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Biochemistry

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

A cinesinismo mitostática bi-direcional-5 Cin8 acumula-se em aglomerados que se dividem e se fundem durante sua motilidade. O acúmulo em clusters também altera a velocidade e a direcionalidade do Cin8. Aqui, é descrito um protocolo de ensaios de motilidade com Cin8-GFP purificado e análise de propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8.

Abstract

Os motores de cinesina bipolar mitotítica-5 desempenham funções essenciais na dinâmica do fuso. Estes motores exibem uma estrutura homo-tetramérica com dois pares de domínios motores catalíticos, localizados em extremidades opostas do complexo ativo. Esta arquitetura única permite que os motores kinesin-5 cruzem e deslizem para além de microtúbulos de eixo antiparaol (MTs), fornecendo assim a força direcionada externamente que separa os polos do eixo. Anteriormente, acreditava-se que os motores kinesin-5 eram exclusivamente mais-end dirigidos. No entanto, estudos recentes revelaram que vários motores fúngicos de cinesina-5 são menos-finais direcionados ao nível de molécula única e podem mudar a direcionalidade em várias condições experimentais. O Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 é um exemplo de tal proteína motora bidirecional: em alta resistência iônica, moléculas únicas de Cin8 se movem na direção menos final dos MTs. Também foi demonstrado que o Cin8 forma clusters motile, predominantemente na extremidade inferior dos MTs, e tal agrupamento permite que Cin8 mude de direcionalidade e se submeta a motilidade direcionada lenta e plus-end. Este artigo fornece um protocolo detalhado para todas as etapas de trabalho com kinesin-5 Cin8 marcado por GFP, desde a superexpressão de proteínas em células S. cerevisiae e sua purificação até o ensaio de motilidade de molécula única in vitro . Um método recém-desenvolvido descrito aqui ajuda a diferenciar entre moléculas únicas e aglomerados de Cin8, com base em sua intensidade de fluorescência. Este método permite a análise separada da motilidade de moléculas únicas e aglomerados de Cin8, proporcionando assim a caracterização da dependência da motilidade Cin8 em seu tamanho de cluster.

Introduction

Um grande número de eventos de motilidade dentro das células eucarióticas são mediados pela função das proteínas motoras moleculares. Esses motores se movem ao longo dos filamentos citoesqueléticos, filamentos de actin e microtúbulos (MTs), e convertem a energia química da hidrólise ATP em forças cinéticas e mecânicas necessárias para conduzir a motilidade biológica dentro das células. O S. cerevisiae Cin8, baseado em MT, é uma proteína motora bipolar, homotetrameric quinase-5 que cruza e desliza MTs de eixo1. O Cin8 executa funções essenciais durante a mitose, na montagem do eixo 2,3,4 e no alongamento do eixo durante a anafase 5,6,7. Anteriormente, havia sido demonstrado que o Cin8 é um motor bidirecional, que muda a direcionalidade em diferentes condições experimentais. Por exemplo, sob altas condições de resistência iônica, motores Cin8 únicos movem-se em direção à extremidade inferior dos MTs, enquanto em clusters, em ensaios de deslizamento MT multimotores, e entre MTs antiparalhais, os motores Cin8 movem-se principalmente em direção às extremidades mais altas dos MTs 8,9,10,11,12 . Esses achados foram altamente inesperados por várias razões. Primeiro, o Cin8 carrega seu domínio motor catalítico no amino-terminus e tais motores foram previamente acreditados como exclusivamente mais-end dirigidos, enquanto Cin8 foi mostrado ser menos-fim direcionado ao nível de molécula única. Em segundo lugar, acreditava-se que os motores de cinesina eram unidirecionais, seja de ponta ou de ponta, enquanto o Cin8 mostrou-se bi-direcional, dependendo das condições experimentais. Finalmente, por causa da orientação em MT no fuso mitótico, o papel clássico dos motores cinesina-5 na separação de postes de fuso durante a montagem do fuso e da anfífase B só poderia ser explicado por sua motilidade direcionada plus-end nos MTs que eles cruzam 1,13. Após os primeiros relatos sobre a bidirecionalidade do Cin8, alguns outros motores de cinesina foram demonstrados como bi-direcionais 14,15,16, indicando que a motilidade bidirecional dos motores de cinesina pode ser mais comum do que se acreditava anteriormente.

Foi relatado anteriormente que nas células, o Cin8 também se move de forma bidirecional8, apoiando a noção de que a motilidade bidirecional de alguns motores cinesin-5 é importante para suas funções intracelulares. Além disso, uma vez que os três motores cinesin-5 que foram relatados como bidirecionais são de células fúngicas, um possível papel para a bidalidade bi-direcionalidade dos motores cinesin-5 foi recentemente proposto nessas células10. De acordo com este modelo, em mitose fechada de células fúngicas, onde o envelope nuclear não quebra durante a mitose, os motores de quinase-5 fornecem a força inicial que separa os polos do eixo antes da montagem do eixo. Para realizar esta tarefa, antes da separação do polo de fuso, os motores kinesin-5 localizam-se perto dos polos de fuso, por sua motilidade direcionada sem fim em MTs nucleares únicos. Uma vez nesta posição, os motores kinesin-5 agrupam, alternam direcionalidade, capturam e cruzam MTs de postes de fuso vizinhos. Posteriormente, os motores kinesin-5 fornecem a separação inicial dos polos por motilidade dirigida plus-end nos MTs que eles cruzam. Por este modelo, tanto a motilidade dirigida por fim em MTs único quanto a motilidade direcionada plus-end em MTs transversais durante o deslizamento antiparal são necessárias para que os motores fúngicos kinesin-5 realizem seus papéis na montagemdo eixo 1,13.

O objetivo geral do método descrito é obter kinesina-5 Cin8 marcada por FFP de alta pureza e realizar ensaios de motilidade de molécula única (Figura 1) enquanto analisa separadamente a motilidade de moléculas únicas e aglomerados de Cin8. A separação entre moléculas únicas e aglomerados é importante, uma vez que um dos fatores que foram demonstrados para afetar a direcionalidade do Cin8 é o seu acúmulo em clusters nos MTs10,12. Ensaios alternativos de motilidade, como o deslizamento de superfície mt e ensaios deslizantes de MT não fornecem informações sobre a atividade de proteínas motoras únicas 17,18. Os robustos métodos de ensaio e análise de motilidade de molécula única descritos aqui foram aplicados com sucesso para caracterizar diferentes aspectos dos motores kinesin-5, Cin8 e Kip1 10,11,12,14,19,20.

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a superexpressão e purificação do Cin8, polimerização de MTs e o ensaio de motilidade de molécula única. Além disso, também são descritas as análises para diferenciar moléculas e aglomerados únicos de Cin8 e determinar velocidades motoras e cluster únicas por deslocamento médio (MD) e análise média de deslocamento quadrado (MSD). Este protocolo tem como objetivo ajudar os pesquisadores a visualizar todas as etapas dos procedimentos e auxiliar na solução de problemas desse tipo de ensaio.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do ensaio de motilidade de molécula única. Os MTs fluorescentes biotinilados são anexados à superfície de vidro, revestidos com o Avidin que interage com o biotinilado-BSA conectado à superfície. O arqueiro verde representa a direção de movimento de moléculas cin8 únicas sob altas condições de resistência iônica. +/- representar a polaridade do MT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. Preparação de tampões e reagentes

  1. Buffers
    1. -Leu aa dropout mix: Misture 2 g cada de Adenina, Uracil, Triptofano, Histidine, Lysine e Methionine e armazene à temperatura ambiente.
    2. Levedura meio seletivo com raffinose (1 L): Misture 6,7 g de base de nitrogênio de levedura (com sulfato de amônio), 2 g de mistura de gota de -Leu aa e 20 g de raffinose em água dupla destilada, mexendo (sem aquecimento) até totalmente dissolvida. Usando um filtro de 0,22 μm, filtre a solução em uma garrafa estéril.
    3. Tampão de lise: Prepare 25 mL de solução em água tripla destilada (TDW) composta por 50 mM Tris, Tubos de 30 mM, 500 mM KCl, 10% glicerol, 1,5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP e 0,1% Triton X-100. Ajuste o pH para 8 usando 6 M HCl.
    4. Tampão de elução: Prepare 10 mL de solução em TDW consistindo de 50 mM Tris, Tubos de 30 mM, 500 mM KCl, 350 mM imidazole, 10% glicerol, 1,5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP e 0,1% Triton X-100. Ajuste o pH para 7,2 usando 6 M HCl.
    5. P12 Buffer: Prepare 10 mL de uma solução em TDW composta por tubos de 12 mM, 1 mM EGTA e 2 mM MgCl2. Ajuste o pH para 6,9 usando 10 M NaOH.
    6. Tampão BRB80: Prepare 50 mL de uma solução composta por tubos de 80 mM, 1 mM EGTA e 2 mM MgCl2 em água ultrauso. Ajuste o pH para 6,9 usando 10 M NaOH.
    7. Buffer de tubulina geral (GTB): Prepare 50 mL de uma solução composta por tubos de 80 mM, 0,5 mM EGTA e 2 mM MgCl2 em água ultrauso. Ajuste o pH para 6,9 usando 10 M NaOH.
    8. Solução Tris-Pipes: Prepare 40 mL de solução de tubos Tris-0,6 M de 1M misturando 6,055 g de Tris e 9,07 g de tubos em TDW e ajuste pH para 7,2 usando 6 M HCl. Leve o volume final para 50 mL com TDW.
      NOTA: Os buffers P12, BRB80 e Tris-Pipes são utilizados para a elaboração de soluções de estoque para ensaio de motilidade. Estes buffers podem ser preparados em grandes quantidades, aliquos em tubos de 1,5 mL, congelados por snap e armazenados a -20 °C.
  2. Soluções de estoque para ensaio de motilidade
    1. Tubulina (10 mg mL-1): Dissolver 1 mg de tubulina liofilizada em 100 μL de tampão de tubulina geral (GTB). Snap-freeze 1 μL alíquotas e armazene-as a -80 °C.
    2. Tubulina biotinilada (1 mg mL-1): Dissolver 20 μg de tubulina liofilizada em 20 μL de GTB frio. Snap-freeze 1 μL alíquotas e armazene-as a -80 °C.
    3. Tubulina rotulada de rhodamina (1 mg mL-1): Dissolver 20 μg de tubulina liofilizada em 20 μL de GTB frio. Snap-freeze 0,5 μL alíquotas e armazene-as a -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): O GMPCPP é obtido do fornecedor como uma solução aquosa de 100 μL e armazenado a -80 °C. Descongele o frasco com GMPCPP no gelo. Prepare 1 μL aliquots, snap-freeze e armazene-os a -80 °C.
    5. ATP: Prepare a solução de 500 μL de ATP de 100 mM em tampão 0,5 M Tris (pH 8). Snap-freeze 2 alíquotas de μL e armazene-as a -20 °C.
    6. MgCl2: Prepare a solução de 1 mL de 200 mM MgCl2 no buffer P12. Armazene 5 alíquotas de μL a -20 °C.
    7. Casein: Prepare uma solução de 1 mL de caixa mL-1 de 5 mg em tampão BRB 80. Snap-freeze 10 μL alíquotas e armazene-as a -20 °C.
    8. D-Glicose: Prepare uma solução de 1 mL de 1 M D-glicose no buffer P12. Armazene 10 alíquotas μL a -20 °C.
    9. Glicose oxidase: Prepare uma solução de 1 mL de 10 mg mL-1 glicose oxidase no tampão P12. Snap-freeze 2 alíquotas de μL e armazene-as a -20 °C.
    10. Catalase: Prepare uma solução de 1 mL de catalase mL-1 de 0,8 mg mL-1 no buffer P12. Snap-freeze 2 alíquotas de μL e armazenar a -20 °C.
    11. Dithiothreitol (DTT): Prepare uma solução de 1 mL de 1 M DTT em tampão P12 em um capô de fumaça. Snap-freeze 10 μL alíquotas e armazene-as a -20 °C.
    12. Fosfato de creatina: Prepare uma solução de 1 mL de fosfato de creatina de 1 M no tampão P12. Snap-freeze 2 alíquotas de μL e armazene-as a -20 °C.
    13. Creatina fosfokinase: Prepare uma solução de 1 mL de 5 mg mL-1 creatina phosphokinase em 0,25 M de glicitllicilato, pH 7.4. Snap-freeze 2 alíquotas de μL e armazene-as a -20 °C.
    14. EGTA: Prepare uma solução EGTA de 100 mM em água ultrauso e armazene-a à temperatura ambiente.
    15. KCl: Prepare uma solução de 1 M KCl em água ultrauso e armazene-a à temperatura ambiente.
  3. Tampão de motilidade e mistura de reação
    1. Tampão de motilidade (MB) com 145 mM KCl, 2x stock: Prepare 1 mL de estoque de 2x do tampão de motilidade misturando 100 μL de solução Tris-Pipes pré-fabricada, 20 μL de 100 mM EGTA, 290 μL de KCl e 590 μL de TDW. Mantenha o tampão no gelo.
    2. Mistura de reação de motilidade: Prepare a mistura de reação de motilidade de acordo com a Tabela 1 e armazene-a no gelo.
Volume Estoque Nome do reagente
50 μL 2X MB (da etapa 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM ATP
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/mL Caseína
1 μL 1 M Glicose
1 μL 1 M DTT
1 μL 10 mg/mL Glicose oxidase
1 μL 8 mg/mL Catalase
1 μL 1 M Fosforcreatina
1 μL 5 mg/mL Phosphokinase creatina
100 μL Total

Mesa 1.

2. Cin8 sobreexpressão e purificação de células S. cerevisiae

  1. Cultivar células S. cerevisiae contendo o plasmídeo para superexpressão de Cin8-GFP-6His para a fase de crescimento exponencial (OD600 = 0,6-0,8) em 1 L de levedura seletiva complementada com raffinose de 2% (ver passo 1.1.2) a 28 °C12.
  2. Induzir Cin8-GFP-6A superexpressão por adição de 2% de galactose. Monitore o crescimento da cultura da levedura medindo a absorvância a 600 nm.
  3. Cinco horas após a adição de galactose, colher as células por centrifugação a 4.000 x g por 15 min a 4 °C, suspender as células no tampão de lise e congelar no líquido N2.
    NOTA: As células congeladas podem ser armazenadas a -80 °C para uso posterior ou imediatamente aterradas no líquido N2.
  4. Triture as células congeladas no líquido N2 usando argamassa gelada e pilão. Adicione o líquido N2 durante a moagem para manter os extratos congelados. Normalmente requer 4-5 vezes de adicionar líquido N2.
  5. Monitore a lise celular por observação sob contraste de fase ou microscópio DIC.
  6. Descongele as células moídas e centrífugas a 21.000 x g por 30 min a 4 °C. Carregue o sobrenante em uma coluna de fluxo de gravidade preenchida com 2 mL de Ni-NTA e pré-equilibrada com tampão de lise. Deixe o supernatante fluir através da coluna.
  7. Lave a coluna com cinco volumes de coluna de tampão de lise e, em seguida, com cinco volumes de coluna de tampão de lise suplementados com imidazol de 25 mM.
  8. Elute Cin8-GFP-6His com tampão de eluição (ver passo 1.1.4).
  9. Analise as amostras elucidadas pelo fracionamento SDS-PAGE, seguido de coloração azul Coomassie e análise de manchas ocidentais sondadas com anticorpo α-GFP19.
  10. Acumule as frações contendo Cin8-GFP-6His (etapas 2.8 e 2.9). Além disso, purificá-los por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL min-1 e limite de pressão da coluna de 1,5 MPa, com monitoramento simultâneo da absorvância em 280 nm e da emissão de gfpnce com excitação a 488 nm (Figura 2A).
  11. Colete as frações correspondentes ao tetramer Cin8-GFP e analise-as por SDS-PAGE e manchas ocidentais (ver passo 2.9) (Figura 2B).
  12. Estime a concentração de proteínas usando espectrofotometria ou ensaios bioquímicos como ensaio de Bradford, ensaio BCA etc.
  13. Alíquotar as frações selecionadas, congelar no líquido N2 e armazenar até usar a -80 °C. Estas amostras de proteína purificada podem ser usadas por 6 meses.
    NOTA: Cin8-GFP é superexpresso e purificado de uma cepa S. cerevisiae deficiente protease contendo um plasmídeo de 2 μm para Cin8-GFP-6His sobreexpressão do promotor indutível galactose, LGY 4093: MATα, leu2-3.112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). A cepa de levedura e plasmid estão disponíveis mediante solicitação.

Figure 2
Figura 2: Purificação de Cin8-GFP. (A) O cromatograma de exclusão de tamanho do Ni-NTA purificou Cin8-GFP, com detecção contínua de fluorescência GFP através de excitação de 488 nm e emissão em ~510 nm. O tetramer elutes Cin8-GFP é de ~10 mL da coluna SEC (marcada com uma seta). (B) Gel SDS-PAGE manchado de Coomassie (superior) e α-GFP mancha ocidental (inferior) de frações Cin8-GFP elucidadas da SEC. As amostras nas pistas são as seguintes: M - Marcador de peso molecular, Ni2+- Ni-NTA purificada amostra Cin8-GFP que é carregada na coluna SEC, frações GF: fração correspondente à elução SEC Cin8-GFP como marcado no painel A. A seta à direita marca o tamanho do monômero Cin8-GFP (esperado no SDS-PAGE). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Ensaio de motilidade de molécula única com o Cin8 purificado

  1. Polimerização de MTs rotulados de biotina e rhodamina, estabilizado com GMPCPP.
    1. Inicie a polimerização mt misturando os seguintes componentes em um tubo de 1,5 mL: 1 μL de 10 mg/mL de proteína tubulina, 1 μL de tubulina biotinilada de 1 mg/mL, 0,5 μL de tubulina com rhodamina de 1 mg/mL, 1 μL de 10 mM GMPCPP e 6,5 μL de tampão de tubulina geral (GTB). Incubar a mistura por 1h a 37 °C.
    2. Após a polimerização mt, adicione 80 μL de GTB quente (37 °C), misture cuidadosamente e centrífuga a 16.500 x g por 20 min.
    3. Descarte o supernatante e suspenda a pelota cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo com 50 μL de GTB quente. Armazene a suspensão a 28 °C.
    4. Examine os MTs com um microscópio de fluorescência usando o canal de rhodamina de 647 nm (Figura 3A).
      NOTA: Para obter MTs rotulados fluorescentemente biotinilados, a reação de polimerização contém tubulina sem rótulo, bem como tubulina biotinylated e fluorescentemente rotulada. Neste protocolo, a tubulina rotulada por rhodamina é usada, mas outros conjugados fluorescentes também podem ser utilizados.
  2. Montagem da Câmara de Fluxo
    1. Monte uma câmara de fluxo colocando quatro tiras de fita dupla face (~4 cm x ~3 mm) em um slide avançado de vidro adesivo (paralelo à borda mais longa e ~3-4 mm de distância) para criar três 'pistas' entre as tiras de fita. Remova o papel protetor das tiras de fita e coloque um deslizamento de tampa silanizado10 nas tiras de fita para criar três câmaras de fluxo de ~10 μL em volume.
  3. Imobilização mt para a superfície revestida de avidin (Figura 1)
    1. Cubra silanizado perfusando com 15 μL de 1 mg/mL biotinilto-bovino albumina (b-BSA, dissolvida em GTB) na câmara de fluxo usando uma micropipette. Depois de 5 min, lave a câmara com 80 μL de GTB.
    2. Posteriormente, como na etapa 3.3.1, insira na câmara de fluxo 15 μL de 1 mg/mL Avidin (dissolvida em GTB) que se liga à b-BSA. Depois de 5 min, lave a câmara com 80 μL de GTB.
    3. Passivate a superfície de deslizamento de cobertura silanizada usando 20 μL de 1% poloxamer. Depois de 3 min, lave com 80 μL de GTB.
    4. Anexar MTs biotinilados (passo 3.1) ao deslizamento revestido b-BSA-avidin inserindo 20 μL de MTs tipicamente diluídos a 1:20 em GTB. Incubar os slides em posição invertida, ou seja, com o deslizamento voltado para baixo em uma câmara de umidade escura (por exemplo, uma placa de Petri contendo papel de tecido molhado) por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave com 200 μL de GTB.
    5. Aplique 30 μL de mistura de reação de motilidade (ver passo 1.3.2) na câmara de fluxo.
    6. Diluir os motores Cin8-GFP (etapa 2.13) em 20 μL de mistura de reação de motilidade (ver Tabela 1) (tipicamente para uma concentração final de 5-10 μM). Aplique-os na câmara de fluxo e apenas a imagem do movimento dos motores ao longo dos MTs.
  4. Imagem de motilidade motora
    NOTA: A ligação MT e a motilidade dos motores foram monitoradas usando um microscópio invertido de epifluorescência equipado com uma lâmpada de arco de mercúrio, um objetivo de abertura numérica de 100x/1.4, e dois conjuntos de filtros de bandpass de fluorescência, um com um comprimento de onda de 647 nm (para rhodamina) e outro com um comprimento de onda de 488 nm (para GFP).
    1. Coloque uma gota de óleo de imersão no objetivo do microscópio. Coloque a câmara de fluxo no estágio do microscópio fluorescente com o deslizamento de cobertura para baixo de frente para o objetivo.
    2. Ligue o canal de rhodamine para focar nos MTs conectados à superfície do deslizamento de cobertura e adquira a imagem com exposição de 20 ms usando o software Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Ligue o canal GFP e adquira 90 imagens de lapso de tempo com intervalo de 1 s e exposição de 800 ms, para análise da motilidade Cin8-GFP.

Figure 3
Figura 3: MTs e MT vinculados Cin8-GFP. (A) Imagens de dois campos (esquerda e direita) para MTs polimerizados seguindo o protocolo descrito na etapa 3.1 e visualizados com objetivo de 100x conforme descrito na etapa 3.4. (B) Imagens de dois campos (esquerda e direita) para o Cin8-GFP (painéis inferiores, marcados com setas) anexadas ao MT mostrados nos painéis superiores. Barra de escala: 4 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise de motilidade

NOTA: Realize toda a análise de imagem e gere kymographs usando o Software ImageJ-Fiji.

  1. Geração de kymograph
    1. Abra o filme de lapso de tempo e a imagem de campo MT correspondente. Sincronize essas duas janelas escolhendo a seguinte opção: Analisar ferramentas > > sincronizar o Windows.
    2. Destaque um MT usando a opção Linha Segmentada e use a guia Analisar > Multi Kymograph para obter um kymograph.
  2. Determinação do tamanho do cluster de Cin8-GFP (ou seja, o número de moléculas Cin8 em um cluster)
    1. Execute a subtração de fundo e a correção para iluminação irregular usando a opção Processo > Subtrair fundo . Defina o raio da bola rolando em 100 pixels e verifique a opção Paraboloid deslizante .
    2. Siga a intensidade média de fluorescência de um motor Cin8-GFP não motile específico (Figura 3B) em função do tempo dentro de um círculo de 4 pixels de raio usando o plugin TrackMate do software ImageJ-Fiji, escolhendo a seguinte opção: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Repita o passo 4.2.2 para diferentes motores Cin8-GFP. Plote a intensidade de fluorescência dos diferentes motores Cin8-GFP em função do tempo.
      NOTA: Uma estratégia experimental para medir o tamanho do cluster, ou seja, o número de moléculas Cin8 em um cluster estabelece uma base para a análise da motilidade relacionada ao cluster do Cin8. A fotobleaching de GFP anexada ao Cin8 é empregada para determinar a contribuição de moléculas de GFP únicas para a intensidade total dos clusters Cin8. Por exemplo, as intensidades de fluorescência diminuem em etapas de ~50 unidades arbitrárias (a.u.), com cada passo provavelmente representando o fotobleaching de uma molécula de GFP (Figura 4A). Como o Cin8 é uma proteína motora homo-tetramérica, contém quatro moléculas de GFP. Assim, todos os motores Cin8 com uma intensidade ≤ 200 a.u. provavelmente são moléculas tetraméricas cin8 únicas. Seguindo este método, faixas de intensidade da fluorescência motora Cin8 são atribuídas como <200, 200-400, e >400 para moléculas cin8 únicas, pares de moléculas Cin8 (dimer de Cin8 tetramer), e cin8 oligômeros, respectivamente12.
  3. Análise de distribuição de intensidade para motores Cin8-GFP
    1. Meça a intensidade média de floresnce de todos os motores Fluorescentes Cin8-GFP no primeiro quadro da sequência de lapso de tempo usando plugin TrackMate em ImageJ-Fiji, conforme descrito na etapa 4.2.2.
    2. Traçar um histograma das intensidades médias de Cin8-GFP com um tamanho de caixa de 20 a.u. e encaixar o pico principal do histograma a uma curva gaussiana (Figura 4B).
      NOTA: A análise de distribuição de intensidade complementa a determinação do tamanho do cluster para os motores Cin8-GFP a partir dos experimentos de fotobleaching. A curva gaussiana se encaixava no histograma de distribuição de intensidade para os picos populacionais cin8-GFP em ~125 a.u., o que é consistente com a intensidade média de moléculas únicas tetraméricas Cin8 contendo uma, duas, três ou quatro moléculas fluorescentes (não branqueadas), com cada molécula fluorescente de GFP contribuindo ~50 a.u. Assim, utilizando este método de distribuição de intensidade, a contribuição de uma molécula de GFP também pode ser calculada, que pode ser ainda mais utilizada para atribuir o tamanho do cluster das moléculas Cin8-GFP.

Figure 4
Figura 4: Perfil de branqueamento cin8-GFP e distribuição de intensidade. (A) Fotobleaching de GFP em quatro diferentes motores Cin8-GFP. Passos de fotobleaching único, cada um provavelmente representando o fotobleaching de um GFP, levam a uma queda na intensidade da fluorescência de ~50 a.u. (B) A distribuição de intensidade dos motores Cin8-GFP no primeiro quadro de uma sequência de lapso de tempo (inset). O pico gaussiano (azul) centrado em ~125 a.u representa moléculas únicas cin8-GFP. Este pico exibe a intensidade média de tetramers Cin8 únicos com uma, duas, três ou quatro moléculas fluorescentes de GFP, com cada molécula GFP contribuindo ~50 a.u. para a intensidade total (ou seja, (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Rastreamento das moléculas Cin8-GFP motilidade ao longo das trilhas mt
    1. Crop o MT para ser analisado na sequência de lapso de tempo dos quadros gravados, destacando-o com a ferramenta Retângulo e, em seguida, escolhendo Imagem > Crop.
    2. Escolha uma partícula fluorescente Cin8-GFP para a análise. Registo as coordenadas de partículas em cada período (ponto de tempo) da sequência de lapso de tempo usando as opções Ferramenta de ponto e Medida . Realize um registro semelhante de coordenadas para outras partículas fluorescentes na sequência de lapso de tempo.
    3. Atribua o tamanho do cluster a todas as partículas Cin8-GFP examinadas no primeiro quadro de sua aparência, conforme descrito na etapa 4.2.
  2. Análises de deslocamento médio (MD) e deslocamento quadrado médio (MSD)
    1. A partir das coordenadas dos movimentos Cin8-GFP determinadas na etapa 4.4, calcule os deslocamentos de Cin8-GFP em cada ponto de tempo em relação às coordenadas iniciais, utilizando a equação para cálculo da distância entre dois pontos com coordenadas dadas:
      Equation 1
      onde, dt são os deslocamentos de Cin8-GFP no momento t, xt e yt são as respectivas coordenadas no momento t. x0 e y0 são as respectivas coordenadas de Cin8-GFP em t = 0.
    2. Calcule a partir desses valores de deslocamento o deslocamento para todos os intervalos de tempo possíveis para uma partícula Cin8-GFP específica. Repita o procedimento para todas as partículas Cin8-GFP examinadas.
    3. Plote o deslocamento médio (MD) de todas as partículas Cin8-GFP examinadas versus intervalo de tempo e sujeito a um ajuste linear, MD = v x t + c. A inclinação deste ajuste (v) representa a velocidade média das partículas Motile Cin8-GFP.
      NOTA: Desta forma, a velocidade média de todas as moléculas Cin8-GFP pertencentes a cada tamanho de cluster pode ser calculada separadamente caracterizando a motilidade de diferentes tamanhos de cluster. Além da análise de DM, a análise média de deslocamento quadrado (DMM) também pode ser realizada por meio da quadratura dos valores de deslocamento calculados nas etapas 4.5.1 e 4.5.2. Os valores MSD são plotados versus intervalo de tempo e instalados na curva polinomial MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, dando o parâmetro adicional D, que é o coeficiente de difusão do movimento Cin8-GFP. A análise de MD deve ser realizada na polarização marcada MTs 8,10, enquanto para a análise de MSD o conhecimento da polaridade MT não é necessário.

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Representative Results

O experimento tem como objetivo investigar as características de motilidade da proteína motora bidirecional Cin8 de diferentes tamanhos de cluster em MTs únicos. A motilidade representativa do Cin8-GFP também é evidente a partir dos kymographs na Figura 5A, onde a posição espacial do motor ao longo do tempo é mostrada.

Para a análise das propriedades motile do Cin8-GFP, primeiro, o tamanho do cluster é atribuído (etapa 4.3) a cada partícula cin8-GFP anexada a MT e, em seguida, a posição das partículas Cin8 examinadas é rastreada em função do tempo (etapa 4.4). Para cada categoria de tamanho de cluster, foram extraídos >40 trajetórias de Cin8-GFP individuais das gravações (Figura 5B). Utilizando-se as coordenadas obtidas a partir da análise de rastreamento, a análise de DM e MSD é realizada separadamente para cada população de tamanho de cluster. As velocidades são obtidas de ajustes lineares para MD apresentados na Figura 5C. Verificou-se que as moléculas únicas de Cin8-GFP se movem de forma unidirecional e sem fim dirigida com alta velocidade, enquanto os clusters Cin8 apresentam velocidade consideravelmente menor com maior propensão para motilidade bi-direcional (Figura 5B,C).

Figure 5
Figura 5: Cítilidade cin8-GFP. (A) Os kymógrafos que representam a motilidade dos motores Cin8-GFP em MTs. X- e Y-axes representam rede MT e tempo, respectivamente. As setas amarelas marcam a motilidade rápida das partículas Cin8-GFP únicas em direção à direção menos final do MT, enquanto as setas azuis marcam a motilidade lenta dos aglomerados Cin8 na direção plus-end do MT. A polaridade dos TM é indicada na parte inferior de cada kymograph (+/-). Barra horizontal: 4 μm, barra vertical: 20 s. (B) Traços de deslocamento de motores únicos (esquerda) e clusters (à direita) de motores Cin8-GFP. Os traços de deslocamento foram traçados utilizando as coordenadas obtidas após o rastreamento dos motores Cin8-GFP individuais, conforme explicado na etapa 4.4. Valores negativos e positivos de deslocamento indicam movimento nas direções de ponta e plus-end do MT, respectivamente. Note que sob o mesmo ensaio, a motilidade dos aglomerados Cin8 é mais lenta e bidirecional em comparação com as moléculas únicas de Cin8. (C) Parcelas de deslocamento médio (MD) ± SEM, de moléculas únicas (esquerda) e clusters (direita) de motores Cin8 em função do intervalo de tempo. Linhas pretas representam ajustes lineares da trama (MD = v xt + c, onde v é a velocidade média, t é o intervalo de tempo e c representa a interceptação). A partir do encaixe, é evidente que a velocidade média para motores simples e clusters de Cin8 é de -265 ± 20 nm/s e -48 ± 5 nm/s, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste trabalho, é apresentado um protocolo para ensaio de motilidade de molécula única com a cinesina bidirecional-5 Cin8 e a análise de motilidade. O Cin818 de comprimento completo, incluindo o sinal de localização nuclear nativa (NLS) no terminal C foi purificado do hospedeiro nativo S. cerevisiae. Como o Cin8 é uma proteína motora nuclear, moer as células S. cerevisiae sob nitrogênio líquido é considerado o método mais eficiente para a lise celular. Após a lise, combinando a afinidade metálica e a cromatografia de exclusão de tamanho, obtém-se Cin8 altamente puro, o que é importante para os ensaios de motilidade de molécula única. Foi relatado anteriormente que há diferenças entre as propriedades motile do Cin8 em extratos brutos e amostras purificadas8. Além disso, também foi relatado que a aglomeração de MT com proteínas motoras e não motoras afeta a direcionalidade da cinestesina bidirecional-5 Cut722. Assim, a alta pureza do motor é necessária para análise confiável da motilidade e conclusões sobre o comportamento motor selvagem e mutante. As técnicas descritas aqui podem ser facilmente adaptadas para purificar outras proteínas nucleares da levedura com ajustes de buffer adequados.

Descrito aqui é um ensaio de motilidade de molécula única altamente robusto e sensível com Cin8 marcado por GFP. O sucesso deste ensaio depende fortemente da polimerização e imobilização adequada de MT para a superfície. A forte interação avidin-biotina é utilizada para imobilizar os MTs à superfície de vidro hidrofóbico, que anexa irreversivelmente os MTs. Nestes MTs imobilizados usando o GFP rotulado Cin8, a motilidade Cin8 pode ser rastreada de forma confiável 11,12,19.

O Cin8 é relatado para formar aglomerados contendo mais de um motor tetramédico10,12, com a motilidade desses aglomerados sendo diferente da de moléculas cin8 únicas. Para caracterizar com precisão a motilidade Cin8 em função de seu tamanho, um método baseado em intensidade de fluorescência foi desenvolvido para identificar o tamanho do cluster de cada partícula Cin812. Com base nessa categorização de tamanho, a motilidade é analisada separadamente em cada categoria de tamanho. Após essa análise baseada em tamanho, são fornecidos detalhes critáveis, que podem ser utilizados para entender o comportamento diferente dos oligômeros da mesma molécula 11,12,19. O procedimento de determinação do tamanho do cluster descrito aqui pode ser aplicado para determinar o tamanho de uma variedade de moléculas fluorescentes rotuladas. Ao realizar a determinação de tamanho baseada em fluorescência, deve-se ter cuidado para determinar o tamanho do cluster de partículas Cin8-GFP no primeiro quadro de aparência para evitar o impacto do branqueamento, uma vez que os grandes clusters poderiam aparecer como menores após o fotobleaching.

A caracterização da motilidade é realizada pelas análises MD e/ou MSD. Se for de interesse determinar apenas a velocidade do motor, a análise de MD é suficiente. No entanto, se a motilidade motora contiver componentes ativos e passivos e determinar o coeficiente de difusão também for necessária, a análise de MSD deve ser realizada 20,23,24,25. Para análises de MD e MSD, as coordenadas do motor para cada ponto de tempo precisam ser determinadas. Para um rastreamento eficiente, é importante manter a concentração do motor ótima. Os MTs não devem estar muito cheios de motores; idealmente, deve haver motores/partículas Cin8-GFP 3-4 de cada vez em um MT de ~10 μm. Ferramentas automatizadas como o plugin "KymoButler" ou "TrackMate" no ImageJ-Fiji também podem ser usadas para rastrear os motoresmotile 26,27. Essas ferramentas automatizadas economizam tempo e trabalho, mas têm algumas limitações. Por exemplo, se a motilidade de algumas partículas é muito lenta, essas ferramentas podem lê-las como partículas não-motile. Além disso, essas ferramentas têm limites no reconhecimento de moléculas de baixa intensidade. Portanto, eles podem exibir um viés de alta intensidade. Por outro lado, o rastreamento manual (embora demorado) é menos sensível a erros de rastreamento.

Em resumo, este protocolo, a partir da purificação do Cin8 superexpresso em S. cerevisiae, explica de forma abrangente o ensaio de motilidade de molécula única e a análise de motilidade subsequente desta cinesina bidirecional-5. Este protocolo pode ser seguido facilmente para purificar e caracterizar a motilidade de proteínas motoras como o Cin8. Além disso, as diferentes partes do protocolo podem ser adaptadas para purificar proteínas da levedura ou desenvolver ensaios de motilidade de molécula única para diferentes proteínas motoras e sua caracterização de motilidade.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada em parte pela bolsa da Israel Science Foundation (ISF-386/18) e pela bolsa da Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008), concedida à L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

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References

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Bioquímica Edição 180 cinesina Cin8 motilidade de molécula única microtúbulo motilidade bidirecional

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

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Roy Avraham

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso <em></em>
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Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

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