Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Motilitet af enkeltmolekyler og klynger af tovejs kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae-celler

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

Den tovejs mitotiske kinesin-5 Cin8 akkumuleres i klynger, der splittes og fusionerer under deres bevægelighed. Akkumulering i klynger ændrer også Cin8's hastighed og retningsvirkning. Her beskrives en protokol for motilitetsassays med oprenset Cin8-GFP og analyse af bevægelige egenskaber af enkeltmolekyler og klynger af Cin8.

Abstract

De mitotiske bipolære kinesin-5 motorer udfører væsentlige funktioner i spindeldynamikken. Disse motorer udviser en homo-tetramere struktur med to par katalytiske motordomæner, der ligger i modsatte ender af det aktive kompleks. Denne unikke arkitektur gør det muligt for kinesin-5-motorer at tværbinde og glide fra hinanden antiparallelle spindelmikrotubuli (MT'er), hvilket giver den udadrettede kraft, der adskiller spindelpolerne fra hinanden. Tidligere blev kinesin-5 motorer antaget at være udelukkende plus-end rettet. Nylige undersøgelser afslørede imidlertid, at flere svampekinesin-5-motorer er minus-ende rettet mod enkeltmolekyleniveauet og kan skifte retningsbestemthed under forskellige eksperimentelle forhold. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et eksempel på et sådant tovejs motorisk protein: Under betingelser med høj ionstyrke bevæger enkelte molekyler af Cin8 sig i minus-end retning af MT'erne. Det blev også vist, at Cin8 danner bevægelige klynger, overvejende i minus-enden af MT'erne, og en sådan klyngedannelse gør det muligt for Cin8 at skifte retningsbestemthed og gennemgå langsom, plus-end rettet bevægelighed. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for alle trin i arbejdet med GFP-mærket kinesin-5 Cin8, fra proteinoverekspression i S. cerevisiae-celler og dets oprensning til in vitro-enkeltmolekylemotilitetsassay . En nyudviklet metode beskrevet her hjælper med at skelne mellem enkeltmolekyler og klynger af Cin8 baseret på deres fluorescensintensitet. Denne metode muliggør separat analyse af bevægeligheden af enkeltmolekyler og klynger af Cin8, hvilket giver karakteriseringen af cin8-motilitetens afhængighed af dens klyngestørrelse.

Introduction

Et stort antal motilitetshændelser i eukaryote celler medieres af funktionen af molekylære motoriske proteiner. Disse motorer bevæger sig langs cytoskeletale filamenter, actinfilamenter og mikrotubuli (MT'er) og omdanner den kemiske energi af ATP-hydrolyse til kinetiske og mekaniske kræfter, der kræves for at drive biologisk bevægelighed i celler. Den MT-baserede S. cerevisiae Cin8 er et bipolært, homotetramert kinesin-5 motorprotein, der tværbinder og glider spindel-MT'er fra hinanden1. Cin8 udfører væsentlige funktioner under mitose, i spindelsamling 2,3,4 og spindelforlængelse under anafase 5,6,7. Tidligere var det blevet påvist, at Cin8 er en tovejsmotor, der skifter retningsbestemthed under forskellige eksperimentelle forhold. For eksempel bevæger enkelte Cin8-motorer sig under forhold med høj ionstyrke mod minus-enden af MT'erne, mens Cin8-motorer i klynger, i multimotoriske MT-glideassays og mellem antiparallelle MT'er hovedsageligt bevæger sig mod plus-enderne af MT'erne 8,9,10,11,12 . Disse resultater var meget uventede på grund af flere grunde. For det første bærer Cin8 sit katalytiske motoriske domæne ved amino-terminus, og sådanne motorer blev tidligere antaget at være udelukkende plus-end rettet, mens Cin8 viste sig at være minus-end rettet mod enkeltmolekyleniveauet. For det andet blev kinesinmotorer antaget at være ensrettede, enten minus-end eller plus-end rettet, mens Cin8 viste sig at være tovejs, afhængigt af de eksperimentelle forhold. Endelig, på grund af MT-orienteringen ved den mitotiske spindel, kunne kinesin-5-motorernes klassiske rolle i adskillelsen af spindelpoler under spindelsamling og anafase B kun forklares ved deres plus-end-rettede bevægelighed på MT'erne, de krydsbinder 1,13. Efter de første rapporter om tovejsvirkningen af Cin8 blev et par andre kinesinmotorer påvist at være tovejs 14,15,16, hvilket indikerer, at kinesinmotorers tovejsmotilitet kan være mere almindelig end tidligere antaget.

Det er tidligere blevet rapporteret, at Cin8 i celler også bevæger sig på en tovejs måde8, hvilket understøtter forestillingen om, at den tovejsmotilitet af nogle kinesin-5-motorer er vigtig for deres intracellulære funktioner. Da de tre kinesin-5-motorer, der blev rapporteret at være tovejsmotorer, er fra svampeceller, er der desuden for nylig blevet foreslået en mulig rolle for tovejsvirkningen af kinesin-5-motorer i sådanne celler10. Ifølge denne model, i lukket mitose af svampeceller, hvor den nukleare kuvert ikke nedbrydes under mitose, giver kinesin-5-motorer den indledende kraft, der adskiller spindelpolerne fra hinanden før spindelsamling. For at udføre denne opgave, før spindelpolseparation, lokaliserer kinesin-5-motorer nær spindelpolerne ved deres minus-ende rettet bevægelighed på enkelte nukleare MT'er. En gang i denne position klynger kinesin-5-motorer, skifter retningsbestemthed, fanger og tværbinder MT'er fra nabospindelpoler. Derefter tilvejebringer kinesin-5-motorer den indledende adskillelse af polerne ved plus-end rettet bevægelighed på MT'erne, de tværbinder. Ved denne model kræves både minus-end rettet bevægelighed på enkelte MT'er og plus-end rettet bevægelighed på tværbundne MT'er under antiparallel glidning for svampekinesin-5-motorer til at udføre deres roller i spindelsamling 1,13.

Det overordnede mål med den beskrevne metode er at opnå svampe-GFP-mærket kinesin-5 Cin8 med høj renhed og at udføre enkeltmolekylemotilitetsassays (figur 1), mens man separat analyserer bevægeligheden for enkeltmolekyler og klynger af Cin8. Adskillelsen mellem enkeltmolekyler og klynger er vigtig, da en af de faktorer, der havde vist sig at påvirke retningen af Cin8, er dens ophobning i klynger på MT'erne10,12. Alternative motilitetsassays, såsom MT-overfladeglidning og MT-glideassays, giver ikke oplysninger om aktiviteten af enkeltmotoriske proteiner17,18. De robuste enkeltmolekylemotilitetsanalyse- og analysemetoder, der er beskrevet her, er blevet anvendt med succes til at karakterisere forskellige aspekter af kinesin-5-motorer, Cin8 og Kip1 10,11,12,14,19,20.

Her præsenteres en detaljeret protokol for Cin8-overekspression og oprensning, polymerisation af MT'er og enkeltmolekylemotilitetsassayet. Desuden beskrives analyserne til at skelne mellem enkeltmolekyler og klynger af Cin8 og til bestemmelse af enkeltmotor- og klyngehastigheder ved middelforskydning (MD) og gennemsnitlig kvadratforskydning (MSD) analyse. Denne protokol har til formål at hjælpe forskere med at visualisere alle trin i procedurerne og hjælpe med fejlfinding af denne type assays.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af enkeltmolekylemotilitetsassayet. Biotinylerede fluorescerende MT'er er fastgjort til glasoverfladen, belagt med Avidin, der interagerer med den overfladebundne biotinylerede-BSA. Den grønne pil repræsenterer bevægelsesretningen for enkelte Cin8-molekyler under forhold med høj ionstyrke. +/- repræsenterer polariteten af MT. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af buffere og reagenser

  1. Buffere
    1. -Leu aa dropout mix: Bland 2 g hver af Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin og Methionin og opbevar ved stuetemperatur.
    2. Gærselektivt medium med raffinose (1 l): Bland 6,7 g gærkvælstofbase (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa-dropoutblanding og 20 g raffinose i dobbeltdestilleret vand under omrøring (uden opvarmning), indtil det er helt opløst. Brug et 0,22 μm filter til at filtrere opløsningen i en steril flaske.
    3. Lysisbuffer: Forbered 25 ml opløsning i tredobbelt destilleret vand (TDW) bestående af 50 mM Tris, 30 mM Rør, 500 mM KCl, 10% glycerol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP og 0,1% Triton X-100. Juster pH til 8 ved hjælp af 6 M HCl.
    4. Elutionsbuffer: Forbered 10 ml opløsning i TDW bestående af 50 mM Tris, 30 mM rør, 500 mM KCl, 350 mM imidazol, 10% glycerol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP og 0,1% Triton X-100. Juster pH til 7,2 ved hjælp af 6 M HCl.
    5. P12-buffer: Forbered 10 ml af en opløsning i TDW bestående af 12 mM rør, 1 mM EGTA og 2 mM MgCl2. Juster pH til 6,9 ved hjælp af 10 M NaOH.
    6. BRB80-buffer: Forbered 50 ml af en opløsning bestående af 80 mM rør, 1 mM EGTA og 2 mM MgCl2 i ultrarent vand. Juster pH til 6,9 ved hjælp af 10 M NaOH.
    7. Generel tubulinbuffer (GTB): Forbered 50 ml af en opløsning bestående af 80 mM rør, 0,5 mM EGTA og 2 mM MgCl2 i ultrarent vand. Juster pH til 6,9 ved hjælp af 10 M NaOH.
    8. Tris-Pipes-opløsning: Forbered 40 ml 1M Tris-0,6 M Røropløsning ved at blande 6,055 g Tris og 9,07 g rør i TDW og juster pH til 7,2 ved hjælp af 6 M HCl. Bring det endelige volumen til 50 ml med TDW.
      BEMÆRK: P12-, BRB80- og Tris-Pipes-buffere anvendes til fremstilling af stamopløsninger til motilitetsanalyse. Disse buffere kan fremstilles i store mængder, aliciteret i 1,5 ml rør, snapfrosne og opbevares ved -20 °C.
  2. Lageropløsninger til motilitetsassay
    1. Tubulin (10 mg ml-1): 1 mg lyofiliseret tubulin opløses i 100 μL kold (4 °C) generel tubulinbuffer (GTB). Snap-freeze 1 μL aliquots og opbevar dem ved -80 °C.
    2. Biotinyleret tubulin (1 mg ml-1): 20 μg lyofiliseret tubulin opløses i 20 μL kold GTB. Snap-freeze 1 μL aliquots og opbevar dem ved -80 °C.
    3. Rhodamin mærket tubulin (1 mg ml-1): Opløs 20 μg lyofiliseret tubulin i 20 μL kold GTB. Snap-freeze 0,5 μL aliquots og opbevar dem ved -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP fremstilles fra leverandøren som en vandig opløsning på 100 μL og opbevares ved -80 °C. Tø hætteglasset op med GMPCPP på is. Forbered 1 μL aliquots, snap-freeze og opbevar dem ved -80 °C.
    5. ATP: Der fremstilles 500 μL opløsning af 100 mM ATP i 0,5 M Tris buffer (pH 8). Snap-freeze 2 μL aliquots og opbevar dem ved -20 °C.
    6. MgCl2: Der fremstilles 1 ml opløsning af 200 mMMgCl2 i P12-buffer. Opbevar 5 μL alikvoter ved -20 °C.
    7. Kasein: Der fremstilles en 1 ml opløsning af 5 mg ml-1 kasein i BRB 80 buffer. Snap-freeze 10 μL aliquots og opbevar dem ved -20 °C.
    8. D-glucose: Forbered en 1 ml opløsning af 1 M D-glucose i P12-buffer. Opbevar 10 μL alikvoter ved -20 °C.
    9. Glucoseoxidase: Forbered en 1 ml opløsning af 10 mg ml-1 glucoseoxidase i P12-buffer. Snap-freeze 2 μL aliquots og opbevar dem ved -20 °C.
    10. Katalase: Der fremstilles en 1 ml opløsning af 0,8 mg ml-1-katalase i P12-buffer . Snap-freeze 2 μL aliquots og opbevar ved -20 °C.
    11. Dithiothreitol (DTT): Forbered en 1 ml opløsning af 1 M DTT i P12-buffer i en stinkhætte. Snap-freeze 10 μL aliquots og opbevar dem ved -20 °C.
    12. Kreatinphosphat: Forbered en 1 ml opløsning af 1 M kreatinphosphat i P12-buffer. Snap-freeze 2 μL aliquots og opbevar dem ved -20 °C.
    13. Kreatinphosphokinase: Forbered en 1 ml opløsning af 5 mg ml-1 kreatinphosphokinase i 0,25 M glycylglycin, pH 7,4. Snap-freeze 2 μL aliquots og opbevar dem ved -20 °C.
    14. EGTA: Forbered en 100 mM EGTA-opløsning i ultrarent vand og opbevar den ved stuetemperatur.
    15. KCl: Forbered en 1 M KCl-opløsning i ultrarent vand og opbevar den ved stuetemperatur.
  3. Motilitetsbuffer og reaktionsblanding
    1. Motilitetsbuffer (MB) med 145 mM KCl, 2x lager: Forbered 1 ml 2x lager af motilitetsbufferen ved at blande 100 μL præfabrikeret Tris-Pipes-opløsning, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl og 590 μL TDW. Hold bufferen på is.
    2. Motilitetsreaktionsblanding: Forbered motilitetsreaktionsblanding i henhold til tabel 1 og opbevar den på is.
Lydstyrke Lager Reagens navn
50 μL 2X MB (fra trin 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM ATP
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/ml Kasein
1 μL 1 m Glukose
1 μL 1 m DTT
1 μL 10 mg/ml Glucoseoxidase
1 μL 8 mg/ml Katalase
1 μL 1 m Fosfocreatin
1 μL 5 mg/ml Kreatinphosphokinase
100 μL Total

Tabel 1.

2. Cin8 overekspression og oprensning fra S. cerevisiae celler

  1. Dyrk S. cerevisiae-celler , der indeholder plasmidet til overekspression af Cin8-GFP-6Hans til den eksponentielle vækstfase (OD600 = 0,6-0,8) i 1 liter gærselektivt medium suppleret med 2% raffinose (se trin 1.1.2) ved 28 °C12.
  2. Inducer Cin8-GFP-6Hans overekspression ved tilsætning af 2% galactose. Overvåg gærkulturens vækst ved at måle absorbans ved 600 nm.
  3. Fem timer efter galactosetilsætning høstes cellerne ved centrifugering ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C, cellerne suspenderes i lysisbufferen og fryses i flydendeN2.
    BEMÆRK: Frosne celler kan opbevares ved -80 °C til videre brug eller straks formales i flydendeN2.
  4. Slib de frosne celler i flydendeN2 ved hjælp af kølet mørtel og støder. Tilsæt væskeN2 under slibningen for at holde ekstrakterne frosne. Det kræver typisk 4-5 gange tilsætning af væskeN2.
  5. Overvåg cellelyse ved observation under fasekontrast eller DIC-mikroskop.
  6. Jordcellerne og centrifugen tøs op ved 21.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Læg supernatanten på en tyngdekraftsstrømningskolonne fyldt med 2 ml Ni-NTA og forkalibreret med lysisbuffer. Lad supernatanten strømme ud gennem søjlen.
  7. Vask kolonnen med fem kolonnevolumener lysisbuffer og derefter med fem kolonnevolumener lysisbuffer suppleret med 25 mM imidazol.
  8. Elute Cin8-GFP-6Hans med elueringsbuffer (se trin 1.1.4).
  9. Analyser de eluerede prøver ved SDS-PAGE fraktionering, efterfulgt af Coomassie blå farvning og western blot analyse undersøgt med α-GFP antistof19.
  10. Pool de fraktioner, der indeholder Cin8-GFP-6His (trin 2.8 og 2.9). Desuden renses de ved størrelseseksklusionskromatografi (SEC) ved en strømningshastighed på 0,5 ml min-1 og kolonnetrykgrænse på 1,5 MPa med samtidig overvågning af absorbansen ved 280 nm og GFP-florescensemissionen med excitation ved 488 nm (figur 2A).
  11. Saml de fraktioner, der svarer til Cin8-GFP-tetrameren, og analysér dem ved hjælp af SDS-PAGE og western blotting (se trin 2.9) (figur 2B).
  12. Anslå proteinkoncentrationen ved hjælp af spektrofotometri eller biokemiske assays såsom Bradford-assay, BCA-assay osv.
  13. Aliquot de valgte fraktioner, snap-freeze i flydendeN2, og opbevar indtil brug ved -80 °C. Disse rensede proteinprøver kan anvendes i 6 måneder.
    BEMÆRK: Cin8-GFP overudtrykkes og renses fra en protease-mangelfuld S. cerevisiae-stamme indeholdende et 2 μm plasmid til Cin8-GFP-6Hans overekspression fra galactose-inducerbar promotor, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Gærstammen og plasmidet er tilgængelige efter anmodning.

Figure 2
Figur 2: Oprensning af Cin8-GFP. (A) Størrelsesudelukkelseskromatogrammet for Ni-NTA renset Cin8-GFP med kontinuerlig GFP-fluorescensdetektion gennem 488 nm excitation og emission ved ~510 nm. Cin8-GFP-tetrameren eluerer ved ~10 ml fra SEC-kolonnen (markeret med en pil). (B) Coomassie-farvet SDS-PAGE gel (øverst) og α-GFP western blot (nederst) af Cin8-GFP fraktioner elueret fra SEC. Prøver i banerne er som følger: M - Molekylvægtmarkør, Ni2 +- Ni-NTA renset Cin8-GFP prøve, der indlæses i SEC-kolonnen, GF-fraktioner: fraktion svarende til Cin8-GFP SEC eluering som markeret i panel A. Pilen til højre markerer størrelsen på Cin8-GFP-monomeren (forventes på SDS-PAGE). Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Enkeltmolekylemotilitetsassay med den rensede Cin8

  1. Polymerisation af biotin og rhodaminmærkede MT'er, stabiliseret med GMPCPP.
    1. Start MT-polymerisation ved at blande følgende komponenter i et 1,5 ml rør: 1 μL 10 mg/ml tubulinprotein, 1 μL 1 mg/ml biotinyleret tubulin, 0,5 μL 1 mg/ml rhodaminmærket tubulin, 1 μL 10 mM GMPCPP og 6,5 μL generel tubulinbuffer (GTB). Blandingen inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    2. Efter MT-polymerisation tilsættes 80 μL varm (37 °C) GTB, blandes forsigtigt og centrifugeres ved 16.500 x g i 20 minutter.
    3. Kassér supernatanten, og ophæng pillen forsigtigt igen ved at pipettere op og ned med 50 μL varm GTB. Ophænget opbevares ved 28 °C.
    4. Undersøg MT'erne med et fluorescensmikroskop ved hjælp af 647 nm rhodaminkanalen (figur 3A).
      BEMÆRK: For at opnå biotinylerede fluorescerende mærkede MT'er indeholder polymerisationsreaktion umærket tubulin såvel som biotinyleret og fluorescerende mærket tubulin. I denne protokol anvendes rhodaminmærket tubulin, men andre fluorescerende konjugater kan også anvendes.
  2. Samling af flowkammer
    1. Saml et flowkammer ved at placere fire strimler dobbeltsidet tape (~ 4 cm x ~ 3 mm) på et avanceret klæbende glasglas (parallelt med den længere kant og ~ 3-4 mm fra hinanden) for at skabe tre 'baner' mellem båndstrimlerne. Fjern beskyttelsespapiret fra båndstrimlerne, og læg et silaniseret dæksler10 på båndstrimlerne for at skabe tre flowkamre på ~ 10 μL i volumen.
  3. MT-immobilisering på den avidinbelagte overflade (figur 1)
    1. Belæg det silaniserede coverslip ved at perfusere med 15 μL 1 mg/ml biotinyleret-kvæg serumalbumin (b-BSA, opløst i GTB) i flowkammeret ved hjælp af en mikropipette. Efter 5 minutter vaskes kammeret med 80 μL GTB.
    2. Derefter, som i trin 3.3.1, indsættes 15 μL 1 mg/ml Avidin (opløst i GTB), der binder sig til b-BSA, i flowkammeret. Efter 5 minutter vaskes kammeret med 80 μL GTB.
    3. Passiver den silaniserede dækslipoverflade ved hjælp af 20 μL 1% poloxamer. Efter 3 minutter vaskes med 80 μL GTB.
    4. Fastgør biotinylerede MT'er (trin 3.1) til det b-BSA-avidinbelagte dækslip ved at indsætte 20 μL MT'er, der typisk fortyndes til 1:20 i GTB. Inkuber lysbillederne i omvendt position, dvs. med dæksedlen nedad i et mørkt fugtighedskammer (f.eks. en petriskål indeholdende vådt silkepapir) i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter med 200 μL GTB.
    5. Påfør 30 μL motilitetsreaktionsblanding (se trin 1.3.2) i flowkammeret.
    6. Cin8-GFP-motorerne fortyndes (trin 2.13) i 20 μL motilitetsreaktionsmix (se tabel 1) (typisk til en endelig koncentration på 5-10 μM). Påfør dem på flowkammeret og forestil dig straks motorernes bevægelse langs MT'erne.
  4. Billeddannelse af motormotilitet
    BEMÆRK: MT-binding og motorernes bevægelighed blev overvåget ved hjælp af et epifluorescensomvendt mikroskop udstyret med en kviksølvbuelampe, et 100x / 1,4 numerisk blændemål og to fluorescensbåndpasfiltersæt, et med en bølgelængde på 647 nm (for rhodamin) og et andet med en bølgelængde på 488 nm (for GFP).
    1. Placer en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopmålet. Placer flowkammeret på det fluorescerende mikroskoptrin med dækslaget nedad mod målet.
    2. Tænd rhodaminkanalen for at fokusere på MT'erne, der er fastgjort til dækslipoverfladen, og hent billedet med 20 ms eksponering ved hjælp af Micro-Manager ImageJ-Fiji-softwaren21.
    3. Tænd GFP-kanalen, og hent 90 timelapse-billeder med 1 s interval og 800 ms eksponering til analyse af Cin8-GFP-motilitet.

Figure 3
Figur 3: MT'er og MT-bundne Cin8-GFP. (A) Billeder fra to felter (venstre og højre) for MT'er polymeriseret efter protokollen beskrevet i trin 3.1 og afbildet med 100x mål som beskrevet i trin 3.4. (B) Billeder fra to felter (venstre og højre) for Cin8-GFP (nederste paneler, markeret med pile), der er fastgjort til MT vist i de øverste paneler. Skalabjælke: 4 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Analyse af bevægelighed

BEMÆRK: Udfør al billedanalyse og generer kymografer ved hjælp af ImageJ-Fiji Software.

  1. Kymograph generation
    1. Åbn time lapse-filmen og det tilsvarende MT-feltbillede. Synkroniser disse to vinduer ved at vælge følgende indstilling: Analysér > Værktøjer > Synkroniser Windows.
    2. Fremhæv en MT ved hjælp af indstillingen Segmenteret linje , og brug fanen Analysér > Multi Kymograph til at få en kymograf.
  2. Bestemmelse af klyngestørrelse af Cin8-GFP (dvs. antallet af Cin8-molekyler i en klynge)
    1. Udfør baggrundssubtraktionen og korrektionen for ujævn belysning ved hjælp af indstillingen Proces > træk baggrund . Indstil Rolling Ball Radius til 100 pixels, og kontroller indstillingen Glidende paraboloid .
    2. Følg den gennemsnitlige fluorescensintensitet for en specifik ikke-bevægelig Cin8-GFP-motor (figur 3B) som en funktion af tiden inden for en cirkel på 4 pixels radius ved hjælp af TrackMate-pluginet i ImageJ-Fiji-softwaren ved at vælge følgende mulighed: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Gentag trin 4.2.2 for forskellige Cin8-GFP-motorer. Plot fluorescensintensiteten af de forskellige Cin8-GFP-motorer som en funktion af tiden.
      BEMÆRK: En eksperimentel strategi til måling af klyngestørrelsen - dvs. antallet af Cin8-molekyler i en klynge - etablerer et grundlag for analysen af Cin8-klyngerelateret bevægelighed. Fotoblegning af GFP fastgjort til Cin8 anvendes til at bestemme bidraget fra enkelte GFP-molekyler til den samlede intensitet af Cin8-klynger. For eksempel falder fluorescensintensiteterne i trin på ~ 50 vilkårlige enheder (a.u.), hvor hvert enkelt trin sandsynligvis repræsenterer fotoblegning af et GFP-molekyle (figur 4A). Da Cin8 er et homo-tetramere motorprotein, indeholder det fire GFP-molekyler. Således er alle Cin8-motorer med en intensitet ≤ 200 a.u. sandsynligvis enkelte tetramere Cin8-molekyler. Efter denne metode tildeles intensitetsområder for Cin8-motorfluorescens som <200, 200-400 og >400 for henholdsvis enkelte Cin8-molekyler, par Cin8-molekyler (dimer af Cin8-tetramer) og Cin8-oligomerer12.
  3. Intensitetsfordelingsanalyse for Cin8-GFP-motorer
    1. Mål den gennemsnitlige florescensintensitet for alle fluorescerende Cin8-GFP-motorer i den første ramme af time-lapse-sekvensen ved hjælp af TrackMate-plugin i ImageJ-Fiji som beskrevet i trin 4.2.2.
    2. Plot et histogram af de gennemsnitlige intensiteter af Cin8-GFP med en skraldespandstørrelse på 20 a.u. og tilpas histogrammets største top til en gaussisk kurve (figur 4B).
      BEMÆRK: Intensitetsfordelingsanalyse supplerer klyngestørrelsesbestemmelsen for Cin8-GFP-motorer fra fotoblegningseksperimenterne. Den gaussiske kurve, der er tilpasset intensitetsfordelingshistogrammet for Cin8-GFP-populationen, topper ved ~ 125 a.u., hvilket er i overensstemmelse med den gennemsnitlige intensitet af enkelte tetramere Cin8-molekyler, der indeholder enten et, to, tre eller fire fluorescerende (ikke-blegede) GFP-molekyler, hvor hvert fluorescerende GFP-molekyle bidrager ~ 50 a.u. Ved hjælp af denne intensitetsfordelingsmetode kan bidraget fra et GFP-molekyle således også beregnes, hvilket yderligere kan udnyttes til at tildele klyngestørrelsen af Cin8-GFP-molekyler.

Figure 4
Figur 4: Cin8-GFP blegeprofil og intensitetsfordeling. (A) Fotoblegning af GFP i fire forskellige Cin8-GFP-motorer. Enkelte fotoblegningstrin, der sandsynligvis hver især repræsenterer fotoblegning af en GFP, fører til et fald i fluorescensintensiteten på ~ 50 a.u. (B) Intensitetsfordelingen af Cin8-GFP-motorer i den første ramme af en time-lapse-sekvens (inset). Den gaussiske top (blå) centreret ved ~ 125 a.u repræsenterer enkelte Cin8-GFP-molekyler. Denne top udviser den gennemsnitlige intensitet af enkelte Cin8-tetramerer med et, to, tre eller fire fluorescerende GFP-molekyler, hvor hvert GFP-molekyle bidrager ~ 50 a.u. til den samlede intensitet (dvs. (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Sporing af Cin8-GFP-molekylernes bevægelighed langs MT-sporene
    1. Beskær den MT, der skal analyseres, i timelapse-sekvensen for optagede billeder ved at fremhæve den med rektangelværktøjet og derefter vælge Billede > Beskæring.
    2. Vælg en fluorescerende Cin8-GFP-partikel til analysen. Registrer partikelkoordinaterne i hvert billede (tidspunkt) i tidsforløbssekvensen ved hjælp af indstillingerne Punktværktøj og Måling . Udfør lignende registrering af koordinater for andre fluorescerende partikler i time-lapse-sekvensen.
    3. Tildel klyngestørrelse til alle de undersøgte Cin8-GFP-partikler i den første ramme af deres udseende som beskrevet i trin 4.2.
  2. Analyser af gennemsnitlig forskydning (MD) og gennemsnitlig kvadratisk forskydning (MSD)
    1. Ud fra koordinaterne for Cin8-GFP-bevægelser bestemt i trin 4.4 beregnes forskydningerne af Cin8-GFP på hvert tidspunkt i forhold til de indledende koordinater ved hjælp af ligningen til beregning af afstanden mellem to punkter med givne koordinater:
      Equation 1
      hvor dt er forskydningerne af Cin8-GFP på tidspunktet t, xt og yt er de respektive koordinater på tidspunktet t. x0 og y0 er de respektive koordinater for Cin8-GFP ved t = 0.
    2. Beregn ud fra disse forskydningsværdier forskydningen for alle mulige tidsintervaller for en bestemt Cin8-GFP-partikel. Gentag proceduren for alle de undersøgte Cin8-GFP-partikler.
    3. Plot den gennemsnitlige forskydning (MD) af alle de undersøgte Cin8-GFP-partikler versus tidsinterval og underlagt en lineær pasform, MD = v x t + c. Hældningen af denne pasform (v) repræsenterer gennemsnitshastigheden af bevægelige Cin8-GFP-partikler.
      BEMÆRK: På denne måde kan gennemsnitshastigheden for alle Cin8-GFP-molekyler, der tilhører hver klyngestørrelse, beregnes separat, hvilket karakteriserer bevægeligheden for forskellige klyngestørrelser. Ud over MD-analysen kan analysen af gennemsnitlig kvadratisk forskydning (MSD) også udføres ved at kvadrere forskydningsværdierne beregnet i trin 4.5.1 og 4.5.2. MSD-værdier afbildes i forhold til tidsintervallet og tilpasses polynomkurven MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, hvilket giver den ekstra parameter D, som er diffusionskoefficienten for Cin8-GFP-bevægelse. MD-analyse bør udføres på polaritetsmærkede MT'er 8,10, mens viden om MT-polariteten ikke er nødvendig for MSD-analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksperimentet har til formål at undersøge motilitetsegenskaberne ved tovejsmotorisk protein Cin8 i forskellige klyngestørrelser på enkelte MT'er. Repræsentativ bevægelighed for Cin8-GFP fremgår også af kymograferne i figur 5A, hvor motorens rumlige position over tid er vist.

Til analyse af Cin8-GFP's bevægelige egenskaber tildeles først klyngestørrelsen (trin 4.3) til hver MT-vedhæftet bevægelig Cin8-GFP-partikel, og derefter spores positionen af de undersøgte Cin8-partikler som en funktion af tiden (trin 4.4). For hver kategori af klyngestørrelse blev >40 baner for individuel cin8-GFP ekstraheret fra optagelserne (figur 5B). Ved hjælp af koordinaterne fra sporingsanalysen udføres MD- og MSD-analyse for hver klyngestørrelsespopulation separat. Hastighederne opnås ved lineære tilpasninger til MD som vist i figur 5C. Det blev konstateret, at enkelte Cin8-GFP-molekyler bevæger sig på en ensrettet, minus-ende rettet måde med høj hastighed, mens Cin8-klyngerne udviser betydeligt lavere hastighed med en højere tilbøjelighed til tovejsmotilitet (figur 5B, C).

Figure 5
Figur 5: Cin8-GFP-motilitet. (A) Kymografer, der repræsenterer bevægeligheden for Cin8-GFP-motorer på MT'er. X- og Y-akser repræsenterer henholdsvis MT-gitter og tid. Gule pile markerer den hurtige bevægelighed af enkelte Cin8-GFP-partikler mod minus-end-retningen af MT, mens blå pile markerer den langsomme bevægelighed af Cin8-klynger i plus-end-retningen af MT. MT'ernes polaritet er angivet i bunden af hver kymograf (+/-). Vandret stang: 4 μm, lodret stang: 20 s. (B) Forskydningsspor af enkeltmotorer (venstre) og klynger (højre) af Cin8-GFP-motorer. Forskydningssporene blev afbildet ved hjælp af de koordinater, der blev opnået efter sporing af de enkelte Cin8-GFP-motorer som forklaret i trin 4.4. Negative og positive værdier af forskydning indikerer bevægelse i henholdsvis minus-end og plus-end retninger af MT. Bemærk, at under samme assay er motiliteten af Cin8-klynger langsommere og tovejs sammenlignet med de enkelte molekyler i Cin8. (C) Plots af middelforskydning (MD) ± SEM, af enkeltmolekyler (venstre) og klynger (højre) af Cin8-motorer som funktion af tidsintervallet. Sorte linjer repræsenterer lineære passer af plottet (MD = v xt + c, hvor v er middelhastigheden, t er tidsintervallet og c repræsenterer aflytningen). Af monteringen fremgår det, at gennemsnitshastigheden for enkeltmotorer og klynger af Cin8 er henholdsvis -265 ± 20 nm/s og -48 ± 5 nm/s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde præsenteres en protokol for enkeltmolekylemotilitetsassay med den tovejs kinesin-5 Cin8 og motilitetsanalysen. Cin818 i fuld længde inklusive det oprindelige nukleare lokaliseringssignal (NLS) ved C-terminalen er blevet renset fra den indfødte vært S. cerevisiae. Da Cin8 er et nukleart motorprotein, viser slibning af S. cerevisiae-cellerne under flydende nitrogen sig at være den mest effektive metode til cellelyse. Efter lysis opnås der ved at kombinere metalaffinitet og størrelsesudelukkelseskromatografi meget ren Cin8, hvilket er vigtigt for enkeltmolekylemotilitetsanalyserne. Det er tidligere blevet rapporteret, at der er forskelle mellem bevægelige egenskaber af Cin8 i råekstrakter og rensede prøver8. Derudover er det også blevet rapporteret, at MT-trængsel med motoriske og ikke-motoriske proteiner påvirker retningsbestemtheden af tovejs kinesin-5 Cut722. Således kræves høj renhed af motoren for pålidelig motilitetsanalyse og konklusioner vedrørende vildtype og mutant motorisk adfærd. De teknikker, der er beskrevet her, kan let tilpasses til at rense andre nukleare proteiner fra gæren med passende bufferjusteringer.

Beskrevet her er et meget robust og følsomt enkeltmolekylemotilitetsassay med GFP-mærket Cin8. Succesen med dette assay er stærkt afhængig af den korrekte MT-polymerisation og immobilisering til overfladen. Den stærke avidin-biotin-interaktion bruges til at immobilisere MT'erne til den hydrofobe glasoverflade, som irreversibelt fastgør MT'erne. På disse immobiliserede MT'er, der bruger GFP mærket Cin8, kan Cin8-motilitet pålideligt spores 11,12,19.

Cin8 rapporteres at danne klynger, der indeholder mere end en tetramerisk motor10,12, hvor motiliteten af disse klynger er forskellig fra den for enkelte Cin8-molekyler. For nøjagtigt at karakterisere Cin8-motiliteten som en funktion af dens størrelse er der udviklet en fluorescensintensitetsbaseret metode til at identificere klyngestørrelsen af hver Cin8-partikel12. Baseret på denne størrelseskategorisering analyseres bevægeligheden separat i hver størrelseskategori. Efter denne størrelsesbaserede analyse tilvejebringes indsigtsfulde detaljer, der kan bruges til at forstå den forskellige opførsel af oligomerer af det samme molekyle 11,12,19. Den her beskrevne klyngestørrelsesbestemmelsesprocedure kan anvendes til at bestemme størrelsen af en række fluorescerende mærkede molekyler. Under udførelsen af den fluorescensbaserede størrelsesbestemmelse skal man være forsigtig med at bestemme klyngestørrelsen af Cin8-GFP-partikler ved den første udseenderamme for at undgå virkningen af blegning, da de store klynger kan fremstå som mindre efter fotoblegning.

Motilitetskarakteriseringen udføres af MD- og/eller MSD-analyserne. Hvis det kun er af interesse kun at bestemme motorhastigheden, er MD-analyse tilstrækkelig. Hvis motormotiliteten imidlertid indeholder både aktive og passive komponenter, og det også er nødvendigt at bestemme diffusionskoefficienten, bør DER foretages en MSD-analysepå 20,23,24,25. For både MS- og MSD-analyser skal motorens koordinater for hvert tidspunkt bestemmes. For effektiv sporing er det vigtigt at holde motorkoncentrationen optimal. MT'erne bør ikke være for overfyldte med motorer; ideelt set bør der være 3-4 Cin8-GFP motorer / partikler ad gangen på en MT på ~ 10 μm. Automatiserede værktøjer som "KymoButler" eller "TrackMate" plugin i ImageJ-Fiji kan også bruges til at spore de bevægelige motorer26,27. Disse automatiserede værktøjer sparer tid og arbejde, men de har et par begrænsninger. For eksempel, hvis motiliteten af nogle partikler er meget langsom, kan disse værktøjer læse dem som ikke-bevægelige partikler. Derudover har disse værktøjer grænser for at genkende molekyler med lav intensitet. Derfor kan de udvise en højintensiv bias. På den anden side er manuel sporing (selvom det er tidskrævende) mindre følsom over for sporingsfejl.

Sammenfattende forklarer denne protokol, der starter fra oprensningen af Cin8, der er overudtrykt i S. cerevisiae, udførligt enkeltmolekylemotilitetsassayet og den efterfølgende motilitetsanalyse af dette tovejs kinesin-5. Denne protokol kan let følges for at rense og karakterisere bevægeligheden af motorproteiner som Cin8. Desuden kan de forskellige dele af protokollen tilpasses til at rense proteiner fra gær eller udvikle enkeltmolekylemotilitetsassays for forskellige motorproteiner og deres motilitetskarakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev delvist støttet af Israel Science Foundation-bevillingen (ISF-386/18) og Israel Binational Science Foundation-bevillingen (BSF-2019008), der blev tildelt L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

Tags

Biokemi udgave 180 kinesin Cin8 enkeltmolekylemotilitet mikrotubuli tovejsmotilitet

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Motilitet af enkeltmolekyler og klynger af tovejs kinesin-5 Cin8 renset fra <em>S. cerevisiae-celler</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter