طريقة تلطيخ مزدوج للكشف عن البكتين في التفاعل بين النبات والفطريات
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة مجهرية للكشف عن البكتين في التفاعل بين القهوة والفطريات.
Abstract
تستخدم الخلايا النباتية آليات هيكلية مختلفة ، إما تأسيسية أو مستحثة ، للدفاع عن نفسها من العدوى الفطرية. التغليف هو آلية فعالة للحث على عزل الهوستوريا الفطرية من بروتوبلاست الخلية النباتية. على العكس من ذلك ، فإن البكتين ، أحد المكونات البوليمرية لجدار الخلية ، هو هدف للعديد من الإنزيمات المحللة للبكتالوتيك في التفاعلات الضمورية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن البكتين والفطريات من خلال المجهر الضوئي. يتم التحقيق في التغليف الغني بالبكتين في خلايا أوراق القهوة المصابة بفطر الصدأ Hemileia vastatrix وتعديل جدار خلية mesophyll الناجم عن Cercospora coffeicola . تم إصلاح عينات الأوراق المصابة بمحلول كارنوفسكي ، وتجفيفها ، وتضمينها في ميثاكريليت الجليكول لمدة 2-4 أيام. اتبعت جميع الخطوات عن طريق الضخ الفراغي لإزالة الهواء في المساحات بين الخلايا وتحسين عملية التضمين. تم تقسيم الكتل المدمجة إلى أقسام بسماكة 5-7 ميكرومتر ، والتي تم ترسيبها على شريحة زجاجية مغطاة بالماء وتم تسخينها لاحقا عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، كانت الشرائح ملطخة مرتين ب 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول للكشف عن الفطريات و 0.05٪ من الروثينيوم الأحمر في الماء للكشف عن البكتين (المجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين). تم العثور على الهوستوريا الفطرية من Hemileia vastatrix مغلفة بالبكتين. في cercosporiosis القهوة ، أظهرت خلايا mesophyll ذوبان جدران الخلايا ، ولوحظ hyphae بين الخلايا و conidiophoress. الطريقة المعروضة هنا فعالة للكشف عن الاستجابة المرتبطة بالبكتين في التفاعل بين النبات والفطريات.
Introduction
آليات الدفاع عن جدار الخلية في النباتات ضرورية لكبح العدوى الفطرية. وقد أبلغت الدراسات عن تغيرات في سمك جدار الخلية وتكوينها منذ القرن التاسععشر 1,2. يمكن أن تحدث هذه التغييرات بواسطة مسببات الأمراض الفطرية التي تحفز تكوين حليمة ، والتي تمنع الفطريات من دخول الخلية أو يمكن استخدامها لتغليف الواصلة لعزل بروتوبلاست الخلية المضيفة من الهوستوريا الفطرية. يعد إنتاج حاجز جدار خلية ديناميكي (أي الحليمات و haustorium مغلف بالكامل) مهما لتعزيز مقاومة النبات3. وقد بحثت الدراسات النسيجية المرضية على الأمراض المرتبطة بالفطريات في حدوث هذه الآليات ووصفت بوليمرات جدار الخلية والسليلوز والهيميسيلولوز (أرابينوكسيلان) والكالوز كآليات مقاومة للهجوم الفطري4،5،6،7.
جدار الخلية هو الحاجز الأول ضد هجوم الكائنات الحية الدقيقة ، مما يضعف التفاعل بين النبات والفطريات. تشكل السكريات البكتيكية جدار الخلية وتمثل حوالي 30٪ من تكوين جدار الخلية في الخلايا الأولية لنباتات اليوديكوت التي يكون فيها الهوموجالاكتورونان البوليمر الأكثر وفرة (حوالي 60٪)8. يفرز Golgi مركبات البكتين المعقدة التي تشكل سلاسل حمض الجالاكتورونيك ، والتي قد تكون أو لا تكون ميثيلية 8,9. منذ عام 2012 ، أشارت الأدبيات إلى أن درجة استرجاع ميثيل البكتين أمر بالغ الأهمية لتحديد التوافق أثناء العدوى بالإنزيمات البكتية الميكروبية 10،11،12. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكولات للتحقق من وجود وتوزيع المركبات البكتيكية في النظم المرضية النباتية الفطرية.
تم استخدام تقنيات مختلفة للكشف عن تغليف الحليمات أو haustoria. الطرق المرجعية المستخدمة هي المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للأنسجة الثابتة والمجهر الضوئي للأنسجة الحية والثابتة. فيما يتعلق ب TEM ، أظهرت العديد من الدراسات الدور الهيكلي لتعيينات جدار الخلية في المقاومة الفطرية 13،14،15،16 ، وأن استخدام الليكتين والأجسام المضادة هو طريقة معقدة لتحديد موقع بوليمرات الكربوهيدرات 16. ومع ذلك ، تشير الدراسات إلى أن الفحص المجهري الضوئي هو نهج مهم وأن الأدوات الكيميائية النسيجية والكيميائية المناعية تسمح بفهم أفضل لتكوين الحليمات وتغليف الهوستوريوم 6,7.
تظهر الفطريات المسببة للأمراض نوعين رئيسيين من أنماط الحياة: التغذية الحيوية والميتة. تعتمد الفطريات الحيوية على الخلايا الحية لتغذيتها في حين أن الفطريات الميتة تقتل الخلايا المضيفة ، ثم تعيش في الأنسجة الميتة17. في أمريكا اللاتينية ، صدأ أوراق البن ، الناجم عن الفطريات Hemileia vastatrix ، هو مرض مهم في محاصيل البن18,19. يقدم Hemileia vastatrix سلوكا حيويا ، ومن بين التغيرات الهيكلية التي لوحظت في أنواع أو أصناف القهوة المقاومة ، تم الإبلاغ عن استجابة فرط الحساسية ، وترسب الكالوز والسليلوز واللجنين على جدران الخلايا ، وكذلك تضخم الخلايا14. على حد علم المؤلفين ، لا تقدم الأدبيات معلومات حول أهمية البكتين في مقاومة صدأ القهوة. من ناحية أخرى ، تستهدف الفطريات الميتة التي تسبب التهاب عنق الرحم البكتين عبر مجموعة من الإنزيمات المرتبطة بتدهور جدار الخلية ، مثل البكتيناز و polygalacturonase20. Cercosporiosis في البن ، الناجم عن الفطريات Cercospora coffeicola هو أيضا تهديد كبير لمحاصيل البن21,22. هذا الفطر يسبب آفات نخرية في كل من الأوراق والتوت. بعد الاختراق ، يستعمر C. coffeicola الأنسجة النباتية من خلال المسارات داخل الخلايا وبين الخلايا 23،24،25.
يبحث هذا البروتوكول في وجود هياكل فطرية وبكتين على جدران الخلايا. هذا البروتوكول مفيد لتحديد استجابة النبات المرتبطة بالبكتين (ملطخة بصبغة الروثينيوم الحمراء ، والتي هي خاصة بالمجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين) ، التي يسببها المضيف في تفاعل حيوي مع الفطريات. كما أنه يساعد على التحقق من تأثير الفطريات الميتة على تدهور جدران الخلايا البكتيكية. تشير النتائج الحالية إلى أن طريقة التلطيخ المزدوج فعالة في التمييز بين الهياكل والمرحلة التناسلية للفطريات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا العمل اختبارا نسيجيا كيميائيا بديلا مزدوج التلطيخ للتحقيق في تكوين البكتين لجدران الخلايا التي تغلف الهوستوريا في نظام مرضي حيوي. والهدف من ذلك أيضا هو إثبات فعالية الطريقة للكشف عن الفطريات الميتة وتغيرات جدار الخلية الناجمة عنها. هنا ، يمكن أن يغلف البكتين من جدران خلايا حمة ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور هدسون دبليو بي دي كارفالهو على الدعم لتطوير هذا العمل. كما أعرب المؤلفون عن امتنانهم لمختبر المجهر الإلكتروني “البروفيسور إليوت واتانابي كيتاجيما” لتوفيره مرفق الفحص المجهري الضوئي. يشكر المؤلفون الدكتور فلافيا رودريغز ألفيس باتريسيو على تزويد المواد النباتية بالآفات.
Materials
| Blades DB80 HS | Leica | 14035838383 | Sectioning |
| Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | Fixation |
| Cotton Blue Lactophenol | Metaquímica | 70SOLSIG024629 | Staining |
| Formaldehyde | EMS | #15712 | Fixation |
| Glutaraldehyde | EMS | #16216 | Fixation |
| Historesin Kit | Technovit /EMS | #14653 | Historesin for embedding |
| Hot plate | Dubesser | SSCD25X30-110V | Staining |
| Microscopy | Zeiss | #490040-0030-000 | Image capture |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
| Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
| Ruthenium red | LABHouse | #006004 | Staining |
| Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | Image capture |
| Vaccum pump | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | Fixation |
References
- deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
- Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
- Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
- Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
- Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
- Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
- Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
- Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
- Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).
- Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
- Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
- Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
- Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
- Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
- An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
- Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
- Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
- Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
- Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
- Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
- Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
- Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).
- Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
- Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
- Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).
- Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).
- Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
- Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
- Hayat, M. A. . Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).
- Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).
- Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
- Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. . Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).
- Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
- Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
- Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).
- Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
- Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
- Chamberlain, C. J. . Methods in Plant Histology. , 349 (1932).
- Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
- Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
- Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. Cell Wall. Plant Physiology. , 165-181 (2013).
