Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.
Bitki hücreleri, kendilerini mantar enfeksiyonundan korumak için kurucu veya indüklenebilir farklı yapısal mekanizmalar kullanırlar. Enkapsülasyon, mantar haustoriasını bitki hücresi protoplastından izole etmek için etkili bir indüklenebilir mekanizmadır. Tersine, hücre duvarının polimerik bileşenlerinden biri olan pektin, nekrotrofik etkileşimlerde birkaç pektolitik enzimin hedefidir. Burada, optik mikroskopi yoluyla pektin ve mantar hiflerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Pas mantarı Hemileia vastatrix ile enfekte olmuş kahve yapraklarının hücrelerinde pektin bakımından zengin kapsüllenme ve Cercospora coffeicola tarafından indüklenen mezofil hücre duvarı modifikasyonu araştırılmıştır. Lezyonlu yaprak örnekleri Karnovsky çözeltisi ile sabitlendi, dehidre edildi ve 2-4 gün boyunca glikol metakrilat içine gömüldü. Tüm adımları, hücreler arası boşluklardaki havayı uzaklaştırmak ve gömme işlemini iyileştirmek için vakum pompalama izledi. Gömülü bloklar, suyla kaplı bir cam slayt üzerinde biriktirilen ve daha sonra 30 dakika boyunca 40 ° C’de ısıtılan 5-7 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı. Daha sonra, slaytlar mantarı tespit etmek için laktofenolde% 5 pamuk mavisi ve pektini (pektinin poliüronik asitlerinin asidik grupları) tespit etmek için suda% 0.05 rutenyum kırmızısı ile çift boyandı. Hemileia vastatrix’in fungal haustoria’sının pektin tarafından kapsüllendiği bulundu. Kahve cercosporiosis’te mezofil hücrelerinde hücre duvarlarında çözünme görüldü ve hücreler arası hifa ve konidioforlar gözlendi. Burada sunulan yöntem, bitki-mantar etkileşiminde pektin ile ilişkili bir yanıtı tespit etmek için etkilidir.
Bitkilerde hücre duvarı savunma mekanizmaları mantar enfeksiyonunu engellemek için çok önemlidir. Çalışmalar, 19.yüzyıldan bu yana hücre duvar kalınlığı ve bileşimindeki değişiklikleri bildirmiştir 1,2. Bu değişiklikler, mantarların hücreye girmesini önleyen bir papilla oluşumunu uyaran bir mantar patojeni tarafından indüklenebilir veya konakçı hücre protoplastını mantar haustoriasından izole etmek için hifleri kapsüllemek için kullanılabilir. Dinamik bir hücre duvarı bariyerinin (yani, papillalar ve tamamen kaplanmış bir haustorium) üretimi, bitki direncini arttırmak için önemlidir3. Mantarla ilişkili hastalıklar üzerine yapılan histopatolojik çalışmalar bu mekanizmaların oluşumunu araştırmış ve hücre duvarı polimerleri, selüloz, hemiselüloz (arabinoksilans) ve kalozu mantar atağına direnç mekanizmaları olarak tanımlamıştır 4,5,6,7.
Hücre duvarı, mikroorganizma saldırısına karşı ilk bariyerdir ve bitki-mantar etkileşimini bozar. Pektik polisakkaritler hücre duvarını oluşturur ve homogalakturonanların en bol polimer (kabaca% 60) olduğu ödikot bitkilerinin birincil hücrelerinde hücre duvarı bileşiminin yaklaşık% 30’unu oluşturur8. Golgi, metillenmiş veya metillenemeyen galakturonik asit zincirlerini oluşturan kompleks pektin bileşiklerini salgılar 8,9. 2012 yılından bu yana, literatür, pektin metil esterifikasyon derecesinin, mikrobiyal pektik enzimler10,11,12 tarafından enfeksiyon sırasında uyumluluğu belirlemek için kritik öneme sahip olduğuna dikkat çekmiştir. Bu nedenle, bitki-mantar patosistemlerinde pektik bileşiklerin varlığını ve dağılımını doğrulamak için protokoller gereklidir.
Papilla veya haustoria’nın kapsüllenmesini tespit etmek için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Kullanılan referans yöntemleri sabit dokunun transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve canlı ve sabit dokuların ışık mikroskobudur. TEM ile ilgili olarak, çeşitli çalışmalar mantar direncinde hücre duvarı appozisyonlarının yapısal rolünü göstermiştir 13,14,15,16 ve lektinlerin ve antikorların kullanımının karbonhidrat polimerlerini bulmak için karmaşık bir yöntem olduğunu göstermiştir 16. Bununla birlikte, çalışmalar ışık mikroskobunun önemli bir yaklaşım olduğunu ve histokimyasal ve immünohistokimyasal araçların papilla ve haustorium encasement 6,7’nin bileşiminin daha iyi anlaşılmasını sağladığını göstermektedir.
Patojenik mantarlar iki ana yaşam tarzı türü gösterir: biyotrofik ve nekrotrofik. Biyotrofik mantarlar beslenmeleri için canlı hücrelere bağımlıyken, nekrotrofik mantarlar konakçı hücreleri öldürür ve daha sonra ölü dokularda yaşar17. Latin Amerika’da, Hemileia vastatrix mantarının neden olduğu kahve yaprağı pası, kahve bitkilerinde önemli bir hastalıktır18,19. Hemileia vastatrix biyotrofik bir davranış sergiler ve dirençli kahve türlerinde veya çeşitlerinde gözlenen yapısal değişiklikler arasında aşırı duyarlılık yanıtı, hücre duvarlarında kalloz, selüloz ve lignin birikimi ve hücre hipertrofisi14 bildirilmiştir. Yazarların bilgisine göre, literatür pektinin kahve pas direncindeki önemi hakkında bilgi vermemektedir. Öte yandan, cercosporiosise neden olan nekrotrofik mantarlar, pektinazlar ve poligalakturonaz20 gibi hücre duvarı bozulması ile ilişkili bir dizi enzim yoluyla pektin’i hedef alır. Cercospora coffeicola mantarının neden olduğu kahvedeki cercosporiosis de kahve bitkileri için büyük bir tehdittir21,22. Bu mantar hem yapraklarda hem de meyvelerde nekrotik lezyonlara neden olur. Penetrasyondan sonra, C. coffeicola bitki dokularını hücre içi ve hücreler arası yollar23,24,25 yoluyla kolonize eder.
Mevcut protokol, hücre duvarlarında mantar yapılarının ve pektinin varlığını araştırmaktadır. Bu protokol, konakçı tarafından mantar ile biyotrofik bir etkileşimde indüklenen pektin (pektinin poliüronik asitlerinin asidik gruplarına özgü rutenyum kırmızı boya ile boyanmış) ile ilişkili bitki tepkisini tanımlamak için yararlıdır. Ayrıca nekrotrofik mantarların pektik hücre duvarlarının bozulması üzerindeki etkisini doğrulamaya yardımcı olur. Mevcut sonuçlar, çift boyama yönteminin yapıları ve mantarların üreme evresini ayırt etmede etkili olduğunu göstermektedir.
Bu çalışma, biyotrofik bir patosistemde haustoriayı kapsülleyen hücre duvarlarının pektin bileşimini araştırmak için alternatif bir çift boyama histokimyasal testi sunmaktadır. Amaç ayrıca, nekrotrofik mantarı ve bunun neden olduğu hücre duvarı değişikliklerini tespit etmek için yöntemin etkinliğini göstermektir. Burada, kahve parankimi hücre duvarlarının pektini, pas mantarı Hemileia vastatrix’in hem boynunu hem de haustoriumunu kapsayabilir. Silva ve ark. ayrıca kahve-H. vast…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bu çalışmanın geliştirilmesine verdiği destek için Dr. Hudson W. P. de Carvalho’ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca ışık mikroskobu tesisini sağladığı için Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ”Prof. Elliot Watanabe Kitajima” ya minnettardır. Yazarlar, bitki materyaline lezyonlar sağladığı için Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício’ya teşekkür eder.
Blades DB80 HS | Leica | 14035838383 | Sectioning |
Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | Fixation |
Cotton Blue Lactophenol | Metaquímica | 70SOLSIG024629 | Staining |
Formaldehyde | EMS | #15712 | Fixation |
Glutaraldehyde | EMS | #16216 | Fixation |
Historesin Kit | Technovit /EMS | #14653 | Historesin for embedding |
Hot plate | Dubesser | SSCD25X30-110V | Staining |
Microscopy | Zeiss | #490040-0030-000 | Image capture |
Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
Ruthenium red | LABHouse | #006004 | Staining |
Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | Image capture |
Vaccum pump | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | Fixation |