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Biochemistry

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Abstract

Les moteurs bipolaires mitotiques kinésine-5 remplissent des fonctions essentielles dans la dynamique de la broche. Ces moteurs présentent une structure homo-tétramérique avec deux paires de domaines moteurs catalytiques, situés aux extrémités opposées du complexe actif. Cette architecture unique permet aux moteurs kinésine-5 de se réticuler et de séparer les microtubules de broche antiparallèles (MT), fournissant ainsi la force dirigée vers l’extérieur qui sépare les pôles de broche. Auparavant, on croyait que les moteurs kinésine-5 étaient exclusivement dirigés vers des extrémités plus. Cependant, des études récentes ont révélé que plusieurs moteurs fongiques à kinésine 5 sont dirigés vers l’extrémité négative au niveau de la molécule unique et peuvent changer de directionnalité dans diverses conditions expérimentales. La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 est un exemple d’une telle protéine motrice bidirectionnelle: dans des conditions de force ionique élevée, des molécules uniques de Cin8 se déplacent dans la direction de l’extrémité négative des MT. Il a également été démontré que Cin8 forme des amas mobiles, principalement à l’extrémité inférieure des MT, et un tel regroupement permet à Cin8 de changer de directionnalité et de subir une motilité dirigée lente et plus- Cet article fournit un protocole détaillé pour toutes les étapes du travail avec la kinésine-5 Cin8 marquée GFP, de la surexpression des protéines dans les cellules de S. cerevisiae et de sa purification au test de motilité in vitro à molécule unique. Une méthode nouvellement développée décrite ici aide à différencier les molécules uniques et les amas de Cin8, en fonction de leur intensité de fluorescence. Cette méthode permet une analyse séparée de la motilité des molécules individuelles et des amas de Cin8, fournissant ainsi la caractérisation de la dépendance de la motilité de Cin8 sur sa taille de cluster.

Introduction

Un grand nombre d’événements de motilité dans les cellules eucaryotes sont médiés par la fonction des protéines motrices moléculaires. Ces moteurs se déplacent le long des filaments cytosquelettiques, des filaments d’actine et des microtubules (MT), et convertissent l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en forces cinétiques et mécaniques nécessaires pour conduire la motilité biologique dans les cellules. Le S. cerevisiae Cin8 à base de MT est une protéine motrice bipolaire homotétramérique de la kinésine-5 qui réticule et sépare les MT du fuseau1. Cin8 remplit des fonctions essentielles pendant la mitose, dans l’assemblage de la broche 2,3,4 et l’allongement de la broche pendant l’anaphase 5,6,7. Auparavant, il avait été démontré que Cin8 est un moteur bidirectionnel, qui commute la directionnalité dans différentes conditions expérimentales. Par exemple, dans des conditions de résistance ionique élevée, les moteurs Cin8 simples se déplacent vers l’extrémité inférieure des MT, tandis que dans les clusters, dans les essais de glissement MT multimoteurs et entre les MT antiparallèles, les moteurs Cin8 se déplacent principalement vers les extrémités plus des MT 8,9,10,11,12 . Ces résultats étaient très inattendus pour plusieurs raisons. Tout d’abord, Cin8 porte son domaine moteur catalytique à l’amino-terminus et de tels moteurs étaient auparavant considérés comme exclusivement dirigés vers l’extrémité plus, tandis que Cin8 s’est avéré être dirigé vers l’extrémité moins au niveau de la molécule unique. Deuxièmement, on croyait que les moteurs à kinésine étaient unidirectionnels, soit dirigés vers l’extrémité moins, soit vers l’extrémité plus, tandis que Cin8 s’est avéré bidirectionnel, selon les conditions expérimentales. Enfin, en raison de l’orientation MT au niveau de la broche mitotique, le rôle classique des moteurs kinésine-5 dans la séparation des pôles de broche lors de l’assemblage de la broche et de l’anaphase B ne pouvait s’expliquer que par leur motilité dirigée plus-end sur les MT qu’ils réticulent 1,13. À la suite des premiers rapports sur la bidirectionnalité de Cin8, il a été démontré que quelques autres moteurs de kinésine étaient bidirectionnels 14,15,16, ce qui indique que la motilité bidirectionnelle des moteurs de kinésine pourrait être plus courante qu’on ne le croyait auparavant.

Il a déjà été rapporté que dans les cellules, Cin8 se déplace également de manière bidirectionnelle8, soutenant l’idée que la motilité bidirectionnelle de certains moteurs kinésine-5 est importante pour leurs fonctions intracellulaires. De plus, étant donné que les trois moteurs à kinésine-5 qui ont été signalés comme étant bidirectionnels proviennent de cellules fongiques, un rôle possible pour la bidirectionnalité des moteurs à la kinésine-5 a récemment été proposé dans ces cellules10. Selon ce modèle, dans la mitose fermée des cellules fongiques, où l’enveloppe nucléaire ne se décompose pas pendant la mitose, les moteurs kinésine-5 fournissent la force initiale qui sépare les pôles de la broche avant l’assemblage de la broche. Pour effectuer cette tâche, avant la séparation des pôles de la broche, les moteurs à kinésine 5 se localisent près des pôles de la broche, par leur motilité dirigée à l’extrémité négative sur les MT nucléaires simples. Une fois à cette position, les moteurs kinésine-5 se regroupent, commutent la directionnalité, capturent et réticulent les MT des pôles de broche voisins. Par la suite, les moteurs kinésine-5 assurent la séparation initiale des pôles par motilité dirigée plus-end sur les MT qu’ils réticulent. Selon ce modèle, la motilité dirigée à l’extrémité moins sur les MT simples et la motilité dirigée à extrémité plus sur les MT réticulés lors du glissement antiparallèle sont nécessaires pour que les moteurs à kinésine 5 fongique remplissent leur rôle dans l’assemblage de la broche 1,13.

L’objectif global de la méthode décrite est d’obtenir de la kinésine-5 Cin8 fongique de haute pureté marquée GFP et d’effectuer des tests de motilité à molécule unique (Figure 1) tout en analysant séparément la motilité de molécules uniques et de grappes de Cin8. La séparation entre les molécules individuelles et les amas est importante car l’un des facteurs dont il a été démontré qu’il affectait la directionnalité de Cin8 est son accumulation en grappes sur les MT10,12. Les essais de motilité alternatifs, tels que les essais de glissement de surface MT et les essais de glissement MT, ne fournissent pas d’informations concernant l’activité des protéines motrices uniques17,18. Les méthodes robustes de dosage et d’analyse de la motilité à molécule unique décrites ici ont été appliquées avec succès pour caractériser différents aspects des moteurs kinésine-5, Cin8 et Kip1 10,11,12,14,19,20.

Ici, un protocole détaillé est présenté pour la surexpression et la purification de Cin8, la polymérisation des MT et le test de motilité à molécule unique. En outre, les analyses visant à différencier les molécules uniques et les amas de Cin8 et à déterminer les vitesses des moteurs et des grappes par l’analyse du déplacement moyen (MD) et du déplacement carré moyen (MSD) sont également décrites. Ce protocole vise à aider les chercheurs à visualiser toutes les étapes des procédures et à faciliter le dépannage de ce type de tests.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du test de motilité à molécule unique. Les MT fluorescents biotinylés sont fixés à la surface du verre, recouverts d’avidine qui interagit avec le BSA biotinylé attaché à la surface. La flèche verte représente la direction du mouvement des molécules uniques de Cin8 dans des conditions de force ionique élevée. +/- représentent la polarité du MT. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocol

1. Préparation des tampons et des réactifs

  1. Tampons
    1. -Leu aa dropout mix: Mélanger 2 g chacun d’adénine, d’uracile, de tryptophane, d’histidine, de lysine et de méthionine et conserver à température ambiante.
    2. Milieu sélectif de levure avec raffinose (1 L) : Mélanger 6,7 g de base d’azote de levure (avec du sulfate d’ammonium), 2 g de mélange de gouttes -Leu aa et 20 g de raffinose dans de l’eau double distillée en remuant (sans chauffage) jusqu’à dissolution complète. À l’aide d’un filtre de 0,22 μm, filtrer la solution dans une bouteille stérile.
    3. Tampon de lyse : Préparer 25 mL de solution dans de l’eau triple distillée (TDW) composée de 50 mM de Tris, 30 mM de tuyaux, 500 mM de KCl, 10 % de glycérol, 1,5 mM de β-mercaptoéthanol, 1 mM deMgCl2, 0,1 mM d’ATP et 0,1 % de Triton X-100. Ajuster le pH à 8 en utilisant 6 M HCl.
    4. Tampon d’élution : Préparer 10 mL de solution dans du TDW composé de 50 mM de Tris, 30 mM de tuyaux, 500 mM de KCl, 350 mM d’imidazole, 10 % de glycérol, 1,5 mM de β-mercaptoéthanol, 1 mMMgCl2, 0,1 mM d’ATP et 0,1 % de Triton X-100. Ajuster le pH à 7,2 à l’aide de 6 M HCl.
    5. Tampon P12 : Préparer 10 mL d’une solution dans du TDW composé de tuyaux de 12 mM, de 1 mM d’EGTA et de 2 mM de MgCl2. Ajuster le pH à 6,9 en utilisant 10 M NaOH.
    6. Tampon BRB80 : Préparer 50 mL d’une solution composée de tuyaux de 80 mM, de 1 mM d’EGTA et de 2 mM de MgCl2 dans de l’eau ultrapure. Ajuster le pH à 6,9 en utilisant 10 M NaOH.
    7. Tampon général de tubuline (GTB) : Préparer 50 mL d’une solution composée de tuyaux de 80 mM, de 0,5 mM d’EGTA et de 2 mM mgCl2 dans de l’eau ultrapure. Ajuster le pH à 6,9 en utilisant 10 M NaOH.
    8. Solution Tris-Pipes: Préparer 40 mL de 1M Tris-0.6 M Solution de tuyaux en mélangeant 6,055 g de Tris et 9,07 g de tuyaux dans TDW et ajuster le pH à 7,2 en utilisant 6 M HCl. Porter le volume final à 50 mL avec TDW.
      REMARQUE: Les tampons P12, BRB80 et Tris-Pipes sont utilisés pour la préparation de solutions mères pour le test de motilité. Ces tampons peuvent être préparés en grande quantité, aliquotes dans des tubes de 1,5 mL, surgelés et stockés à -20 °C.
  2. Solutions de stock pour le dosage de la motilité
    1. Tubuline (10 mg mL-1) : Dissoudre 1 mg de tubuline lyophilisée dans 100 μL de tampon général de tubuline (GTB) froid (4 °C). Congeler les aliquotes de 1 μL et les conserver à -80 °C.
    2. Tubuline biotinylée (1 mg mL-1) : Dissoudre 20 μg de tubuline lyophilisée dans 20 μL de GTB froid. Congeler les aliquotes de 1 μL et les conserver à -80 °C.
    3. Tubuline marquée rhodamine (1 mg mL-1) : Dissoudre 20 μg de tubuline lyophilisée dans 20 μL de GTB froid. Congeler les aliquotes de 0,5 μL et les conserver à -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM) : Le GMPCPP est obtenu du fournisseur sous forme de solution aqueuse de 100 μL et stocké à -80 °C. Décongeler le flacon avec du GMPCPP sur de la glace. Préparer des aliquotes de 1 μL, les congeler et les conserver à -80 °C.
    5. ATP : Préparer une solution de 500 μL de 100 mM d’ATP dans un tampon Tris de 0,5 M (pH 8). Congeler 2 μL aliquotes et les conserver à -20 °C.
    6. MgCl2 : Préparer 1 mL de solution de 200 mMMgCl2 dans un tampon P12. Conserver 5 μL aliquotes à -20 °C.
    7. Caséine : Préparer une solution de 1 mL de 5 mg de caséine mL-1 dans un tampon BRB 80. Congeler les aliquotes de 10 μL et les conserver à -20 °C.
    8. D-Glucose: Préparer une solution de 1 mL de 1 M D-glucose dans un tampon P12. Conserver les aliquotes de 10 μL à -20 °C.
    9. Glucose oxydase : Préparer une solution de 1 mL de 10 mg de glucose oxydase mL-1 dans un tampon P12. Congeler 2 μL aliquotes et les conserver à -20 °C.
    10. Catalase : Préparer une solution de 1 mL de 0,8 mg de catalase mL-1 dans un tampon P12. Congeler 2 μL aliquotes et conserver à -20 °C.
    11. Dithiothréitol (TNT) : Préparer une solution de 1 mL de 1 M de TNT dans un tampon P12 dans une hotte. Congeler les aliquotes de 10 μL et les conserver à -20 °C.
    12. Phosphate de créatine : Préparer une solution de 1 mL de phosphate de créatine de 1 M dans un tampon P12. Congeler 2 μL aliquotes et les conserver à -20 °C.
    13. Créatine phosphokinase : Préparer une solution de 1 mL de 5 mg de créatine phosphokinase mL-1 dans 0,25 M de glycylglycine, pH 7,4. Congeler 2 μL aliquotes et les conserver à -20 °C.
    14. EGTA: Préparez une solution EGTA de 100 mM dans de l’eau ultrapure et conservez-la à température ambiante.
    15. KCl : Préparez une solution de KCl de 1 M dans de l’eau ultrapure et conservez-la à température ambiante.
  3. Tampon de motilité et mélange de réactions
    1. Tampon de motilité (MB) avec 145 mM KCl, 2x stock: Préparer 1 mL de 2x stock du tampon de motilité en mélangeant 100 μL de solution préfabriquée tris-pipes, 20 μL de 100 mM EGTA, 290 μL de KCl et 590 μL de TDW. Gardez le tampon sur la glace.
    2. Mélange de réaction de motilité : Préparez le mélange de réaction de motilité conformément au tableau 1 et conservez-le sur de la glace.
Volume Stock Nom du réactif
50 μL 2X Mo (à partir de l’étape 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM ATP
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/mL Caséine
1 μL 1 M Glucose
1 μL 1 M TNT
1 μL 10 mg/mL Glucose oxydase
1 μL 8 mg/mL Catalase
1 μL 1 M Phosphocréatine
1 μL 5 mg/mL Créatine phosphokinase
100 μL Total

Tableau 1.

2. Surexpression de Cin8 et purification des cellules de S. cerevisiae

  1. Cultiver des cellules de S. cerevisiae contenant le plasmide pour la surexpression de Cin8-GFP-6En phase de croissance exponentielle (OD600 = 0,6-0,8) dans 1 L de milieu sélectif de levure complété par 2% de raffinose (voir étape 1.1.2) à 28 °C12.
  2. Induire la surexpression de Cin8-GFP-6His par addition de 2% de galactose. Surveillez la croissance de la culture de levure en mesurant l’absorbance à 600 nm.
  3. Cinq heures après l’addition de galactose, récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C, suspendre les cellules dans le tampon de lyse et les congeler dans un liquideN2.
    REMARQUE: Les cellules congelées peuvent être stockées à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou immédiatement broyées dans un liquide N2.
  4. Broyer les cellules congelées dans du liquide N2 à l’aide de mortier et de pilon réfrigérés. Ajouter le liquide N2 pendant le broyage pour garder les extraits congelés. Il nécessite généralement 4 à 5 fois l’ajout de liquide N2.
  5. Surveiller la lyse cellulaire par observation au microscope à contraste de phase ou au microscope DIC.
  6. Décongeler les cellules broyées et centrifuger à 21 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Chargez le surnageant sur une colonne d’écoulement gravitaire remplie de 2 mL de Ni-NTA et pré-équilibrée avec un tampon de lyse. Laissez le surnageant s’écouler à travers la colonne.
  7. Lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon de lyse, puis avec cinq volumes de colonne de tampon de lyse complétés par 25 mM d’imidazole.
  8. Elute Cin8-GFP-6His avec tampon d’élution (voir étape 1.1.4).
  9. Analyser les échantillons élués par fractionnement SDS-PAGE, suivi d’une coloration bleue de Coomassie et d’une analyse par transfert western sondée avec l’anticorps α-GFP19.
  10. Regrouper les fractions contenant Cin8-GFP-6His (étapes 2.8 et 2.9). En outre, purifiez-les par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) à un débit de 0,5 mL min-1 et une limite de pression de colonne de 1,5 MPa, avec surveillance simultanée de l’absorbance à 280 nm et de l’émission de floraison GFP avec excitation à 488 nm (Figure 2A).
  11. Collectez les fractions correspondant au tétramère Cin8-GFP et analysez-les par SDS-PAGE et Western blotting (voir étape 2.9) (Figure 2B).
  12. Estimer la concentration en protéines à l’aide de spectrophotométrie ou de tests biochimiques tels que le test de Bradford, le test BCA, etc.
  13. Aliquoter les fractions sélectionnées, congeler dans le liquide N2 et conserver jusqu’à utilisation à -80 °C. Ces échantillons de protéines purifiées peuvent être utilisés pendant 6 mois.
    REMARQUE: Cin8-GFP est surexprimé et purifié à partir d’une souche de S. cerevisiae déficiente en protéase contenant un plasmide de 2 μm pour la surexpression de Cin8-GFP-6His du promoteur inductible au galactose, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). La souche de levure et le plasmide sont disponibles sur demande.

Figure 2
Figure 2 : Purification de Cin8-GFP. (A) Le chromatogramme d’exclusion de taille de Cin8-GFP purifié ni-NTA, avec détection continue de fluorescence GFP par excitation et émission de 488 nm à ~510 nm. Le tétramère Cin8-GFP élue à environ 10 mL de la colonne SEC (marquée d’une flèche). (B) Gel SDS-PAGE coloré par Coomassie (en haut) et α-GFP western blot (en bas) de fractions Cin8-GFP éluées à partir de SEC. Les échantillons dans les voies sont les suivants: M - Marqueur de poids moléculaire, Ni2+- Échantillon de Cin8-GFP purifié Ni-NTA chargé dans la colonne SEC, Fractions GF: fraction correspondant à l’élution Cin8-GFP SEC comme indiqué dans le panneau A. La flèche à droite marque la taille du monomère Cin8-GFP (attendu sur la SDS-PAGE). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Test de motilité monomoléculaire avec le Cin8 purifié

  1. Polymérisation de MT marqués à la biotine et à la rhodamine, stabilisés avec gmPCPP.
    1. Commencez la polymérisation MT en mélangeant les composants suivants dans un tube de 1,5 mL : 1 μL de protéine de tubuline de 10 mg/mL, 1 μL de tubuline biotinylée de 1 mg/mL, 0,5 μL de tubuline marquée à la rhodamine de 1 mg/mL, 1 μL de 10 mM de GMPCPP et 6,5 μL de tampon général de tubuline (GTB). Incuber le mélange pendant 1 h à 37 °C.
    2. Après la polymérisation MT, ajouter 80 μL de GTB chaud (37 °C), mélanger soigneusement et centrifuger à 16 500 x g pendant 20 min.
    3. Jetez le surnageant et remettez-le soigneusement en suspension en pipetant de haut en bas avec 50 μL de GTB chaud. Conserver la suspension à 28 °C.
    4. Examinez les MT avec un microscope à fluorescence à l’aide du canal rhodamine de 647 nm (Figure 3A).
      REMARQUE: Pour obtenir des MT biotinylés marqués par fluorescence, la réaction de polymérisation contient de la tubuline non marquée, ainsi que de la tubuline biotinylée et marquée par fluorescence. Dans ce protocole, la tubuline marquée à la rhodamine est utilisée, mais d’autres conjugués fluorescents peuvent également être utilisés.
  2. Ensemble de la chambre d’écoulement
    1. Assemblez une chambre d’écoulement en plaçant quatre bandes de ruban adhésif double face (~4 cm x ~3 mm) sur une glissière de verre adhésif avancée (parallèle au bord le plus long et espacée d’environ 3-4 mm) pour créer trois « voies » entre les bandes de ruban adhésif. Retirez le papier protecteur des bandes de ruban adhésif et placez un couvercle silanisé10 sur les bandes de ruban adhésif pour créer trois chambres d’écoulement d’environ 10 μL de volume.
  3. Immobilisation MT sur la surface revêtue d’avidine (Figure 1)
    1. Enduire le couvercle silanisé en perfusant 15 μL d’albumine sérique bovine biotinylée de 1 mg/mL (b-BSA, dissous dans le GTB) dans la chambre d’écoulement à l’aide d’une micropipette. Après 5 min, laver la chambre avec 80 μL de GTB.
    2. Par la suite, comme à l’étape 3.3.1, insérer dans la chambre d’écoulement 15 μL d’Avidine 1 mg/mL (dissoute dans le GTB) qui se lie au b-BSA. Après 5 min, laver la chambre avec 80 μL de GTB.
    3. Passivate la surface de couverture silanisée en utilisant 20 μL de poloxamère à 1%. Après 3 min, laver avec 80 μL de GTB.
    4. Fixez des MT biotinylés (étape 3.1) à la couche de couverture revêtue de b-BSA-avidine en insérant 20 μL de MT généralement dilués à 1:20 dans le GTB. Incuber les glissières dans une position inversée, c’est-à-dire avec le couvercle orienté vers le bas dans une chambre d’humidité sombre (par exemple, une boîte de Petri contenant du papier de soie humide) pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez avec 200 μL de GTB.
    5. Appliquer 30 μL de mélange réactionnel de motilité (voir étape 1.3.2) dans la chambre d’écoulement.
    6. Diluer les moteurs Cin8-GFP (étape 2.13) dans 20 μL de mélange réactionnel de motilité (voir tableau 1) (généralement jusqu’à une concentration finale de 5 à 10 μM). Appliquez-les sur la chambre d’écoulement et imagez immédiatement le mouvement des moteurs le long des MT.
  4. Imagerie de la motilité motrice
    REMARQUE: La liaison MT et la motilité des moteurs ont été surveillées à l’aide d’un microscope inversé à épifluorescence équipé d’une lampe à arc au mercure, d’un objectif à ouverture numérique 100x / 1,4 et de deux ensembles de filtres passe-bande de fluorescence, l’un avec une longueur d’onde de 647 nm (pour la rhodamine) et l’autre avec une longueur d’onde de 488 nm (pour GFP).
    1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope. Placez la chambre d’écoulement sur l’étage du microscope fluorescent avec le couvercle vers le bas face à l’objectif.
    2. Activez le canal de rhodamine pour vous concentrer sur les MT attachés à la surface du couvercle et acquérir l’image avec une exposition de 20 ms à l’aide du logiciel Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Activez le canal GFP et acquérez 90 images time-lapse avec un intervalle de 1 s et une exposition de 800 ms, pour analyser la motilité Cin8-GFP.

Figure 3
Figure 3 : MT et MT liés à Cin8-GFP. (A) Images de deux champs (gauche et droite) pour les MT polymérisées selon le protocole décrit à l’étape 3.1 et imagées avec un objectif 100x comme décrit à l’étape 3.4. (B) Images de deux champs (gauche et droite) pour le Cin8-GFP (panneaux inférieurs, marqués de flèches) attachés au MT affichés dans les panneaux supérieurs. Barre d’échelle : 4 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Analyse de la motilité

REMARQUE: Effectuez toutes les analyses d’image et générez des kymographes à l’aide du logiciel ImageJ-Fiji.

  1. Génération de kymographe
    1. Ouvrez le film en accéléré et l’image de champ MT correspondante. Synchronisez ces deux fenêtres en choisissant l’option suivante : Analyser les outils > > Synchroniser les fenêtres.
    2. Mettez en surbrillance un MT à l’aide de l’option Ligne segmentée et utilisez l’onglet Analyser > Multi Kymograph pour obtenir un kymographe.
  2. Détermination de la taille du groupe de Cin8-GFP (c.-à-d. le nombre de molécules de Cin8 dans un groupe)
    1. Effectuez la soustraction d’arrière-plan et la correction de l’éclairage inégal à l’aide de l’option Processus > Soustraire l’arrière-plan . Réglez le rayon de la boule roulante à 100 pixels et cochez l’option Paraboloïde coulissant .
    2. Suivez l’intensité de fluorescence moyenne d’un moteur Cin8-GFP non mobile spécifique (Figure 3B) en fonction du temps dans un rayon de cercle de 4 pixels à l’aide du plugin TrackMate du logiciel ImageJ-Fiji en choisissant l’option suivante : Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Répétez l’étape 4.2.2 pour différents moteurs Cin8-GFP. Tracez l’intensité de fluorescence des différents moteurs Cin8-GFP en fonction du temps.
      NOTE : Une stratégie expérimentale pour mesurer la taille de la grappe, c’est-à-dire le nombre de molécules de Cin8 dans une grappe, établit une base pour l’analyse de la motilité liée au regroupement de Cin8. Le photoblanchiment de GFP attaché à Cin8 est utilisé pour déterminer la contribution de molécules GFP uniques à l’intensité totale des amas de Cin8. Par exemple, les intensités de fluorescence diminuent par paliers d’environ 50 unités arbitraires (u.a.), chaque étape représentant probablement le photoblanchiment d’une molécule de GFP (Figure 4A). Comme Cin8 est une protéine motrice homo-tétramérique, elle contient quatre molécules GFP. Ainsi, tous les moteurs Cin8 ayant une intensité ≤ 200 a.u. sont susceptibles d’être des molécules Cin8 tétramériques uniques. Selon cette méthode, les plages d’intensité de la fluorescence du moteur Cin8 sont assignées comme <200, 200-400 et >400 pour les molécules uniques de Cin8, les paires de molécules de Cin8 (dimère du tétramère de Cin8) et les oligomères de Cin8, respectivement12.
  3. Analyse de la distribution d’intensité pour les moteurs Cin8-GFP
    1. Mesurez l’intensité moyenne de la floraison de tous les moteurs fluorescents Cin8-GFP dans la première image de la séquence time-lapse à l’aide du plugin TrackMate dans ImageJ-Fiji comme décrit à l’étape 4.2.2.
    2. Tracer un histogramme des intensités moyennes de Cin8-GFP avec une taille de bac de 20 a.u. et ajuster le pic principal de l’histogramme à une courbe gaussienne (Figure 4B).
      REMARQUE: L’analyse de la distribution de l’intensité complète la détermination de la taille du cluster pour les moteurs Cin8-GFP à partir des expériences de photoblanchiment. La courbe gaussienne ajustée à l’histogramme de distribution d’intensité pour la population de Cin8-GFP culmine à ~125 a.u., ce qui est cohérent avec l’intensité moyenne des molécules de Cin8 tétramérique unique contenant une, deux, trois ou quatre molécules de GFP fluorescentes (non blanchies), chaque molécule de GFP fluorescente contribuant à ~50 a.u. Ainsi, en utilisant cette méthode de distribution de l’intensité, la contribution d’une molécule GFP peut également être calculée, qui peut être utilisée pour attribuer la taille du cluster des molécules Cin8-GFP.

Figure 4
Figure 4: Profil de blanchiment Cin8-GFP et distribution de l’intensité. (A) Photoblanchiment du GFP dans quatre moteurs Cin8-GFP différents. Des étapes uniques de photoblanchiment, chacune représentant probablement le photoblanchiment d’un GFP, entraînent une baisse de l’intensité de fluorescence d’environ 50 a.u. (B) La distribution de l’intensité des moteurs Cin8-GFP dans la première image d’une séquence time-lapse (encart). Le pic gaussien (bleu) centré à ~125 a.u représente des molécules uniques de Cin8-GFP. Ce pic présente l’intensité moyenne des tétramères Cin8 simples avec une, deux, trois ou quatre molécules GFP fluorescentes, chaque molécule GFP contribuant ~ 50 a.u. à l’intensité totale (c’est-à-dire (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Suivi de la motilité des molécules Cin8-GFP le long des pistes MT
    1. Recadrez la traduction automatique à analyser dans la séquence time-lapse des images enregistrées en la mettant en surbrillance à l’aide de l’outil Rectangle , puis en choisissant Image > Recadrage.
    2. Choisissez une particule fluorescente Cin8-GFP pour l’analyse. Enregistrez les coordonnées des particules dans chaque image (point temporel) de la séquence en accéléré à l’aide des options Outil Point et Mesure . Effectuer un enregistrement similaire des coordonnées d’autres particules fluorescentes dans la séquence time-lapse.
    3. Attribuez la taille du cluster à toutes les particules Cin8-GFP examinées dans la première image de leur apparition, comme décrit à l’étape 4.2.
  2. Analyses du déplacement moyen (DM) et du déplacement carré moyen (TMS)
    1. À partir des coordonnées des mouvements Cin8-GFP déterminées à l’étape 4.4, calculer les déplacements de Cin8-GFP à chaque point temporel par rapport aux coordonnées initiales, en utilisant l’équation pour le calcul de la distance entre deux points avec des coordonnées données:
      Equation 1
      où, dt est les déplacements de Cin8-GFP au temps t, xt et yt sont les coordonnées respectives au temps t. x0 et y0 sont les coordonnées respectives de Cin8-GFP à t = 0.
    2. Calculez à partir de ces valeurs de déplacement le déplacement pour tous les intervalles de temps possibles pour une particule Cin8-GFP spécifique. Répétez la procédure pour toutes les particules de Cin8-GFP examinées.
    3. Tracer le déplacement moyen (DM) de toutes les particules de Cin8-GFP examinées par rapport à l’intervalle de temps et sous réserve d’un ajustement linéaire, MD = v x t + c. La pente de cet ajustement (v) représente la vitesse moyenne des particules mobiles de Cin8-GFP.
      REMARQUE: De cette manière, la vitesse moyenne de toutes les molécules de Cin8-GFP appartenant à chaque taille de cluster peut être calculée séparément en caractérisant la motilité de différentes tailles de cluster. En plus de l’analyse MD, l’analyse du déplacement au carré moyen (MSD) peut également être effectuée en quadraturant les valeurs de déplacement calculées aux étapes 4.5.1 et 4.5.2. Les valeurs MSD sont tracées par rapport à l’intervalle de temps et ajustées à la courbe polynomiale MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, ce qui donne le paramètre supplémentaire D, qui est le coefficient de diffusion du mouvement Cin8-GFP. L’analyse MD doit être effectuée sur des MT marqués de polarité 8,10, alors que pour l’analyse MSD, la connaissance de la polarité MT n’est pas nécessaire.

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Representative Results

L’expérience vise à étudier les caractéristiques de motilité de la protéine motrice bidirectionnelle Cin8 de différentes tailles de grappes sur des MT uniques. La motilité représentative de Cin8-GFP est également évidente à partir des kymographes de la figure 5A, où la position spatiale du moteur au fil du temps est montrée.

Pour l’analyse des propriétés mobiles de Cin8-GFP, la taille du cluster est d’abord attribuée (étape 4.3) à chaque particule de Cin8-GFP mobile attachée à MT, puis la position des particules de Cin8 examinées est suivie en fonction du temps (étape 4.4). Pour chaque catégorie de taille de grappe, >40 trajectoires de Cin8-GFP individuelles ont été extraites des enregistrements (figure 5B). À l’aide des coordonnées obtenues à partir de l’analyse de suivi, l’analyse md et MSD est effectuée séparément pour chaque population de taille de grappe. Les vitesses sont obtenues à partir d’ajustements linéaires à MD comme présenté à la figure 5C. Il a été constaté que les molécules uniques de Cin8-GFP se déplacent de manière unidirectionnelle, dirigée vers l’extrémité négative avec une vitesse élevée, tandis que les amas de Cin8 présentent une vitesse considérablement plus faible avec une propension plus élevée à la motilité bidirectionnelle (Figure 5B, C).

Figure 5
Figure 5 : Motilité du Cin8-GFP. (A) Kymographes représentant la motilité des moteurs Cin8-GFP sur les MT. Les axes X et Y représentent respectivement le réseau MT et le temps. Les flèches jaunes marquent la motilité rapide des particules uniques de Cin8-GFP vers la direction de l’extrémité inférieure du MT, tandis que les flèches bleues marquent la motilité lente des amas de Cin8 dans la direction de l’extrémité supérieure du MT. La polarité des MT est indiquée au bas de chaque kymographe (+/-). Barre horizontale: 4 μm, barre verticale: 20 s. (B) Traces de déplacement de moteurs simples (à gauche) et de grappes (à droite) de moteurs Cin8-GFP. Les traces de déplacement ont été tracées à l’aide des coordonnées obtenues après le suivi des moteurs Cin8-GFP individuels, comme expliqué à l’étape 4.4. Les valeurs négatives et positives du déplacement indiquent un mouvement dans les directions moins et plus de la MT, respectivement. Notez que sous le même test, la motilité des amas de Cin8 est plus lente et bidirectionnelle par rapport aux molécules uniques de Cin8. (C) Tracés du déplacement moyen (DM) ± SEM, des molécules simples (à gauche) et des amas (à droite) des moteurs Cin8 en fonction de l’intervalle de temps. Les lignes noires représentent les ajustements linéaires du tracé (MD = v xt + c, où v est la vitesse moyenne, t est l’intervalle de temps et c représente l’interception). D’après le raccord, il est évident que la vitesse moyenne pour les moteurs simples et les groupes de Cin8 est de -265 ± 20 nm/s et -48 ± 5 nm/s, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce travail, un protocole pour le test de motilité à molécule unique avec la kinésine bidirectionnelle-5 Cin8 et l’analyse de motilité sont présentés. Le Cin818 pleine longueur, y compris le signal de localisation nucléaire natif (NLS) au terminal C, a été purifié à partir de l’hôte natif S. cerevisiae. Comme le Cin8 est une protéine du moteur nucléaire, le broyage des cellules de S. cerevisiae sous azote liquide s’avère être la méthode la plus efficace pour la lyse cellulaire. Après lyse, en combinant l’affinité métallique et la chromatographie d’exclusion de taille, on obtient du Cin8 très pur, ce qui est important pour les tests de motilité à molécule unique. Il a déjà été rapporté qu’il existe des différences entre les propriétés mobiles de Cin8 dans les extraits bruts et les échantillons purifiés8. En outre, il a également été rapporté que l’encombrement MT avec des protéines motrices et non motrices affecte la directionnalité de la kinésine bidirectionnelle-5 Cut722. Ainsi, une grande pureté du moteur est nécessaire pour une analyse fiable de la motilité et des conclusions concernant le comportement moteur de type sauvage et mutant. Les techniques décrites ici peuvent être facilement adaptées pour purifier d’autres protéines nucléaires de la levure avec des ajustements tampons appropriés.

Décrit ici est un test de motilité monomoléculaire très robuste et sensible avec Cin8 marqué GFP. Le succès de ce test repose en grande partie sur la polymérisation MT appropriée et l’immobilisation à la surface. La forte interaction avidine-biotine est utilisée pour immobiliser les MT à la surface du verre hydrophobe, qui fixe irréversiblement les MT. Sur ces MT immobilisés utilisant GFP étiqueté Cin8, la motilité Cin8 peut être suivie de manière fiable 11,12,19.

Cin8 formerait des amas contenant plus d’un moteur tétramérique10,12, la motilité de ces amas étant différente de celle des molécules uniques de Cin8. Pour caractériser avec précision la motilité de Cin8 en fonction de sa taille, une méthode basée sur l’intensité de fluorescence a été développée pour identifier la taille de l’amas de chaque particule de Cin812. Sur la base de cette catégorisation de taille, la motilité est analysée séparément dans chaque catégorie de taille. Suite à cette analyse basée sur la taille, des détails perspicaces sont fournis, qui peuvent être utilisés pour comprendre le comportement différent des oligomères de la même molécule 11,12,19. La procédure de détermination de la taille des grappes décrite ici peut être appliquée pour déterminer la taille d’une variété de molécules marquées par fluorescence. Lors de la détermination de la taille basée sur la fluorescence, il faut faire attention à déterminer la taille des grappes de particules de Cin8-GFP au premier cadre d’apparition pour éviter l’impact du blanchiment, car les grands amas pourraient apparaître comme plus petits après le photoblanchiment.

La caractérisation de la motilité est effectuée par les analyses MD et/ou MSD. S’il est intéressant de déterminer uniquement la vitesse du moteur, l’analyse MD est suffisante. Toutefois, si la motilité motrice contient à la fois des composants actifs et passifs et que la détermination du coefficient de diffusion est également nécessaire, l’analyse MSD doit être effectuée 20,23,24,25. Pour les analyses MD et MSD, les coordonnées du moteur pour chaque point temporel doivent être déterminées. Pour un suivi efficace, il est important de maintenir la concentration du moteur optimale. Les MT ne doivent pas être trop encombrés de moteurs; idéalement, il devrait y avoir 3-4 moteurs/particules Cin8-GFP à la fois sur un MT d’environ 10 μm. Des outils automatisés tels que le plugin « KymoButler » ou « TrackMate » dans ImageJ-Fiji peuvent également être utilisés pour suivre les moteurs mobiles26,27. Ces outils automatisés permettent d’économiser du temps et du travail, mais ils ont quelques limites. Par exemple, si la motilité de certaines particules est très lente, ces outils peuvent les lire comme des particules non mobiles. De plus, ces outils ont des limites dans la reconnaissance des molécules de faible intensité. Par conséquent, ils peuvent présenter un biais de haute intensité. D’autre part, le suivi manuel (bien que chronophage) est moins sensible aux erreurs de suivi.

En résumé, ce protocole, à partir de la purification de Cin8 surexprimé dans S. cerevisiae, explique de manière exhaustive le dosage de motilité monomoléculaire et l’analyse de motilité ultérieure de cette kinésine-5 bidirectionnelle. Ce protocole peut être suivi facilement pour purifier et caractériser la motilité des protéines motrices telles que Cin8. De plus, les différentes parties du protocole peuvent être adaptées pour purifier les protéines de la levure ou développer des tests de motilité à molécule unique pour différentes protéines motrices et leur caractérisation de motilité.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue en partie par la subvention de la Fondation israélienne pour la science (ISF-386/18) et la subvention de la Fondation binationale pour la science d’Israël (BSF-2019008), attribuée à L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

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References

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Tags

Biochimie numéro 180 kinésine Cin8 motilité monomoléculaire microtubule motilité bidirectionnelle

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

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Roy Avraham

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules <em>de S. cerevisiae</em>
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Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

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