Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Motilitet av enskilda molekyler och kluster av dubbelriktad kinesin-5 Cin8 renad från S. cerevisiae-celler

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

Den dubbelriktade mitotiska kinesin-5 Cin8 ackumuleras i kluster som splittras och smälter samman under deras rörlighet. Ackumulering i kluster förändrar också hastigheten och riktningen hos Cin8. Här beskrivs ett protokoll för motilitetsanalyser med renad Cin8-GFP och analys av rörliga egenskaper hos enskilda molekyler och kluster av Cin8.

Abstract

De mitotiska bipolära kinesin-5-motorerna utför väsentliga funktioner i spindeldynamiken. Dessa motorer uppvisar en homo-tetramerisk struktur med två par katalytiska motordomäner, belägna i motsatta ändar av det aktiva komplexet. Denna unika arkitektur gör det möjligt för kinesin-5-motorer att tvärlänka och glida isär antiparallella spindelmikrotubuli (MT), vilket ger den utåtriktade kraften som skiljer spindelpolerna från varandra. Tidigare trodde man att kinesin-5-motorer uteslutande var plus-end-riktade. Nya studier visade emellertid att flera svampkinesin-5-motorer är minus-end riktade mot enmolekylnivå och kan byta riktning under olika experimentella förhållanden. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 är ett exempel på sådant dubbelriktat motoriskt protein: under förhållanden med hög jonstyrka rör sig enskilda molekyler av Cin8 i minus-end-riktningen för MT: erna. Det visades också att Cin8 bildar rörliga kluster, främst vid minus-änden av MTs, och sådan klustring gör det möjligt för Cin8 att byta riktning och genomgå långsam, plus-end riktad motilitet. Denna artikel ger ett detaljerat protokoll för alla steg i arbetet med GFP-märkt kinesin-5 Cin8, från proteinöveruttryck i S. cerevisiae-celler och dess rening till in vitro-enmolekyls motilitetsanalys. En nyutvecklad metod som beskrivs här hjälper till att skilja mellan enskilda molekyler och kluster av Cin8, baserat på deras fluorescensintensitet. Denna metod möjliggör separat analys av rörligheten hos enskilda molekyler och kluster av Cin8, vilket ger karakteriseringen av beroendet av Cin8-motilitet på dess klusterstorlek.

Introduction

Ett stort antal motilitetshändelser inom eukaryota celler medieras av funktionen av molekylära motorproteiner. Dessa motorer rör sig längs cytoskelettfilamenten, aktinfilamenten och mikrotubuli (MT) och omvandlar den kemiska energin hos ATP-hydrolys till kinetiska och mekaniska krafter som krävs för att driva biologisk motilitet i celler. Mt-baserade S. cerevisiae Cin8 är ett bipolärt, homotetrameriskt kinesin-5-motorprotein som tvärlänkar och skjuter spindel-MT isär1. Cin8 utför väsentliga funktioner under mitos, i spindelaggregat 2,3,4 och spindelförlängning under anafas 5,6,7. Tidigare hade det visats att Cin8 är en dubbelriktad motor, som växlar riktning under olika experimentella förhållanden. Till exempel, under förhållanden med hög jonhållfasthet, rör sig enkla Cin8-motorer mot mt: s minusände, medan i kluster, i mt-glidanalyser med flera motorer och mellan antiparallell MT rör sig Cin8-motorer huvudsakligen mot plusändarna av MT: erna 8,9,10,11,12 . Dessa resultat var mycket oväntade på grund av flera skäl. För det första bär Cin8 sin katalytiska motordomän vid amino-terminalen och sådana motorer troddes tidigare vara uteslutande plus-end-riktade, medan Cin8 visade sig vara minus-end riktad mot enmolekylnivå. För det andra trodde man att kinesinmotorer var enkelriktade, antingen minus-end eller plus-end riktade, medan Cin8 visade sig vara dubbelriktad, beroende på experimentella förhållanden. Slutligen, på grund av MT-orienteringen vid den mitotiska spindeln, kunde den klassiska rollen hos kinesin-5-motorer i separationen av spindelpoler under spindelmontering och anafas B endast förklaras av deras plus-end-riktade rörlighet på MT: erna som de tvärlänkar 1,13. Efter de första rapporterna om dubbelriktningen av Cin8 visades några andra kinesinmotorer vara dubbelriktade 14,15,16, vilket indikerar att kinesinmotorernas dubbelriktade rörlighet kan vara vanligare än man tidigare trott.

Det har tidigare rapporterats att Cin8 i celler också rör sig på ett dubbelriktat sätt8, vilket stöder uppfattningen att den dubbelriktade rörligheten hos vissa kinesin-5-motorer är viktig för deras intracellulära funktioner. Dessutom, eftersom de tre kinesin-5-motorerna som rapporterades vara dubbelriktade är från svampceller, har en möjlig roll för dubbelriktningen hos kinesin-5-motorer nyligen föreslagits i sådana celler10. Enligt denna modell, i sluten mitos av svampceller, där kärnhöljet inte bryts ner under mitos, ger kinesin-5-motorer den initiala kraften som separerar spindelpolerna isär före spindelmontering. För att utföra denna uppgift, före spindelpolseparation, lokaliseras kinesin-5-motorer nära spindelpolerna, genom sin minus-end riktade motilitet på enstaka kärn-MT. En gång i detta läge kluster kinesin-5-motorer, byter riktning, fångar och tvärlänkar MTs från angränsande spindelpoler. Därefter ger kinesin-5-motorer den initiala separationen av polerna med plus-ändriktad motilitet på DE MTs som de tvärlänkar. Enligt denna modell krävs både minus-end riktad motilitet på enstaka MTs och plus-end riktad motilitet på tvärbundna MTs under antiparallell glidning för svampkinesin-5-motorer för att utföra sina roller i spindelmontering 1,13.

Det övergripande målet med den beskrivna metoden är att erhålla svamp GFP-märkt kinesin-5 Cin8 med hög renhet och att utföra enmolekyliga motilitetsanalyser (figur 1) samtidigt som man separat analyserar rörligheten hos enskilda molekyler och kluster av Cin8. Separationen mellan enskilda molekyler och kluster är viktig eftersom en av de faktorer som hade visat sig påverka riktningen för Cin8 är dess ackumulering i kluster på MTs10,12. Alternativa motilitetsanalyser, såsom MT-ytglidning och MT-glidanalyser, ger inte information om aktiviteten hos enmotoriga proteiner17,18. De robusta enmolekylära rörlighetsanalys- och analysmetoderna som beskrivs här har framgångsrikt tillämpats för att karakterisera olika aspekter av kinesin-5-motorer, Cin8 och Kip1 10,11,12,14,19,20.

Här presenteras ett detaljerat protokoll för Cin8-överuttryck och rening, polymerisation av MTs och enmolekyls motilitetsanalys. Vidare beskrivs också analyserna för att skilja mellan enskilda molekyler och kluster av Cin8 och för att bestämma enskilda motor- och klusterhastigheter genom analys av medelförskjutning (MD) och genomsnittlig kvadratförskjutning (MSD). Detta protokoll syftar till att hjälpa forskare att visualisera alla steg i procedurerna och hjälpa till med felsökning av denna typ av analyser.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av enmolekylens motilitetsanalys. Biotinylerade fluorescerande MTs är fästa på glasytan, belagda med Avidin som interagerar med den ytbundna biotinylerade BSA. Den gröna pilen representerar rörelseriktningen för enskilda Cin8-molekyler under förhållanden med hög jonstyrka. +/- representerar POLARITETEN hos MT. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av buffertar och reagenser

  1. Buffertar
    1. -Leu aa dropout mix: Blanda 2 g vardera av Adenin, Uracil, Tryptofan, Histidin, Lysin, och Metionin och förvara vid rumstemperatur.
    2. Jästselektivt medium med raffinos (1 liter): Blanda 6,7 g jästkvävebas (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa dropout-blandning och 20 g raffinos i dubbeldestillerat vatten under omrörning (utan uppvärmning) tills det är helt upplöst. Filtrera lösningen i en steril flaska med ett 0,22 μm filter.
    3. Lysbuffert: Förbered 25 ml lösning i trippeldestillerat vatten (TDW) bestående av 50 mM Tris, 30 mM rör, 500 mM KCl, 10% glycerol, 1,5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP och 0,1% Triton X-100. Justera pH till 8 med 6 M HCl.
    4. Elutionsbuffert: Förbered 10 ml lösning i TDW bestående av 50 mM Tris, 30 mM rör, 500 mM KCl, 350 mM imidazol, 10% glycerol, 1,5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP och 0,1% Triton X-100. Justera pH till 7,2 med 6 M HCl.
    5. P12-buffert: Förbered 10 ml av en lösning i TDW bestående av 12 mM rör, 1 mM EGTA och 2 mM MgCl2. Justera pH till 6,9 med 10 M NaOH.
    6. BRB80-buffert: Förbered 50 ml av en lösning bestående av 80 mM rör, 1 mM EGTA och 2 mM MgCl2 i ultrarent vatten. Justera pH till 6,9 med 10 M NaOH.
    7. Allmän tubulinbuffert (GTB): Förbered 50 ml av en lösning bestående av 80 mM rör, 0,5 mM EGTA och 2 mM MgCl2 i ultrarent vatten. Justera pH till 6,9 med 10 M NaOH.
    8. Tris-Pipes lösning: Förbered 40 ml 1M Tris-0,6 M Rörlösning genom att blanda 6,055 g Tris och 9,07 g Rör i TDW och justera pH till 7,2 med 6 M HCl. Ta den slutliga volymen till 50 ml med TDW.
      P12-, BRB80- och Tris-Pipes-buffertar används för framställning av lagerlösningar för motilitetsanalys. Dessa buffertar kan framställas i stora mängder, alikvoteras i 1,5 ml rör, snäppfrysas och förvaras vid -20 °C.
  2. Lagerlösningar för rörlighetsanalys
    1. Tubulin (10 mg ml-1): Lös upp 1 mg lyofiliserat tubulin i 100 μL kall (4 °C) allmän tubulinbuffert (GTB). Snäppfry 1 μL alikvoter och förvara dem vid -80 °C.
    2. Biotinylerat tubulin (1 mg ml-1): Lös upp 20 μg lyofiliserat tubulin i 20 μL kall GTB. Snäppfry 1 μL alikvoter och förvara dem vid -80 °C.
    3. Rhodamin märkt tubulin (1 mg ml-1): Lös upp 20 μg lyofiliserat tubulin i 20 μL kall GTB. Snäppfry 0,5 μL alikvoter och förvara dem vid -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP erhålls från leverantören som en vattenlösning på 100 μL och lagras vid -80 °C. Tina flaskan med GMPCPP på is. Förbered 1 μL alikvoter, snäppfrys och förvara dem vid -80 °C.
    5. ATP: Förbered 500 μL lösning av 100 mM ATP i 0,5 M Tris buffert (pH 8). Snäppfry 2 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
    6. MgCl2: Förbered 1 ml lösning av 200 mMMgCl2 i P12 buffert. Förvara 5 μL alikvoter vid -20 °C.
    7. Kasein: Förbered en 1 ml lösning av 5 mg ml-1 kasein i BRB 80 buffert. Snäppfry 10 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
    8. D-glukos: Förbered en 1 ml lösning av 1 M D-glukos i P12-buffert. Förvara 10 μL alikvoter vid -20 °C.
    9. Glukosoxidas: Förbered en 1 ml lösning av 10 mg ml-1 glukosoxidas i P12-buffert. Snäppfry 2 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
    10. Katalas: Förbered en 1 ml lösning av 0,8 mg ml-1 katalas i P12-buffert. Snäppfry 2 μL alikvoter och förvara vid -20 °C.
    11. Dithiothreitol (DTT): Förbered en 1 ml lösning av 1 M DTT i P12-buffert i en draghuv. Snäppfry 10 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
    12. Kreatinfosfat: Förbered en 1 ml lösning av 1 M kreatinfosfat i P12-buffert. Snäppfry 2 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
    13. Kreatinfosfokinas: Förbered en 1 ml lösning av 5 mg ml-1 kreatinfosfokinas i 0,25 M glycylglycin, pH 7,4. Snäppfry 2 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
    14. EGTA: Förbered en 100 mM EGTA-lösning i ultrarent vatten och förvara den vid rumstemperatur.
    15. KCl: Förbered en 1 M KCl-lösning i ultrarent vatten och förvara den vid rumstemperatur.
  3. Motilitetsbuffert och reaktionsblandning
    1. Motilitetsbuffert (MB) med 145 mM KCl, 2x lager: Förbered 1 ml 2x lager av motilitetsbufferten genom att blanda 100 μL färdig Tris-Pipes-lösning, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl och 590 μL TDW. Håll bufferten på is.
    2. Blandning av motilitetsreaktion: Förbered motilitetsreaktionsblandningen enligt tabell 1 och förvara den på is.
Volym Lager Reagens namn
50 μL 2X MB (från steg 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM ATP
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/ml Kasein
1 μL 1 M Glukos
1 μL 1 M DTT
1 μL 10 mg/ml Glukosoxidas
1 μL 8 mg/ml Katalas
1 μL 1 M Phosphocreatine
1 μL 5 mg/ml Kreatinfosfokinas
100 μL Total

Tabell 1.

2. Cin8 överuttryck och rening från S. cerevisiae celler

  1. Odla S. cerevisiae-celler innehållande plasmiden för överuttryck av Cin8-GFP-6Hans till exponentiell tillväxtfas (OD600 = 0,6-0,8) i 1 liter jästselektivt medium kompletterat med 2% raffinos (se steg 1.1.2) vid 28 °C12.
  2. Inducera Cin8-GFP-6Hans överuttryck genom tillsats av 2% galaktos. Övervaka jästodlingstillväxten genom att mäta absorbansen vid 600 nm.
  3. Fem timmar efter tillsats av galaktos, skörda cellerna genom centrifugering vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C, suspendera cellerna i lysbufferten och frys in vätskaN2.
    OBS: Frysta celler kan förvaras vid -80 °C för vidare användning eller omedelbart malas ivätska N2.
  4. Mal de frysta cellerna ivätska N2 med kyld murbruk och stöt. Tillsätt vätskaN2 under slipningen för att hålla extrakten frysta. Det kräver vanligtvis 4-5 gånger tillsats avvätska N2.
  5. Övervaka celllys genom observation under faskontrast eller DIC-mikroskop.
  6. Tina markcellerna och centrifugen vid 21 000 x g i 30 min vid 4 °C. Ladda supernatanten på en gravitationsflödeskolonn fylld med 2 ml Ni-NTA och förbalanserad med lysbuffert. Låt supernatanten strömma ut genom kolonnen.
  7. Tvätta kolonnen med fem kolonnvolymer lysbuffert och sedan med fem kolonnvolymer lysbuffert kompletterad med 25 mM imidazol.
  8. Elute Cin8-GFP-6His med elueringsbuffert (se steg 1.1.4).
  9. Analysera de eluerade proverna genom SDS-PAGE-fraktionering, följt av Coomassie blå färgning och western blot-analys undersökt med α-GFP-antikropp19.
  10. Slå samman fraktionerna som innehåller Cin8-GFP-6His (steg 2.8 och 2.9). Rena dem dessutom genom storleksuteslutningskromatografi (SEC) vid en flödeshastighet 0,5 ml min-1 och kolonntrycksgräns på 1,5 MPa, med samtidig övervakning av absorbansen vid 280 nm och GFP-florescensutsläppet med excitation vid 488 nm (figur 2A).
  11. Samla in fraktionerna som motsvarar Cin8-GFP-tetrameren och analysera dem med SDS-PAGE och western blotting (se steg 2.9) (Figur 2B).
  12. Uppskatta proteinkoncentrationen med hjälp av spektrofotometri eller biokemiska analyser som Bradford-analys, BCA-analys etc.
  13. Alicitera de valda fraktionerna, snäppfry i vätskaN2 och förvara tills de används vid -80 °C. Dessa renade proteinprover kan användas i 6 månader.
    OBS: Cin8-GFP överuttrycks och renas från en proteasbrist S. cerevisiae-stam innehållande en 2 μm plasmid för Cin8-GFP-6Ditt överuttryck från galaktosinducerbar promotor, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Jäststammen och plasmiden erbjuds på begäran.

Figure 2
Figur 2: Rening av Cin8-GFP. (A) Storleksuteslutningskromatogrammet för Ni-NTA renad Cin8-GFP, med kontinuerlig GFP-fluorescensdetektion genom 488 nm excitation och emission vid ~ 510 nm. Cin8-GFP-tetrameren eluar vid ~ 10 ml från SEC-kolonnen (markerad med en pil). (B) Coomassie-färgad SDS-PAGE gel (överst) och α-GFP western blot (botten) av Cin8-GFP-fraktioner eluerade från SEC. Prover i banorna är följande: M - Molekylviktsmarkör, Ni2+- Ni-NTA renat Cin8-GFP-prov som laddas i SEC-kolumnen, GF-fraktioner: fraktion motsvarande Cin8-GFP SEC-eluering enligt markeringen i panel A. Pilen till höger markerar storleken på Cin8-GFP-monomeren (förväntas på SDS-SIDAN). Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Enmolekylig rörlighetsanalys med renad Cin8

  1. Polymerisation av biotin och rodamin märkta MTs, stabiliserad med GMPCPP.
    1. Starta MT-polymerisation genom att blanda följande komponenter i ett 1,5 ml rör: 1 μL 10 mg /ml tubulinprotein, 1 μL 1 mg/ml biotinylerat tubulin, 0,5 μL 1 mg/ml rodaminmärkt tubulin, 1 μL 10 mM GMPCPP och 6,5 μL allmän tubulinbuffert (GTB). Inkubera blandningen i 1 timme vid 37 °C.
    2. Efter MT-polymerisation, tillsätt 80 μL varm (37 ° C) GTB, blanda försiktigt och centrifug vid 16 500 x g i 20 min.
    3. Kassera supernatanten och häng försiktigt upp pelletsen igen genom att pipettera upp och ner med 50 μL varm GTB. Förvara suspensionen vid 28 °C.
    4. Undersök MTs med ett fluorescensmikroskop med hjälp av 647 nm rodaminkanalen (Figur 3A).
      OBS: För att erhålla biotinylerade fluorescerande märkta MT innehåller polymerisationsreaktionen omärkt tubulin, såväl som biotinylerat och fluorescerande märkt tubulin. I detta protokoll används rodaminmärkt tubulin men andra fluorescerande konjugat kan också användas.
  2. Flödeskammarens montering
    1. Montera en flödeskammare genom att placera fyra remsor dubbelsidig tejp (~ 4 cm x ~ 3 mm) på en avancerad självhäftande glasskiva (parallellt med den längre kanten och ~ 3-4 mm från varandra) för att skapa tre "körfält" mellan tejpremsorna. Ta bort skyddspapperet från tejpremsor och placera en silaniserad täckglas10 på tejpremsorna för att skapa tre flödeskammare med ~ 10 μL i volym.
  3. MT immobilisering till den avidinbelagda ytan (figur 1)
    1. Täck den silaniserade täckglaset genom att perfusera med 15 μL 1 mg/ml biotinylerat bovint serumalbumin (b-BSA, upplöst i GTB) i flödeskammaren med hjälp av en mikropipett. Tvätta kammaren med 80 μL GTB efter 5 minuter.
    2. Därefter, som i steg 3.3.1, sätt in i flödeskammaren 15 μL av 1 mg/ml Avidin (upplöst i GTB) som binder till b-BSA. Tvätta kammaren med 80 μL GTB efter 5 minuter.
    3. Passivera den silaniserade täckglasytan med 20 μL 1% poloxamer. Tvätta med 80 μL GTB efter 3 min.
    4. Fäst biotinylerade MT (steg 3.1) på den b-BSA-avidinbelagda täckglasen genom att sätta in 20 μL MT som vanligtvis späds ut till 1:20 i GTB. Inkubera rutschkanorna i ett inverterat läge, dvs. med täckglaset vänt nedåt i en mörk fuktighetskammare (t.ex. en petriskål som innehåller vått silkespapper) i 5 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sedan med 200 μL GTB.
    5. Applicera 30 μL motilitetsreaktionsblandning (se steg 1.3.2) i flödeskammaren.
    6. Späd Cin8-GFP-motorerna (steg 2.13) i 20 μL motilitetsreaktionsblandning (se tabell 1) (vanligtvis till en slutlig koncentration på 5-10 μM). Applicera dem på flödeskammaren och avbilda omedelbart motorernas rörelse längs MT: erna.
  4. Motorisk motilitetsavbildning
    OBS: MT-bindning och motorernas rörlighet övervakades med hjälp av ett inverterat mikroskop för epifluorescens utrustat med en kvicksilverbågslampa, ett numeriskt bländarmål på 100x/1,4 och två fluorescensbandpassfilteruppsättningar, en med en våglängd på 647 nm (för rodamin) och en annan med en våglängd på 488 nm (för GFP).
    1. Placera en droppe nedsänkningsolja på mikroskopmålet. Placera flödeskammaren på det fluorescerande mikroskopsteget med täckglaset nedåt mot målet.
    2. Slå på rhodaminekanalen för att fokusera på MTs som är fästa på täckglasytan och skaffa bilden med 20 ms exponering med hjälp av Micro-Manager ImageJ-Fiji-programvaran21.
    3. Slå på GFP-kanalen och skaffa 90 time-lapse-bilder med 1 s intervall och 800 ms exponering för att analysera Cin8-GFP-rörligheten.

Figure 3
Figur 3: MT och MT-bundna Cin8-GFP. (A) Bilder från två fält (vänster och höger) för MT polymeriserade enligt protokollet som beskrivs i steg 3.1 och avbildade med 100x mål enligt beskrivningen i steg 3.4. (B) Bilder från två fält (vänster och höger) för Cin8-GFP (nedre paneler, markerade med pilar) som är fästa vid MT som visas i de övre panelerna. Skala bar: 4 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Motilitetsanalys

OBS: Utför all bildanalys och generera kymografer med ImageJ-Fiji Software.

  1. Kymograph generation
    1. Öppna timelapse-filmen och motsvarande MT-fältbild. Synkronisera dessa två fönster genom att välja följande alternativ: Analysera > verktyg > synkronisera Windows.
    2. Markera en MT med alternativet Segmenterad linje och använd fliken Analysera > Multi Kymograph för att få en kymograf.
  2. Bestämning av klusterstorlek för Cin8-GFP (dvs. antalet Cin8-molekyler i ett kluster)
    1. Utför bakgrundssubtraktionen och korrigeringen för ojämn belysning med hjälp av alternativet Process > Subtrahera bakgrund . Ställ in Rolling Ball Radius på 100 pixlar och kontrollera alternativet Sliding Paraboloid .
    2. Följ den genomsnittliga fluorescensintensiteten för en specifik icke-rörlig Cin8-GFP-motor (figur 3B) som en funktion av tiden inom en cirkel med 4 pixlars radie med hjälp av TrackMate-plugin i ImageJ-Fiji-programvaran genom att välja följande alternativ: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Upprepa steg 4.2.2 för olika Cin8-GFP-motorer. Plotta fluorescensintensiteten hos de olika Cin8-GFP-motorerna som en funktion av tiden.
      OBS: En experimentell strategi för att mäta klusterstorleken - dvs antalet Cin8-molekyler i ett kluster - skapar en grund för analysen av Cin8-klusterrelaterad rörlighet. Fotoblekning av GFP fäst vid Cin8 används för att bestämma bidraget från enskilda GFP-molekyler till den totala intensiteten hos Cin8-kluster. Till exempel minskar fluorescensintensiteterna i steg om ~ 50 godtyckliga enheter (a.u.), där varje enskilt steg förmodligen representerar fotoblekningen av en GFP-molekyl (figur 4A). Eftersom Cin8 är ett homo-tetrameriskt motorprotein innehåller det fyra GFP-molekyler. Således är alla Cin8-motorer med en intensitet ≤ 200 a.u. sannolikt att vara enstaka tetramera Cin8-molekyler. Efter denna metod tilldelas intensitetsintervallen för Cin8-motorfluorescens som <200, 200-400 och >400 för enskilda Cin8-molekyler, par Cin8-molekyler (dimer av Cin8-tetramer) respektive Cin8-oligomerer12.
  3. Intensitetsfördelningsanalys för Cin8-GFP-motorer
    1. Mät den genomsnittliga florescensintensiteten för alla fluorescerande Cin8-GFP-motorer i den första bildrutan i time-lapse-sekvensen med TrackMate-plugin i ImageJ-Fiji enligt beskrivningen i steg 4.2.2.
    2. Rita ett histogram över de genomsnittliga intensiteterna för Cin8-GFP med en binstorlek på 20 a.u. och anpassa histogrammets huvudtopp till en Gaussisk kurva (figur 4B).
      OBS: Intensitetsfördelningsanalys kompletterar bestämningen av klusterstorlek för Cin8-GFP-motorer från fotoblekningsexperimenten. Den Gaussiska kurvan monterad på intensitetsfördelnings histogrammet för Cin8-GFP-populationen toppar vid ~ 125 a.u., vilket överensstämmer med den genomsnittliga intensiteten hos enstaka tetrameriska Cin8-molekyler som innehåller antingen en, två, tre eller fyra fluorescerande (icke-blekta) GFP-molekyler, där varje fluorescerande GFP-molekyl bidrar med ~ 50 a.u. Med hjälp av denna intensitetsfördelningsmetod kan således bidraget från en GFP-molekyl också beräknas, vilket ytterligare kan användas för att tilldela klusterstorleken hos Cin8-GFP-molekyler.

Figure 4
Figur 4: Cin8-GFP blekningsprofil och intensitetsfördelning. (A) Fotoblekning av GFP i fyra olika Cin8-GFP-motorer. Enstaka fotoblekningssteg, var och en sannolikt representerar fotoblekningen av en GFP, leder till en minskning av fluorescensintensiteten på ~ 50 a.u. (B) Intensitetsfördelningen av Cin8-GFP-motorer i den första ramen i en time-lapse-sekvens (infälld). Den Gaussiska toppen (blå) centrerad vid ~ 125 a.u representerar enskilda Cin8-GFP-molekyler. Denna topp uppvisar den genomsnittliga intensiteten hos enstaka Cin8-tetramerer med en, två, tre eller fyra fluorescerande GFP-molekyler, där varje GFP-molekyl bidrar med ~ 50 a.u. till den totala intensiteten (dvs (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Spåra Cin8-GFP-molekylernas rörlighet längs MT-spåren
    1. Beskär MT som ska analyseras i time-lapse-sekvensen för inspelade ramar genom att markera den med rektangelverktyget och sedan välja Bild > beskär.
    2. Välj en fluorescerande Cin8-GFP-partikel för analysen. Registrera partikelkoordinaterna i varje bildruta (tidpunkt) i tidsfördröjningssekvensen med hjälp av alternativen Punktverktyg och Mät . Utför liknande registrering av koordinater för andra fluorescerande partiklar i time-lapse-sekvensen.
    3. Tilldela klusterstorlek till alla undersökta Cin8-GFP-partiklar i den första ramen av deras utseende, enligt beskrivningen i steg 4.2.
  2. Analyser av medelförskjutning (MD) och genomsnittlig kvadratförskjutning (MSD)
    1. Från koordinaterna för Cin8-GFP-rörelser bestämda i steg 4.4 beräknar du förskjutningarna av Cin8-GFP vid varje tidpunkt med avseende på de ursprungliga koordinaterna, med hjälp av ekvationen för beräkning av avståndet mellan två punkter med givna koordinater:
      Equation 1
      där dt är förskjutningarna av Cin8-GFP vid tiden t, xt och yt är respektive koordinater vid tiden t. x0 och y0 är respektive koordinater för Cin8-GFP vid t = 0.
    2. Beräkna från dessa förskjutningsvärden förskjutningen för alla möjliga tidsintervall för en specifik Cin8-GFP-partikel. Upprepa proceduren för alla undersökta Cin8-GFP-partiklar.
    3. Plotta medelförskjutningen (MD) för alla undersökta Cin8-GFP-partiklar kontra tidsintervall och föremål för en linjär passform, MD = v x t + c. Lutningen på denna passform (v) representerar medelhastigheten för rörliga Cin8-GFP-partiklar.
      OBS: På detta sätt kan medelhastigheten för alla Cin8-GFP-molekyler som tillhör varje klusterstorlek beräknas separat och karakterisera rörligheten hos olika klusterstorlekar. Utöver MD-analysen kan analys av genomsnittlig kvadrerad förskjutning (MSD) också utföras genom att kvadrera de förskjutningsvärden som beräknats i steg 4.5.1 och 4.5.2. MSD-värden ritas kontra tidsintervall och monteras på polynomkurvan MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, vilket ger den extra parametern D, som är diffusionskoefficienten för Cin8-GFP-rörelsen. MD-analys bör utföras på polaritetsmärktaMTs 8,10, medan det för MSD-analysen inte är nödvändigt med kunskap om MT-polariteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Experimentet syftar till att undersöka motilitetsegenskaperna hos dubbelriktat motoriskt protein Cin8 av olika klusterstorlekar på enstaka MTs. Representativ motilitet hos Cin8-GFP framgår också av kymograferna i figur 5A, där motorns rumsliga position över tid visas.

För analys av de rörliga egenskaperna hos Cin8-GFP tilldelas först klusterstorleken (steg 4.3) till varje MT-fäst rörlig Cin8-GFP-partikel, och sedan spåras positionen för de undersökta Cin8-partiklarna som en funktion av tiden (steg 4.4). För varje klusterstorlekskategori extraherades >40-banorna för individuell Cin8-GFP från inspelningarna (figur 5B). Med hjälp av koordinaterna från spårningsanalysen utförs MD- och MSD-analys för varje klusterstorlekspopulation separat. Hastigheterna erhålls från linjära anpassningar till MD som presenteras i figur 5C. Det visade sig att enskilda Cin8-GFP-molekyler rör sig på ett enkelriktat, minus-end-riktat sätt med hög hastighet, medan Cin8-klusterna uppvisar betydligt lägre hastighet med högre benägenhet för dubbelriktad motilitet (figur 5B, C).

Figure 5
Figur 5: Cin8-GFP-rörlighet. (A) Kymografer som representerar rörligheten hos Cin8-GFP-motorer på MT. X- och Y-axlar representerar MT-gitter respektive tid. Gula pilar markerar den snabba rörligheten hos enstaka Cin8-GFP-partiklar mot MT: s minus-ändriktning, medan blå pilar markerar den långsamma rörligheten hos Cin8-kluster i MT: s plus-ändriktning. MT: s polaritet anges längst ner på varje kymograf (+/-). Horisontell stapel: 4 μm, vertikal stång: 20 s. (B) Förskjutningsspår av enskilda motorer (vänster) och kluster (höger) av Cin8-GFP-motorer. Förskjutningsspåren ritades med hjälp av de koordinater som erhållits efter spårning av de enskilda Cin8-GFP-motorerna enligt förklaringen i steg 4.4. Negativa och positiva värden på förskjutning indikerar rörelse i MT: s minus-end respektive plus-end-riktningar. Observera att under samma analys är rörligheten hos Cin8-kluster långsammare och dubbelriktad jämfört med de enskilda molekylerna i Cin8. (C) Diagram över medelförskjutning (MD) ± SEM, av enskilda molekyler (vänster) och kluster (höger) av Cin8-motorer som en funktion av tidsintervallet. Svarta linjer representerar linjära anpassningar av diagrammet (MD = v xt + c, där v är medelhastigheten, t är tidsintervallet och c representerar avlyssningen). Av monteringen framgår att medelhastigheten för enstaka motorer och kluster av Cin8 är -265 ± 20 nm/s respektive -48 ± 5 nm/s. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete presenteras ett protokoll för enmolekylig motilitetsanalys med dubbelriktad kinesin-5 Cin8 och motilitetsanalysen. Fullängdaren Cin818 inklusive den ursprungliga kärnlokaliseringssignalen (NLS) vid C-terminalen har renats från den inhemska värden S. cerevisiae. Eftersom Cin8 är ett kärnmotorprotein har slipning av S. cerevisiae-cellerna under flytande kväve visat sig vara den mest effektiva metoden för celllys. Efter lys, genom att kombinera metallaffinitet och storleksuteslutningskromatografi, erhålls mycket ren Cin8, vilket är viktigt för enmolekylära motilitetsanalyserna. Det har tidigare rapporterats att det finns skillnader mellan rörliga egenskaper hos Cin8 i råa extrakt och renade prover8. Dessutom har det också rapporterats att MT-trängsel med motoriska och icke-motoriska proteiner påverkar riktningen för dubbelriktat kinesin-5 Cut722. Således krävs hög renhet hos motorn för tillförlitlig motilitetsanalys och slutsatser angående vildtyp och mutant motoriskt beteende. De tekniker som beskrivs här kan enkelt anpassas för att rena andra kärnproteiner från jästen med lämpliga buffertjusteringar.

Här beskrivs en mycket robust och känslig enmolekylär motilitetsanalys med GFP-märkt Cin8. Framgången för denna analys är starkt beroende av korrekt MT-polymerisation och immobilisering till ytan. Den starka avidin-biotininteraktionen används för att immobilisera MT: erna till den hydrofoba glasytan, som irreversibelt fäster MT: erna. På dessa immobiliserade MTs med GFP märkt Cin8 kan Cin8-rörlighet spåras på ett tillförlitligt sätt 11,12,19.

Cin8 rapporteras bilda kluster som innehåller mer än en tetramerisk motor10,12, med rörligheten hos dessa kluster som skiljer sig från den hos enskilda Cin8-molekyler. För att exakt karakterisera Cin8-motiliteten som en funktion av dess storlek har en fluorescensintensitetsbaserad metod utvecklats för att identifiera klusterstorleken för varje Cin8-partikel12. Baserat på denna storlekskategorisering analyseras motiliteten separat i varje storlekskategori. Efter denna storleksbaserade analys tillhandahålls insiktsfulla detaljer som kan användas för att förstå det olika beteendet hos oligomerer av samma molekyl 11,12,19. Klusterstorleksbestämningsproceduren som beskrivs här kan tillämpas för att bestämma storleken på en mängd fluorescerande märkta molekyler. När man utför den fluorescensbaserade storleksbestämningen bör man vara försiktig med att bestämma klusterstorleken för Cin8-GFP-partiklar vid den första utseenderamen för att undvika blekningens inverkan, eftersom de stora klustren kan visas som mindre efter fotoblekning.

Motilitetskarakteriseringen utförs av MD- och / eller MSD-analyserna. Om det är av intresse att bestämma endast motorhastigheten är MD-analysen tillräcklig. Om motorisk rörlighet innehåller både aktiva och passiva komponenter och bestämning av diffusionskoefficienten också krävs, bör MSD-analys utföras 20,23,24,25. För både MD- och MSD-analyser måste motorns koordinater för varje tidpunkt bestämmas. För effektiv spårning är det viktigt att hålla motorkoncentrationen optimal. MT: erna bör inte vara för trånga med motorer; helst bör det finnas 3-4 Cin8-GFP-motorer / partiklar åt gången på en MT på ~ 10 μm. Automatiserade verktyg som "KymoButler" eller "TrackMate" plugin i ImageJ-Fiji kan också användas för att spåra de rörliga motorerna26,27. Dessa automatiserade verktyg sparar tid och arbete, men de har några begränsningar. Till exempel, om rörligheten hos vissa partiklar är mycket långsam, kan dessa verktyg läsa dem som icke-rörliga partiklar. Dessutom har dessa verktyg gränser för att känna igen lågintensiva molekyler. Därför kan de uppvisa en högintensiv bias. Å andra sidan är manuell spårning (även om den är tidskrävande) mindre känslig för spårningsfel.

Sammanfattningsvis förklarar detta protokoll, med utgångspunkt från reningen av Cin8 överuttryckt i S. cerevisiae, omfattande den enmolekylära motilitetsanalysen och den efterföljande motilitetsanalysen av denna dubbelriktade kinesin-5. Detta protokoll kan enkelt följas för att rena och karakterisera rörligheten hos motorproteiner som Cin8. Dessutom kan de olika delarna av protokollet anpassas för att rena proteiner från jäst eller utveckla enmolekylära motilitetsanalyser för olika motorproteiner och deras motilitetskarakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes delvis av Israel Science Foundation-bidraget (ISF-386/18) och Israel Binational Science Foundation-bidraget (BSF-2019008), tilldelat L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

Tags

Biokemi utgåva 180 kinesin Cin8 enmolekylär motilitet mikrotubuli dubbelriktad motilitet

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Motilitet av enskilda molekyler och kluster av dubbelriktad kinesin-5 Cin8 renad från <em>S. cerevisiae-celler</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter