JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie

Published: February 04, 2022
doi:
10.3791/63432
,
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences,University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture,University of São Paulo

Summary

Dit protocol beschrijft een microscopische methode om pectine te detecteren in koffie-schimmel interactie.

Abstract

Plantencellen gebruiken verschillende structurele mechanismen, constitutief of inducerend, om zichzelf te verdedigen tegen schimmelinfecties. Inkapseling is een efficiënt induceerbaar mechanisme om de schimmel haustoria te isoleren van de protoplast van de plantencel. Omgekeerd is pectine, een van de polymere componenten van de celwand, een doelwit van verschillende pectolytische enzymen in necrotrofe interacties. Hier wordt een protocol gepresenteerd om pectine en schimmeldraden te detecteren door middel van optische microscopie. De pectinerijke inkapseling in de cellen van koffiebladeren die zijn geïnfecteerd door de roestschimmel Hemileia vastatrix en de mesofylcelwandmodificatie geïnduceerd door Cercospora coffeicola worden onderzocht. Laesiebladmonsters werden gefixeerd met de Karnovsky-oplossing, gedehydrateerd en ingebed in glycolmethacrylaat gedurende 2-4 dagen. Alle stappen werden gevolgd door vacuümpompen om lucht in de intercellulaire ruimtes te verwijderen en het inbeddingsproces te verbeteren. De ingebedde blokken werden verdeeld in 5-7 μm dikke secties, die werden afgezet op een glazen glijbaan bedekt met water en vervolgens verwarmd bij 40 °C gedurende 30 minuten. Vervolgens werden de dia’s dubbel gekleurd met 5% katoenblauw in lactofenol om de schimmel te detecteren en 0,05% rutheniumrood in water om pectine (zure groepen polyuronzuren van pectine) te detecteren. Schimmel haustoria van Hemileia vastatrix bleken te zijn ingekapseld door pectine. Bij koffie cercosporiose vertoonden mesofylcellen oplossing van celwanden en werden intercellulaire schimmeldraden en conidioforen waargenomen. De hier gepresenteerde methode is effectief om een pectine-geassocieerde respons in de interactie tussen plant en schimmel te detecteren.

Introduction

Celwandafweermechanismen in planten zijn cruciaal om schimmelinfecties te beperken. Studies hebben veranderingen in celwanddikte en samenstelling gemeld sinds de19e eeuw 1,2. Deze veranderingen kunnen worden geïnduceerd door een schimmelpathogeen dat de vorming van een papilla stimuleert, waardoor schimmels de cel niet binnendringen of kunnen worden gebruikt om de schimmeldraden in te kapselen om de protoplast van de gastheercel te isoleren van de schimmelhaustoria. De productie van een dynamische celwandbarrière (d.w.z. papillen en een volledig ingekapseld haustorium) is belangrijk om de resistentie van planten te bevorderen3. Histopathologische studies op schimmelgerelateerde ziekten hebben het optreden van deze mechanismen onderzocht en hebben de celwandpolymeren, cellulose, hemicellulose (arabinoxylanen) en callose beschreven als resistentiemechanismen tegen schimmelaantasting 4,5,6,7.

De celwand is de eerste barrière tegen micro-organismen, waardoor de interactie tussen plant en schimmel wordt aangetast. Pectische polysacchariden vormen de celwand en zijn goed voor ongeveer 30% van de celwandsamenstelling in primaire cellen van eudicotplanten waarin homogalacturonanen het meest voorkomende polymeer zijn (ongeveer 60%)8. De Golgi scheidt complexe pectineverbindingen af waaruit de galacturonzuurketens bestaan, die al dan niet gemethyleerd kunnen worden 8,9. Sinds 2012 heeft de literatuur erop gewezen dat de mate van pectinemethylverestering van cruciaal belang is voor het bepalen van de compatibiliteit tijdens infectie door microbiële pectische enzymen 10,11,12. Er zijn dus protocollen nodig om de aanwezigheid en distributie van pectische verbindingen in plantschimmelpathosystemen te verifiëren.

Verschillende technieken zijn gebruikt om de inkapseling van papillen of haustoria te detecteren. De gebruikte referentiemethoden zijn transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van vast weefsel en lichtmicroscopie van levende en vaste weefsels. Met betrekking tot TEM hebben verschillende studies de structurele rol van celwandacposities in schimmelresistentieaangetoond 13,14,15,16, en dat het gebruik van lectines en antilichamen een ingewikkelde methode is om koolhydraatpolymeren te lokaliseren16. Studies tonen echter aan dat lichtmicroscopie een belangrijke benadering is en dat de histochemische en immunohistochemische hulpmiddelen een beter begrip van de samenstelling van papillen en haustorium-omhullingmogelijk maken 6,7.

Pathogene schimmels vertonen twee hoofdtypen levensstijlen: biotrofisch en necrotroof. Biotrofe schimmels zijn afhankelijk van levende cellen voor hun voeding, terwijl necrotrofe schimmels de gastheercellen doden en vervolgens in de dode weefsels leven17. In Latijns-Amerika is koffiebladroest, veroorzaakt door de schimmel Hemileia vastatrix, een belangrijke ziekte in koffiegewassen18,19. Hemileia vastatrix vertoont een biotroof gedrag en, onder de structurele veranderingen waargenomen bij resistente koffiesoorten of cultivars, een overgevoeligheidsrespons, afzetting van callose, cellulose en lignine op de celwanden, evenals celhypertrofie14 zijn gemeld. Voor zover de auteurs weten, rapporteert de literatuur geen informatie over het belang van pectine in koffieroestbestendigheid. Aan de andere kant richten necrotrofe schimmels die cercosporiose veroorzaken zich op pectine via een reeks enzymen die geassocieerd zijn met celwandafbraak, zoals pectinasen en polygalacturonase20. Cercosporiose in koffie, veroorzaakt door de schimmel Cercospora coffeicola is ook een grote bedreiging voor koffiegewassen21,22. Deze schimmel veroorzaakt necrotische laesies in zowel bladeren als bessen. Na penetratie koloniseert C. coffeicola plantenweefsels via intracellulaire en intercellulaire routes 23,24,25.

Het huidige protocol onderzoekt de aanwezigheid van schimmelstructuren en pectine op celwanden. Dit protocol is nuttig om de plantrespons geassocieerd met pectine (gekleurd met rutheniumrode kleurstof, die specifiek is voor zure groepen polyuronzuren van pectine), geïnduceerd door de gastheer in een biotrofe interactie met schimmel te identificeren. Het helpt ook om het effect van necrotrofe schimmels op de afbraak van pectische celwanden te verifiëren. De huidige resultaten geven aan dat de dubbele kleuringsmethode effectief is om structuren en de voortplantingsfase van schimmels te onderscheiden.

Protocol

1. Bereiding van de bufferoplossing en reagentia Bereid 2 M cacodylaatbuffer door 4,28 g natriumcacodylaat toe te voegen aan 100 ml gedestilleerd water en stel de pH in op 7,25 met 0,2 N HCl. Bereid 100 ml van de Karnovsky-fixatieoplossing door 10 ml 25% waterig glutaaraldehyde, 10 ml 10% waterig formaldehyde, 25 ml 2 m cacodylaatbuffer en 0,5 ml 0,5 m CaCl2 26 te mengen. Vul het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water.OPMERKING: De oplossi…

Representative Results

De katoenblauwe lactofenolkleuring op de GMA-ingebedde sectie onthulde de aanwezigheid van verschillende schimmelstructuren tussen en in koffie mesofylcellen in zowel biotrofe als necrotrofe schimmelinteracties. In het biotrofe pathosysteem verschijnen, wanneer gekleurd met behulp van de dubbele kleuringsmethode, Hemileia vastatrix-schimmeldraden met celwanden en het dichte protoplastgehalte in donkerblauw in zowel sponsachtig als palissadeparenchym (figuur 4A</st…

Discussion

Het huidige werk introduceert een alternatieve dubbelkleuring histochemische test om de pectinesamenstelling van celwanden te onderzoeken die haustoria inkapselt in een biotroof pathosysteem. Het doel is ook om de effectiviteit aan te tonen van de methode om necrotrofe schimmels en celwandveranderingen te detecteren die hierdoor worden veroorzaakt. Hier kan pectine van koffieparenchymcelwanden zowel de nek als het haustorium van de roestschimmel Hemileia vastatrix inkapselen. Silva et al. hebben ook inkapseling …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Dr. Hudson W.P. de Carvalho bedanken voor de steun om dit werk te ontwikkelen. De auteurs zijn ook het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie ”Prof. Elliot Watanabe Kitajima” dankbaar voor het leveren van de lichtmicroscopiefaciliteit. De auteurs bedanken Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício voor het leveren van laesies aan het plantmateriaal.

Materials

Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. . Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. . Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. . Methods in Plant Histology. , 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. Cell Wall. Plant Physiology. , 165-181 (2013).

Tags

Double-stainingPectinPlant-fungus InteractionHistopathological StudiesCoffee RustCercosporiosisKarnovsky FixativeCacodylate BufferGlycol MethacrylatePolymerization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image