Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna , deniz kaya havuzlarından izole edilmiş filamentli bir siyanobakteridir. Bu makalede filamentlerin doğal kaynaklardan izolasyonu, DNA ekstraksiyonu, genom dizilimi, doğal transformasyon, sfGFP ekspresyonu, kriyokonservasyon ve motiliteye yöntemleri anlatılmaktadır.

Abstract

Siyanobakteriler, güneş enerjisinin biyokütle üretimi için kullanıldığı temel araştırma ve biyoteknolojik projelerin odak noktasıdır. Phormidium lacuna, yeni izole edilmiş bir filamentli siyanobakteridir. Bu makalede, yeni filamentli siyanobakterilerin deniz kaya havuzlarından nasıl izole edilebileceği açıklanmaktadır. Ayrıca DNA'nın filamentlerden nasıl çıkarılabileceğini ve genomların nasıl sıralanabileceğini de açıklar. Birçok tek hücreli tür için transformasyon kurulmuş olmasına rağmen, filamentli siyanobakteriler için daha az sıklıkla bildirilmektedir. P. lacuna'nın doğal dönüşümü için basitleştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. P. lacuna, doğal dönüşümün kurulduğu Oscillatoriales düzeninin tek üyesidir. Bu makale aynı zamanda süper klasör yeşil floresan proteinini (sfGFP) eksprese etmek için doğal dönüşümün nasıl kullanıldığını göstermektedir. Endojen bir cpcB promotörü, Synechocystis sp. PCC6803'ten cpc560, A2813 veya psbA2 promotörlerinden yaklaşık 5 kat daha güçlü ekspresyonu indükledi. Ayrıca, P. lacuna ve Synechocystis sp.CPP 6803'ün kriyoprezervasyonu için bir yöntem oluşturulmuş ve sıvı bir ortamda ve agar ve plastik yüzeylerde hareketliliği değerlendirmek için yöntemler tanımlanmıştır.

Introduction

Siyanobakteriler, fotosentezi bir enerji kaynağı olarak kullanan prokaryotik organizmalardır 1,2. Araştırmalar giderek siyanobakteriyel türlere odaklanmaktadır. Birkaç siyanobakteri DNA3 ile dönüştürülebilir. Genler bu türlerde nakavt edilebilir veya aşırı eksprese edilebilir. Bununla birlikte, dönüşüm birkaç türle sınırlıdır 4,5,6,7,8,9,10,11 ve kültür koleksiyonlarından veya vahşi 8'den gelen suşlarda dönüşüm sağlamak zor olabilir. Filamentli Phormidium lacuna türlerinin suşları (Şekil 1), tuz konsantrasyonları veya sıcaklık gibi çevresel koşulların zamanla dalgalandığı deniz kaya havuzlarından izole edilmiştir. Bu filamentli siyanobakteriler, ait oldukları Oscillatoriales12 sırası için model organizmalar olarak kullanılabilir.

Elektroporasyon ile gen transferini test eden denemeler sırasında 13,14 P. lacuna'nın doğal dönüşüm ile dönüştürülebileceği bulunmuştur 15. Bu süreçte, DNA bazı hücreler tarafından doğal olarak alınır. Diğer dönüşüm yöntemleriyle karşılaştırıldığında16,17, doğal dönüşüm, prosedürü karmaşıklaştırabilecek ek araçlara ihtiyaç duymama avantajına sahiptir. Örneğin, elektroporasyon uygun küvetler, sağlam teller ve uygun voltajın seçilmesini gerektirir. P. lacuna şu anda doğal dönüşüme duyarlı tek Oscillatoriales üyesidir. Orijinal protokol elektroporasyon protokollerine dayandığından, yine de gereksiz olabilecek birkaç yıkama adımı içeriyordu. Protokolü basitleştirmek için farklı yaklaşımlar test edildi ve burada sunulan dönüşüm protokolüne yol açtı.

Genom dizisi, gen nakavtına veya aşırı ekspresyonuna dayanan daha ileri moleküler çalışmalar için gereklidir. Genom dizileri yeni nesil dizileme makineleri ile kısa süreler içinde elde edilebilse de, DNA'nın çıkarılması zor olabilir ve türlere bağlıdır. P. lacuna ile çeşitli protokoller test edildi. Modifiye edilmiş bir setil trimetil amonyum bromür (CTAB) bazlı yöntem oluşturuldu ve bu da DNA'nın kabul edilebilir saflığı ve laboratuvarda devam eden çalışmalar için her saflaştırma döngüsünün DNA verimi ile sonuçlandı. Beş suşun genomu bu protokolle dizilenebilir. Bir sonraki mantıksal dönüşüm adımı, P. lacuna'da protein ekspresyonu oluşturmaktı.

Bu protokolde belirteç protein olarak kullanılan sfGFP, herhangi bir floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Test edilen tüm promotörler P. lacuna sfGFP ekspresyonu için kullanılabilir. Dönüşümden kaynaklanan suşların sayısının artması, kültürlerin depolanması için bir yönteme ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. Bu tür yöntemler Escherichia coli ve diğer birçok bakteri için kurulmuştur18. Standart protokollerde, gliserol kültürleri hazırlanır, sıvı azot içinde aktarılır ve -80 ° C'de depolanır. Bu yöntem sadece birkaç adım gerektirir ve kurulduğu türler için oldukça güvenilirdir. Standart protokol P. lacuna için uygun değildi, çünkü canlı hücreler her durumda kurtarılamadı. Bununla birlikte, gliserol çözüldükten sonra çıkarıldığında, tüm denemelerin hücreleri hayatta kaldı. Tip IV pili veya fotoreseptörlerin rolünü araştırmak için nakavt mutagenezi ile birleştirilebilen P. lacuna'nın hareketliliğinin analizi için basit yöntemler sunulmaktadır. Bu tahliller, tek hücreli siyanobakteriler 19,20,21'inkilerden farklıdır ve diğer Osilatoryalar için de yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Doğal çevreden izolasyon

NOT: Yeşil algler, diatomlar, filamentli siyanobakteriler ve diğer mikroalgler izole edilebilir. Protokol, laboratuvar koşullarında yetişen kaya havuzlarından herhangi bir mikroalg türü için kullanılabilir. Oscillatoriales'e ait filamentli siyanobakteriler, hareketleri ve filamentli şekilleri ile kolayca tanınabilir. Türler, genom dizilimi veya 16S rRNA dizilimi ile yarı saf bir durumda tanımlanabilir.

  1. Sıvı deniz suyu örneklerini deniz kaya havuzlarından (yani kayalık kıyıdaki boşluklardan) 50 mL şişelere aktarın. Her şişe için, doğal kaynağın tam yerini veya koordinatlarını not edin. Mümkünse, zooplankton miktarlarını azaltmak için içeriği 50 μm ağlardan filtreleyin. Numuneleri alt kültüre alınana kadar 4 ° C'de saklayın.
  2. 1 mL kültürleri, f/2 orta22,23'te %3 bakto-agar içeren 10 cm'lik Petri kaplarına aktarın (bkz. 20 tabakta kadar hazırlayın. 50 μmol m-2 s-1 beyaz ışık altında yetiştirin.
    NOT: Yetiştirme için daha yüksek ışık yoğunlukları kullanılabilir. P. lacuna için 400 μmol m-2 s-1'e kadar yoğunluk kullanılabilir, ancak diğer türler ışığa daha duyarlı olabilir.
  3. Bir hafta sonra, steril forseps kullanarak istenen hücreleri taze agar plakalarına aktarın. Hücreleri steril koşullar altında dürbün mikroskobu altında izole edin. Eski agar plakasını, hücreler görünene ve yeni agar plakasında büyüyene kadar 4 ° C'de saklayın.
  4. Kontaminasyonu ortadan kaldırmak için bu transfer adımını her hafta tekrarlayın. Ağır kontaminasyonu algılamak için çıplak gözü ve kontaminasyona karşı ek kontroller için 400x büyütmeli bir mikroskop kullanın.
  5. Bir numune kontaminasyonsuz görünüyorsa, agar plakalarında bakteriyel veya fungal kontaminasyon olup olmadığını test edin. Aşılama halkası ile kültürün bir kısmını LB24 agar plakasına (10 cm çapında) aktarın, plakayı oda sıcaklığında tutun ve 1-3 gün boyunca kirleticilerin büyümesini kontrol edin.
  6. Steril bir filamentli siyanobakteriyel tür elde edilirse, daha fazla kültür çalışması için kullanın. P. lacuna'yı sıvı içinde veya bacto-agar plakalarında yetiştirin. Sıvı kültür için 50 mL f/2 orta veya f/2+ orta ile 250 mL şişe kullanın.

2. DNA ekstraksiyonu

NOT: Bu yöntem 2526'dan itibaren benimsenmiştir 

  1. 50 mL f/2 orta boy iki şişe hazırlayın. Her birini diğer büyüyen kültürlerden ~ 1 mL P. lacuna filamentleri ile aşılayın. Kültürleri 25 ° C'de beyaz ışık altında (50 μmol m-2 s-1) 50 rpm'de ajitasyon (yatay dönüş) altında 7 gün veya daha uzun süre saklayın.
  2. Kültürü ultrasonla tedavi edin ( Malzeme Tablosuna bakın) 2 dakika boyunca tam enerjiyle. OD'yi 750 nm'de ölçün; ~0,5 olduğundan emin olmak için kontrol edin. OD çok düşükse kültürleri büyütmeye devam edin.
  3. Filamentleri 5.000 × g, 20 dakika santrifüjleme ile toplayın. Süper natantı çıkarın. Artık sıvı içeren filamentleri bir French Press27'nin odasına aktarın. French Press'in basıncını 20.000 psi'ye ayarlayın ve hücreleri çıkarın.
    NOT: Fransız basını tüm hücreleri lize edecek ve DNA'yı serbest bırakacaktır; güçlü kesme kuvvetleri 1.500 bp DNA parçası üretecektir.
  4. Numuneyi 10.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
  5. Pelet üzerine 400 μL lizis tamponu (4 M üre, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) ve 50 μL proteinaz K (10 mg/mL) ekleyin. Numuneyi 550 rpm'de çalkalayarak 60 dakika boyunca 55 ° C'ye ısıtın.
  6. 1 mL DNA ekstraksiyon tamponu (%3 CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, %1 Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) ekleyin ve 55 °C ve 550 rpm'de 60 dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltileri santrifüjleme tüplerine aktarın ve iki hacim kloroform / izoamilalkol (24/1) ekleyin.
  7. Salladıktan sonra, numuneyi 9.000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst, sulu fazı reaksiyon şişelerine aktarın ve 1 mL buz gibi soğuk etanol ve 50 μL 3 M sodyum asetat ekleyin.
  8. Numuneyi vorteksleyin ve 1 saat veya daha uzun süre -20 ° C'ye yerleştirin.
  9. 10.000 × g'da (4 °C) 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Pelet% 70 etanol ile yıkayın.
  10. Numuneyi tekrar santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti gece boyunca kurutun. DNA'yı nükleaz içermeyen suda çözün. OD 260 nm / OD 280 nm'nin 1.6 ile 1.9 arasında olup olmadığını kontrol etmek için DNA spektrumunu ölçün.
  11. Bir agaroz elektroforez jeli28 üzerindeki DNA'nın boyutunu analiz edin.
  12. Genomik DNA'yı, 300 döngü boyunca yeni nesil dizileme ile dizileyin, çift uçlu bir ayar ve 150 bazlık okuma uzunluğu ile (bkz.
  13. Derlemeyi uygun bilgisayar programı ile gerçekleştirin; Malzeme Tablosunda verilen örneğe bakınız.
  14. Ek açıklama için taslak genomu RAST sunucusuna gönderin.
    NOT: Birkaç dakika içinde tam ek açıklama elde etmek için DNA dizilerini yükleyin.

3. Doğal dönüşüm ve GFP ekspresyonu

NOT: Transformasyon, E. coli'de yayılan bir plazmid vektörüne dayanır; pGEM-T veya pUC19 omurga vektörleri olarak kullanılabilir. Klonlama teknikleri birçok laboratuvarda yerleşmiştir; Ayrıca standart protokoller28'e ve P. lacuna15,29 için dönüşüm vektörleri hakkındaki makalelere bakınız. sfGFP ifadesi için vektör örnekleri temsili sonuçlar bölümünde açıklanmıştır. Henüz yayınlanmamış dört vektörün ayrıntıları Ek Dosya 1'de verilmiştir.

  1. Tüm adımları steril laboratuvar koşullarında steril malzeme kullanarak gerçekleştirin (temiz tezgah, steril cam eşyalar).
  2. Akan bir kültürden 2 x 1 mL P. lacuna filamentleri ile iki adet 250 mL şişede 2 x 50 mL f/2 sıvı ortamı aşılayın. 25 ° C'de ~ 5 gün boyunca ajitasyon altında (yatay dönüş, 50 rpm) beyaz ışıkta (50 μmol m-2 s-1) yetiştirin.
  3. Üreticinin talimatlarına göre bir midi hazırlık kiti kullanarak transformasyon vektörü DNA'sının ~ 200 μg'sini hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. 100 mL P. lacuna hücre süspansiyonunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10.000 rpm'de 3 dakika boyunca homojenize edin. OD'yi 750 nm'de ölçün (istenen değer = 0,35).
  5. Hücre süspansiyonunu 6.000 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatanı çıkarın ve peleti kalan sıvının ve ek f / 2 + ortamının 800 μL'sinde (artık sıvı ve filamentler dahil toplam hacim) askıya alın.
  6. 120 μg / mL kanamisin içeren sekiz f / 2 + bacto-agar plakası (10 cm çapında) alın. Pipet, her bir agar plakasının ortasına 10 μg DNA koyar. Hemen pipet, her bir agar plakasının ortasına (DNA'nın üstüne) 100 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
  7. Fazla sıvının buharlaşmasına izin vermek için agar plakasını kapaksız olarak temiz tezgahta tutun. Plakayı kapatın ve 2 gün boyunca 25 ° C'de beyaz ışıkta yetiştirin.
  8. Her bir agar plakasının filamentlerini bir aşılama döngüsü ile 120 μg / mL kanamisin içeren birkaç taze f / 2 + bakto-agar plakasına dağıtın. Plakaları 25 ° C'de beyaz ışıkta yetiştirin ve kültürleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin.
  9. Mikroskop altında 7-28 gün sonra canlı, dönüştürülmüş filamentleri tanımlayın. Diğer filamentlerden farklı olan sağlıklı, yeşil filamentleri (Şekil 2) arayın. Bu yeşil filamentler tanımlanabilirse, bir sonraki adımla devam edin; aksi takdirde, plakayı 7 gün daha saklayın.
  10. Bu tanımlanmış canlı filamentleri 250 μg / mL kanamisin ile 50 mL sıvı f / 2 + ortamına aktarmak için forseps kullanın. Bir çalkalayıcıda 25 ° C'de beyaz ışıkta yetiştirin (yatay dönüş, 50 rpm). Dört haftaya kadar büyümeyi gözlemleyin.
  11. Filamentleri 250 μg / mL kanamisin içeren agar ortamına geri aktarın ve filamentlerin büyümesini bekleyin. Birkaç gün sonra, tek filamentleri daha yüksek konsantrasyonda kanamisin içeren taze bir agar plakasına aktarın, örneğin 500 μg / mL. Orijinal plakayı saklayın.
  12. Filamentlerin sıvı kültürde veya agar üzerinde yüksek konsantrasyonda kanamisin içinde çoğaltıldığından emin olun. Ayrışmayı hızlandırmak için kanamisin konsantrasyonunu tekrar arttırın.
    NOT: Dönüştürülmüş P. lacuna , 10.000 μg / mL'ye kadar kanamisinde büyür. Diğer türler bu kadar yüksek konsantrasyonlara tolerans göstermeyebilir.
  13. Dirençli hücreler büyütülür ve bir plaka üzerinde geniş bir şekilde dağıtılırsa, dış ve iç primerlerle PCR yaparak ekin P. lacuna genomuna entegrasyonunu test edin.
    1. Yerleştirmenin klonlanması için tasarlanmış primerleri iç astarlar olarak kullanın.
    2. Dış astarların tasarımı için, P. lacuna'nın genomunda önerilen yerleştirme bölgesinin 5' ve 3' olan dizilerini seçin, ancak yerleştirmenin dışında.
    3. PCR reaksiyonları için, iç astarları ve dış primerleri kullanın. Dirençli gerinim (ler) i ve vahşi türü kullanın.
      NOT: İç astarlar kesici ucun mevcut olduğunu gösterir; dış astarlar, kesici ucun doğru lokusa yerleştirildiğini gösterir.
  14. Her PCR reaksiyonu için, ~ 10 mg filamentleri doğrudan PCR tüplerine yerleştirin ve standart protokollere göre PCR yapın24. Ürün elde edilmezse, tavlama sıcaklığını değiştirin ve filamentleri suyla yıkayın.
    NOT: PCR'de birçok farklı polimeraz kullanılabilir. Taq polimeraz gibi standart polimerazlar, daha pahalı olan hata kontrol polimerazlardan daha yüksek bir hata oranına sahiptir. Bu analitik PCR, herhangi bir hata kontrol polimeraz gerektirmez. Bununla birlikte, standart bir polimeraz ile PCR ürünü elde edilmezse, hata kontrol polimeraz test edilmelidir.
  15. Agaroz elektroforezi24 üzerindeki dirençli hattın PCR ürünlerini analiz edin.
    1. Bant konumlarını işaretleyici ile karşılaştırın ve vahşi türü ve dönüştürücüyü karşılaştırın. İç ve dış astarlarda, dönüştürücü için wild tipten (direnç kasetinin yerleştirilmesi nedeniyle) daha büyük bir bant veya dönüştürücü için iki bant arayın: biri vahşi tip bandın büyüklüğüne ve daha büyük olanı. İkinci durum eksik ayrışmayı gösterdiğinden, yüksek kanamisin konsantrasyonları ile ekime devam edin.
      NOT: PCR ve elektroforez hakkında daha fazla bilgi için15,24 veya diğer standart literatüre bakınız.
  16. GFP ekspresyonu için: 40x veya 63x olarak belirlenen hedefin büyütülmesinde bir floresan mikroskobu ile tek filamentleri gözlemleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Parlak alan iletim görüntüsü ve floresan görüntü yakalayın. GFP için aşağıdaki ayarları kullanın: uyarma için 470 nm bant geçişi, emisyon için 525 nm bant geçişi ve 500 ms'lik ilk maruz kalma süresi olan 495 nm ışın ayırıcı.
  17. Net floresan sinyalleri için pozlama süresini ayarlayın ve doygun yoğunluklardan kaçının. Tüm örnekler için aynı ayarı kullanmayı deneyin.
  18. Vahşi tip filamentler de floresan göstereceğinden, bu arka plan floresansı için yukarıdakiyle aynı ayarlarla görüntüler yakalayın.
    NOT: GFP'yi ifade eden gerinim daha yüksek bir sinyale sahip olmalıdır; aksi takdirde, GFP'yi ifade etmez.
  19. Pozlama sürelerine ve floresan görüntülerin piksel yoğunluklarına dayanarak, farklı filamentlerin GFP içeriğini hesaplayın ve karşılaştırın.

4. Kriyokonservasyon

NOT: P. lacuna ve tek hücreli siyanobakteri Synechocystis sp. PCC 6803 kullanılır. Mevcut yöntem P. lacuna için daha iyi çalışır.

  1. P. lacuna veya Synechocystissp PCC 6803'ü sırasıyla 10 mL f/2+ veya BG-11 ortamda, ajitasyon altında (yatay rotasyonlar, 50 rpm) 25 °C'de beyaz ışık altında (50 μmol m-2 s-1) en az 10 gün boyunca yetiştirin.
  2. P. lacuna kültürünü (Malzeme Tablosuna bakınız) 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de veya bir ultrason cihazıyla (Malzeme Tablosuna bakınız) tam enerjide 2 dakika homojenize edin. Değerin 1 ile 7 arasında olup olmadığını denetlemek için her iki kültürün OD 750 nm'sini belirleyin.
  3. Hücreleri 15 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleme yoluyla toplayın. Süper natantı çıkarın.
  4. Hücre peletini 800 μL f / 2 + veya BG-11 ortamında (son hacim) askıya alın ve 2 mL'lik bir kriyoliyal içine aktarın. Hücre süspansiyonuna 800 μL% 50'lik bir gliserol çözeltisi ekleyin. Şişeyi kapatın ve tekrar tekrar ters çevirerek karıştırın.
  5. Kriyovyayı sıvı nitrojene aktarın ve -80 °C dondurucuda bir kriyokutuda saklayın. Kutunun dondurucu içindeki konumunu ve numunenin kutu içindeki koordinatlarını not edin.
  6. Hücrelerin geri kazanılması için, kriyovyali çıkarın ve içeriği oda sıcaklığında çözün. İçeriği 2 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın.
  7. Numuneyi iki kez yıkayın. 1. yıkama için, 5 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüj yapın. Süpernatanı çıkarın ve peleti 2 mL f / 2 + veya BG-11 ortamında yeniden askıya alın. 2. yıkama için, 5 dakika boyunca 6.000 × g'da yeniden merkezlentin, süpernatanı çıkarın ve peleti 2 mL f / 2 + veya BG-11 ortamında askıya alın.
  8. Ekime hazır olan bu hücrelerin bütünlüğünü kontrol etmek için, peleti 9 mL ortama aktarın ve ajitasyon altında (55 rpm) beyaz ışıkta (50 μmol m-2 s-1) yetiştirin. Kültürün OD 750 nm'sini ilk gün ve 1 hafta sonra karşılaştırın.

5. Phormidium lacuna'nın hareketliliği

NOT: Üç farklı tahlil tanımlanacaktır. Her durumda aynı kültür kullanılır.

  1. P. lacuna'yı f/2 ortamında yatay ajitasyon altında (50 rpm) beyaz ışıkta (50 μmol m-2 s-1) tahmini OD 750 nm 0,35 olana kadar ~5 gün boyunca yetiştirin. Numuneyi kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Filamentleri (Malzeme Tablosuna bakınız) 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de veya ultrasonla (Malzeme Tablosuna bakınız) maksimum güç ve 1 döngüde 1 dakika boyunca homojenize edin. OD 750 nm ölçün. 0.35'in üzerindeyse, fraksiyonu f / 2 orta ile seyreltin. Bu çözümü 5.3, 5.4 ve 5.5. adımlardaki hareketlilik tahlillerinde kullanın.
  3. Sıvı ortamda hareket testi
    1. Hareketliliğin doğrudan gözlemlenmesi için, P. lacuna içeren 8 mL ortamın (adım 5.2'den) 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın. Numune oda sıcaklığına ulaşana kadar birkaç dakika bekleyin. Petri kabını selofan folyo ile örtün.
    2. Standart bir mikroskobun x-y tablosuna kameralı bir mikroskop slaytı yerleştirin. Mikroskop ışığını açın. İdeal olarak, aydınlatma için her zaman aynı elektrik ve optik ayarları kullanın. 4x veya 10x hedefini ışığın yoluna taşıyın.
    3. Petri kabını slaytın üstüne yerleştirin. Tek filamentleri veya filament demetlerini tablonun x, y ve z hareketlerine göre ayarlayın.
      NOT: Üç boyutlu düzenleme nedeniyle, ilgili bölümün yalnızca bir kısmı odakta olabilir. Selofan folyo, odağın kısıtlama olmaksızın ayarlanmasını sağlar.
    4. Tek filamentlerin veya demetlerin hareketlerini gözlemleyin. Objektif lensin sıvıya temas etmediğinden emin olun. Standart bir mikroskop kamerası ile filamentlerin hareketlerini kaydedin (bakınız Ek Video S1).
  4. Yüzeydeki hareket testi
    1. Agar yüzeylerinde filament hareketliliğinin gözlemlenmesi için, f / 2 bakto-agar ile 6 cm Petri yemekleri hazırlayın. Agar'ın, objektif lensin agar yüzeyine yaklaşması için yeterince yüksek olduğundan emin olun. Alternatif olarak, ~ 3 mm kalınlığında bir agar tabakası hazırlayın ve filamentleri agardan kaydedin (plakayı baş aşağı tutun veya ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın).
    2. 6 cm'lik bir Petri kabının bakto-agar yüzeyinde P. lacuna (adım 5.2'den itibaren) içeren bir çözeltinin 0.5 mL'lik pipeti. Sıvının yüzeye girmesine izin verin. Petri kabını kapatın ve 4x veya 10x hedefi kullanarak yüzeydeki filamentlerin hareketini gözlemleyin.
    3. Mikroskopun aynı elektriksel ve optik ayarlarının kayıt boyunca ve sonraki kayıtlarda kullanıldığından emin olun.
    4. Oküler kamera ve mini bilgisayar sistemi kullanarak hızlandırılmış kayıtlar yakalayın. Sonraki görüntüler arasındaki zaman aralığının 5 s-1 dakika olduğundan emin olun. Hızlandırılmış kaydı kontrol etmek için mini bilgisayarın Linux komut dosyasını programlayın. Örnek komut dosyası için Ek Dosya 2'ye ve örnek olarak Ek Video S2'ye bakın.
  5. Fototaksiler için tahlil
    1. Fototaksis deneyleri için, seçilen 5 mm LED'lerinaşağıdan yukarıya 20 mm2'lik bir alanı ışınlamak için monte edildiği ışık yayan diyot (LED) tutucuları (burada, bir 3D yazıcı ile) hazırlayın (Şekil 3). Gerekirse, paralel olarak birçok LED tutucu kullanın ve her LED'i elektriksel olarak bir direnç ve potansiyometre aracılığıyla ayarlanabilir bir güç kaynağına bağlayın. Deneye bağlı olarak LED yoğunluklarını ölçün ve ayarlayın. Tüm ortamın karanlık bir odada veya kapalı bir karanlık kapta olduğundan emin olun.
    2. P. lacuna içeren ortamın 8 mL'sini (adım 5.2'den itibaren) 6 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. LED'in ışık yoğunluğunu ayarlayın. Petri kabını kapakla kapatın ve LED'in Petri kabının ortasında olması için bir LED tutucuya yerleştirin.
    3. İstenilen süreden sonra (tipik olarak 2 gün), Petri kabının bir görüntüsünü, doğrudan ışık tedavisinin konumuna yönelik bir akıllı telefon kamerasıyla yakalayın. Numunenin ışınlanması için beyaz bir LED panel kullanın. Fotoğraf makinesinin manuel ayarlarını kullanın; ışığın yansımalarından kaçının; her zaman kamera lensi ile numune arasında aynı mesafeyi alacak şekilde ayarlayın. Pozlama ayarlarının ImageJ kullanarak daha sonraki analizler için uygun bir görüntü verdiğinden emin olun.
    4. ImageJ yazılımını kullanarak filamentlerin merkezi çemberinin çapını ölçün.
      1. ImageJ'yi açın, Dosya |'e tıklayın Açın, istediğiniz dosyayı seçin ve Enter tuşuna basın.
      2. Düz düğmesini seçin (düz çizgili). Petri kabının bir ucundan karşı ucuna bir çizgi çekmek için farenin sol düğmesine basın. Çizginin filament çemberinin ortasından geçtiğinden emin olun.
      3. Klavyede Ctrl-K tuşlarına basın veya | Çözümle'yi tıklatın ImageJ menüsündeki Grafiği Profili. Petri çanağının 1B profili olan mesafeye karşı çizilmiş piksel yoğunluklarına sahip bir x-y penceresi arayın. En düşük piksel yoğunluğunun 0'ın biraz üzerinde ve en yüksek değerin 255'in altında olduğundan emin olun.
      4. Dairenin dışındaki piksel yoğunluğu için ortalama bir değer ve dairedeki piksel yoğunluğu için başka bir ortalama değer tahmin edin. Bu değerler arasındaki y konumunda, fareyle bu konumların üzerine gelerek dairenin her iki tarafının x değerlerini tahmin edin. Her iki değeri de not edin ve farkı hesaplayın.
      5. Fareyi sağdaki y eksenine getirerek en yüksek x değerini elde edin. Bu e değerinin Petri kabının çapını temsil ettiğini unutmayın. Bu çap 5 cm ise, merkezi filament çemberinin çapını 5 cm × d / e olarak hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda belirtilen yöntemler izlenerek 5 farklı P. lacuna suşu kaya havuzlarından izole edilmiş ve sıralanmıştır (Şekil 1 ve Tablo 1). P. lacuna HE10JO hariç tüm kültürler ~ 1 yıllık alt kültürlemeden sonra sterildi. Bu suş hala bir deniz bakterisi olan Marivirga atlantica ile kirlenmiştir. Sonraki Helgoland gezileri sırasında, diğer filamentli siyanobakteriler, P. lacuna'dan farklı olan ve karakterize edilmesi gereken kaya havuzlarından izole edildi.

P. lacuna için çeşitli DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma yöntemleri test edildi. En iyi sonuçlar, yukarıda açıklandığı gibi optimize edilmiş bir CTAB yöntemiyle elde edilmiştir. DNA verimleri 310 ± 50 μg / mL, OD 260 nm / OD 280 nm 1.7 ± 0.03 ve OD 260 nm / OD 230 nm 0.78 ± 0.04 (n = 17) idi. Genom dizilimi, tüm suşların DNA'sının beklendiği gibi biraz farklı olduğunu gösterdi (Tablo 1). Çekirdek protein dizileri maksimum %0.04 fark göstermiştir (Tablo 2). Tüm taslak genomlar eksik olmasına rağmen, HE10JO30 genomunun% >98'inin dizilendiği varsayılabilir. Bu tahmin, tamamlanmamış açık okuma çerçevelerinin sayısına dayanmaktadır. Kısmi protein dizileri, HE10DO ve HE10JO'nun RAST ek açıklamasından sonra kolayca tanımlanabilir. HE10JO'da, ~ 4.500 proteinden 60'ı eksik bir N veya C-terminal dizisine sahipti. Genom dizileri ekte bulunabilir (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4, Ek Dosya 5, Ek Dosya 6 ve Ek Dosya 7).

İlginç bir şekilde, aynı türün suşları iki adadan, Helgoland ve Giglio'dan izole edildi. Her iki ada arasındaki doğrusal mesafe 1.400 km'dir. Her iki yer arasında, örneğin deniz yoluyla gemilerle veya daha büyük olasılıkla göçmen kuşlarla bir bağlantı olmalıdır. Her iki adada da birçok kuş türü bulunabilir ve bunların çoğu göçmen kuşlardır. Bir adanın P. lacuna suşlarındaki çeşitlilik, en yakın Helgoland ve Giglio suşları arasındaki çeşitlilikten daha fazlaydı (Tablo 2). Bu, her iki yer arasında yoğun bir alışverişe işaret eder.

Doğal dönüşüm, ana suş olarak HE10DO ve HE10JO ile test edildi. Mevcut protokol, daha önceaçıklanan protokolden daha basittir, çünkü yıkama adımlarının sayısının azalması ve dönüşümden sonra daha az aktarım adımı vardır. Bu yeni yöntem laboratuvarda sürekli olarak kullanılmaktadır; ~15 başarılı dönüşüm sağlandı.

KanR direnç kaseti genellikle iç ve dış primerler kullanılarak PCR tarafından gösterildiği gibi, bitişik bölgeler tarafından tanımlanan homolog bölgeye entegre edildi. Çoğu siyanobakteri gibi, P. lacuna da poliploiddir. 12 hücresi başına 100'den fazla kromozoma sahip olabilir. Transformasyondan ~ 1 hafta sonra dış primerlerle yapılan bir PCR testi, tipik olarak elektroforez jeli üzerinde, biri vahşi tip bandın boyutuna ve direnç kasetinin yerleştirilmesini gösteren daha yavaş göç eden bir banda sahip 2 banda sahiptir (Şekil 4). Çift bant, kromozomların sadece bir alt fraksiyonunun yerleştirmeyi içerdiğini gösterir. Kanamisin üzerinde 4 haftalık seçimden sonra, ayrışma genellikle tamamlanır ve jeller üzerinde sadece bir büyük PCR bandı görülür. Bununla birlikte, pMH1 ile dönüşüm durumunda (aşağıya bakınız), ayrışma 3 aydan fazla bir süre sonra tamamlanmıştır.

pAK1, pAK2, pAK3 ve pMH1 vektörleri sfGFP ekspresyonu testleri için oluşturulmuştur. pAK1, pAK2 ve pAK3'te, sfGFP geni sırasıyla cpc560, A2813 ve psbA2 promotörlerinin kontrolü altındadır. Bu promotörler Synechocystis sp. PCC 6803 veya Synechococcus sp. PCC 700231'dendir. Bu vektörlerin yapımı için, sfGFP promotör ve sonlandırıcı dizileri, Synechococcus sp. PCC 700231'in dönüşümü için kullanılan vektörlerden alınmıştır. İlgili diziler, pFN1'in (veya sc_7_3715) homolog chwA (pFN_7_37_KanR) bölgesine entegre edildi. pMH1 ekspresyon vektörü, P. lacuna dizilerini şablon olarak kullanarak DNA sentezi ile oluşturulmuştur (Ek Dosya 6). P. lacuna'nın cpcB-cpcA (phycocyanin ß ve phycocyanin α) dizileri seri olarak düzenlenir. 100 bp intergenik bölge her iki kodlama bölgesini de ayırır. Sentetik sekans bu endojen cpcB-cpcA dizisini ve cpcB promotörünü içeriyordu. SfGFP ve KanR kaseti cpcB stop kodonunun sadece 3' üne (cpcA'nın 5'i) yerleştirilir. cpcB promotörü, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' ila 3') ile tüm sentetik sekans pUC19'a klonlanır. Şekil 5'te bir harita gösterilmiştir. pAK1, pAK2 ve pAK3'ün klonlanması ve pMH1'in tam dizisi hakkında daha fazla ayrıntı Ek Dosya 1'de verilmiştir.

4 dönüştürücünün tümü (pAK1, pAK2, pAK3 ve pMH1 ile) GFP'yi ifade etti; tüm floresan seviyeleri, vahşi tip filamentlerin arka plan floresansının üzerindeydi (Şekil 6). Eksik ayrışmaya sahip pMH1 transformantları, filamentler arasında çok değişken olan bir GFP sinyali ortaya çıkardı. Floresan sinyali, ayrışma tamamlandığında eşit olarak dağıtıldı (Şekil 6E). pAK1, pAK2 ve pAK3 dönüştürücülerinin mikroskop sinyalleri benzerdi, ancak pMH1'inkinden ~ 5 kat daha zayıftı (Şekil 6E).

Kurulan kriyokonservasyon yöntemi, E. coli için kurulmuş bir yönteme dayanmaktadır . Çözüldükten sonra gliserol çıkarılması için 2 yıkama adımı uygulandığında, 15 P. lacuna örneğinden 15'i hayatta kalmıştır (Tablo 3). Bu protokol Synechocystis PCC 6803 için de kullanılabilir, ancak 1 ile değil, sadece 2 yıkama adımıyla kullanılabilir (Tablo 3).

Oscillatoriales filamentlerinin bir diğer özelliği de hareketlilikleridir: P. lacuna filamentleri yüzeylerde (Şekil 7) ve sıvı bir ortamda (Şekil 8) sürekli hareket eder. Her iki hareket türü de Petri kaplarında agar ortamı olmadan veya agar ortamı ile kolayca incelenebilir. Agar üzerindeki hareket yavaş olduğu için hızlandırılmış kayıt gereklidir. Filamentler, aşağıdan bir ışık demeti gelirse ışık konisine doğru hareket eder (Şekil 3). Işık yoğunluğunun, dalga boyunun ve zamanın etkileri basit bir kurulumla kolayca incelenebilir. Bu etkinin fotoreseptörleri henüz net değildir. Olası adaylar nakavt mutantlarla ele alınabilir. Filamentlerin ışığı nasıl bulduğunun altında yatan mekanizma da belirsizdir. Bu soru için, karanlıktan ışığa hareketleri sırasında filamentleri kaydetmek için bir kızılötesi sistem gereklidir.

Figure 1
Resim 1: Helgoland ve Giglio'dan toplanan Phormidium lacuna suşları. Filamentler f/2 agar üzerinde 11 gün boyunca 6 cm'lik Petri tabaklarda çoğaltılır. (A) gerinim GI08AO; (B) gerinim GI08IO; (C) gerinim GI09CO; (D) HE10DO suşu; (E) HE10JO suşu; (F) gerinim HE15M2G1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Transformasyondan 5 hafta sonra Phormidium lacuna filamentleri. sfGFP ekspresyon vektörü pMH1 kullanıldı; seçim 120 μg/mL kanamisin ile f/2+ besiyumda meydana geldi. Yeşilimsi filamentler dayanıklı ve canlıdır; diğer filamentler öldü. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Fototaksis deneyi. Solda: Ayarlanabilir bir güç kaynağına bağlı 4 kırmızı LED'li LED tutucu. Her LED'in üstünde, 8 mL Phormidium lacuna kültürüne sahip 6 cm'lik bir Petri kabı vardır. Sağda: Kırmızı LED'de 2 gün sonra P. lacuna ile Petri kabı (15 μmol m-2 s-1). Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Phormidium lacuna'nın pAK1 ile dönüştürülmesinden sonra kesici ucun entegrasyonu ve ayrılması. Dış astarlı PCR. Kesici uçsuz ve kesici uçlu ürünün beklenen boyutları sırasıyla 2371 ve 5016 bp'dir. Sol şerit: işaretleyici, şerit 1, 2, 3, 4: Dirençli bir filamentin izolasyonundan 7 gün, 11 gün, 14 gün ve 17 gün sonra (dönüşümden 4 hafta sonra) filamentlerin PCR ürünleri. Şerit 5: Vahşi tipte PCR ürünü (farklı bir jelden). 7 günlük numunede, kesici uç kromozomların küçük bir kısmında bulunur. Bu fraksiyon, vahşi tip bandın görünmediği, yani ayrımın tamamlandığı 17 güne kadar artar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Endojen cpcB promotörünün kontrolü altında sfGFP ekspresyonu için vektör. Turuncu: Phormidium lacuna homolog sekans, mor/mavi: pUC-19 vektör omurgası, yeşil: sfGFP ve KanR ile ekle. Kısaltmalar: sfGFP = süper klasör yeşil floresan proteini; KanR = kanamisin direnci. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Phormidum lacuna'da sfGFP ekspresyonu. P. lacuna vahşi tip filamentlerin (A) ve pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) ve pMH1 (E) ile transformasyondan sonra floresan görüntüleri. pMH1'de, sfGFP geni fikosiyanin ß geninin 3' ü olarak yerleştirilir ve bu nedenle endojen cpcß promotörü tarafından tahrik edilir; Diğer durumlarda, sfGFP sırasıyla Synechocystis PCC 6803'ten cpc560, A2813 veya psbA2s promotörleri tarafından tahrik edilir. Floresan ayarları GFP'ye özgüdür; tüm görüntüler aynı entegrasyon süresi ve optik ayarlarla kaydedildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Resim 7: Phormidium lacuna'nın agar yüzeyinde 4x büyütmede birleştirilmiş görüntüsü. İlk görüntü kırmızı, ikincisi (1 dakika sonra çekilmiş) yeşil renkte sunulur. Ayrıca agar üzerindeki izleri de not edin. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Phormidium lacuna'nın sıvı ortamda birleştirilmiş görüntüsü. Her iki görüntü arasındaki zaman aralığı 10 sn idi. İlk görüntü kırmızı renkte basılmıştır; ikincisi yeşil renkte basılmıştır. Her iki rengin karşılaştırılması, 10 sn içindeki hareketi gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

soy HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Çekişmeler 104 174 218 102 154
toplam bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tablo 1: Phormidium lacuna suşları.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tablo 2. 10.876 amino asitli 20 çekirdek protein dizisindeki suşlar arasındaki amino asit farklılıkları.

Hücre yoğunluğu OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Yıkar 1 2 1 2 1 2 1 2
Siekosistis PCC 6803 Serisi 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tablo 3: Synechocystis PCC 6803 ve Phormidium lacuna HE10DO siyanobakterileri ile kriyokonservasyon çalışmaları. İlk sayı, donma / çözülmeden sonra hayatta kalan kültürlerin sayısını gösterir; ikinci sayı toplam denemeleri gösterir.

Ek Video S1: Phormidium lacuna filamentlerinin sıvı çözelti içinde, hızlandırılmış olmadan hareketi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Phormidium lacuna filamentlerinin agar yüzeyinde hızlandırılmış olarak hareketi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Phormidium lacuna'nın transformasyonu için vektörlerin klonlanması . Dönüşüm vektörlerinin listesi; klonlama için primerlerin listesi; gb formatında pMH1 dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Raspberry Pi mini bilgisayarı için kabuk komut dosyaları (sh). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: HE152G1'in DNA dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 4: GI08AO'nun DNA dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 5: GI09CO'nun DNA dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 6: HE10DO'nun DNA dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 7: HE10JO'nun DNA dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kültür koleksiyonlarından birçok siyanobakteri suşu mevcut olmasına rağmen 32,33,34,35,36, vahşi doğadan yeni siyanobakterilere hala talep vardır, çünkü bu türler belirli özelliklere uyarlanmıştır. P. lacuna kaya havuzlarından toplandı ve tuz konsantrasyonlarının ve sıcaklığın30 varyasyonlarına uyarlandı. Bu türün suşları 2008, 2009 ve 2010 yıllarındaki geziler sırasında bulundu. Burada açıklanan prosedürle, 5 P. lacuna suşu izole edildi ve bu suşların 4'ü sterildi. P. lacuna HE10JO suşu, rRNA ve genom dizilimi ile tanımlanan bir deniz bakterisi olan Marivirga atlantica bakterisi ile kalıcı olarak kontamine olur. Bu bakteri, mekanik ayırma, farklı sıcaklıklarda büyüme, antibiyotiklerle yapılan tedaviler veya kimyasal tedavilerin uygulanmasına rağmen siyanobakteriden ayrılamadı. Kirlenmeye rağmen, P. lacuna HE10JO diğer suşlara benzer şekilde yetiştirilebilir. Daha sonraki gezilerde, henüz ayrıntılı olarak analiz edilmemiş olan Oscillatoriales'in diğer üyeleri bulundu. P. lacuna bir daha bulunamadı. P. lacuna'nın neden sonraki yıllarda ve iki farklı yerde izole edildiği, ancak daha sonra bulunmadığı açık değildir. Bolluğu kesinlikle öngörülemeyen koşullara bağlıdır. Sıcaklık, tuz konsantrasyonları ve inorganik veya organik besinler kaya havuzlarında oldukça değişkendir. Bu nedenle, tür bileşimi zaman içinde öngörülemeyen bir şekilde dalgalanabilir.

Doğal dönüşüm, çoğunlukla tek hücreli türler olmak üzere farklı siyanobakteriler için kurulmuştur. Filamentli P. lacuna , doğal dönüşümün kurulduğu Oscillatoriales düzeninin tek türüdür. Dönüşüm mevcut protokolle neredeyse her zaman başarılı oldu. Genel olarak, bir transformasyon denemesinden sonra dirençli filamentlerin sayısı önemli ölçüde değişir ve bazen dönüşüm başarısız olur, bu da değerli zamanın kaybına neden olur. Bu nedenle, paralel olarak birkaç dönüşüm projesinin gerçekleştirilmesi önerilir. Tam ayrışma süresi, genellikle dirençli suşun izolasyonundan 4 hafta sonra, değişebilir. Kanamisin üzerinde büyümeden sonra tam ayrışma garantisi olmadığından, PCR testlerinin dış ve iç primerler kullanılarak yapılması çok önemlidir.

Her vektör 2 x 500-1.000 bp homolog diziler içermelidir, örneğin, PCR ile konakçıdan yükseltilmiş ve bir direnç kaseti (örneğin, burada kullanılan kanamisin kaseti KanR) tarafından kesilmelidir37,38. İfade için, homolog diziler arasında bir promotör, kodlama dizisi (örneğin, sfGFP39 için), sonlandırıcı ve direnç kaseti klonlanmalıdır. Klonlama stratejileri türe özgüdür ve deneyin amacına bağlıdır.

Bu transformasyon yöntemi, diğer Oscillatoriales suşları veya diğer siyanobakterilerle de mümkün olabilir: doğal transformasyon, hemen hemen her siyanobakteriyel genomda bulunan tip IV pili'ye dayanır 3,15,40. Bu nedenle, mevcut yöntem diğer türlerle yeni denemeleri teşvik edebilir. Tip IV pili aynı zamanda hareketlilik ile de ilgili olduğundan, siyanobakterilerin hareketli olduğu koşulları kontrol etmek önemlidir.

Gen yerleştirme homolog rekombinasyona dayanır ve homolog bölgelerin bozulmasına neden olur. Bu nedenle, transformasyon genellikle gen nakavtı için kullanılır. Eklenen genin ekspresyonu, aktif bir promotör ve bir kodlama dizisi homolog bölgeye entegre edilirse indüklenecektir. P. lacuna'da, promotör aktivitesi türlere bağlıydı. Synechocystis PCC sp 6803 veya Synechococcus sp. PCC 7002 31'in cpc560, A2813 ve psbA2 promotörleri ve P. lacuna'nın cpcB promotörü, sfGFP ekspresyonunu yönlendirebilir. Bu yapılardan, endojen cpcB promotörü en güçlü ekspresyonu indükledi, ancak sfGFP geni fikosiyanin ß geninin 3'ünde bulunur. Bu, siyanobakteriyel ekspresyonda endojen promotörlerin daha genel bir kullanımını gösterir.

Gen nakavtı ve hareket çalışmalarının kombinasyonu, motilitenin moleküler mekanizmalarına ve fototaksilere ışık tutacaktır. LED ışık kaynakları fototaksi deneyleri için ışık sağlayabilir. Hemen hemen her dalga boyu mevcuttur ve ışık yoğunluğu ayarlanabilir bir güç kaynağı ve potansiyometreler ile modüle edilebilir. LED tutucular, farklı LED'lerin kombinasyonlarını kolayca gerçekleştirmek için 3D yazıcılar tarafından oluşturulabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Çalışma Karlsruher Teknoloji Enstitüsü tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 180
Filamentöz Cyanobacterium <em>Phormidium lacuna'nın</em> Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter