A cinesinismo mitostática bi-direcional-5 Cin8 acumula-se em aglomerados que se dividem e se fundem durante sua motilidade. O acúmulo em clusters também altera a velocidade e a direcionalidade do Cin8. Aqui, é descrito um protocolo de ensaios de motilidade com Cin8-GFP purificado e análise de propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso
Neste artigo
Aviso de errata
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumo
Resumo
Os motores de cinesina bipolar mitotítica-5 desempenham funções essenciais na dinâmica do fuso. Estes motores exibem uma estrutura homo-tetramérica com dois pares de domínios motores catalíticos, localizados em extremidades opostas do complexo ativo. Esta arquitetura única permite que os motores kinesin-5 cruzem e deslizem para além de microtúbulos de eixo antiparaol (MTs), fornecendo assim a força direcionada externamente que separa os polos do eixo. Anteriormente, acreditava-se que os motores kinesin-5 eram exclusivamente mais-end dirigidos. No entanto, estudos recentes revelaram que vários motores fúngicos de cinesina-5 são menos-finais direcionados ao nível de molécula única e podem mudar a direcionalidade em várias condições experimentais. O Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 é um exemplo de tal proteína motora bidirecional: em alta resistência iônica, moléculas únicas de Cin8 se movem na direção menos final dos MTs. Também foi demonstrado que o Cin8 forma clusters motile, predominantemente na extremidade inferior dos MTs, e tal agrupamento permite que Cin8 mude de direcionalidade e se submeta a motilidade direcionada lenta e plus-end. Este artigo fornece um protocolo detalhado para todas as etapas de trabalho com kinesin-5 Cin8 marcado por GFP, desde a superexpressão de proteínas em células S. cerevisiae e sua purificação até o ensaio de motilidade de molécula única in vitro . Um método recém-desenvolvido descrito aqui ajuda a diferenciar entre moléculas únicas e aglomerados de Cin8, com base em sua intensidade de fluorescência. Este método permite a análise separada da motilidade de moléculas únicas e aglomerados de Cin8, proporcionando assim a caracterização da dependência da motilidade Cin8 em seu tamanho de cluster.
Introdução
Um grande número de eventos de motilidade dentro das células eucarióticas são mediados pela função das proteínas motoras moleculares. Esses motores se movem ao longo dos filamentos citoesqueléticos, filamentos de actin e microtúbulos (MTs), e convertem a energia química da hidrólise ATP em forças cinéticas e mecânicas necessárias para conduzir a motilidade biológica dentro das células. O S. cerevisiae Cin8, baseado em MT, é uma proteína motora bipolar, homotetrameric quinase-5 que cruza e desliza MTs de eixo1. O Cin8 executa funções essenciais durante a mitose, na montagem do eixo 2,3,4
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação de tampões e reagentes
- Buffers
- -Leu aa dropout mix: Misture 2 g cada de Adenina, Uracil, Triptofano, Histidine, Lysine e Methionine e armazene à temperatura ambiente.
- Levedura meio seletivo com raffinose (1 L): Misture 6,7 g de base de nitrogênio de levedura (com sulfato de amônio), 2 g de mistura de gota de -Leu aa e 20 g de raffinose em água dupla destilada, mexendo (sem aquecimento) até totalmente dissolvida. Usando um filtro de 0,22 μm, filtre a solução em uma garrafa estéril.
- Tampão de lise: Prepare 25 mL de solução em água tripla destilada (TDW) composta por 50 mM Tris, Tubos de 30 mM, 500 mM....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O experimento tem como objetivo investigar as características de motilidade da proteína motora bidirecional Cin8 de diferentes tamanhos de cluster em MTs únicos. A motilidade representativa do Cin8-GFP também é evidente a partir dos kymographs na Figura 5A, onde a posição espacial do motor ao longo do tempo é mostrada.
Para a análise das propriedades motile do Cin8-GFP, primeiro, o tamanho do cluster é atribuído (etapa 4.3) a cada partícula cin8-GFP anexada a MT e.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste trabalho, é apresentado um protocolo para ensaio de motilidade de molécula única com a cinesina bidirecional-5 Cin8 e a análise de motilidade. O Cin818 de comprimento completo, incluindo o sinal de localização nuclear nativa (NLS) no terminal C foi purificado do hospedeiro nativo S. cerevisiae. Como o Cin8 é uma proteína motora nuclear, moer as células S. cerevisiae sob nitrogênio líquido é considerado o método mais eficiente para a lise celular. Após a lise, combinando a a.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pela bolsa da Israel Science Foundation (ISF-386/18) e pela bolsa da Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008), concedida à L.G.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adenina | FORMEDIUM | DOC0230 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinilated-BSA | Sigma | A8549 | |
| Caseína | Sigma | C7078 | |
| Catalase (C40) | Sigma | C40 | |
| Creatina-Quinase | Sigma | C3755 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Conjunto de filtro de fluorescência para GFP | Chroma | 49002: ET-EGFP (FITC / Cy2) | |
| Conjunto de filtro de fluorescência para rodamina | Chroma | 49004: ET-CY3 / TRITC | |
| Microscópio invertido de fluorescência | Zeiss | Axiovert 200M | |
| Galactose | Tivan Biotech | GAL02 | |
| Glicose | Sigma | G8270 | |
| Glicose Oxidase | Sigma | G7141 | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| GlicilGlicina | Merck | G0674 | |
| GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
| GTB | Citoesqueleto | BST01-010 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
| Software ImageJ-FIJI | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | versão 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64 bits] para Windows 10 | |
| Imidazol | Sigma | I0125 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Abcam | ab119211 | |
| Lente | Zeiss | 100x/1.4 óleo DIC objetiva | |
| Lisina | FORMEDIUM | DOC0161 | |
| Cloreto de Magnésio | Sigma | M8266 | |
| Metionina | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
| Neo | Andor Technologies | câmera | |
| NeutraAvidin | Life | A2666 | |
| Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | |
| Fosfo-Creatina | Sigma | P1937 | |
| Tubos | Sigma | P1851 | |
| Ácido plurônico F-127 (poloxâmero) | Sigma | P2443 | |
| Cloreto de Potássio | Sigma | P9541 | |
| Rafinose | Tivan Biotech | RAF01 | |
| Instrumento de cromatografia de exclusão de tamanho | GE Healthcare | AKTA Pure | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
| Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris | Roshe | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Triptofano | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
| Proteína da tubulina | Citoesqueleto | T240 | |
| Tubulina, citoesqueleto biotinilado | T333P | ||
| Tubulina, citoesqueleto de rodamina TRITC | TL530M | ||
| Uracil | Sigma | U0750-100G | |
| Base de nitrogênio de levedura | FORMEDIUM | CYN0401S | |
| α-GFP anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M3148 |
Referências
- Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
- Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham
