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Summary
양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.
Abstract
유사분열성 양극성 키네신-5 모터는 스핀들 역학에서 필수적인 기능을 수행합니다. 이 모터는 활성 복합체의 반대쪽 끝에 위치한 두 쌍의 촉매 모터 도메인을 가진 호모 사량체 구조를 나타냅니다. 이 독특한 아키텍처는 kinesin-5 모터가 반평행 스핀들 미세소관(MT)을 가교 및 분리할 수 있게 해줌으로써 스핀들 극을 분리하는 외향 지향적인 힘을 제공합니다. 이전에는 kinesin-5 모터가 독점적으로 플러스 엔드 지향으로 여겨졌습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 여러 곰팡이 키네신 -5 모터는 단일 분자 수준에서 향하는 마이너스 엔드이며 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환 할 수 있습니다. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8은 이러한 양방향 운동 단백질의 예입니다 : 높은 이온 강도 조건에서 Cin8의 단일 분자가 MT의 마이너스 - 끝 방향으로 움직입니다. 또한 Cin8은 주로 MT의 마이너스 말단에 모타일 클러스터를 형성하며, 이러한 클러스터링을 통해 Cin8은 방향성을 전환하고 느리고 플러스 엔드 지향 운동성을 겪을 수 있습니다. 이 기사는 S. cerevisiae 세포에서의 단백질 과발현 및 그의 정제에서부터 시험관내 단일 분자 운동성 분석에 이르기까지 GFP 태깅된 키네신-5 Cin8로 작업하는 모든 단계에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 새로 개발 된 방법은 형광 강도에 따라 Cin8의 단일 분자와 클러스터를 구별하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성에 대한 별도의 분석을 가능하게하여 클러스터 크기에 대한 Cin8 운동성의 의존성의 특성을 제공합니다.
Introduction
진핵 세포 내의 많은 운동성 사건은 분자 운동 단백질의 기능에 의해 매개된다. 이 모터는 세포 골격 필라멘트, 액틴 필라멘트 및 미세 소관 (MTs)을 따라 움직이며 ATP 가수분해의 화학 에너지를 세포 내에서 생물학적 운동성을 유도하는 데 필요한 운동 및 기계적 힘으로 변환합니다. MT 기반 S. cerevisiae Cin8은 양극성, 호모테트라머 키네신-5 모터 단백질로, 스핀들 MT를 교차 연결하고슬라이드합니다 1. Cin8은 유사분열 동안, 스핀들 어셈블리 2,3,4 및 아나페이즈 5,6,7 동안 스핀들 신장에서 필수 기능을 수행합니다. 이전에는 Cin8이 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환하는 양방향 모터라는 것이 입증되었습니다. 예를 들어, 높은 이온 강도 조건에서 단일 Cin8 모터는 MT의 마이너스 끝쪽으로 이동하지만 클러스터, 다중 모터 MT 글라이딩 분석 및 병렬 MT 사이에서 Cin8 모터는 주로 MT 8,9,10,11,12의 플러스 엔드쪽으로 이동합니다. . 이러한 발견은 여러 가지 이유로 인해 매우 예상치 못한 결과였습니다. 첫째, Cin8은 아미노 말단에서 촉매 모터 도메인을 운반하며 그러한 모터는 이전에 독점적으로 플러스 엔드 지향으로 여겨졌지만 Cin8은 단일 분자 수준에서 마이너스 말단으로 향하는 것으로 나타났습니다. 둘째, 키네신 모터는 마이너스 엔드 또는 플러스 엔드 지향 단방향인 단방향인 것으로 여겨졌지만, Cin8은 실험 조건에 따라 양방향인 것으로 나타났다. 마지막으로, 유사 분열 스핀들에서의 MT 방향 때문에, 스핀들 조립 및 아나 페이즈 B 동안 스핀들 폴의 분리에서 kinesin-5 모터의 고전적인 역할은1,13을 교차 연결하는 MT에 대한 플러스 엔드 지향 운동성으로 만 설명 될 수 있습니다. Cin8의 양방향성에 대한 첫 번째 보고에 따라, 몇 가지 다른 키네신 모터가 양방향 14,15,16인 것으로 입증되었으며, 이는 키네신 모터의 양방향 운동성이 이전에 생각했던 것보다 더 일반적일 수 있음을 나타냅니다.
세포에서 Cin8은 또한 양방향 방식으로 움직인다8, 일부 kinesin-5 모터의 양방향 운동성이 세포 내 기능에 중요하다는 개념을 뒷받침하는 것으로 이전에 보고되었다. 또한, 양방향성으로 보고되었던 세 개의 키네신-5 모터가 진균 세포로부터 왔기 때문에, 키네신-5 모터의 양방향성에 대한 가능한 역할이 최근 이러한 세포(10)에서 제안되고 있다. 이 모델에 따르면, 유사분열 중에 핵 외피가 분해되지 않는 곰팡이 세포의 폐쇄 된 유사분열에서 kinesin-5 모터는 스핀들 조립 전에 스핀들 극을 분리하는 초기 힘을 제공합니다. 이 작업을 수행하기 위해 스핀들 폴 분리 전에 kinesin-5 모터는 단일 핵 MT에서 마이너스 엔드 지향 운동성에 의해 스핀들 폴 근처에 국한됩니다. 이 위치에 도착하면 kinesin-5 모터가 클러스터링되고, 방향성을 전환하고, 캡처하고, 인접 스핀들 폴에서 MT를 교차 연결합니다. 그 후, kinesin-5 모터는 가교 연결된 MT에서 플러스 엔드 지향 운동성으로 극의 초기 분리를 제공합니다. 이 모델에 따르면, 단일 MT의 마이너스 엔드 지향 운동성과 반평행 슬라이딩 중 가교 MT의 플러스 엔드 지향 운동성은 곰팡이 키네신-5 모터가 스핀들 어셈블리1,13에서 역할을 수행하는 데 필요합니다.
기술된 방법의 전반적인 목표는 고순도 진균성 GFP-태깅된 키네신-5 Cin8을 수득하고 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성을 개별적으로 분석하면서 단일 분자 운동성 분석(도 1)을 수행하는 것이다. 단일 분자와 클러스터 사이의 분리는 Cin8의 방향성에 영향을 미치는 것으로 입증된 인자 중 하나가 MT10,12 상의 클러스터에 축적되기 때문에 중요하다. MT 표면 글라이딩 및 MT 슬라이딩 분석과 같은 대안적인 운동성 분석은 단일 운동 단백질17,18의 활성에 관한 정보를 제공하지 않는다. 여기에 설명된 강력한 단일 분자 운동성 분석 및 분석 방법은 키네신-5 모터, Cin8 및 Kip1 10,11,12,14,19,20의 다양한 측면을 특성화하기 위해 성공적으로 적용되었습니다.
여기에서, Cin8 과발현 및 정제, MTs의 중합, 및 단일 분자 운동성 검정을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 또한, Cin8의 단일 분자와 클러스터를 구별하고, 평균 변위 (MD) 및 평균 제곱 변위 (MSD) 분석에 의해 단일 모터 및 클러스터 속도를 결정하는 분석도 설명된다. 이 프로토콜은 연구자가 절차의 모든 단계를 시각화하고 이러한 유형의 분석 문제를 해결하는 데 도움을주는 것을 목표로합니다.
도 1: 단일 분자 운동성 분석의 개략적 표현. 비오티닐화 형광 MTs는 유리 표면에 부착되고, 표면 부착된 비오티닐화-BSA와 상호작용하는 아비딘으로 코팅된다. 녹색 화살표는 높은 이온 강도 조건 하에서 단일 Cin8 분자의 이동 방향을 나타낸다. +/- MT의 극성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 완충제 및 시약의 제조
- 버퍼
- -Leu aa 드롭아웃 믹스: 아데닌, 우라실, 트립토판, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 각각 2g을 섞어 실온에서 보관한다.
- 효모 선택 배지와 라피노스 (1 L): 완전히 용해될 때까지 교반하여(가열 없이) 이중 증류수에 효모 질소 염기 6.7 g(황산암모늄 포함), 2 g의 -Leu aa 드롭아웃 믹스 및 20 g의 라피노오스를 혼합한다. 0.22 μm 필터를 사용하여, 용액을 멸균 병으로 여과한다.
- 용해 완충액: 50 mM 트리스, 30 mM 파이프, 500 mM KCl, 10% 글리세롤, 1.5 mM β-머캅토에탄올, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP 및 0.1% 트리톤 X-100으로 구성된 삼중 증류수(TDW)에용액 25 mL를 준비한다. 6 M HCl을 사용하여 pH를 8로 조정한다.
- 용출 완충액: 50 mM 트리스, 30 mM 파이프, 500 mM KCl, 350 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 1.5 mM β-머캅토에탄올, 1 mMMgCl2, 0.1 mM ATP 및 0.1% 트리톤 X-100으로 구성된 TDW 중 용액 10 mL를 준비한다. 6 M HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정한다.
- P12 완충액: 12 mM 파이프, 1 mM EGTA 및 2 mM MgCl2로 구성된 TDW 용액 10mL를 준비한다. 10 M NaOH를 사용하여 pH를 6.9로 조정한다.
- BRB80 완충액: 초순수에서 80 mM 파이프, 1 mM EGTA 및 2 mM MgCl2로 구성된 용액 50 mL를 준비한다. 10 M NaOH를 사용하여 pH를 6.9로 조정한다.
- 일반 튜불린 버퍼 (GTB): 초순수에서 80 mM 파이프, 0.5 mM EGTA 및 2 mMMgCl2 로 구성된 용액 50 mL를 준비한다. 10 M NaOH를 사용하여 pH를 6.9로 조정한다.
- 트리스-파이프 용액: TDW에 6.055 g의 트리스와 9.07 g의 파이프를 혼합하여 40 mL의 1M 트리스-0.6 M 파이프 용액을 준비하고, 6 M HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정한다. TDW를 사용하여 최종 부피를 50 mL로 가져온다.
참고: P12, BRB80 및 트리스-파이프 버퍼는 운동성 분석을 위한 스톡 용액의 제조에 사용됩니다. 이들 완충제는 대량으로 제조될 수 있고, 1.5 mL 튜브에서 분취되고, 스냅-냉동되고, -20°C에서 저장될 수 있다.
- 운동성 분석을 위한 스톡 솔루션
- 투불린 (10 mg mL-1): 동결건조된 튜불린 1 mg을 차가운 (4°C) 일반 튜불린 완충액 (GTB)의 100 μL에 녹인다. 1 μL 분취량을 스냅-동결시키고 이를 -80°C에서 보관한다.
- 비오티닐화 튜불린 (1 mg mL-1): 동결건조된 튜불린 20 μg을 차가운 GTB 20 μL에 녹인다. 1 μL 분취량을 스냅-동결시키고 이를 -80°C에서 보관한다.
- 로다민 표지된 튜불린 (1 mg mL-1): 동결건조된 튜불린 20 μg을 차가운 GTB 20 μL에 녹인다. 스냅-동결 0.5 μL 분취량을 -80°C에서 저장한다.
- GMPCPP (10 μM): GMPPP는 100 μL 수용액으로서 공급자로부터 수득되고 -80°C에서 저장된다. 얼음 위에 GMPCPP로 바이알을 해동하십시오. 1 μL 분취량을 준비하고, 스냅-동결시키고, 이를 -80°C에서 보관한다.
- ATP: 0.5 M 트리스 완충액 (pH 8)에서 100 mM ATP의 500 μL 용액을 준비한다. 2 μL 분취량을 스냅-동결시키고 이를 -20°C에서 보관한다.
- MgCl2: P12 완충액 중의 200 mMMgCl2의 용액 1 mL를 준비한다. 5 μL 분취량을 -20°C에서 보관하십시오.
- 카제인: BRB 80 완충액에 5 mg mL-1 카제인의 1 mL 용액을 준비한다. 스냅-동결 10 μL 분취량을 -20°C에서 보관한다.
- D-글루코스: P12 완충액에 1 M D-글루코오스의 1 mL 용액을 준비한다. 10 μL 분취량을 -20°C에서 보관하십시오.
- 글루코스 옥시다제: P12 완충액에 10 mg mL-1 글루코스 옥시다제의 1 mL 용액을 준비한다. 2 μL 분취량을 스냅-동결시키고 이를 -20°C에서 보관한다.
- 카탈라아제: P12 완충액에 0.8 mg mL-1 카탈라아제의 1 mL 용액을 준비한다. 스냅-동결 2 μL 분취량을 -20°C에서 저장한다.
- 디티오트레이톨 (DTT): 흄 후드에서 P12 버퍼 중의 1 M DTT의 1 mL 용액을 준비한다. 스냅-동결 10 μL 분취량을 -20°C에서 보관한다.
- 크레아틴 포스페이트: P12 완충액에 1 M 크레아틴 포스페이트의 1 mL 용액을 준비한다. 2 μL 분취량을 스냅-동결시키고 이를 -20°C에서 보관한다.
- 크레아틴 포스포키나제: 0.25 M 글리실글리신, pH 7.4 중의 5 mg mL-1 크레아틴 포스포키나제의 1 mL 용액을 제조하였다. 2 μL 분취량을 스냅-동결시키고 이를 -20°C에서 보관한다.
- EGTA: 초순수에 100 mM EGTA 용액을 준비하고 실온에서 보관하십시오.
- KCl: 초순수에 1 M KCl 용액을 준비하여 실온에서 보관하십시오.
- 운동성 완충액과 반응 혼합
- 145 mM KCl, 2x 스톡을 갖는 운동성 완충액 (MB): 100 μL의 미리 만들어진 트리스-파이프 용액 100 μL, 20 μL의 100 mM EGTA, 290 μL의 KCl 및 590 μL의 TDW를 혼합함으로써 운동성 완충액 1 mL를 준비한다. 버퍼를 얼음 위에 보관하십시오.
- 운동성 반응 믹스: 표 1 에 따라 운동성 반응 믹스를 준비하고 얼음 위에 보관한다.
| 음량 | 주식 | 시약 이름 |
| 50 μL | 2배 | MB(1.3.1단계부터) |
| 40 μL | - | 증권 시세 표시기 |
| 1 μL | 100 밀리미터 | 증권 시세 표시기 |
| 1 μL | 200 밀리미터 | MgCl2 |
| 2 μL | 5 밀리그램/mL | 카제인 |
| 1 μL | 1 엠 | 포도당 |
| 1 μL | 1 엠 | 증권 시세 표시기 |
| 1 μL | 10 밀리그램/mL | 글루코스 옥시다제 |
| 1 μL | 8 밀리그램/mL | 카탈라아제 |
| 1 μL | 1 엠 | 포스포크레아틴 |
| 1 μL | 5 밀리그램/mL | 크레아틴 포스포키나제 |
| 100 μL | 합계 |
표 1.
2. S. cerevisiae 세포로부터의 Cin8 과발현 및 정제
- Cin8-GFP-6His의 과발현을 위한 플라스미드를 함유하는 S. cerevisiae 세포를 28°C에서 2% 라피노오스가 보충된 효모 선택 배지 1 L에서 지수적 성장 단계 (OD600= 0.6-0.8)로 성장시킨다 (단계 1.1.2 참조).
- 2% 갈락토오스를 첨가하여 Cin8-GFP-6His 과발현을 유도하였다. 600 nm에서 흡광도를 측정하여 효모 배양 성장을 모니터링한다.
- 갈락토오스 첨가 5시간 후, 4°C에서 15분 동안 4,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확하고, 세포를 용해 완충액에 현탁시키고, 액체N2에 동결시켰다.
참고: 냉동 세포는 추가 사용을 위해 -80°C에서 보관하거나 액체N2에서 즉시 분쇄할 수 있습니다. - 냉장 모르타르 및 유모차를 사용하여 액체N2 에서 동결된 세포를 분쇄한다. 분쇄 중에 액체N2 를 첨가하여 추출물을 냉동 상태로 유지하십시오. 전형적으로 액체 N2의 4-5 배가 첨가되어야 한다.
- 위상차 또는 DIC 현미경으로 관찰하여 세포 용해를 모니터링합니다.
- 분쇄된 세포를 해동시키고, 4°C에서 30분 동안 21,000 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 2 mL의 Ni-NTA로 채워진 중력 유동 컬럼 상에 로딩하고 용해 완충액으로 미리 평형화시킨다. 상청액이 기둥을 통해 흘러 나오게하십시오.
- 컬럼을 다섯 컬럼 부피의 용해 완충액으로 세척한 다음, 25 mM 이미다졸로 보충된 용해 완충액의 다섯 컬럼 부피로 세척한다.
- 용출 완충액으로 Cin8-GFP-6His를 뤄낸다(단계 1.1.4 참조).
- 용출된 샘플을 SDS-PAGE 분획화에 의해 분석하고, 이어서 쿠마시 블루 염색 및 α-GFP 항체19로 프로빙된 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
- Cin8-GFP-6His를 함유하는 분획을 풀링한다(단계 2.8 및 2.9). 또한, 유속 0.5 mL min-1 및 1.5 MPa의 컬럼 압력 한계에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 정제하고, 280 nm에서의 흡광도와 488 nm에서의 여기와 함께 GFP 꽃차례 방출을 동시에 모니터링한다 (도 2A).
- Cin8-GFP 사량체에 상응하는 분획을 수집하고, 이를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅(단계 2.9 참조)으로 분석한다(도 2B).
- 분광광도계 또는 브래드포드 분석법, BCA 분석 등과 같은 생화학적 분석을 사용하여 단백질 농도를 추정합니다.
- 선택된 분획을 분취하고, 액체N2 에 스냅-동결시키고, -80°C에서 사용할 때까지 저장한다. 이들 정제된 단백질 샘플은 6개월 동안 사용될 수 있다.
참고: Cin8-GFP는 갈락토오스 유도성 프로모터로부터의 Cin8-GFP-6His 과발현에 대한 2 μm 플라스미드를 함유하는 프로테아제 결핍 S. cerevisiae 균주로부터 과발현 및 정제되고, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). 효모 균주 및 플라스미드는 요청시 사용할 수 있습니다.
도 2: Cin8-GFP의 정제. (A) Ni-NTA의 크기 배제 크로마토그램은 488nm 여기 및 ~510nm에서의 방출을 통한 지속적인 GFP 형광 검출과 함께 정제된 Cin8-GFP이다. Cin8-GFP 사량체는 SEC 컬럼으로부터 ~10 mL에서 용출된다(화살표로 표시됨). (b) 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔 (상단) 및 α-GFP SEC로부터 용출된 Cin8-GFP 분획의 웨스턴 블롯 (하단) 레인에서의 샘플은 다음과 같다: M-분자량 마커,Ni2+-Ni-NTA SEC 컬럼에 로딩되는 정제된 Cin8-GFP 샘플, GF 분획: 패널 A에 표시된 바와 같이 Cin8-GFP SEC 용출에 상응하는 분획. 오른쪽의 화살표는 Cin8-GFP 단량체의 크기를 표시합니다 (SDS-PAGE에서 예상됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 정제된 Cin8을 사용한 단일 분자 운동성 분석
- 비오틴과 로다민 표지된 MTs의 중합, GMPCPP로 안정화.
- 1.5 mL 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 MT 중합을 시작하십시오: 10 mg/mL 튜불린 단백질 1 μL, 1 mg/mL 비오티닐화 튜불린 1 μL, 1 mg/mL 로다민 표지된 튜불린 0.5 μL, 10 mM GMPCPP 1 μL, 일반 튜불린 완충액 (GTB) 6.5 μL. 상기 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- MT 중합 후, 80 μL의 가온 (37°C) GTB를 첨가하고, 조심스럽게 혼합하고, 20분 동안 16,500 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 50 μL의 따뜻한 GTB로 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 조심스럽게 재현탁한다. 현탁액을 28°C에서 저장한다.
- 647 nm 로다민 채널을 이용하여 형광현미경으로 MTs를 검사하였다(도 3A).
참고: 비오티닐화 형광 표지된 MTs를 얻기 위해, 중합 반응에는 비표지된 튜불린뿐만 아니라 비오티닐화 및 형광 표지된 튜불린이 포함된다. 이 프로토콜에서, 로다민-표지된 튜불린이 사용되지만 다른 형광 접합체도 활용될 수 있다.
- 교류 약실 집합
- 고급 접착 유리 슬라이드(더 긴 가장자리와 평행하고 ~3-4mm 떨어져 있음)에 양면 테이프 4개(~4cm x ~3mm) 스트립을 배치하여 플로우 챔버를 조립하여 테이프 스트립 사이에 3개의 '레인'을 만듭니다. 테이프 스트립에서 보호 용지를 제거하고 테이프 스트립 위에 실란화된 커버슬립(10 )을 배치하여 ~10μL 부피의 세 개의 유동 챔버를 생성한다.
- 아비딘 코팅된 표면에 MT 고정화(도 1)
- 1mg/mL의 비오티닐화된 소 혈청 알부민(b-BSA, GTB에 용해된)의 15μL를 마이크로피펫을 사용하여 유동 챔버에 관류시켜 실란화된 커버슬립을 코팅한다. 5분 후, 챔버를 80 μL의 GTB로 세척한다.
- 이어서, 단계 3.3.1에서와 같이, b-BSA에 결합하는 1 mg/mL 아비딘 (GTB에 용해된) 15 μL를 유동 챔버 내로 삽입한다. 5분 후, 챔버를 80 μL의 GTB로 세척한다.
- 1% 폴록사머의 20 μL를 사용하여 실란화된 커버슬립 표면을 패시베이트화한다. 3분 후, 80 μL의 GTB로 세척한다.
- 비오티닐화 MTs(단계 3.1)를 GTB에 전형적으로 희석된 MTs 20 μL를 삽입함으로써 b-BSA-아비딘 코팅된 커버슬립에 부착한다(단계 3.1). 슬라이드를 거꾸로 된 위치, 즉 커버슬립을 어두운 습도 챔버(예를 들어, 젖은 티슈 페이퍼를 함유하는 페트리 접시)에서 아래쪽을 향하게 하여 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 200 μL의 GTB로 세척한다.
- 30 μL의 운동성 반응 믹스(단계 1.3.2 참조)를 유동 챔버 내로 적용한다.
- Cin8-GFP 모터(단계 2.13)를 20 μL의 운동성 반응 믹스( 표 1 참조)에 희석한다(전형적으로 최종 농도가 5-10 μM까지). 유량실에 적용하고 MT를 따라 모터의 움직임을 즉시 이미지화하십시오.
- 모터 운동성 이미징
참고: MT 바인딩 및 모터의 운동성은 수은 아크 램프, 100x/1.4 수치 조리개 목표, 두 개의 형광 대역통과 필터 세트가 장착된 에피형광 반전 현미경을 사용하여 모니터링되었으며, 하나는 파장 647nm(로다민의 경우)이고 다른 하나는 파장 488nm(GFP의 경우)입니다.- 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 유동 챔버를 형광 현미경 스테이지 위에 놓고 커버슬립을 아래로 내려가 목표물을 향하게 합니다.
- 로다민 채널을 켜서 커버슬립 표면에 부착된 MT에 초점을 맞추고 Micro-Manager ImageJ-Fiji 소프트웨어(21)를 사용하여 20ms 노출로 이미지를 획득한다.
- GFP 채널을 켜고 Cin8-GFP 운동성을 분석하기 위해 1 s 간격 및 800 ms 노출로 90 타임랩스 이미지를 획득하십시오.
도 3: MT 및 MT 바운드 Cin8-GFP. (A) 단계 3.1에 설명된 프로토콜에 따라 중합된 MT에 대한 두 필드(왼쪽 및 오른쪽)로부터의 이미지, 및 단계 3.4에 설명된 바와 같이 100x 목표로 이미징된 이미지. (B) 상단 패널에 표시된 MT에 부착된 Cin8-GFP(아래쪽 패널, 화살표로 표시됨)에 대한 두 필드(왼쪽 및 오른쪽)의 이미지. 스케일 바: 4 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 운동성 분석
참고: 모든 이미지 분석을 수행하고 ImageJ-피지 소프트웨어를 사용하여 키모그래프를 생성합니다.
- 키모그래프 생성
- 타임랩스 동영상과 해당 MT 필드 이미지를 엽니다. 다음 옵션을 선택하여 이러한 두 창을 동기화합니다: > 도구 분석 > Windows 동기화.
- 세그먼트 선 옵션을 사용하여 하나의 MT를 강조 표시하고 다중 키모그래프 분석 탭을 사용>여 키모그래프를 가져옵니다.
- Cin8-GFP의 클러스터 크기 결정 (즉, 클러스터 내의 Cin8 분자의 수)
- 배경 빼기 및 배경 빼기 프로세스를 사용하여 고르지 않은 조명에 대한 보정 > 수행합니다. 롤링 볼 반경 을 100픽셀로 설정하고 슬라이딩 포물선 옵션을 확인합니다.
- ImageJ-Fiji 소프트웨어의 TrackMate 플러그인을 사용하여 반경 4픽셀 원 내에서 시간의 함수로 특정 비운동성 Cin8-GFP 모터(그림 3B)의 평균 형광 강도를 추적하> TrackMate > LoG 검출기 > 단순 랩 트래커> 플러그인을 선택합니다.
- 다른 Cin8-GFP 모터에 대해 4.2.2단계를 반복합니다. 서로 다른 Cin8-GFP 모터의 형광 강도를 시간의 함수로 플로팅합니다.
참고: 클러스터 크기-즉, 클러스터 내의 Cin8 분자의 수-관련 운동성의 분석을 위한 기초를 확립하는 클러스터 크기-관련 운동성을 측정하기 위한 실험 전략. Cin8에 부착된 GFP의 광표백은 Cin8 클러스터의 총 강도에 대한 단일 GFP 분자의 기여도를 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 형광 강도는 ~50개의 임의의 단위(a.u.)의 단계에서 감소하며, 모든 단일 단계는 아마도 하나의 GFP 분자의 광표백을 나타낼 것이다(도 4A). Cin8은 호모 사량체 운동 단백질이기 때문에 네 개의 GFP 분자를 포함합니다. 따라서, 200a.u.≤ 강도를 갖는 모든 Cin8 모터는 단일 사량체 Cin8 분자일 가능성이 높다. 이 방법에 따라, Cin8 모터 형광의 강도 범위는 단일 Cin8 분자, Cin8 분자 쌍 (Cin8 사량체의 이량체) 및 Cin8 올리고머에 대해 각각 <200, 200-400 및 >400으로 할당됩니다.
- Cin8-GFP 모터에 대한 강도 분포 분석
- 단계 4.2.2에 설명된 바와 같이 ImageJ-Fiji의 TrackMate 플러그인을 사용하여 타임랩스 시퀀스의 첫 번째 프레임에서 모든 형광 Cin8-GFP 모터의 평균 플로레센트 강도를 측정한다.
- 빈 크기가 20a.u.인 Cin8-GFP의 평균 강도의 히스토그램을 플로팅하고 히스토그램의 주요 피크를 가우시안 곡선에 맞춥니다(그림 4B).
참고: 강도 분포 분석은 광표백 실험에서 Cin8-GFP 모터에 대한 클러스터 크기 결정을 보완합니다. Cin8-GFP 집단에 대한 강도 분포 히스토그램에 맞는 가우시안 곡선은 ~125 a.u.에서 피크를 하는데, 이는 하나, 둘, 셋, 또는 네 개의 형광(표백되지 않은) GFP 분자를 포함하는 단일 사량체 Cin8 분자의 평균 강도와 일치하며, 각 형광 GFP 분자는 ~50 a.u.에 기여한다. 따라서, 이러한 강도 분포 방법을 사용하여, 하나의 GFP 분자의 기여도가 또한 계산될 수 있고, 이는 Cin8-GFP 분자의 클러스터 크기를 할당하는데 추가로 활용될 수 있다.
그림 4: Cin8-GFP 표백 프로파일 및 강도 분포. (A) 4개의 서로 다른 Cin8-GFP 모터에서 GFP의 광표백. 단일 광표백 단계는, 각각 하나의 GFP의 광표백을 나타낼 가능성이 높고, ~50 a.u.의 형광 강도의 감소를 야기한다. (B) 타임랩스 시퀀스(inset)의 첫 번째 프레임에서 Cin8-GFP 모터의 강도 분포. ~125 a.u에 중심을 둔 가우시안 피크(파란색)는 단일 Cin8-GFP 분자를 나타낸다. 이 피크는 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 형광 GFP 분자를 갖는 단일 Cin8 사량체의 평균 강도를 나타내며, 각 GFP 분자는 총 강도에 ~50 a.u.에 기여한다 (즉, (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- MT 트랙을 따라 Cin8-GFP 분자 운동성 추적
- 사각형 도구로 강조 표시한 다음 이미지를 잘라서 기록된 프레임의 타임랩스 시퀀스에서 분석할 MT를 자른 다음 자르기> 이미지를 선택합니다.
- 분석을 위해 형광 Cin8-GFP 입자를 선택하십시오. 포인트 툴 및 측정 옵션을 사용하여 타임랩스 시퀀스의 각 프레임(시점)에 파티클 좌표를 기록합니다. 타임랩스 시퀀스에서 다른 형광 입자에 대한 좌표의 유사한 기록을 수행한다.
- 단계 4.2에 설명된 바와 같이, 외관의 첫 번째 프레임에서 조사된 모든 Cin8-GFP 입자에 클러스터 크기를 할당한다.
- 평균 변위(MD) 및 평균 제곱 변위(MSD) 분석
- 단계 4.4에서 결정된 Cin8-GFP 이동의 좌표로부터, 주어진 좌표를 갖는 두 점 사이의 거리의 계산을 위한 방정식을 사용하여, 초기 좌표에 대하여 각 시점에서의 Cin8-GFP의 변위를 계산한다:
여기서, dt는 시간 t에서의 Cin8-GFP의 변위이고,xt 및yt는 시간 t에서의 각각의 좌표이다. x0 및 y0은 t=0에서의 Cin8-GFP의 각각의 좌표이다. - 이러한 변위 값으로부터 특정 Cin8-GFP 입자에 대한 모든 가능한 시간 간격에 대한 변위를 계산하십시오. 조사된 모든 Cin8-GFP 입자에 대해 이 과정을 반복한다.
- 모든 조사된 Cin8-GFP 입자의 평균 변위 (MD)를 시간 간격 대 선형 적합도, MD = vxt+c로 플롯한다. 이러한 적합치(v)의 기울기는 운동성 Cin8-GFP 입자의 평균 속도를 나타낸다.
참고: 이러한 방식으로, 각 클러스터 크기에 속하는 모든 Cin8-GFP 분자의 평균 속도는 상이한 클러스터 크기의 운동성을 특성화하여 개별적으로 계산될 수 있다. MD 분석 이외에도, 평균 제곱 변위(MSD) 분석은 또한 단계 4.5.1 및 4.5.2에서 계산된 변위 값을 제곱하여 수행될 수 있다. MSD 값은 시간 간격 대 플롯팅되고 다항식 곡선 MSD =v2 x t2 +2D x t + c에 적합하여, Cin8-GFP 이동의 확산 계수인 추가 파라미터 D를 제공한다. MD 분석은 극성 표시 MT 8,10에서 수행되어야 하는 반면, MSD 분석의 경우 MT 극성에 대한 지식이 필요하지 않습니다.
- 단계 4.4에서 결정된 Cin8-GFP 이동의 좌표로부터, 주어진 좌표를 갖는 두 점 사이의 거리의 계산을 위한 방정식을 사용하여, 초기 좌표에 대하여 각 시점에서의 Cin8-GFP의 변위를 계산한다:
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Representative Results
이 실험은 단일 MT에서 서로 다른 클러스터 크기의 양방향 모터 단백질 Cin8의 운동성 특성을 조사하는 것을 목표로합니다. Cin8-GFP의 대표적인 운동성은 시간에 따른 모터의 공간 위치가 표시된 그림 5A의 키모 그래프에서도 분명합니다.
Cin8-GFP의 모타일 특성의 분석을 위해, 먼저, 클러스터 크기가 각각의 MT 부착 모타일 Cin8-GFP 입자에 할당되고(단계 4.3), 이어서 조사된 Cin8 입자의 위치가 시간의 함수로서 추적된다(단계 4.4). 각 군집 크기 카테고리에 대해, 개별 Cin8-GFP의 >40개의 궤적이 기록으로부터 추출되었다(도 5B). 추적 분석으로부터 얻은 좌표를 사용하여, MD 및 MSD 분석은 각 클러스터 크기 모집단에 대해 개별적으로 수행된다. 속도는 그림 5C에 제시된 바와 같이 MD에 대한 선형 피팅으로부터 얻어진다. 단일 Cin8-GFP 분자는 단방향, 마이너스 말단 지향 방식으로 높은 속도로 움직이는 반면, Cin8 클러스터는 양방향 운동성에 대한 더 높은 성향으로 상당히 낮은 속도를 나타내는 것으로 나타났습니다 (그림 5B, C).
도 5: Cin8-GFP 운동성. (A) MT에서 Cin8-GFP 모터의 운동성을 나타내는 키모그래프. X축과 Y축은 각각 MT 격자와 시간을 나타냅니다. 노란색 화살표는 MT의 마이너스 끝 방향을 향한 단일 Cin8-GFP 입자의 빠른 운동성을 표시하는 반면, 파란색 화살표는 MT의 플러스 엔드 방향으로 Cin8 클러스터의 느린 운동성을 표시합니다. MT의 극성은 각 키모그래프(+/-)의 하단에 표시됩니다. 수평 막대: 4μm, 세로 막대: 20초(B) Cin8-GFP 모터의 단일 모터(왼쪽) 및 클러스터(오른쪽)의 변위 흔적. 변위 트레이스는 단계 4.4에서 설명된 대로 개별 Cin8-GFP 모터를 추적한 후 얻은 좌표를 사용하여 플롯팅되었습니다. 변위의 음수 및 양수 값은 각각 MT의 마이너스 엔드 및 플러스 엔드 방향에서의 움직임을 나타냅니다. 동일한 분석하에서, Cin8 클러스터의 운동성은 Cin8의 단일 분자에 비해 느리고 양방향이다. (C) 시간 간격의 함수로서 Cin8 모터의 단일 분자 (왼쪽) 및 클러스터 (오른쪽)의 SEM± 평균 변위 (MD)의 플롯. 검정선은 플롯의 선형 적합치를 나타냅니다(MD = v xt + c, 여기서 v는 평균 속도, t는 시간 간격, c는 절편을 나타냅니다). 피팅에서 Cin8의 단일 모터 및 클러스터의 평균 속도는 각각 -265 ± 20 nm / s 및 -48 ± 5 nm / s임을 알 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 양방향 키네신-5 Cin8을 사용한 단일 분자 운동성 분석 및 운동성 분석을 위한 프로토콜이 제시된다. C 말단에서 천연 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 전장Cin8(18 )은 천연 숙주 S. 세레비시아로부터 정제되었다. Cin8은 핵 운동 단백질이기 때문에 액체 질소 하에서 S. cerevisiae 세포를 분쇄하는 것이 세포 용해를위한 가장 효율적인 방법임이 밝혀졌습니다. 용해 후, 금속 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피를 조합함으로써, 고도로 순수한 Cin8이 얻어지며, 이는 단일 분자 운동성 검정에 중요하다. 조 추출물과 정제된 샘플8에서 Cin8의 운동성 특성 사이에 차이가 있다는 것이 이전에 보고되었다. 또한, 모터 및 비운동 단백질로 MT 밀집하는 것이 양방향 키네신-5 Cut722의 방향성에 영향을 미친다는 것도 보고되었다. 따라서, 야생형 및 돌연변이 운동 거동에 관한 신뢰할 수 있는 운동성 분석 및 결론을 위해 모터의 고순도가 요구된다. 여기에 기술된 기술은 적절한 완충액 조정으로 효모로부터 다른 핵 단백질을 정제하도록 쉽게 적응될 수 있다.
여기에 기재된 것은 GFP 태깅된 Cin8을 사용한 매우 강력하고 민감한 단일 분자 운동성 분석이다. 이 분석의 성공은 적절한 MT 중합 및 표면에 고정화에 크게 의존합니다. 강력한 아비딘-비오틴 상호작용은 MT를 소수성 유리 표면에 고정시키는 데 사용되며, MT는 돌이킬 수 없게 부착됩니다. GFP 표지된 Cin8을 사용하여 고정화된 MTs 상에서, Cin8 운동성은11,12,19를 신뢰성 있게 추적할 수 있다.
Cin8은 하나 이상의 사량체 모터10,12를 포함하는 클러스터를 형성하는 것으로 보고되며, 이들 클러스터의 운동성은 단일 Cin8 분자의 운동성과 상이하다. Cin8 운동성을 그 크기의 함수로서 정확하게 특성화하기 위해, 각 Cin8 입자(12)의 클러스터 크기를 확인하기 위해 형광 강도-기반 방법이 개발되었다. 이 크기 분류에 기초하여, 운동성은 각 크기 카테고리에서 개별적으로 분석된다. 이러한 크기 기반 분석에 이어서, 동일한 분자11,12,19의 올리고머의 상이한 거동을 이해하는데 이용될 수 있는 통찰력 있는 세부사항이 제공된다. 여기에 설명된 클러스터 크기 결정 절차는 다양한 형광 표지된 분자의 크기를 결정하기 위해 적용될 수 있다. 형광 기반 크기 결정을 수행하는 동안, 큰 클러스터가 광표백 후 더 작은 클러스터로 나타날 수 있기 때문에 표백의 영향을 피하기 위해 외관의 첫 번째 프레임에서 Cin8-GFP 입자의 클러스터 크기를 결정하도록주의해야합니다.
운동성 특성화는 MD 및/또는 MSD 분석에 의해 수행된다. 모터 속도만 결정하는 것이 중요하다면 MD 분석으로 충분합니다. 그러나 모터 운동성이 능동 및 수동 구성 요소를 모두 포함하고 확산 계수의 결정도 필요한 경우 MSD 분석20,23,24,25를 수행해야합니다. MD 및 MSD 분석의 경우 모든 시점에 대한 모터의 좌표를 결정해야 합니다. 효율적인 추적을 위해서는 모터 농도를 최적으로 유지하는 것이 중요합니다. MT는 모터로 너무 혼잡해서는 안됩니다. 이상적으로는 ~10μm의 MT에서 한 번에 3-4개의 Cin8-GFP 모터/파티클이 있어야 합니다. ImageJ-Fiji의 "KymoButler"또는 "TrackMate"플러그인과 같은 자동화 된 도구를 사용하여 모타일 모터(26,27)를 추적 할 수도 있습니다. 이러한 자동화 된 도구는 시간과 작업을 절약하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 일부 입자의 운동성이 매우 느린 경우, 이러한 도구는 비운동성 입자로 읽을 수 있습니다. 또한, 이러한 도구는 저강도 분자를 인식하는 데 한계가 있습니다. 따라서, 그들은 고강도 편향을 나타낼 수 있다. 반면에 수동 추적(시간이 많이 걸리지만)은 추적 오류에 덜 민감합니다.
요약하면, 이 프로토콜은, S. cerevisiae에서 과발현된 Cin8의 정제로부터 시작하여, 단일-분자 운동성 분석 및 이러한 양방향 키네신-5의 후속 운동성 분석을 포괄적으로 설명한다. 이 프로토콜은 Cin8과 같은 운동 단백질의 운동성을 정제하고 특성화하기 위해 쉽게 따를 수 있습니다. 더욱이, 프로토콜의 상이한 부분은 효모로부터 단백질을 정제하거나 상이한 운동 단백질 및 이들의 운동성 특성화에 대한 단일 분자 운동성 검정을 개발하도록 적응될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 L.G.에 수여 된 이스라엘 과학 재단 보조금 (ISF-386/18)과 이스라엘 이중 국가 과학 재단 보조금 (BSF-2019008)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | FORMEDIUM | DOC0230 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | Sigma | A8549 | |
| Casein | Sigma | C7078 | |
| Catalase (C40) | Sigma | C40 | |
| Creatine-Kinase | Sigma | C3755 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fluorescence filter set for GFP | Chroma | 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2) | |
| Fluorescence filter set for Rhodamine | Chroma | 49004: ET-CY3/TRITC | |
| Fluorescence inverted microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| Galactose | Tivan Biotech | GAL02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glucose Oxidase | Sigma | G7141 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GlycylGlycine | Merck | G0674 | |
| GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
| GTB | Cytoskeleton | BST01-010 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
| ImageJ-FIJI software | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10 | |
| Imidazole | Sigma | I0125 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Abcam | ab119211 | |
| Lens | Zeiss | 100x/1.4 oil DIC objective | |
| Lysine | FORMEDIUM | DOC0161 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| Methionine | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
| Neo | Andor Technologies | sCMOS camera | |
| NeutraAvidin | Life | A2666 | |
| Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | |
| Phospho-Creatine | Sigma | P1937 | |
| Pipes | Sigma | P1851 | |
| Pluronic acid F-127 (poloxamer) | Sigma | P2443 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Raffinose | Tivan Biotech | RAF01 | |
| Size Exclusion chromatography instument | GE Healthcare | AKTA Pure | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
| Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris | Roshe | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tryptophan | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin, biotinylated | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin, TRITC Rhodamine | Cytoskeleton | TL530M | |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | |
| Yeast nitrogen base | FORMEDIUM | CYN0401S | |
| α-GFP antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
References
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생화학 문제 180 키네신 Cin8 단일 분자 운동성 미세소관 양방향 운동성Erratum
Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham
