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Biochemistry

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Abstract

I motori mitotici bipolari kinesin-5 svolgono funzioni essenziali nella dinamica del mandrino. Questi motori presentano una struttura omo-tetramerica con due coppie di domini motori catalitici, situati alle estremità opposte del complesso attivo. Questa architettura unica consente ai motori kinesin-5 di reticolare e far scorrere i microtubuli antiparallelo del mandrino (MT), fornendo così la forza diretta verso l'esterno che separa i poli del mandrino. In precedenza, si riteneva che i motori kinesin-5 fossero esclusivamente diretti verso il plus-end. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che diversi motori fungini kinesin-5 sono meno diretti a livello di singola molecola e possono cambiare direzionalità in varie condizioni sperimentali. Il Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 è un esempio di tale proteina motoria bidirezionale: in condizioni di elevata forza ionica singole molecole di Cin8 si muovono nella direzione meno-estremità delle MT. È stato anche dimostrato che Cin8 forma ammassi mobili, prevalentemente all'estremità negativa delle MT, e tale clustering consente a Cin8 di cambiare direzionalità e subire una motilità lenta e diretta plus-end. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per tutte le fasi di lavoro con kinesin-5 Cin8 con tag GFP, dalla sovraespressione proteica nelle cellule di S. cerevisiae e la sua purificazione al saggio di motilità a singola molecola in vitro . Un metodo di nuova concezione qui descritto aiuta a distinguere tra singole molecole e cluster di Cin8, in base alla loro intensità di fluorescenza. Questo metodo consente un'analisi separata della motilità di singole molecole e cluster di Cin8, fornendo così la caratterizzazione della dipendenza della motilità di Cin8 dalla sua dimensione del cluster.

Introduction

Un gran numero di eventi di motilità all'interno delle cellule eucariotiche sono mediati dalla funzione delle proteine motorie molecolari. Questi motori si muovono lungo i filamenti citoscheletrici, i filamenti di actina e i microtubuli (MT) e convertono l'energia chimica dell'idrolisi dell'ATP in forze cinetiche e meccaniche necessarie per guidare la motilità biologica all'interno delle cellule. La S. cerevisiae Cin8 basata su MT è una proteina motoria bipolare omotetramerica kinesin-5 che reticola e fa scorrere le MT a parte1. Cin8 svolge funzioni essenziali durante la mitosi, nell'assemblaggio del mandrino 2,3,4 e nell'allungamento del mandrino durante l'anafase 5,6,7. In precedenza, era stato dimostrato che Cin8 è un motore bidirezionale, che commuta la direzionalità in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, in condizioni di elevata resistenza ionica, i singoli motori Cin8 si muovono verso l'estremità negativa degli MT, mentre nei cluster, nei saggi di scorrimento MT multimotore e tra GLI MT antiparallelo, i motori Cin8 si muovono principalmente verso le estremità più degli MT 8,9,10,11,12 . Questi risultati sono stati altamente inaspettati a causa di diversi motivi. In primo luogo, Cin8 porta il suo dominio motorio catalitico all'ammino-terminale e tali motori erano precedentemente ritenuti esclusivamente diretti verso il plus-end, mentre Cin8 ha dimostrato di essere minus-end diretto a livello di singola molecola. In secondo luogo, si credeva che i motori kinesin fossero unidirezionali, diretti meno-end o plus-end, mentre Cin8 si è dimostrato bidirezionale, a seconda delle condizioni sperimentali. Infine, a causa dell'orientamento MT al mandrino mitotico, il ruolo classico dei motori kinesin-5 nella separazione dei poli del mandrino durante l'assemblaggio del mandrino e l'anafase B potrebbe essere spiegato solo dalla loro motilità diretta plus-end sugli MT che reticolano 1,13. A seguito dei primi rapporti sulla bidirezionalità di Cin8, alcuni altri motori kinesin sono stati dimostrati bidirezionali 14,15,16, indicando che la motilità bidirezionale dei motori kinesin potrebbe essere più comune di quanto si credesse in precedenza.

È stato precedentemente riportato che nelle cellule, Cin8 si muove anche in modo bidirezionale8, sostenendo l'idea che la motilità bidirezionale di alcuni motori kinesin-5 sia importante per le loro funzioni intracellulari. Inoltre, poiché i tre motori kinesin-5 che sono stati segnalati come bidirezionali provengono da cellule fungine, un possibile ruolo per la bidirezionalità dei motori kinesin-5 è stato recentemente proposto in tali cellule10. Secondo questo modello, nella mitosi chiusa delle cellule fungine, dove l'involucro nucleare non si rompe durante la mitosi, i motori kinesin-5 forniscono la forza iniziale che separa i poli del mandrino prima dell'assemblaggio del mandrino. Per eseguire questo compito, prima della separazione dei poli del mandrino, i motori kinesin-5 si localizzano vicino ai poli del mandrino, per la loro motilità diretta all'estremità inferiore su singoli MT nucleari. Una volta in questa posizione, i motori kinesin-5 si raggruppano, commutano la direzionalità, catturano e collegano incrociato i NET dai poli del mandrino vicini. Successivamente, i motori kinesin-5 forniscono la separazione iniziale dei poli mediante motilità diretta plus-end sugli MT che reticolano. Con questo modello, sia la motilità diretta minus-end su singoli MT che la motilità diretta plus-end su MT reticolati durante lo scorrimento antiparallelo sono necessarie affinché i motori fungini kinesin-5 svolgano i loro ruoli nell'assemblaggio mandrino 1,13.

L'obiettivo generale del metodo descritto è quello di ottenere kinesin-5 Cin8 fungina di elevata purezza marcata con GFP e di eseguire saggi di motilità a singola molecola (Figura 1) analizzando separatamente la motilità di singole molecole e cluster di Cin8. La separazione tra singole molecole e cluster è importante poiché uno dei fattori che ha dimostrato di influenzare la direzionalità di Cin8 è il suo accumulo in cluster sulle MT10,12. Saggi di motilità alternativi, come i saggi di scorrimento superficiale MT e MT sliding non forniscono informazioni sull'attività delle proteine monomotore17,18. I robusti metodi di analisi e analisi della motilità a singola molecola qui descritti sono stati applicati con successo per caratterizzare diversi aspetti dei motori kinesin-5, Cin8 e Kip1 10,11,12,14,19,20.

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la sovraespressione e la purificazione di Cin8, la polimerizzazione delle MT e il test di motilità a singola molecola. Inoltre, vengono descritte anche le analisi per differenziare tra singole molecole e cluster di Cin8 e per determinare le velocità di singolo motore e cluster mediante l'analisi dello spostamento medio (MD) e dello spostamento quadrato medio (MSD). Questo protocollo ha lo scopo di aiutare i ricercatori a visualizzare tutte le fasi delle procedure e assistere nella risoluzione dei problemi di questo tipo di test.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di motilità a singola molecola. Le MT fluorescenti biotinilate sono attaccate alla superficie del vetro, rivestite con Avidin che interagisce con il BSA biotinilato attaccato alla superficie. La freccia verde rappresenta la direzione del movimento di singole molecole Cin8 in condizioni di elevata forza ionica. +/- rappresenta la polarità della MT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti

  1. Buffer
    1. -Leu aa dropout mix: mescolare 2 g ciascuno di adenina, uracile, triptofano, istidina, lisina e metionina e conservare a temperatura ambiente.
    2. Mezzo selettivo di lievito con raffinosio (1 L): Mescolare 6,7 g di base di azoto lievitato (con solfato di ammonio), 2 g di miscela di -Leu aa dropout e 20 g di raffinosio in acqua a doppia distillazione mescolando (senza riscaldamento) fino a completa dissoluzione. Utilizzando un filtro da 0,22 μm, filtrare la soluzione in un flacone sterile.
    3. Tampone di lisi: Preparare 25 mL di soluzione in acqua triplo distillata (TDW) composta da 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 10% glicerolo, 1,5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP e 0,1% Triton X-100. Regolare il pH a 8 utilizzando 6 M HCl.
    4. Tampone di eluizione: Preparare 10 mL di soluzione in TDW composta da 50 mM Tris, 30 mM Tubi, 500 mM KCl, 350 mM imidazolo, 10% glicerolo, 1,5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP e 0,1% Triton X-100. Regolare il pH a 7,2 utilizzando 6 M HCl.
    5. Tampone P12: preparare 10 mL di una soluzione in TDW composta da 12 mM di tubi, 1 mM EGTA e 2 mM di MgCl2. Regolare il pH a 6,9 utilizzando 10 M NaOH.
    6. Tampone BRB80: preparare 50 mL di una soluzione composta da 80 mM di tubi, 1 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2 in acqua ultrapura. Regolare il pH a 6,9 utilizzando 10 M NaOH.
    7. Tampone generale di tubulina (GTB): preparare 50 mL di una soluzione composta da 80 mM di tubi, 0,5 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2 in acqua ultrapura. Regolare il pH a 6,9 utilizzando 10 M NaOH.
    8. Soluzione Tris-Pipes: Preparare 40 mL di soluzione 1M Tris-0,6 M Pipes mescolando 6,055 g di Tris e 9,07 g di Tubi in TDW e regolare il pH a 7,2 utilizzando 6 M HCl. Portare il volume finale a 50 mL con TDW.
      NOTA: i tamponi P12, BRB80 e Tris-Pipes vengono utilizzati per la preparazione di soluzioni di riserva per il saggio di motilità. Questi tamponi possono essere preparati in grandi quantità, aliquotati in tubi da 1,5 ml, congelati a scatto e conservati a -20 °C.
  2. Soluzioni stock per il saggio di motilità
    1. Tubulina (10 mg mL-1): Sciogliere 1 mg di tubulina liofilizzata in 100 μL di tampone di tubulina generale (GTB) freddo (4 °C). Congelare a scatto aliquote da 1 μL e conservarle a -80 °C.
    2. Tubulina biotinilata (1 mg mL-1): Sciogliere 20 μg di tubulina liofilizzata in 20 μL di GTB fredda. Congelare a scatto aliquote da 1 μL e conservarle a -80 °C.
    3. Tubulina marcata con rodamina (1 mg mL-1): Sciogliere 20 μg di tubulina liofilizzata in 20 μL di GTB fredda. Congelare a scatto aliquote da 0,5 μL e conservarle a -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP è ottenuto dal fornitore come soluzione acquosa da 100 μL e conservato a -80 °C. Scongelare il flaconcino con GMPCPP sul ghiaccio. Preparare aliquote da 1 μL, congelarle a scatto e conservarle a -80 °C.
    5. ATP: Preparare una soluzione da 500 μL di ATP da 100 mM in tampone Tris da 0,5 M (pH 8). Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    6. MgCl2: Preparare 1 mL di soluzione da 200 mM MgCl2 in tampone P12. Conservare aliquote da 5 μL a -20 °C.
    7. Caseina: Preparare una soluzione da 1 mL di 5 mg di mL-1 caseina in tampone BRB 80. Congelare a scatto aliquote da 10 μL e conservarle a -20 °C.
    8. D-glucosio: preparare una soluzione da 1 mL di 1 M di D-glucosio in tampone P12. Conservare aliquote da 10 μL a -20 °C.
    9. Glucosio ossidasi: Preparare una soluzione da 1 mL di 10 mg di mL-1 glucosio ossidasi in tampone P12. Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    10. Catalasi: Preparare una soluzione da 1 mL di 0,8 mg di mL-1 catalasi in tampone P12. Surgelare a scatto aliquote da 2 μL e conservare a -20 °C.
    11. Ditiotreitolo (DTT): Preparare una soluzione da 1 mL di 1 M DTT in tampone P12 in una cappa aspirante. Congelare a scatto aliquote da 10 μL e conservarle a -20 °C.
    12. Creatina fosfato: Preparare una soluzione da 1 mL di 1 M di creatina fosfato in tampone P12. Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    13. Creatina fosfochinasi: Preparare una soluzione da 1 mL di 5 mg di creatinfosfochinasi mL-1 in glicilglicina da 0,25 M, pH 7,4. Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    14. EGTA: Preparare una soluzione EGTA da 100 mM in acqua ultrapura e conservarla a temperatura ambiente.
    15. KCl: Preparare una soluzione di KCl da 1 M in acqua ultrapura e conservarla a temperatura ambiente.
  3. Tampone di motilità e miscela di reazione
    1. Tampone di motilità (MB) con 145 mM KCl, 2x stock: Preparare 1 mL di 2x stock del tampone di motilità mescolando 100 μL di soluzione Tris-Pipes prefabbricata, 20 μL di 100 mM EGTA, 290 μL di KCl e 590 μL di TDW. Tenere il tampone sul ghiaccio.
    2. Miscela di reazione di motilità: preparare la miscela di reazione di motilità secondo la Tabella 1 e conservarla sul ghiaccio.
Volume Ceppo Nome del reagente
50 μL 2 volte MB (dal passaggio 1.3.1)
40 μL - TDW ·
1 μL 100 metri ATP
1 μL 200 metri quadrati MgCl2
2 μL 5 mg/ml Caseina
1 μL 1 M Glucosio
1 μL 1 M DTT ·
1 μL 10 mg/ml Glucosio ossidasi
1 μL 8 mg/mL Catalasi
1 μL 1 M Creatinfosfato
1 μL 5 mg/ml Creatina fosfochinasi
100 μL Totale

Tabella 1.

2. Sovraespressione e purificazione di Cin8 da cellule di S. cerevisiae

  1. Coltivare cellule di S. cerevisiae contenenti il plasmide per sovraespressione di Cin8-GFP-6His alla fase di crescita esponenziale (OD600 = 0,6-0,8) in 1 L di mezzo selettivo di lievito integrato con raffinosio al 2% (vedi passo 1.1.2) a 28 °C12.
  2. Indurre Cin8-GFP-6La sua sovraespressione con l'aggiunta del 2% di galattosio. Monitorare la crescita della coltura del lievito misurando l'assorbanza a 600 nm.
  3. Cinque ore dopo l'aggiunta di galattosio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C, sospendere le cellule nel tampone di lisi e congelare nel liquido N2.
    NOTA: le celle congelate possono essere conservate a -80 °C per un ulteriore utilizzo o immediatamente macinate nel liquido N2.
  4. Macinare le celle congelate nel liquido N2 usando mortaio refrigerato e pestello. Aggiungere il liquido N2 durante la macinazione per mantenere gli estratti congelati. In genere richiede 4-5 volte l'aggiunta di N2 liquido.
  5. Monitorare la lisi cellulare mediante osservazione al microscopio a contrasto di fase o DIC.
  6. Scongelare le celle di terra e centrifugare a 21.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Caricare il surnatante su una colonna di flusso gravitazionale riempita con 2 ml di Ni-NTA e pre-bilanciata con tampone di lisi. Lascia che il surnatante fluisca attraverso la colonna.
  7. Lavare la colonna con cinque volumi di colonne di tampone di lisi e quindi con cinque volumi di colonna di tampone di lisi integrati con 25 mM di imidazolo.
  8. Elute Cin8-GFP-6His con tampone di eluizione (vedere punto 1.1.4).
  9. Analizzare i campioni eluiti mediante frazionamento SDS-PAGE, seguito dalla colorazione blu Coomassie e dall'analisi western blot sondata con α-GFP19.
  10. Raggruppare le frazioni contenenti Cin8-GFP-6His (passaggi 2.8 e 2.9). Inoltre, purificarli mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) ad una portata di 0,5 mL min-1 e limite di pressione in colonna di 1,5 MPa, con monitoraggio simultaneo dell'assorbanza a 280 nm e dell'emissione di florescenza GFP con eccitazione a 488 nm (Figura 2A).
  11. Raccogliere le frazioni corrispondenti al tetramero Cin8-GFP e analizzarle mediante SDS-PAGE e western blotting (vedere passo 2.9) (Figura 2B).
  12. Stimare la concentrazione di proteine utilizzando la spettrofotometria o saggi biochimici come il saggio di Bradford, il saggio BCA ecc.
  13. Aliquotare le frazioni selezionate, congelare a scatto nel liquido N2 e conservare fino all'uso a -80 °C. Questi campioni di proteine purificate possono essere utilizzati per 6 mesi.
    NOTA: Cin8-GFP è sovraespresso e purificato da un ceppo di S. cerevisiae carente di proteasi contenente un plasmide di 2 μm per Cin8-GFP-6La sua sovraespressione dal promotore inducibile del galattosio, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Il ceppo di lievito e il plasmide sono disponibili su richiesta.

Figure 2
Figura 2: Purificazione di Cin8-GFP. (A) Il cromatogramma di esclusione dimensionale di Cin8-GFP purificato da Ni-NTA, con rilevamento continuo della fluorescenza GFP attraverso l'eccitazione e l'emissione di 488 nm a ~ 510 nm. Il tetramero Cin8-GFP eluisce a ~10 mL dalla colonna SEC (contrassegnata da una freccia). (B) Gel SDS-PAGE colorato con coomassie (in alto) e western blot α-GFP (in basso) di frazioni Cin8-GFP eluite da SEC. I campioni nelle corsie sono i seguenti: M - Molecular weight marker, Ni2+- Ni-NTA purificato Cin8-GFP campione caricato nella colonna SEC, frazioni GF: frazione corrispondente all'eluizione Cin8-GFP SEC come indicato nel pannello A. La freccia a destra indica la dimensione del monomero Cin8-GFP (previsto sulla SDS-PAGE). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Saggio di motilità a singola molecola con il Cin8 purificato

  1. Polimerizzazione di BIOTINA e RODAMINA marcati MT, stabilizzati con GMPCPP.
    1. Iniziare la polimerizzazione MT mescolando i seguenti componenti in un tubo da 1,5 mL: 1 μL di proteina tubulina da 10 mg/mL, 1 μL di tubulina biotinilata da 1 mg/mL, 0,5 μL di tubulina marcata con rodamina da 1 mg/mL, 1 μL di 10 mM GMPCPP e 6,5 μL di tampone tubulinico generale (GTB). Incubare la miscela per 1 ora a 37 °C.
    2. Dopo la polimerizzazione MT, aggiungere 80 μL di GTB caldo (37 °C), mescolare accuratamente e centrifugare a 16.500 x g per 20 min.
    3. Scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet con attenzione pipettando su e giù con 50 μL di GTB caldo. Conservare la sospensione a 28 °C.
    4. Esaminare le MT con un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale della rodamina da 647 nm (Figura 3A).
      NOTA: Per ottenere MT marcati fluorescenti biotinilati, la reazione di polimerizzazione contiene tubulina non etichettata, nonché tubulina biotinilata ed etichettata fluorescentemente. In questo protocollo, viene utilizzata tubulina marcata con rodamina, ma possono essere utilizzati anche altri coniugati fluorescenti.
  2. Assemblaggio della camera di flusso
    1. Assemblare una camera di flusso posizionando quattro strisce di nastro biadesivo (~ 4 cm x ~ 3 mm) su una slitta di vetro adesiva avanzata (parallela al bordo più lungo e ~ 3-4 mm di distanza) per creare tre "corsie" tra le strisce di nastro. Rimuovere la carta protettiva dalle strisce di nastro e posizionare una coverslip10 silanizzata sulle strisce di nastro per creare tre camere di flusso di ~ 10 μL di volume.
  3. Immobilizzazione MT sulla superficie rivestita di avidina (Figura 1)
    1. Rivestire il coverslip silanizzato perfondendo con 15 μL di 1 mg/mL di albumina sierica bovina biotinilata (b-BSA, disciolta in GTB) nella camera di flusso utilizzando una micropipetta. Dopo 5 minuti, lavare la camera con 80 μL di GTB.
    2. Successivamente, come nel passaggio 3.3.1, inserire nella camera di flusso 15 μL di 1 mg/mL di Avidina (disciolta in GTB) che si lega alla b-BSA. Dopo 5 minuti, lavare la camera con 80 μL di GTB.
    3. Passivare la superficie silanizzata del coverslip utilizzando 20 μL di poloxamer all'1%. Dopo 3 min, lavare con 80 μL di GTB.
    4. Attaccare le MT biotinilate (fase 3.1) al coperchio rivestito con b-BSA-avidina inserendo 20 μL di MT tipicamente diluite a 1:20 in GTB. Incubare i vetrini in posizione invertita, cioè con il coperchio rivolto verso il basso in una camera di umidità scura (ad esempio, una capsula di Petri contenente carta velina bagnata) per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare con 200 μL di GTB.
    5. Applicare 30 μL di miscela di reazione di motilità (vedere punto 1.3.2) nella camera di flusso.
    6. Diluire i motori Cin8-GFP (fase 2.13) in 20 μL di miscela di reazione di motilità (vedere Tabella 1) (tipicamente ad una concentrazione finale di 5-10 μM). Applicarli alla camera di flusso e visualizzare immediatamente il movimento dei motori lungo le MT.
  4. Imaging della motilità motoria
    NOTA: il legame MT e la motilità dei motori sono stati monitorati utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza dotato di una lampada ad arco di mercurio, un obiettivo ad apertura numerica 100x/1,4 e due set di filtri passa-banda a fluorescenza, uno con una lunghezza d'onda di 647 nm (per la rodamina) e un altro con una lunghezza d'onda di 488 nm (per GFP).
    1. Posizionare una goccia di olio per immersione sull'obiettivo del microscopio. Posizionare la camera di flusso sullo stadio del microscopio fluorescente con il coperchio rivolto verso il basso rivolto verso l'obiettivo.
    2. Attivare il canale della rodamina per mettere a fuoco le MT attaccate alla superficie del coverslip e acquisire l'immagine con un'esposizione di 20 ms utilizzando il software Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Accendi il canale GFP e acquisisci 90 immagini time-lapse con intervallo di 1 s e esposizione di 800 ms, per analizzare la motilità Cin8-GFP.

Figure 3
Figura 3: MT e MT bound Cin8-GFP. (A) Immagini da due campi (sinistro e destro) per MT polimerizzate seguendo il protocollo descritto nel passaggio 3.1 e immagini con obiettivo 100x come descritto nel passaggio 3.4. (B) Immagini da due campi (sinistra e destra) per il Cin8-GFP (pannelli inferiori, contrassegnati con frecce) attaccati alla MT mostrata nei pannelli superiori. Barra della scala: 4 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi della motilità

NOTA: Eseguire tutte le analisi delle immagini e generare kymographs utilizzando il software ImageJ-Fiji.

  1. Generazione kymograph
    1. Apri il filmato time lapse e l'immagine del campo MT corrispondente. Sincronizzare queste due finestre scegliendo l'opzione seguente: Analizza > Strumenti > Sincronizza finestre.
    2. Evidenziare una MT utilizzando l'opzione Linea segmentata e utilizzare la scheda Analizza > Multi Kymograph per ottenere un kymograph.
  2. Determinazione della dimensione del cluster di Cin8-GFP (cioè il numero di molecole cin8 in un cluster)
    1. Eseguire la sottrazione dello sfondo e la correzione per l'illuminazione irregolare utilizzando l'opzione Elabora > Sottrai sfondo . Impostate il raggio della sfera mobile su 100 pixel e selezionate l'opzione Paraboloide scorrevole .
    2. Seguire l'intensità media di fluorescenza di uno specifico motore Cin8-GFP non mobile (Figura 3B) in funzione del tempo all'interno di un raggio di 4 pixel utilizzando il plug-in TrackMate del software ImageJ-Fiji scegliendo la seguente opzione: Plugin > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Ripetere il passaggio 4.2.2 per diversi motori Cin8-GFP. Traccia l'intensità di fluorescenza dei diversi motori Cin8-GFP in funzione del tempo.
      NOTA: Una strategia sperimentale per misurare la dimensione del cluster, cioè il numero di molecole Cin8 in un cluster, stabilisce una base per l'analisi della motilità correlata al clustering cin8. La fotosbiancamento della GFP collegata a Cin8 viene utilizzata per determinare il contributo delle singole molecole GFP all'intensità totale dei cluster Cin8. Ad esempio, le intensità di fluorescenza diminuiscono in passi di ~ 50 unità arbitrarie (a.u.), con ogni singolo passo che probabilmente rappresenta il fotosbiancamento di una molecola GFP (Figura 4A). Poiché Cin8 è una proteina motoria omo-tetramerica, contiene quattro molecole GFP. Pertanto, tutti i motori Cin8 con un'intensità ≤ 200 u.a. sono probabilmente singole molecole tetrameriche Cin8. Seguendo questo metodo, gli intervalli di intensità della fluorescenza del motore Cin8 vengono assegnati come <200, 200-400 e >400 per singole molecole Cin8, coppie di molecole Cin8 (dimero del tetramero Cin8) e oligomeri Cin8, rispettivamente12.
  3. Analisi della distribuzione dell'intensità per motori Cin8-GFP
    1. Misurare l'intensità media di fioritura di tutti i motori fluorescenti Cin8-GFP nel primo fotogramma della sequenza time-lapse utilizzando il plug-in TrackMate in ImageJ-Fiji come descritto nel passaggio 4.2.2.
    2. Traccia un istogramma delle intensità medie di Cin8-GFP con una dimensione del contenitore di 20 u.a. e adatta il picco maggiore dell'istogramma a una curva gaussiana (Figura 4B).
      NOTA: l'analisi della distribuzione dell'intensità integra la determinazione della dimensione del cluster per i motori Cin8-GFP degli esperimenti di fotosbiancamento. La curva gaussiana si adatta all'istogramma di distribuzione dell'intensità per i picchi di popolazione Cin8-GFP a ~ 125 a.u., che è coerente con l'intensità media di singole molecole tetrameriche Cin8 contenenti una, due, tre o quattro molecole GFP fluorescenti (non sbiancate), con ogni molecola GFP fluorescente che contribuisce ~ 50 a.u. Pertanto, utilizzando questo metodo di distribuzione dell'intensità, è possibile calcolare anche il contributo di una molecola GFP, che può essere ulteriormente utilizzato per assegnare la dimensione del cluster delle molecole Cin8-GFP.

Figure 4
Figura 4: Profilo di sbiancamento Cin8-GFP e distribuzione dell'intensità. (A) Fotosbiancamento della GFP in quattro diversi motori Cin8-GFP. Singoli passaggi di fotosbiancamento, ciascuno dei quali probabilmente rappresenta il fotosbiancamento di una GFP, portano a un calo dell'intensità di fluorescenza di ~ 50 a.u. (B) La distribuzione dell'intensità dei motori Cin8-GFP nel primo fotogramma di una sequenza time-lapse (inserto). Il picco gaussiano (blu) centrato a ~125 a.u rappresenta singole molecole Cin8-GFP. Questo picco mostra l'intensità media dei singoli tetrameri Cin8 con una, due, tre o quattro molecole fluorescenti GFP, con ogni molecola GFP che contribuisce ~ 50 a.u. all'intensità totale (cioè (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Tracciamento della motilità delle molecole Cin8-GFP lungo le tracce MT
    1. Ritagliate la MT da analizzare nella sequenza time-lapse dei fotogrammi registrati evidenziandola con lo strumento Rettangolo e quindi scegliendo Immagine > Ritaglia.
    2. Scegli una particella fluorescente Cin8-GFP per l'analisi. Registrate le coordinate delle particelle in ogni fotogramma (punto temporale) della sequenza time lapse utilizzando le opzioni Strumento punto (Point Tool) e Misura (Measure). Eseguire una registrazione simile delle coordinate per altre particelle fluorescenti nella sequenza time-lapse.
    3. Assegnare la dimensione del cluster a tutte le particelle Cin8-GFP esaminate nel primo fotogramma del loro aspetto, come descritto nel passaggio 4.2.
  2. Analisi dello spostamento medio (MD) e dello spostamento quadrato medio (MSD)
    1. Dalle coordinate dei movimenti Cin8-GFP determinate nel passaggio 4.4, calcolare gli spostamenti di Cin8-GFP in ogni punto temporale rispetto alle coordinate iniziali, utilizzando l'equazione per il calcolo della distanza tra due punti con coordinate date:
      Equation 1
      dove, dt è gli spostamenti di Cin8-GFP al momento t, xt e yt sono le rispettive coordinate al tempo t. x0 e y0 sono le rispettive coordinate di Cin8-GFP a t = 0.
    2. Calcola da questi valori di spostamento lo spostamento per tutti i possibili intervalli di tempo per una specifica particella Cin8-GFP. Ripetere la procedura per tutte le particelle Cin8-GFP esaminate.
    3. Tracciare lo spostamento medio (MD) di tutte le particelle Cin8-GFP esaminate rispetto all'intervallo di tempo e soggette a un adattamento lineare, MD = v x t + c. La pendenza di questo fit (v) rappresenta la velocità media delle particelle mobili Cin8-GFP.
      NOTA: In questo modo, la velocità media di tutte le molecole Cin8-GFP appartenenti a ciascuna dimensione di cluster può essere calcolata separatamente caratterizzando la motilità di diverse dimensioni di cluster. Oltre all'analisi MD, l'analisi dello spostamento quadrato medio (MSD) può essere eseguita anche quadrando i valori di spostamento calcolati nei passaggi 4.5.1 e 4.5.2. I valori MSD sono tracciati rispetto all'intervallo di tempo e adattati alla curva polinomiale MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, dando il parametro aggiuntivo D, che è il coefficiente di diffusione del movimento Cin8-GFP. L'analisi MD deve essere eseguita su MT 8,10 marcati con polarità, mentre per l'analisi MSD non è necessaria la conoscenza della polarità MT.

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Representative Results

L'esperimento mira a studiare le caratteristiche di motilità della proteina motoria bidirezionale Cin8 di diverse dimensioni di cluster su singoli MT. La motilità rappresentativa di Cin8-GFP è evidente anche dai chimografi in Figura 5A, dove viene mostrata la posizione spaziale del motore nel tempo.

Per l'analisi delle proprietà mobili di Cin8-GFP, in primo luogo, la dimensione del cluster viene assegnata (passo 4.3) a ciascuna particella cin8-GFP mobile attaccata a MT, e quindi la posizione delle particelle Cin8 esaminate viene tracciata in funzione del tempo (passo 4.4). Per ogni categoria di dimensioni del cluster, dalle registrazioni sono state estratte >40 traiettorie dei singoli Cin8-GFP (Figura 5B). Utilizzando le coordinate ottenute dall'analisi di tracciamento, l'analisi MD e MSD viene eseguita separatamente per ogni popolazione di dimensioni del cluster. Le velocità sono ottenute da adattamenti lineari a MD come presentato nella Figura 5C. È stato scoperto che le singole molecole Cin8-GFP si muovono in modo unidirezionale, diretto all'estremità inferiore con alta velocità, mentre gli ammassi Cin8 mostrano una velocità considerevolmente inferiore con una maggiore propensione alla motilità bidirezionale (Figura 5B, C).

Figure 5
Figura 5: Motilità Cin8-GFP. (A) I chimografi che rappresentano la motilità dei motori Cin8-GFP su MT. Gli assi X e Y rappresentano rispettivamente il reticolo MT e il tempo. Le frecce gialle segnano la rapida motilità delle singole particelle Cin8-GFP verso la direzione meno-fine della MT, mentre le frecce blu segnano la lenta motilità degli ammassi Cin8 nella direzione più fine della MT. La polarità delle MT è indicata nella parte inferiore di ciascun kymograph (+/-). Barra orizzontale: 4 μm, barra verticale: 20 s. (B) Tracce di spostamento di singoli motori (a sinistra) e cluster (a destra) di motori Cin8-GFP. Le tracce di spostamento sono state tracciate utilizzando le coordinate ottenute dopo aver tracciato i singoli motori Cin8-GFP come spiegato al punto 4.4. I valori negativi e positivi di spostamento indicano il movimento nelle direzioni minus-end e plus-end della MT, rispettivamente. Si noti che sotto lo stesso test, la motilità degli ammassi Cin8 è più lenta e bidirezionale rispetto alle singole molecole di Cin8. (C) Grafici di spostamento medio (MD) ± SEM, di singole molecole (a sinistra) e cluster (a destra) di motori Cin8 in funzione dell'intervallo di tempo. Le linee nere rappresentano gli adattamenti lineari del grafico (MD = v xt + c, dove v è la velocità media, t è l'intervallo di tempo e c rappresenta l'intercetta). Dal raccordo, è evidente che la velocità media per singoli motori e cluster di Cin8 è rispettivamente -265 ± 20 nm/s e -48 ± 5 nm/s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo lavoro, viene presentato un protocollo per il saggio di motilità a singola molecola con la kinesin-5 bidirezionale Cin8 e l'analisi della motilità. Il Cin818 a lunghezza intera, incluso il segnale di localizzazione nucleare nativo (NLS) al C-terminale, è stato purificato dall'ospite nativo S. cerevisiae. Poiché il Cin8 è una proteina del motore nucleare, la macinazione delle cellule S. cerevisiae sotto azoto liquido è il metodo più efficiente per la lisi cellulare. Dopo la lisi, combinando l'affinità del metallo e la cromatografia di esclusione dimensionale, si ottiene Cin8 altamente puro, che è importante per i saggi di motilità a singola molecola. È stato precedentemente riportato che ci sono differenze tra le proprietà mobili di Cin8 negli estratti grezzi e nei campioni purificati8. Inoltre, è stato anche riportato che l'affollamento mt con proteine motorie e non motorie influisce sulla direzionalità della kinesin-5 Cut722 bidirezionale. Pertanto, è necessaria un'elevata purezza del motore per un'analisi affidabile della motilità e conclusioni riguardanti il comportamento motorio selvaggio e mutante. Le tecniche qui descritte possono essere facilmente adattate per purificare altre proteine nucleari dal lievito con opportuni aggiustamenti tampone.

Qui è descritto un test di motilità a singola molecola altamente robusto e sensibile con Cin8 con tag GFP. Il successo di questo test si basa fortemente sulla corretta polimerizzazione MT e immobilizzazione in superficie. La forte interazione avidina-biotina viene utilizzata per immobilizzare le MT sulla superficie del vetro idrofobo, che attacca irreversibilmente le MT. Su questi MT immobilizzati che utilizzano GFP etichettato Cin8, la motilità Cin8 può essere tracciata in modo affidabile 11,12,19.

Cin8 è segnalato per formare cluster contenenti più di un motore tetramerico10,12, con la motilità di questi cluster diversa da quella delle singole molecole Cin8. Per caratterizzare accuratamente la motilità di Cin8 in funzione delle sue dimensioni, è stato sviluppato un metodo basato sull'intensità di fluorescenza per identificare la dimensione del cluster di ciascuna particellaCin8 12. Sulla base di questa categorizzazione delle dimensioni, la motilità viene analizzata separatamente in ciascuna categoria di dimensioni. A seguito di questa analisi basata sulle dimensioni, vengono forniti dettagli approfonditi, che possono essere utilizzati per comprendere il diverso comportamento degli oligomeri della stessa molecola 11,12,19. La procedura di determinazione della dimensione del cluster qui descritta può essere applicata per determinare la dimensione di una varietà di molecole marcate fluorescentemente. Durante l'esecuzione della determinazione delle dimensioni basata sulla fluorescenza, si dovrebbe fare attenzione a determinare la dimensione del cluster delle particelle Cin8-GFP al primo fotogramma di apparizione per evitare l'impatto dello sbiancamento, poiché i grandi ammassi potrebbero apparire come quelli più piccoli dopo il fotosbiancamento.

La caratterizzazione della motilità viene eseguita mediante le analisi MD e/o MSD. Se è interessante determinare solo la velocità del motore, l'analisi MD è sufficiente. Tuttavia, se la motilità motoria contiene sia componenti attivi che passivi ed è richiesta anche la determinazione del coefficiente di diffusione, l'analisi MSD deve essere eseguita 20,23,24,25. Sia per le analisi MD che MSD, è necessario determinare le coordinate del motore per ogni punto temporale. Per un monitoraggio efficiente, è importante mantenere ottimale la concentrazione del motore. Le MT non dovrebbero essere troppo affollate di motori; idealmente, ci dovrebbero essere 3-4 motori / particelle Cin8-GFP alla volta su una MT di ~ 10 μm. Strumenti automatizzati come il plugin "KymoButler" o "TrackMate" in ImageJ-Fiji possono anche essere utilizzati per tracciare i motori mobili26,27. Questi strumenti automatizzati consentono di risparmiare tempo e lavoro, ma hanno alcune limitazioni. Ad esempio, se la motilità di alcune particelle è molto lenta, questi strumenti possono leggerle come particelle non mobili. Inoltre, questi strumenti hanno limiti nel riconoscere le molecole a bassa intensità. Pertanto, possono mostrare un pregiudizio ad alta intensità. D'altra parte, il tracciamento manuale (anche se richiede tempo) è meno sensibile agli errori di tracciamento.

In sintesi, questo protocollo, a partire dalla purificazione di Cin8 sovraespresso in S. cerevisiae, spiega in modo esaustivo il saggio di motilità a singola molecola e la successiva analisi della motilità di questa kinesin-5 bidirezionale. Questo protocollo può essere seguito facilmente per purificare e caratterizzare la motilità di proteine motorie come Cin8. Inoltre, le diverse parti del protocollo possono essere adattate per purificare le proteine dal lievito o sviluppare saggi di motilità a singola molecola per diverse proteine motorie e la loro caratterizzazione della motilità.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (ISF-386/18) e dalla sovvenzione della Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008), assegnata a L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

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References

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Biochimica Numero 180 kinesina Cin8 motilità a singola molecola microtubulo motilità bidirezionale

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

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Roy Avraham

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule <em>S. cerevisiae</em>
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Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

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