r-project.org/ (2021).
  36. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
  37. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
  38. Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , https://naarm.org.in/VirtualLearning/vic/e-chapters/Probit_Analysis-ravichandran.pdf (2021).
  39. Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
  40. Finney, D. J. Probit Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge, England. (1971).
  41. Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
  42. Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
  43. Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
  44. Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
  45. ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T., Tabashnik, B. E. , Springer. Boston, MA. (1990).
  46. Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
  47. Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
  48. Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
  49. Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).

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जीव विज्ञान अंक 179
सामयिक अनुप्रयोग Bioassay मच्छरों और फल मक्खियों के लिए कीटनाशक विषाक्तता की मात्रा निर्धारित करने के लिए
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Jensen, B. M., Althoff, R. A.,… More

Jensen, B. M., Althoff, R. A., Rydberg, S. E., Royster, E. N., Estep, A., Huijben, S. Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies. J. Vis. Exp. (179), e63391, doi:10.3791/63391 (2022).

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