Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Motilitet av enkeltmolekyler og klynger av toveis Kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae celler

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

Den toveis mititotiske kinesin-5 Cin8 akkumuleres i klynger som deler og fusjonerer under deres motilitet. Akkumulering i klynger endrer også hastigheten og direksjonaliteten til Cin8. Her beskrives en protokoll for motilitetsanalyser med renset Cin8-GFP og analyse av motile egenskaper av enkeltmolekyler og klynger av Cin8.

Abstract

De mititotiske bipolare kinesin-5-motorene utfører viktige funksjoner i spindeldynamikk. Disse motorene har en homo-tetramerisk struktur med to par katalytiske motordomener, plassert i motsatte ender av det aktive komplekset. Denne unike arkitekturen gjør det mulig for kinesin-5-motorer å krysslinke og skyve fra hverandre antiparallel spindelmikrotubuler (MTs), og dermed gi den utadrettede kraften som skiller spindelstengene fra hverandre. Tidligere ble kinesin-5-motorer antatt å være utelukkende pluss-end rettet. Nyere studier viste imidlertid at flere soppkinesin-5-motorer er minus-end rettet mot enkeltmolekylnivå og kan bytte direksjonalitet under ulike eksperimentelle forhold. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et eksempel på et slikt toveis motorprotein: i høye ioniske styrkeforhold beveger enkeltmolekyler av Cin8 seg i minus-end retning av MTs. Det ble også vist at Cin8 danner motile klynger, hovedsakelig i minus-enden av MTs, og slik klynge gjør at Cin8 kan bytte direksjonalitet og gjennomgå langsom, pluss-end rettet motilitet. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for alle trinn i arbeidet med GFP-tagged kinesin-5 Cin8, fra proteinovertrykk i S. cerevisiae-celler og dens rensing til in vitro enkeltmolekylsmotilitetsanalyse. En nyutviklet metode beskrevet her bidrar til å skille mellom enkeltmolekyler og klynger av Cin8, basert på deres fluorescensintensitet. Denne metoden muliggjør separat analyse av motilitet av enkeltmolekyler og klynger av Cin8, og gir dermed karakterisering av avhengigheten av Cin8-motilitet på klyngestørrelsen.

Introduction

Et stort antall motilitetshendelser innen eukaryote celler formidles av funksjonen til molekylære motorproteiner. Disse motorene beveger seg langs cytoskeletalfilamenter, aktinfilamenter og mikrotubuler (MTs), og konverterer den kjemiske energien til ATP hydrolyse til kinetiske og mekaniske krefter som kreves for å drive biologisk bevegelighet i celler. Det MT-baserte S. cerevisiae Cin8 er et bipolart, homotetramerisk kinesin-5 motorprotein som krysser og skyver spindel-MTs fra hverandre1. Cin8 utfører viktige funksjoner under mitose, i spindelmontering 2,3,4 og spindelforlengelse under anafase 5,6,7. Tidligere hadde det blitt demonstrert at Cin8 er en toveis motor, som skifter direksjonalitet under forskjellige eksperimentelle forhold. For eksempel, under høye ioniske styrkeforhold, beveger enkle Cin8-motorer seg mot minusenden av MT-ene, mens i klynger, i multimotor MT-glideanalyser, og mellom antiparallel MTs, beveger Cin8-motorer seg hovedsakelig mot pluss endene av MTs 8,9,10,11,12 . Disse funnene var svært uventede av flere årsaker. For det første bærer Cin8 sitt katalytiske motordomene ved amino-terminus, og slike motorer ble tidligere antatt å være utelukkende pluss-end rettet, mens Cin8 ble vist å være minus-end rettet mot enkeltmolekylnivå. For det andre ble kinesinmotorer antatt å være enveis, enten minus-end eller plus-end rettet, mens Cin8 ble vist å være toveis, avhengig av de eksperimentelle forholdene. Til slutt, på grunn av MT-orienteringen ved den mitotiske spindelen, kunne den klassiske rollen til kinesin-5-motorer i separasjonen av spindelstenger under spindelmontering og anafase B bare forklares av deres pluss-end rettet motilitet på MT-ene de krysskobling 1,13. Etter de første rapportene om toveisiteten til Cin8, ble noen få andre kinesinmotorer vist å være toveis 14,15,16, noe som indikerer at den toveis motiliteten til kinesinmotorer kan være mer vanlig enn tidligere antatt.

Det har tidligere blitt rapportert at i celler beveger Cin8 seg også på en toveis måte8, og støtter forestillingen om at toveismotiliteten til noen kinesin-5-motorer er viktig for deres intracellulære funksjoner. I tillegg, siden de tre kinesin-5-motorene som ble rapportert å være toveis, er fra soppceller, har en mulig rolle for toveis kinesin-5-motorer nylig blitt foreslått i slike celler10. Ifølge denne modellen, i lukket mitose av soppceller, hvor atomkonvolutten ikke bryter ned under mitose, gir kinesin-5-motorer den første kraften som skiller spindelstengene fra hverandre før spindelmontering. For å utføre denne oppgaven, før spindelstangseparasjon, lokaliserer kinesin-5-motorer nær spindelstengene, ved deres minus-end rettet motilitet på enkelt kjernefysiske MTs. Når du er i denne posisjonen, klynger kinesin-5-motorer, bryterretningalitet, fangst og krysskoblings-MT-er fra nærliggende spindelstenger. Deretter gir kinesin-5-motorer den første separasjonen av polene ved pluss-end rettet motilitet på MTs de krysskobling. Med denne modellen kreves både minus-end rettet motilitet på enkle MTs og plus-end rettet motilitet på krysskoblede MTs under antiparallel glidende for soppkinesin-5 motorer for å utføre sine roller i spindelmontering 1,13.

Det overordnede målet med den beskrevne metoden er å oppnå høy renhets sopp GFP-tagget kinesin-5 Cin8 og å utføre enkeltmolekyler motilitetsanalyser (figur 1) mens du separat analyserer motiliteten til enkeltmolekyler og klynger av Cin8. Separasjonen mellom enkeltmolekyler og klynger er viktig siden en av faktorene som hadde vist seg å påvirke retningen til Cin8 er dens akkumulering i klynger på MTs10,12. Alternative motilitetsanalyser, som MT-overflateglidning og MT-glidende analyser, gir ikke informasjon om aktiviteten til enkeltmotorproteiner17,18. De robuste enkeltmolekylsmotilitetsanalyse- og analysemetodene beskrevet her har blitt brukt til å karakterisere forskjellige aspekter av kinesin-5-motorer, Cin8 og Kip1 10,11,12,14,19,20.

Her presenteres en detaljert protokoll for Cin8 overekspressjon og rensing, polymerisering av MTs og enkeltmolekylets motilitetsanalyse. Videre beskrives også analysene for å skille mellom enkeltmolekyler og klynger av Cin8, og for å bestemme enkeltmotor- og klyngehastigheter ved middelforskyvning (MD) og gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning (MSD). Denne protokollen tar sikte på å hjelpe forskere med å visualisere alle trinnene i prosedyrene og hjelpe til med å feilsøke denne typen analyser.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av enkeltmolekylets motilitetsanalyse. Biotinylerte fluorescerende MT-er er festet til glassoverflaten, belagt med Avidin som samhandler med den overflatemonterte biotinylerte BSA. Den grønne pilen representerer bevegelsesretningen til enkle Cin8-molekyler under høye ioniske styrkeforhold. +/- representerer polariteten til MT. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser

  1. Buffere
    1. -Leu aa dropout mix: Bland 2 g hver av Adenine, Uracil, Tryptophan, Histidine, Lysine og Methionine og lagre ved romtemperatur.
    2. Gjær selektiv medium med raffinose (1 L): Bland 6,7 g gjær nitrogenbase (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa dropout mix og 20 g raffinose i dobbeltdestillert vann ved omrøring (uten oppvarming) til den er helt oppløst. Bruk et filter på 0,22 μm til å filtrere oppløsningen inn i en steril flaske.
    3. Lysis buffer: Forbered 25 ml løsning i trippel destillert vann (TDW) bestående av 50 mM Tris, 30 mM rør, 500 mM KCl, 10% glyserol, 1,5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP og 0,1% Triton X-100. Juster pH til 8 ved hjelp av 6 M HCl.
    4. Elution buffer: Forbered 10 ml løsning i TDW som består av 50 mM Tris, 30 mM rør, 500 mM KCl, 350 mM imidazol, 10% glyserol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP og 0,1% Triton X-100. Juster pH til 7.2 ved hjelp av 6 M HCl.
    5. P12 Buffer: Forbered 10 ml av en løsning i TDW som består av 12 mM rør, 1 mM EGTA og 2 mM MgCl2. Juster pH til 6,9 ved hjelp av 10 M NaOH.
    6. BRB80 buffer: Klargjør 50 ml av en løsning som består av 80 mM rør, 1 mM EGTA og 2 mM MgCl2 i ultrarent vann. Juster pH til 6,9 ved hjelp av 10 M NaOH.
    7. Generell tubulinbuffer (GTB): Forbered 50 ml av en løsning som består av 80 mM rør, 0,5 mM EGTA og 2 mM MgCl2 i ultrarent vann. Juster pH til 6,9 ved hjelp av 10 M NaOH.
    8. Tris-Pipes løsning: Forbered 40 ml 1M Tris-0,6 M Rørløsning ved å blande 6,055 g Tris og 9,07 g rør i TDW og juster pH til 7,2 ved hjelp av 6 M HCl. Ta det endelige volumet til 50 ml med TDW.
      MERK: P12-, BRB80- og Tris-Pipes-buffere brukes til fremstilling av lagerløsninger for motilitetsanalyse. Disse bufferne kan fremstilles i store mengder, alisitert i 1,5 ml rør, snapfryst og lagres ved -20 °C.
  2. Lagerløsninger for motilitetsanalyse
    1. Tubulin (10 mg ml-1): Løs opp 1 mg lyofilisert tubulin i 100 μL kald (4 °C) generell tubulinbuffer (GTB). Snap-freeze 1 μL aliquots og lagre dem ved -80 °C.
    2. Biotinylert tubulin (1 mg ml-1): Løs opp 20 μg lyofilisert tubulin i 20 μL kald GTB. Snap-freeze 1 μL aliquots og lagre dem ved -80 °C.
    3. Rhodamin merket tubulin (1 mg ml-1): Løs opp 20 μg lyofilisert tubulin i 20 μL kald GTB. Snap-freeze 0,5 μL aliquots og lagre dem ved -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP er hentet fra leverandøren som en 100 μL vandig løsning og lagret ved -80 °C. Tine hetteglasset med GMPCPP på is. Forbered 1 μL aliquots, snap-freeze og lagre dem ved -80 °C.
    5. ATP: Klargjør 500 μL oppløsning på 100 mM ATP i 0,5 M Tris buffer (pH 8). Snap-freeze 2 μL aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    6. MgCl2: Klargjør 1 ml oppløsning på 200 mM MgCl2 i P12-buffer. Oppbevar 5 μL aliquots ved -20 °C.
    7. Kasein: Forbered en 1 ml oppløsning på 5 mg ml-1 kasein i BRB 80-buffer. Snap-freeze 10 μL aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    8. D-glukose: Forbered en 1 ml løsning på 1 M D-glukose i P12-buffer. Oppbevar 10 μL aliquots ved -20 °C.
    9. Glukoseoksidase: Forbered en 1 ml oppløsning på 10 mg ml-1 glukoseoksidase i P12-buffer. Snap-freeze 2 μL aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    10. Katase: Forbered en 1 ml oppløsning på 0,8 mg ml-1 katase i P12-bufferen. Snap-freeze 2 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C.
    11. Dithiothreitol (DTT): Klargjør en 1 ml løsning på 1 M DTT i P12-bufferen i en avtrekkshette. Snap-freeze 10 μL aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    12. Kreatinfosfat: Forbered en 1 ml oppløsning på 1 M kreatinfosfat i P12-buffer. Snap-freeze 2 μL aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    13. Kreatinfokinase: Forbered en 1 ml oppløsning på 5 mg ml-1 kreatinfokinase i 0,25 M glycylglycin, pH 7,4. Snap-freeze 2 μL aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    14. EGTA: Forbered en 100 mM EGTA-løsning i ultrarent vann og oppbevar den ved romtemperatur.
    15. KCl: Forbered en 1 M KCl-løsning i ultrarent vann og oppbevar den ved romtemperatur.
  3. Motilitetsbuffer og reaksjonsblanding
    1. Motility buffer (MB) med 145 mM KCl, 2x lager: Forbered 1 ml 2x lager av motilitetsbufferen ved å blande 100 μL ferdiglagde Tris-Pipes-løsning, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl og 590 μL TDW. Hold bufferen på is.
    2. Motilitetsreaksjonsblanding: Forbered motilitetsreaksjonsblandingen i henhold til tabell 1 og oppbevar den på is.
Volum Lager Navn på reagens
50 μL 2X MB (fra trinn 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM ATP
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/ml Kasein
1 μL 1 M Glukose
1 μL 1 M DTT
1 μL 10 mg/ml Glukoseoksidase
1 μL 8 mg/ml Catalase
1 μL 1 M Fosfokreatin
1 μL 5 mg/ml Kreatinfokinase
100 μL Total

Tabell 1.

2. Cin8 overekspressjon og rensing fra S. cerevisiae celler

  1. Vokse S. cerevisiae celler som inneholder plasmid for overekspression av Cin8-GFP-6His til eksponentiell vekst fase (OD600 = 0,6-0,8) i 1 L gjær selektiv medium supplert med 2% raffinose (se trinn 1.1.2) ved 28 °C12.
  2. Induser Cin8-GFP-6His overekspression ved tilsetning av 2% galaktose. Overvåk gjærkulturveksten ved å måle absorbans ved 600 nm.
  3. Fem timer etter galaktosetilskudd, høst cellene ved sentrifugering ved 4000 x g i 15 min ved 4 °C, innstill cellene i lysisbufferen og frys i flytende N2.
    MERK: Frosne celler kan oppbevares ved -80 °C for videre bruk eller umiddelbart jordes i flytende N2.
  4. Grind de frosne cellene i flytende N2 ved hjelp av kjølt mørtel og pestle. Tilsett flytende N2 under slipingen for å holde ekstraktene frosne. Det krever vanligvis 4-5 ganger å tilsette væske N2.
  5. Overvåk cellelys ved observasjon under fasekontrast eller DIC-mikroskop.
  6. Tine grunncellene og sentrifugen ved 21 000 x g i 30 min ved 4 °C. Legg supernatanten på en gravitasjonsstrømningskolonne fylt med 2 ml Ni-NTA og forhåndsoverveid med lysisbuffer. La supernatanten strømme ut gjennom kolonnen.
  7. Vask kolonnen med fem kolonnevolumer lysisbuffer, og deretter med fem kolonnevolumer lysisbuffer supplert med 25 mM imidazol.
  8. Elute Cin8-GFP-6His med elutionbuffer (se trinn 1.1.4).
  9. Analyser de eluterte prøvene ved SDS-PAGE-fraksjonering, etterfulgt av Coomassie blåfarging og vestlig blotanalyse probed med α-GFP antistoff19.
  10. Samle brøkene som inneholder Cin8-GFP-6His (trinn 2.8 og 2.9). Videre renser du dem ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) med en strømningshastighet på 0,5 ml min-1 og kolonnetrykkgrense på 1,5 MPa, med samtidig overvåking av absorbansen ved 280 nm og GFP-florescensutslipp med eksitasjon ved 488 nm (figur 2A).
  11. Samle fraksjonene som tilsvarer Cin8-GFP-tetrameren og analyser dem ved hjelp av SDS-PAGE og vestlig blotting (se trinn 2.9) (figur 2B).
  12. Beregn proteinkonsentrasjonen ved hjelp av spektrofotometri eller biokjemiske analyser som Bradford-analyse, BCA-analyse osv.
  13. Aliquot de valgte fraksjonene, snap-freeze i flytende N2, og lagre til bruk ved -80 °C. Disse rensede proteinprøvene kan brukes i 6 måneder.
    MERK: Cin8-GFP er overekspressert og renset fra en protease-mangelfull S. cerevisiae-stamme som inneholder en 2 μm plasmid for Cin8-GFP-6His overekspression fra den galaktose inducible promotoren, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Gjærstammen og plasmiden er tilgjengelig etter avtale.

Figure 2
Figur 2: Rensing av Cin8-GFP. (A) Størrelseseksklusjonskromatogrammet til Ni-NTA renset Cin8-GFP, med kontinuerlig GFP fluorescensdeteksjon gjennom 488 nm eksitasjon og utslipp ved ~ 510 nm. Cin8-GFP tetramer elutes ved ~ 10 ml fra SEC-kolonnen (merket med en pil). (B) Coomassie-farget SDS-PAGE gel (topp) og α-GFP vestlig blot (bunn) av Cin8-GFP-fraksjoner rømte fra SEC. Prøver i banene er som følger: M - Molekylvektmarkør, Ni2 +- Ni-NTA renset Cin8-GFP-prøve som lastes inn i SEC-kolonnen, GF-brøker: brøkdel tilsvarende Cin8-GFP SEC-elution som merket i panel A. Pilen til høyre markerer størrelsen på Cin8-GFP-monomeren (forventet på SDS-SIDEN). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Enkeltmolekylets motilitetsanalyse med den rensede Cin8

  1. Polymerisering av biotin og rhodamin merket MTs, stabilisert med GMPCPP.
    1. Start MT-polymerisering ved å blande følgende komponenter i et 1,5 ml rør: 1 μL 10 mg/ml tubulinprotein, 1 μL 1 mg/ml biotinylert tubulin, 0,5 μL 1 mg/ml rhodaminmerket tubulin, 1 μL 10 mM GMPCPP og 6,5 μL generell tubulinbuffer (GTB). Inkuber blandingen i 1 time ved 37 °C.
    2. Etter MT-polymerisering, tilsett 80 μL varm (37 °C) GTB, bland forsiktig og sentrifuger ved 16 500 x g i 20 minutter.
    3. Kast supernatanten og heng pelletsen forsiktig ved å pipettere opp og ned med 50 μL varm GTB. Oppbevar suspensjonen ved 28 °C.
    4. Undersøk MT-ene med et fluorescensmikroskop ved hjelp av 647 nm rhodaminkanalen (figur 3A).
      MERK: For å oppnå biotinylerte fluorescerende merkede MT-er inneholder polymerisasjonsreaksjonen umerket tubulin, samt biotinylert og fluorescerende merket tubulin. I denne protokollen brukes rhodamin-merket tubulin, men andre fluorescerende konjugater kan også brukes.
  2. Montering av flytkammer
    1. Monter et strømningskammer ved å plassere fire strimler med dobbeltsidig tape (~4 cm x ~3 mm) på en avansert glasssklie (parallelt med den lengre kanten og ~3-4 mm fra hverandre) for å lage tre "baner" mellom båndstrimlene. Fjern beskyttelsespapiret fra båndstrimler og legg en silanisert dekslelip10 på båndstrimlene for å lage tre strømningskamre på ~ 10 μL i volum.
  3. MT immobilisering til den avidinbelagte overflaten (figur 1)
    1. Belegge den silaniserte coverlip ved perfusing med 15 μL 1 mg/ml biotinylert-bovint serumalbumin (b-BSA, oppløst i GTB) i strømningskammeret ved hjelp av en mikropipette. Etter 5 min, vask kammeret med 80 μL GTB.
    2. Deretter, som i trinn 3.3.1, sett inn i strømningskammeret 15 μL av 1 mg / ml Avidin (oppløst i GTB) som binder seg til b-BSA. Etter 5 min, vask kammeret med 80 μL GTB.
    3. Passivisere den silaniserte coverlip overflaten ved hjelp av 20 μL av 1% poloksamer. Etter 3 min, vask med 80 μL GTB.
    4. Fest biotinylerte MT-er (trinn 3.1) til b-BSA-avidinbelagte deksler ved å sette inn 20 μL MTs som vanligvis fortynnes til 1:20 i GTB. Inkuber lysbildene i omvendt stilling, det vil si med dekslene vendt nedover i et mørkt fuktighetskammer (f.eks. en Petri-tallerken som inneholder vått vevpapir) i 5 minutter ved romtemperatur. Vask deretter med 200 μL GTB.
    5. Påfør 30 μL motilitetsreaksjonsblanding (se trinn 1.3.2) i strømningskammeret.
    6. Fortynn Cin8-GFP-motorene (trinn 2.13) i 20 μL motilitetsreaksjonsblanding (se tabell 1) (vanligvis til en endelig konsentrasjon på 5-10 μM). Påfør dem på strømningskammeret og bilde umiddelbart motorenes bevegelse langs MT-ene.
  4. Bilde av motorisk bevegelighet
    MERK: MT binding og motorenes motilitet ble overvåket ved hjelp av et epifluorescens invertert mikroskop utstyrt med en kvikksølvbuelampe, en 100x / 1,4 numerisk blenderåpningsmål, og to fluorescensbåndpassfiltersett, en med en bølgelengde på 647 nm (for rhodamin) og en annen med en bølgelengde på 488 nm (for GFP).
    1. Plasser en dråpe nedsenkningsolje på mikroskopmålet. Plasser strømningskammeret på det fluorescerende mikroskopstadiet med dekslene ned mot målet.
    2. Slå på rhodaminkanalen for å fokusere på MT-ene som er festet til coverlipoverflaten og få bildet med 20 ms eksponering ved hjelp av Micro-Manager ImageJ-Fiji-programvaren21.
    3. Slå på GFP-kanalen og skaff deg 90 tidsforløpbilder med 1 s intervall og 800 ms eksponering, for å analysere Cin8-GFP-motilitet.

Figure 3
Figur 3: MT-er og MT-bundet Cin8-GFP. (A) Bilder fra to felt (venstre og høyre) for MT-er polymerisert etter protokollen beskrevet i trinn 3.1 og avbildet med 100x-mål som beskrevet i trinn 3.4. (B) Bilder fra to felt (venstre og høyre) for Cin8-GFP (nedre paneler, merket med piler) festet til MT som vises i de øvre panelene. Skalalinje: 4 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Motilitetsanalyse

MERK: Utfør all bildeanalyse og generer kymografier ved hjelp av ImageJ-Fiji-programvare.

  1. Kymograf generasjon
    1. Åpne intervallfilmen og det tilsvarende MT-feltbildet. Synkroniser disse to vinduene ved å velge følgende alternativ: Analyser > verktøy > Synkroniser Windows.
    2. Uthev én MT ved hjelp av alternativet Segmentert linje , og bruk kategorien Analyser > multi kymografi til å få en kymograf.
  2. Bestemmelse av klyngestørrelse for Cin8-GFP (dvs. antall Cin8-molekyler i en klynge)
    1. Utfør bakgrunnsavsnittet og rettelsen for ujevn belysning ved hjelp av alternativet Prosess > Trekk fra bakgrunn . Sett Rolling Ball Radius på 100 piksler og sjekk Sliding Paraboloid alternativet.
    2. Følg den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til en bestemt ikke-motil Cin8-GFP-motor (figur 3B) som en funksjon av tid innenfor en sirkel på 4 piksler radius ved hjelp av TrackMate-plugin av ImageJ-Fiji-programvaren ved å velge følgende alternativ: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Gjenta trinn 4.2.2 for forskjellige Cin8-GFP-motorer. Plott fluorescensintensiteten til de forskjellige Cin8-GFP-motorene som en funksjon av tid.
      MERK: En eksperimentell strategi for å måle klyngestørrelsen- det vil si antall Cin8-molekyler i en klynge etablerer et grunnlag for analyse av Cin8 klyngerelatert bevegelighet. Photobleaching av GFP festet til Cin8 brukes til å bestemme bidraget fra enkelt GFP-molekyler til den totale intensiteten til Cin8-klynger. For eksempel reduseres fluorescensintensitetene i trinn på ~ 50 vilkårlige enheter (a.u.), med hvert eneste trinn som sannsynligvis representerer fotobleaching av ett GFP-molekyl (figur 4A). Siden Cin8 er et homo-tetramerisk motorprotein, inneholder det fire GFP-molekyler. Dermed vil alle Cin8-motorer som har en intensitet ≤ 200 a.u. sannsynligvis være enkelttetrameriske Cin8-molekyler. Etter denne metoden tildeles intensitetsområder av Cin8 motorfluorescens som <200, 200-400 og >400 for enkle Cin8-molekyler, par Cin8-molekyler (dimer av Cin8 tetramer) og Cin8 oligomerer, henholdsvis12.
  3. Intensitetsfordelingsanalyse for Cin8-GFP-motorer
    1. Mål den gjennomsnittlige florescensintensiteten til alle fluorescerende Cin8-GFP-motorer i den første rammen av tidsforløpsekvensen ved hjelp av TrackMate-plugin i ImageJ-Fiji som beskrevet i trinn 4.2.2.
    2. Plott et histogram av gjennomsnittlige intensiteter av Cin8-GFP med en bin størrelse på 20 a.u. og passer den største toppen av histogrammet til en gaussisk kurve (figur 4B).
      MERK: Intensitetsfordelingsanalysen kompletterer klyngestørrelsesbestemmelsen for Cin8-GFP-motorer fra fotobleaching-eksperimentene. Den gaussiske kurven montert på intensitetsfordelingshistogrammet for Cin8-GFP-populasjonen topper seg på ~ 125 a.u., som er i samsvar med gjennomsnittlig intensitet av enkelttetrameriske Cin8-molekyler som inneholder enten en, to, tre eller fire fluorescerende (ikke-blekede) GFP-molekyler, med hvert fluorescerende GFP-molekyl som bidrar ~ 50 a.u. Ved hjelp av denne intensitetsfordelingsmetoden kan bidraget til ett GFP-molekyl også beregnes, som ytterligere kan brukes til å tildele klyngestørrelsen til Cin8-GFP-molekyler.

Figure 4
Figur 4: Cin8-GFP blekeprofil og intensitetsfordeling. (A) Fotobleaching av GFP i fire forskjellige Cin8-GFP-motorer. Enkle fotobleaching trinn, som hver sannsynligvis representerer fotobleaching av en GFP, fører til en nedgang i fluorescensintensiteten på ~ 50 a.u. (B) Intensitetsfordelingen av Cin8-GFP-motorer i den første rammen av en tidsforløpsekvens (innfelt). Den gaussiske toppen (blå) sentrert på ~ 125 a.u representerer enkle Cin8-GFP molekyler. Denne toppen viser den gjennomsnittlige intensiteten til enkle Cin8-tetramerer med ett, to, tre eller fire fluorescerende GFP-molekyler, der hvert GFP-molekyl bidrar ~ 50 a.u. til den totale intensiteten (dvs. (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Spore Cin8-GFP-molekylenes bevegelighet langs MT-sporene
    1. Beskjær MT-en som skal analyseres i intervallsekvensen for innspilte rammer, ved å merke den med rektangelverktøyet og deretter velge Bilde > Beskjær.
    2. Velg en fluorescerende Cin8-GFP-partikkel for analysen. Registrer partikkelkoordinatene i hvert bilde (tidspunkt) for tidsforløpsekvensen ved hjelp av alternativene Punktverktøy og Mål . Utfør lignende registrering av koordinater for andre fluorescerende partikler i tidsforløpsekvensen.
    3. Tilordne klyngestørrelse til alle de undersøkte Cin8-GFP-partiklene i den første rammen av utseendet, som beskrevet i trinn 4.2.
  2. Gjennomsnittsforskyvningsanalyser (MD) og middelverdianalyser (MSD)
    1. Fra koordinatene til Cin8-GFP-bevegelser bestemt i trinn 4.4, beregn forskyvningene til Cin8-GFP på hvert tidspunkt med hensyn til de opprinnelige koordinatene, ved hjelp av ligningen for beregning av avstand mellom to punkter med gitt koordinater:
      Equation 1
      hvor, dt er forskyvningene til Cin8-GFP på den tiden t, xt og yt er de respektive koordinatene på tidspunktet t. x0 og y0 er de respektive koordinatene til Cin8-GFP ved t = 0.
    2. Beregn fra disse forskyvningsverdiene forskyvningen for alle mulige tidsintervaller for en bestemt Cin8-GFP-partikkel. Gjenta prosedyren for alle de undersøkte Cin8-GFP-partiklene.
    3. Plott gjennomsnittlig forskyvning (MD) av alle undersøkte Cin8-GFP partikler versus tidsintervall og underlagt en lineær passform, MD = v x t + c. Hellingen av denne passformen (v) representerer gjennomsnittlig hastighet av motile Cin8-GFP partikler.
      MERK: På denne måten kan den gjennomsnittlige hastigheten til alle Cin8-GFP-molekyler som tilhører hver klyngestørrelse beregnes separat og karakteriserer motiliteten til forskjellige klyngestørrelser. I tillegg til MD-analysen kan gjennomsnittlig kvadrert forskyvningsanalyse (MSD) også utføres ved å kvadrere forskyvningsverdiene beregnet i trinn 4.5.1 og 4.5.2. MSD-verdier tegnes inn i forhold til tidsintervallet og monteres på den polynomiske kurven MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, noe som gir tilleggsparameteren D, som er diffusjonskoeffisienten til Cin8-GFP-bevegelsen. MD-analyse bør utføres på polaritetsmerkede MTs 8,10, mens for MSD-analysen er kunnskap om MT-polariteten ikke nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksperimentet tar sikte på å undersøke motility egenskapene til toveis motorprotein Cin8 av forskjellige klyngestørrelser på enkelt MTs. Representativ motilitet av Cin8-GFP er også tydelig fra kymografene i figur 5A, hvor motorens romlige posisjon over tid vises.

For analyse av motile egenskapene til Cin8-GFP, først, er klyngestørrelsen tildelt (trinn 4.3) til hver MT-festet motil Cin8-GFP-partikkel, og deretter spores posisjonen til de undersøkte Cin8-partiklene som en funksjon av tid (trinn 4.4). For hver klyngestørrelseskategori ble >40 baner for individuell Cin8-GFP trukket ut fra opptakene (figur 5B). Ved hjelp av koordinatene hentet fra sporingsanalyse utføres MD- og MSD-analyse for hver klyngestørrelsespopulasjon separat. Hastighetene er hentet fra lineære anfall til MD som presentert i figur 5C. Det ble funnet at enkle Cin8-GFP-molekyler beveger seg på en enveis, minus-end rettet måte med høy hastighet, mens Cin8-klyngene har betydelig lavere hastighet med høyere tilbøyelighet til toveis bevegelighet (figur 5B, C).

Figure 5
Figur 5: Cin8-GFP-bevegelighet. (A) Kymografier som representerer motilitet av Cin8-GFP-motorer på MTs. X- og Y-akser representerer henholdsvis MT-gitter og tid. Gule piler markerer den raske motiliteten til enkle Cin8-GFP-partikler mot minus-end retningen av MT, mens blå piler markerer den langsomme motiliteten til Cin8-klynger i pluss-end retningen av MT. Polariteten til MT-ene er angitt nederst på hver kymografi (+/-). Horisontal stang: 4 μm, vertikal bar: 20 s. (B) Forskyvning spor av enkeltmotorer (venstre) og klynger (høyre) av Cin8-GFP motorer. Forskyvningssporene ble plottet inn ved hjelp av koordinatene som ble oppnådd etter sporing av de enkelte Cin8-GFP-motorene som forklart i trinn 4.4. Negative og positive verdier for forskyvning indikerer bevegelse i henholdsvis minus- og pluss-ende-retningen for MT. Merk at under samme analyse er motiliteten til Cin8-klynger langsommere og toveis sammenlignet med de enkle molekylene til Cin8. (C) Plott av gjennomsnittlig forskyvning (MD) ± SEM, av enkeltmolekyler (venstre) og klynger (høyre) av Cin8-motorer som en funksjon av tidsintervallet. Svarte linjer representerer lineære anfall av plottet (MD = v xt + c, der v er gjennomsnittlig hastighet, t er tidsintervallet og c representerer skjæringspunktet). Fra armaturen er det tydelig at gjennomsnittshastigheten for enkeltmotorer og klynger av Cin8 er -265 ± henholdsvis 20 nm / s og -48 ± 5 nm / s. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet presenteres en protokoll for enkeltmolekylell motilitetsanalyse med toveis kinesin-5 Cin8 og motilitetsanalysen. Cin818 i full lengde, inkludert det opprinnelige kjernefysiske lokaliseringssignalet (NLS) på C-terminalen, er renset fra den innfødte verten S. cerevisiae. Siden Cin8 er et kjernemotorprotein, er sliping av S. cerevisiae-cellene under flytende nitrogen funnet å være den mest effektive metoden for cellelys. Etter lysis, ved å kombinere metallaffinitet og størrelseseksklusjonskromatografi, oppnås svært ren Cin8, noe som er viktig for enkeltmolekylets motilitetsanalyser. Det har tidligere blitt rapportert at det er forskjeller mellom motile egenskaper til Cin8 i råoljeekstrakter og rensede prøver8. I tillegg har det også blitt rapportert at MT-trengsel med motoriske og ikke-motoriske proteiner påvirker retningen til toveis kinesin-5 Cut722. Dermed er høy renhet av motoren nødvendig for pålitelig motilitetsanalyse og konklusjoner angående villtype og mutant motorisk oppførsel. Teknikkene beskrevet her kan enkelt tilpasses for å rense andre kjerneproteiner fra gjæren med passende bufferjusteringer.

Beskrevet her er en svært robust og følsom enkeltmolekylet motility analyse med GFP-merket Cin8. Suksessen til denne analysen er avhengig av riktig MT-polymerisering og immobilisering til overflaten. Den sterke avidin-biotin interaksjonen brukes til å immobilisere MTs til den hydrofobe glassoverflaten, som irreversibelt fester MT-ene. På disse immobiliserte MT-ene som bruker GFP merket Cin8, kan Cin8-motilitet spores pålitelig 11,12,19.

Cin8 er rapportert å danne klynger som inneholder mer enn en tetramerisk motor 10,12, med motiliteten til disse klyngene som er forskjellig fra enkelt Cin8-molekyler. For å nøyaktig karakterisere Cin8-motiliteten som en funksjon av sin størrelse, er det utviklet en fluorescensintensitetsbasert metode for å identifisere klyngestørrelsen til hver Cin8-partikkel12. Basert på denne størrelseskategoriseringen analyseres motilitet separat i hver størrelseskategori. Etter denne størrelsesbaserte analysen gis innsiktsfulle detaljer, som kan brukes til å forstå den forskjellige oppførselen til oligomerer av samme molekyl 11,12,19. Klyngestørrelsesbestemmelsesprosedyren som er beskrevet her, kan brukes til å bestemme størrelsen på en rekke fluorescerende merkede molekyler. Mens man utfører fluorescensbasert størrelsesbestemmelse, bør man være forsiktig med å bestemme klyngestørrelsen på Cin8-GFP-partikler ved den første rammen av utseendet for å unngå virkningen av bleking, siden de store klyngene kan vises som mindre etter fotobleking.

Motilitetskarakteriseringen utføres av MD- og/eller MSD-analysene. Hvis det er av interesse å bestemme bare motorhastigheten, er MD-analyse tilstrekkelig. Men hvis motormotilitet inneholder både aktive og passive komponenter og bestemmelse av diffusjonskoeffisienten også er nødvendig, bør MSD-analyse utføres 20,23,24,25. For både MD- og MSD-analyser må koordinatene til motoren for hvert tidspunkt bestemmes. For effektiv sporing er det viktig å holde motorkonsentrasjonen optimal. MT-ene bør ikke være for overfylte med motorer; Ideelt sett bør det være 3-4 Cin8-GFP motorer / partikler om gangen på en MT på ~ 10 μm. Automatiserte verktøy som "KymoButler" eller "TrackMate" plugin i ImageJ-Fiji kan også brukes til å spore motile motorer26,27. Disse automatiserte verktøyene sparer tid og arbeid, men de har noen begrensninger. For eksempel, hvis motiliteten til noen partikler er veldig treg, kan disse verktøyene lese dem som ikke-motile partikler. I tillegg har disse verktøyene grenser for å gjenkjenne lavintensitetsmolekyler. Derfor kan de vise en høyintensitetsbias. På den annen side er manuell sporing (selv om den er tidkrevende) mindre følsom for sporingsfeil.

Oppsummert forklarer denne protokollen, fra rensing av Cin8 overekspressert i S. cerevisiae, omfattende enkeltmolekylets motilitetsanalyse og den påfølgende motilitetsanalysen av denne toveis kinesin-5. Denne protokollen kan enkelt følges for å rense og karakterisere motiliteten til motorproteiner som Cin8. Videre kan de forskjellige delene av protokollen tilpasses for å rense proteiner fra gjær eller utvikle enkeltmolekylets motilitetsanalyser for forskjellige motorproteiner og deres motilitetskarakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble delvis støttet av Israel Science Foundation grant (ISF-386/18) og Israel Binational Science Foundation grant (BSF-2019008), tildelt L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

Tags

Biokjemi Utgave 180 kinesin Cin8 enkeltmolekylsmotilitet mikrotubul toveis bevegelighet

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Motilitet av enkeltmolekyler og klynger av toveis Kinesin-5 Cin8 renset fra <em>S. cerevisiae</em> celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter