Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

Himanshu Pandey; Tatiana Zvagelsky; Mary Popov; Mayan Sadan; Neta Yanir; Alina Goldstein-Levitin; Nurit Siegler; Shira Hershfinkel; Yahel Abraham; Roy Avraham; Levi A. Gheber; Larisa Gheber

doi:10.3791/63425

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Articolo metodologico

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

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DOI:

10.3791/63425

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2 febbraio 2022

Himanshu Pandey¹ , Tatiana Zvagelsky¹ , Mary Popov¹ , Mayan Sadan¹ , Neta Yanir¹ , Alina Goldstein-Levitin¹ , Nurit Siegler¹ , Shira Hershfinkel¹ , Yahel Abraham¹ , Roy Avraham¹ , Levi A. Gheber² , Larisa Gheber¹

¹Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, ²Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

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Sommario

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Abstract

I motori mitotici bipolari kinesin-5 svolgono funzioni essenziali nella dinamica del mandrino. Questi motori presentano una struttura omo-tetramerica con due coppie di domini motori catalitici, situati alle estremità opposte del complesso attivo. Questa architettura unica consente ai motori kinesin-5 di reticolare e far scorrere i microtubuli antiparallelo del mandrino (MT), fornendo così la forza diretta verso l'esterno che separa i poli del mandrino. In precedenza, si riteneva che i motori kinesin-5 fossero esclusivamente diretti verso il plus-end. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che diversi motori fungini kinesin-5 sono meno diretti a livello di singola molecola e possono cambiare direzionalità in varie condizioni sperimentali. Il Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 è un esempio di tale proteina motoria bidirezionale: in condizioni di elevata forza ionica singole molecole di Cin8 si muovono nella direzione meno-estremità delle MT. È stato anche dimostrato che Cin8 forma ammassi mobili, prevalentemente all'estremità negativa delle MT, e tale clustering consente a Cin8 di cambiare direzionalità e subire una motilità lenta e diretta plus-end. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per tutte le fasi di lavoro con kinesin-5 Cin8 con tag GFP, dalla sovraespressione proteica nelle cellule di S. cerevisiae e la sua purificazione al saggio di motilità a singola molecola in vitro . Un metodo di nuova concezione qui descritto aiuta a distinguere tra singole molecole e cluster di Cin8, in base alla loro intensità di fluorescenza. Questo metodo consente un'analisi separata della motilità di singole molecole e cluster di Cin8, fornendo così la caratterizzazione della dipendenza della motilità di Cin8 dalla sua dimensione del cluster.

Introduzione

Un gran numero di eventi di motilità all'interno delle cellule eucariotiche sono mediati dalla funzione delle proteine motorie molecolari. Questi motori si muovono lungo i filamenti citoscheletrici, i filamenti di actina e i microtubuli (MT) e convertono l'energia chimica dell'idrolisi dell'ATP in forze cinetiche e meccaniche necessarie per guidare la motilità biologica all'interno delle cellule. La S. cerevisiae Cin8 basata su MT è una proteina motoria bipolare omotetramerica kinesin-5 che reticola e fa scorrere le MT a parte¹. Cin8 svolge funzioni essenziali durante la mitosi, nell'assemblaggio del mandrino