Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.

Abstract

Next-generation sequencing is steeds belangrijker geworden in de klinische toepassing bij de bepaling van genetische varianten. In de pre-implantatie genetische test heeft deze techniek zijn unieke voordelen in schaalbaarheid, doorvoer en kosten. Voor de pre-implantatie genetische test voor aneuploïdie-analyse biedt het hier gepresenteerde semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) systeem een alomvattende aanpak om structurele genetische varianten te bepalen met een minimale resolutie van 8 Mb. Van monsteracquisitie tot het eindrapport, het werkproces vereist meerdere stappen met nauwe naleving van protocollen. Aangezien verschillende kritieke stappen het resultaat van versterking, kwaliteit van de bibliotheek, dekking van gelezen gegevens en uitvoer van gegevens kunnen bepalen, zou beschrijvende informatie met visuele demonstratie anders dan woorden meer details kunnen bieden aan de werking en manipulatie, wat een grote impact kan hebben op de resultaten van alle kritieke stappen. De hierin gepresenteerde methoden zullen de procedures weergeven die betrokken zijn bij de versterking van het hele genoom (WGA) van biopsie Trophectoderm (TE) -cellen, genomische bibliotheekconstructie, sequencerbeheer en ten slotte het genereren van rapporten met kopieernummervarianten.

Introduction

Aneuploïdie is de afwijking in het aantal chromosomen door de aanwezigheid van een of meer extra chromosomen of de afwezigheid van een of meer chromosomen. Embryo's die een vorm van aneuploïdie dragen, zoals het verlies van één X-chromosoom (syndroom van Turner), extra kopieën van autosomen, zoals trisomieën van autosoom 21 (syndroom van Down), 13 (Patau-syndroom) en 18 (Syndroom van Edwards), of extra geslachtschromosomen zoals 47, XXY (Klinefelter-syndroom) en 47, XXX (Triple X-syndroom), kunnen overleven met geboorteafwijkingen1. Aneuploïdie is de primaire oorzaak van miskramen in het eerste trimester en falen van in vitro fertilisatie (IVF)2. Er wordt gemeld dat het aneuploïdiepercentage kan variëren van 25,4% -84,5% door de verschillende leeftijdslagen van de natuurlijke cyclus en de medicinale controlegroep in IVF-praktijk3.

Next-generation sequencing-technologie wordt steeds meer toegepast bij de klinische bepaling van genetische informatie; het biedt praktische toegang tot genoomsequentie met efficiëntie en hoge doorvoer. Met name de volgende generatie sequencing zorgde ook voor een revolutie in de diagnose van aandoeningen met genetische factoren en tests voor abnormiteit in het genoom4. Met behulp van halfgeleidersequencingtechnologie om chemische signalen direct over te brengen in sequencing bioreactie in digitale gegevens, biedt het op halfgeleiders gebaseerde sequentiesysteem een directe, realtime detectie van sequentiegegevens in 3-7 h 5,6.

In een IVF-procedure onderzoekt pre-implantatie genetisch testen (PGT) het genetische profiel van het embryo voordat het in de baarmoeder wordt overgebracht om de IVF-uitkomst te verbeteren en het risico op genetische aandoeningen bij pasgeborenen te verminderen 1,7. In PGT in combinatie met NGS-technieken wordt genetisch materiaal geëxtraheerd uit minder dan 10 cellen versterkt met amplificatiekits voor het hele genoom of een onafhankelijk ontwikkeld reagens voor amplificatie van het hele genoom. Dit vereist slechts één stap in de amplificatiefase en vereist geen pre-amplificatie om amplificatieproducten voor het hele genoom te verkrijgen. Primers of panelen voor copy number variant en speciale gene loci sequencing worden ontworpen en toegepast in de geconstrueerde bibliotheek.

Een typische workflow van pre-implantatie genetisch testen-aneuploïdie (PGT-A) in NGS omvat seriële procedures en vereist een intense werklast van laboratoriumpersoneel8. Sommige misoperaties veroorzaakten het terugdraaien van de procedure kan leiden tot ongewenst verlies van zowel tijd als middelen van het lab. Een beknopte en duidelijke standard operating procedure (SOP) voor PGS-NGS workflow is nuttig; Tekstindelingsprotocollen kunnen echter geen meer gedetailleerde informatie bevatten over monsterverwerking, apparaatmanipulatie en instellingen van instrumenten, die kunnen worden gevisualiseerd in een videoprotocol. In dit artikel zou een gevalideerde workflow in combinatie met een gevisualiseerde demonstratie van operationele details meer directe en intuïtieve verwijzende protocollen kunnen bieden in de PGT-praktijk op een halfgeleidersequencingplatform.

Het protocol beschrijft hier een methode die het batchen van maximaal 16 embryobiopten parallel ondersteunt. Voor grotere batches wordt aanbevolen om een commercieel kitgebaseerd protocol te gebruiken voor halfgeleidersequencing, zoals Reproes-PGS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protocollen en de trophectoderm (TE) biopsie (1.1.1.1 sectie) toegepast in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de humane onderzoeksethiek commissie van no. 924 ziekenhuis op 18 september 2017 (NO: PLA924-2017-59). De patiënten/deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.

1. DNA-isolatie van biopsie van menselijke embryo's en volledige genomische amplificatie

  1. Protocol voor versterking van het gehele genoom 9,10
    OPMERKING: Pico PLEX WGA Kit wordt gebruikt om versterking van het hele genoom uit te voeren.
    1. Monsterverzameling en -opslag
      1. Trophectoderm biopsie: Put uit gemiddeld zes tot negen cellen uit hernia TE van D5/6 embryo na geassisteerd uitkomen om een gekwalificeerde hoeveelheid DNA te verkrijgen voor de volgende amplificatie.
      2. Breng de monstercellen over naar een PCR-buis in 5 μL PBS.
      3. Vries de monsters onmiddellijk in bij -80 °C als het protocol niet direct overgaat tot de DNA-extractie.
    2. Cellyse
      OPMERKING: Aanvullend bestand 1 bevat een lijst en dient als referentie voor de aanbevolen volumes van elk onderdeel bij het voorbereiden van de hoofdmix tijdens cellyse en volledige genoomversterking van batches van 1, 8, 16 en 32 monsters (met overschrijding om pipetteerfouten op te vangen). Bij het formuleren van andere hoofdmengsels van dit protocol wordt het volume van elke component bovendien verhoogd om rekening te houden met het componentverbruik dat wordt veroorzaakt door herhaald pipetteren. Alle korte centrifugatie wordt uitgevoerd op een tafelmodel minicentrifuge gedurende 2-10 s bij kamertemperatuur (RT), met een vast toerental van 10.000 met een centrifugale kracht van 5.300 x g. De middelpuntvliedende kracht moet tussen 2.000 x g en 12.000 x g liggen.
      1. Bereid het cellysemengsel voor met 4,8 μL van de verdunningsbuffer van het extractie-enzym en 0,2 μL van het celextractie-enzym per monster.
      2. Pipetteer 5 μL van de vers bereide cellyse meng in elk 5 μL celmonster in PCR-buizen en centrifugeer de buis kort op RT gedurende 5 s. Draai de buis niet vortex.
      3. Incubeer het monster in een thermische cycler als volgt: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Kort centrifugeer (5 s) de buis na de incubatie.
    3. Pre-amplificatie van het hele genoom-DNA
      1. Bereid het voorversterkingsmengsel voor met 4,8 μL van de voorversterkerbuffer en 0,2 μL van het voorversterkerenzym per monster.
      2. Pipetteer 5 μL van het voorversterkingsmengsel in de monsterbuizen door de wanden van de buis en centrifugeer kort gedurende 3 s. Vermijd dat de punt de bodem van de buis bereikt en draai de buis niet vortex.
      3. Incubeer het monster volgens het in tabel 1 vermelde thermische cyclerprogramma.
    4. DNA-amplificatie van het hele genoom
      1. Centrifugeer het monster kort gedurende 5 s en plaats het pre-amp incubatieproduct op ijs.
      2. Bereid de gehele genoomversterkingsmix voor met 25 μL van de amplificatiebuffer, 0,8 μL van het amplificatie-enzym en 34,2 μL nucleasevrij water per monster.
      3. Meng 60 μL van het vers bereide gehele genoomversterkingsmengsel met de 15 μL pre-amp incubatieproduct; het totale volume moet 75 μL bedragen. Kort centrifugeren gedurende 5 s. Vermijd dat de punt de bodem van de buis bereikt en draai de buis niet vortex.
      4. Plaats de PCR-buis op de thermische cycler en voer het in tabel 2 vermelde thermische cyclerprogramma uit.
      5. Centrifugeer de buizen kort gedurende 5 s en breng de producten over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
      6. Kwantificeer de WGA-productconcentratie met een fluorometer11. Monsters kunnen tijdelijk worden bewaard bij -20 °C gedurende minder dan 2 maanden als ze niet doorgaan naar de volgende stap.
  2. Protocol van de onafhankelijk ontwikkelde WGA-reagentia.
    1. Monsterverzameling en -opslag
      1. Trek de cellen uit het D5/6-embryo na geassisteerd uitkomen voor de volgende amplificatie.
      2. Breng de monstercellen met 1,5 μL PBS over in een PCR-buis met 2 μL PBS.
        OPMERKING: PBS is vrij van Mg2+ en Ca2+.
      3. Vries de monsters onmiddellijk in bij -80 °C als ze niet direct overgaan tot het DNA-extractieprotocol.
    2. Cellyse
      1. Smelt de cellysebuffer (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethyleenglycoltetra-azijnzuur (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfaat, 2 mM β-glycerofosfaat, 0,1% SDS) bij RT en plaats het op het ijs. Voeg 2 μL cellysebuffer toe aan elk monster en centrifugeer kort (5 s).
        OPMERKING: Draai de buis niet vortex en vermijd dat de pipetpunt het vloeibare oppervlak in de buis raakt om te voorkomen dat cellen of DNA uit het reactiesysteem worden gehaald.
      2. Incubeer het monster in een thermische cycler als volgt: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, vasthouden. Centrifugeer de buis kort op RT gedurende 10 s na de incubatie.
    3. DNA-amplificatie van het hele genoom
      1. Centrifugeer het cellyseproduct kort gedurende 5 s en plaats het op ijs.
      2. Bereid het volledige genoomversterkingsmengsel voor elk monster door te mengen met 16 μL amplificatievoorgemengde oplossing, 1 μL amplificatie-enzym en 28 μL nucleasevrij water. Meng voorzichtig, centrifugeer kort (5 s) en leg het mengsel op ijs. Draai de buis niet vortex.
      3. Pipetteer 45 μL van het vers bereide amplificatiemengsel van het gehele genoom in het cellysisproduct, bereid in stap 1.2.2.2; meng voorzichtig en centrifugeer kort gedurende 5 s.
        OPMERKING: Draai de buis niet vortex en vermijd dat de pipetpunt de vloeistof in de buis raakt.
      4. Plaats de PCR-buis op de thermische cycler en voer het programma uit zoals beschreven in tabel 3.
      5. Centrifugeer de buizen kort gedurende 5 s en breng de producten over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
      6. Kwantificeer de WGA-productconcentratie met een fluorometer11 en noteer de resultaten op het QA-blad (kwaliteitsanalyse). Producten met gekwalificeerde concentraties kunnen tijdelijk worden bewaard bij -20 °C gedurende minder dan 2 maanden als ze niet overgaan tot de volgende stap.

2. Selectie van versterkingsfragmenten

OPMERKING: Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Bibliotheekvoorbereidingskit (Materiaaltabel).

  1. Voorbereiding voor aanvang
    1. Breng de magnetische kralen (n x 100 μL) in evenwicht voor zuivering bij RT gedurende 30 minuten.
    2. Herstel het vorige WGA-product naar RT. Vortex het product bij RT gedurende 30 s voordat u het kort centrifugeert.
    3. Bereid verse 70% ethanol.
  2. Selectieprocedure voor fragmenten
    1. Pipetteer 25 μL van de WGA-producten en breng over in een centrifugebuis van 1,5 ml met 25 μL nucleasevrij water vooraf geladen.
    2. Vortex en meng de DNA-zuiveringskralen goed. Aliquot 50 μL ervan in elke monsterbuis (origineel monster: kralen (volume) = 1:1), vortex en centrifuge kort (5 s). Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces.
    3. Plaats de centrifugebuis van 1,5 ml in een magneetrek en wacht tot alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis worden aangetrokken. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    4. Volgens het oorspronkelijke monstervolume pipet 30 μL (origineel monster: kralen (volume) = 1:0,6) magnetische kralen, vortex en centrifuge kort (5 s). Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces.
    5. Plaats de centrifugebuizen van 1,5 ml in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis zijn aangetrokken. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    6. Pipetteer 300 μL 70% ethanol in de centrifugebuis van 1,5 ml, draai de buis twee keer voorzichtig met een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    7. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    8. Verwijder de centrifugebuis van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Plaats de buizen terug in het magneetrek en wacht tot alle magnetische kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis.
    9. Pipetteer voorzichtig de resterende vloeistof aan de onderkant. Houd de buis open om de kralen op RT gedurende 3-5 minuten te drogen. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren op de pellet van kralen ontstaan.
    10. Verwijder de buizen uit het magnetische rek, pipetteer 25-30 μL van de DNA-elutiebuffer in een buis en sluit de dop en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele vloeistof naar de bodem van de buis te krijgen en zet de buis gedurende 5 minuten op RT.
    11. Steek de buizen terug in de magnetische rekken en wacht tot alle kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis en het supernatant transparant wordt. Breng de DNA-oplossing voorzichtig over in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    12. Kwantificeer de concentratie van DNA na fragmentselectie met een fluorometer11, bewaar het bij -20 °C. Doorgaans varieert de concentratie van het geselecteerde DNA-fragment van 1,5-2,4 ng/μL.

3. Voorbereiding van de DNA-bibliotheek12

OPMERKING: Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Bibliotheekvoorbereidingskit (Materiaaltabel).

  1. Eindreparatie
    1. Balanceer de magnetische kralen op RT gedurende 30 minuten.
    2. Breng het DNA-product van fragmentselectie in evenwicht in stap 2.2.12 tot RT. Controleer en noteer het label op elke injectieflacon die het DNA bevat.
    3. Bereid het DNA-eindherstelsysteem voor met 30 μL DNA-producten, 10 μL eindreparatiebuffer, 0,5 μL eindherstellende enzym en 9,5 μL nucleasevrij water in een centrifugebuis van 1,5 ml. Vortex de buis voor 30 s en centrifuge kort (5 s) bij RT om alle vloeistof naar de buisbodem te krijgen.
    4. Incubeer bij 25 °C gedurende 30 minuten en centrifugeer de buis kort (5 s) na incubatie.
    5. Vortex of omgekeerd meng de magnetische kralen en breng 75 μL van de magnetische kralen over in een buis met eindherstellende DNA-monsters (origineel monster: kralen (volume) = 1:1,5). Pipet of vortex voorzichtig om de kralen goed te mengen en kort centrifuge (5 s) om alle suspensie naar de bodem van de buis te draaien. Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces. Draai de buisjes voorzichtig om om de kralen verspreid te houden.
    6. Plaats de centrifugebuizen in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Verwijder het supernatant en vermijd het pipetteren van de kralen, waarbij de buizen op het rek blijven tijdens het pipetteren.
    7. Breng 300 μL van de nieuw bereide 70% ethanol over in de buizen, draai de buizen voorzichtig twee keer in een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    8. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    9. Verwijder de centrifugebuizen van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Plaats de buizen terug in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis worden aangetrokken.
    10. Pipetteer voorzichtig de resterende vloeistof in de bodem. Open de dop van centrifugebuizen van 1,5 ml en droog de kralen op RT gedurende 3-5 minuten. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren op de pellet van kralen ontstaan.
    11. Pipetteer 33 μL DNA-elutiebuffer in een buis, sluit de dop en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele suspensie naar de bodem van de buis te krijgen en zet de buis gedurende 5 minuten op RT.
    12. Steek de buizen terug in de magnetische rekken en wacht tot alle kralen naar de zijwand worden aangetrokken en de oplossing transparant wordt. Breng de DNA-oplossing voorzichtig over in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml met de juiste tag, zodat de kralen niet worden gepipetteerd.
  2. Ligatie van streepjescodes
    1. Plaats de ligatiereagentia met streepjescode in stap 3.2.2 op ijs om alle bevroren reagentia te smelten.
    2. Bereid het ligatiesysteem voor met 32 μL eindherstellende DNA-producten, 10 μL nucleasevrij water, 5 μL ligasebuffer, 1 μL ligase en 1 μL P1-adapt in een centrifugebuis van 1,5 ml. Pipetteer 1 μL van elk barcodereagens in de oplossingsmix in de buis voor één monster, vortex gedurende 5 s en centrifugeer kort (5 s) om alle vloeistof in de bodem van de buis te krijgen.
      OPMERKING: Controleer bij het toevoegen van de streepjescodes of het aantal streepjescodes en monsters overeenkomt; open slechts één injectieflacon met streepjescode tegelijk om gemengde vervuiling van barcodes te voorkomen; Vervang de handschoenen voor elke vijf of zes toegevoegde barcodes.
    3. Incubeer de buizen bij 25 °C gedurende 30 min.
    4. Pipetteer 75 μL (oorspronkelijk monster: kralen (volume) = 1:1,5) van de magnetische kralen in een buis en pipet of vortex voorzichtig om de kralen goed te mengen. Centrifugeer kort (5 s) om alle suspensie naar de bodem te laten draaien, waardoor kraalaggregatie wordt vermeden. Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces. Draai de buizen voorzichtig om om de kralen verspreid te houden.
    5. Plaats de centrifugebuizen in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Verwijder het supernatant en vermijd het pipetteren van de kralen, waarbij de buizen op het rek blijven tijdens het pipetteren.
    6. Breng 300 μL van de nieuw bereide 70% ethanol over in buizen, draai de buizen voorzichtig twee keer in een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    7. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    8. Verwijder de centrifugebuizen van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Steek de buizen terug in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis zijn aangetrokken. Pipetteer voorzichtig het resterende supernatant in de bodem.
    9. Houd de buisdop open om de kralen op RT gedurende 3-5 minuten te drogen. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren op de pellet van kralen ontstaan.
    10. Pipetteer 15 μL van de DNA-elutiebuffer in de buis. Spoel de pellet van de kralen af tot op de bodem van de buis, sluit de dop af en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele suspensie naar de bodem van de buis te krijgen en houd de buis gedurende 5 minuten stabiel op RT.
  3. Fragmentversterking
    1. Plaats de bibliotheekgebouwen op ijs wanneer het bevroren reagens oplost.
    2. Breng 47,5 μL van het enzymmengsel en 2,5 μL van het primermengsel over in de buis met geëlueerd DNA en kralen, vortex gedurende 5 s en centrifugeer kort (5 s) om alle vloeistof naar de buisbodem te krijgen.
    3. Zet de buis op RT gedurende 5 min. Plaats de buizen terug in magnetische rekken en wacht tot alle kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Breng de DNA-oplossing voorzichtig over in PCR-buizen van 0,2 ml met labels die duidelijk zijn gemarkeerd en vermijd pipetteren van de kralen.
    4. Incubeer het monster in een thermische cycler set met het volgende programma: 72 °C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cycli); 70 °C, 5 min. Centrifugeer de buis kort (5 s) wanneer de reactie is voltooid en bewaar de producten bij 4 °C.
    5. Breng de PCR-producten over in een centrifugebuis van 1,5 ml (lage bevestiging). Voeg 97,5 μL (oorspronkelijk monstervolume: kralen (volume) = 1:1,5) magnetische kralen toe aan de buis wanneer de reactie eindigt, pipet of voorzichtig vortex om de kralen goed te mengen, en centrifugeer kort (5 s) om alle vloeistof naar de bodem te laten draaien. Vermijd kralenaggregatie. Zet de buis op RT gedurende 5 min. Draai de buizen voorzichtig om om de kralen verspreid te houden.
    6. Plaats de centrifugebuizen in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Verwijder het supernatant, pipetteer de kralen niet en houd de buizen stabiel op het rek.
    7. Breng 300 μL van de nieuw bereide 70% ethanol over in buizen, draai de buizen voorzichtig twee keer in een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    8. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    9. Verwijder de centrifugebuis van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Steek de buis terug in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis zijn aangetrokken. Pipetteer voorzichtig de resterende vloeistof in de bodem.
    10. Houd de buisdop open om de kralen op RT gedurende 3-5 minuten te drogen. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren ontstaan in de pellet van de kralen.
    11. Pipetteer 22 μL van de DNA-elutiebuffer in de buis, spoel de pellet van de kralen naar beneden en sluit de dop en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele vloeistof naar de bodem van de buis te krijgen en zet de buis gedurende 5 minuten op RT.
    12. Kwantificeer de concentratie van de geconstrueerde DNA-bibliotheek met een fluorometer11 en bewaar de geconstrueerde DNA-bibliotheek bij -20 °C; de concentratie van het geselecteerde DNA-fragment varieert van 0,6-10 ng/μL. Hercodeer de bibliotheekinformatie in de bibliotheekdatabase en sla de monsters dienovereenkomstig op.

4. Voorbereiding van sequencing template13,14

OPMERKING: Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Template Preparation Kit Set (Reagentia/Solutions/Materials) van de Sequencing Reactions Universal Kit (Materiaaltabel).

  1. Bibliotheek mix
    1. Vul de vorm in van een vooraf uitgevoerd registratieblad in het serversysteem en tag de monsterbuis met bibliotheekconcentratie en barcodenummer. Vermijd het gebruik van dezelfde barcodes op verschillende monsters in één keer.
    2. Vortex en meng het bibliotheekmonster en centrifugeer kort (5 s). Verdun alle monsters tot 100 pM met nucleasevrij water, vortex gedurende 30 s en centrifugeer het monster kort.
      OPMERKING: Aangezien DNA een gemiddelde lengte heeft van 260 bp en 1 bp 660 g/mol, berekent u de omzetting van ng/μL naar pM met behulp van de volgende vergelijking: 1 ng/μL = 5.827,5 pM/L.
    3. Pipet 10 μL van 100 pM verdunde bibliotheek in een centrifugebuis van 1,5 ml, vortex gedurende 30 s en kort centrifuge gedurende 2 s. Houd de gemengde bibliotheek op ijs.
  2. Template voorbereiding
    1. Start het sjabloonversterkingssysteem en kies het schone programma. Voeg de reactieolie toe aan 1/2 van de buis en voeg de emulgatorbreekoplossing toe aan 1/3 van de buis.
    2. Controleer of de versterkingsplaat en de wasadapter in de AAN-stand staan. Reinig de afvalfles en steek een naald in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml om afval te verzamelen. Bevestig de verwerkte stappen op het scherm van het sjabloonversterkingssysteem. Druk op NEXT om een schoon programma te starten, dat ongeveer 15 minuten duurt.
    3. Vervang de versterkingsplaat door een nieuwe na het reinigingsprogramma, plaats de opvangbuizen met 150 μL breekoplossing II in de rotor en plaats de brug op de opvangbuizen. Voeg de reactieolie toe aan 1/2 van de buis en de emulgatorbreekoplossing aan 1/3 van de buis.
    4. Emulgeer PCR-reagenspreparaat: Breng de geëmulgeerde PCR-buffer op RT in evenwicht totdat deze is opgelost, centrifugeer kort (5 s) alle reagentia en plaats ze voor gebruik op ijs.
    5. Pipet 120 μL van het geëmulgeerde PCR-enzymmengsel, 100 μL template Ion Sphere Particle (ISP's) buffer, 170,5 μL nucleasevrij water en 9,5 μL van de gemengde bibliotheek (100 pM) in een buis met 2.000 μL geëmulgeerde PCR-buffer. Meng de oplossing goed met herhaald pipetteren.
      OPMERKING: De gemengde oplossing moet binnen 15 minuten op het sjabloonversterkingssysteem worden geladen; voer alle procedures uit bij RT.
    6. Plaats een nieuw filter voor sjabloonvoorbereiding stabiel op het buisrek met het monsterportaal naar boven. Vortex de oplossing gedurende 5 s, centrifugeer kort (5 s) en breng de oplossing over in het monsterportaal van het filter na herhaaldelijk driemaal pipetteren van 800 μL. Centrifugeer de buis om de bubbels vóór de laatste injectie te verminderen. Vermijd het injecteren van lucht in het filter. Injecteer 200 μL reactieolie II na de gemengde oplossing.
    7. Draai het monsterportaal van het filter naar beneden en vervang de wasaanpassing door het filter. Steek de monsternaald in het middelste gat van het rotordeksel en druk de naald vervolgens naar beneden.
    8. Druk op de RUN-knop op het scherm, kies het programma volgens de bijbehorende kit en druk op ASSISTED om alle stappen te controleren. Druk op NEXT totdat de run is gestart; het duurt ongeveer 4,5 uur om klaar te zijn.
    9. Druk op VOLGENDE wanneer het programma is voltooid; het systeem start een centrifugatie van 10 minuten. Wanneer de centrifugatie stopt, drukt u op de knop Deksel openen en verplaatst u de opvangbuizen naar rekken. Als de procedure niet binnen 15 minuten naar de volgende stap gaat, drukt u op Final Spin om opnieuw te centrifugeren.
    10. Verwijder het supernatant in de opvangbuis en laat 100 μL oplossing in de buis achter. Meng het resterende monster door te pipetteren en breng het monster over naar de nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml met de aanduiding OT (One touch 2-systeem).
      OPMERKING: Wanneer u het supernatant pipetteert, vermijd dan het aanraken van de buisbodem langs de zijkant.
    11. Pipetteer 100 μL nucleasevrij water in elk van de opvangbuizen en breng de oplossing over naar de OT-buis die wordt gewassen met herhaald pipetteren. Voeg 600 μL nucleasevrij water toe aan de OT-buis om het totale volume 1 ml te maken, vortex gedurende 30 s en centrifugeer bij 15.500 x g gedurende 8 minuten.
    12. Verwijder voorzichtig het supernatant in de OT-buis met nog 100 μL over en gebruik de punt om de olielaag grondig weg te gooien. Voeg 900 μL nucleasevrij water toe, vortex gedurende 30 s en centrifugeer bij 15.500 x g gedurende 8 minuten.
    13. Verwijder het supernatant totdat er nog 20 μL over is, voeg de sjabloon resuspendatieoplossing toe om het volume 100 μL te maken, vortex gedurende 30 s en centrifugeer kort gedurende 2 s.
      OPMERKING: De oplossing die in deze stap wordt verkregen, moet in minder dan 12 uur naar de volgende stap gaan.
    14. Voer het schone programma uit op het sjabloonversterkingssysteem voordat u de stroom uitschakelt.
  3. Template verrijking
    1. Bereid het smeltmengsel met 280 μL tween-80 en 40 μL 1 M NaOH.
    2. Was de C1 kralen. Vortex de C1 kralen oplossing voor 30 s. Breng 100 μL kralen over in een centrifugebuis van 1,5 ml, plaats de buis gedurende 2 minuten op een magnetisch rek en gooi het supernatant weg.
    3. Breng 1 ml van de C1-kralenwasoplossing gedurende 30 s over in de buis en vortex. Centrifugeer kort (5 s), steek de buis gedurende 2 minuten in het magnetische rek en gooi het supernatant weg. Pipetteer 130 μL C1-kraal resuspensieoplossing in de buis en meng de kralen door herhaaldelijk pipetteren. Vermijd het creëren van bubbels.
    4. Laad 100 μL van de verdunde bibliotheek, 130 μL C1-kralen, 300 μL x 3 sjabloonwasoplossing en 300 μL van de smeltoplossing op de stroken met acht putten, zoals weergegeven in figuur 1.
    5. Installeer de achtputtenstrips op de verrijkingsmodule, laad de pipetteerpunt en zet de centrifugebuis van 200 μL in de opvangpositie. Druk op START om het programma uit te voeren; het duurt ongeveer 35 min.
    6. Het monster wordt automatisch verzameld in de centrifugebuis van 200 μL; sluit het deksel en centrifugeer het op 15.500 x g gedurende 5 minuten. Controleer de onderkant van de buis om te controleren of er C1-kralen achterblijven.
    7. Als er nog C1-kralen overblijven, pipetteer de sjabloonoplossing dan herhaaldelijk 10x en plaats de buis gedurende 4 minuten op het magnetische rek. Breng al het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis van 0,2 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 15.500 x g .
    8. Als er geen zichtbare C1-kralen overblijven, gooit u het supernatant weg totdat er nog 10 μL over is, voegt u 200 μL nucleasevrij water toe en mengt u door 10x te pipetteren. Centrifugeer bij 15.500 x g gedurende 5 min.
    9. Gooi het supernatant weg met nog 10 μL over en voeg 90 μL nucleasevrij water toe om een totaal volume van 100 μL te bereiken. Pipetteer 10x op en neer om de oplossing te mengen, vortex gedurende 5 s en kort centrifugeer (5 s). De oplossing kan minder dan 3 dagen bij 2-8 °C worden bewaard.

5. Next-generation sequencing 9,15

OPMERKING: Alle procedures in deze sectie worden uitgevoerd op het DA8600-sequencingplatform. Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Sequencing Kit Set (Reagentia/Oplossingen/Materialen) van de Sequencing Reactions Universal Kit (Materiaaltabel).

  1. Controleer alle reagentia en materialen die nodig zijn in een run-on sequencingplatform.
    1. Sequencingreagens: Controleer op de beschikbaarheid van sequencing-enzymoplossing (6 μL), sequencingprimers (20 μL), kwaliteitscontrolesjabloon (5 μL) en dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), opgeslagen tussen -30-10 °C.
    2. Sequencingoplossing: Controleer op de beschikbaarheid van sequencingoplossing II (100 ml), sequencingoplossing III (50 ml), gloeibuffer (1.015 μl), laadbuffer (10 μL), schuimmiddel (2 μL), chloortablet (1 tablet) en Streptavidin-kralen (100 μL), bewaard bij 4 °C.
    3. Materialen: Controleer op de beschikbaarheid van 250 ml reagentiabuis (8), 250 reagentia buisdop (8), sipper II (8), sipper (1), 2 L reagensfles (1) en sequencingchip (1), opgeslagen bij RT.
  2. Was de chip voor gebruik.
    1. Plaats één chip stabiel op een werkplaat, injecteer 100 μL nucleasevrij water in het monstergat, verwijder de oplossing in het buitenportaal en herhaal de procedure.
    2. Injecteer 100 μL 0,1 M NaOH-oplossing in de chip en incubeer gedurende 1 minuut bij RT.
    3. Injecteer 100 μL isopropanol in het monstergat, verwijder extra oplossing in het buitenportaal en herhaal de procedure opnieuw.
    4. Bedek het buitenportaal met een filterpapier, laat de stikstof instromen om de resterende isopropanol in de stroomcel van de chip te drogen en houd de kant-en-klare chip op RT.
  3. Sequencer initiatie
    1. Schakel de stikstofklep in en stel de druk af op 30 psi. Start de sequencer, druk op CLEAN op het hoofdscherm en kies water of chloride om de machine dienovereenkomstig te wassen.
      OPMERKING: Was met water voor elke run, was elke week met chloride of de tijd dat de machine klaarstaat met reagentia gedurende 48 uur.
    2. Chloride wassen: Kies één reagensfles die is gespecificeerd voor chloridewas, was de fles tweemaal met 18 MΩ water en vul de fles met 1 L 18 MΩ water. Doe een chloridetablet in de fles, los de tablet gedurende 10 minuten op, voeg 1 ml 1 M NaOH toe en keer de fles om om de oplossing te mengen. Gebruik de chlorideoplossing binnen 3 uur na bereiding.
    3. Filtreer 100 ml chlorideoplossing met een filter van 0,45 μm en verzamel met twee buisjes. Installeer de twee chloridebuizen in posities C1 en C2. Druk op CLEAN op het hoofdscherm en rust een chip uit voor chloridewas.
    4. Druk op NEXT en controleer alle stappen op het scherm om het wasprogramma te starten; het programma eindigt over 30 minuten. Begin een wasbeurt met water na de chloridewasbeurt.
    5. Waterwassing: Markeer twee buizen specifiek voor water met C1 en C2 en was de buizen tweemaal met 18 MΩ water. Voeg 100 ml water van 18 MΩ toe aan elk van de waterwasbuizen en zet ze in respectievelijk C1- en C2-posities.
    6. Kies het CLEAN-programma , installeer de chip die is voorbereid voor waterwas, druk op NEXT en controleer vervolgens alle stappen op het scherm om het wasprogramma te starten.
  4. Initialisatie
    1. Reinig de wasfles met wasoplossing II, markeer deze als W2 en was deze drie keer met 18 MΩ water.
    2. Reinig de stikstofbuis met lucht gelegd papier, steek deze in de bodem van de buis en stem de luchtstroom af op 0,5 l/min. Ontlaad de zuurstof in de fles en vul de fles met 1.920 ml water van 18 MΩ. Voeg sequentieoplossing II en 10 μL van 1 M NaOH toe aan de fles, sluit de dop en keer de fles meerdere keren om de oplossing te mengen.
    3. Markeer twee nieuwe buizen als W1 en W3. Voeg 32 μL 1 M NaOH toe aan W1, voeg 40-50 ml 1x sequentieoplossing III toe aan W3 en sluit de doppen.
      OPMERKING: 1x sequentieoplossing III moet bij het eerste gebruik gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C liggen. Sequentieoplossing II moet tegen licht worden beschermd en bij RT worden opgeslagen. De wasfles moet na 20 keer gebruik worden vervangen door een nieuwe.
    4. Druk op INITIALIZE op het hoofdscherm, wijzig de sipper op de W1-, W2- en W3-posities, stel de buizen dienovereenkomstig in op hun positie en sluit ze stevig af door rotatie. Installeer een chip voor initialisatie en controleer de statusparameters van de machine.
    5. Druk op NEXT om het initialisatieprogramma te starten; het duurt 40 minuten in het eerste gedeelte.
      OPMERKING: De handschoenen moeten worden vervangen voordat de nieuwe sipper wordt vervangen om te voorkomen dat het lichaam van de sipper wordt verontreinigd. Eenmaal gebruikt voor waterwas en initialisatie, kunnen de chips worden toegepast op initialisatie, maar gebruik niet de chips die worden gebruikt voor chloride-wash chips voor initialisatie.
    6. Los dGTP, dCTP, dATP en dTTP op ijs op en vortex om te mengen. Markeer vier nieuwe buizen als G, C, A en T en pipetteer 70 μL van de oplossing volgens de tag van de buis.
  5. Bereid de bibliotheek voor op het uitvoeren.
    1. Plaats de kwaliteitscontrolesjabloon, primers en enzymoplossing op ijs.
    2. Bereid de DNA-bibliotheek voor wanneer het initialisatieprogramma nog ongeveer 20 minuten over heeft. Vortex de kwaliteitscontrole sjabloon voor 30 s te mengen, en kort centrifugeren voor 2 s. Breng 5 μL van de kwaliteitscontrolesjabloon over in de sjabloonoplossing, vortex gedurende 5 s en centrifugeer de buis gedurende 15.500 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant door voorzichtig te pipetteren, raak de pellet niet aan en laat een volume van 10 μL in de buis.
    3. Voeg 15 μL gloeibuffer toe aan de buis; het totale volume van de oplossing is 25 μL.
    4. Vortex de sequentie primers wanneer het volledig oplost op ijs en centrifugeer kort gedurende 2 s. Breng 20 μL van de sequentieprimers over in de buis van de vorige stap, vortex gedurende 5 s, kortcentrifugeer gedurende 2 s en bewaar vervolgens bij RT voor gebruik.
  6. Het monster laden en sequencing
    1. Pipetteer 55 μL van de in de vorige stap bereide monsteroplossing en injecteer deze in het monstergat van de chip.
    2. Plaats de chip op de centrifuge; houd de inkeping naar buiten en het monsterportaal naar binnen, balanceer deze met een andere gebruikte chip en centrifugeer gedurende 10 minuten.
    3. Bereid de laadoplossing voor.
      1. Meng 0,5 ml van de gloeibuffer en 0,5 ml nucleasevrij water in een centrifugebuis van 1,5 ml. Markeer het als 50% gloeibuffer en gebruik het binnen 7 dagen.
      2. Meng 0,5 ml isopropanoloplossing en 0,5 ml gloeibuffer. Markeer het als 50% wasbuffer en gebruik het binnen 24 uur.
      3. Meng 6 μL sequentie-enzym en 60 μL 50% gloeibuffer. Markeer het als enzymreactiebuffer en plaats de oplossing na bereiding op ijs.
      4. Meng 49 μL 50% gloeibuffer en 1 μL schuimmiddel en markeer het als schuimoplossing.
    4. Blaas 100 μL lucht in de schuimoplossing, pipetteer de oplossing herhaaldelijk totdat de bellen zich in een dichte schuimtoestand bevinden en houd het schuimvolume rond de 250 μL.
    5. Plaats de chip na de centrifuge op de bank, injecteer 100 μL schuim in het monstergat en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal. Plaats de chip terug in de centrifuge en centrifugeer kort gedurende 30 s.
    6. Herhaal stap 5.6.4-5.6.5.
    7. Injecteer tweemaal 100 μL 50% wasbuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal.
    8. Injecteer driemaal 100 μL 50% gloeibuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal.
    9. Injecteer 65 μL 50% enzymreactiebuffer, vermijd bubbels en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal.
    10. Stabiliseer de geladen chip op RT gedurende 5 minuten en installeer de chip op het sequencerchipportaal. Kies het plan dat in stap 6 is geprogrammeerd, controleer de informatie en start de run; het duurt ongeveer 1,5 uur om klaar te zijn.
    11. Voer het waterwasprogramma uit binnen 72 uur nadat de run is afgelopen. Voer de chloridewas uit vóór het wassen met water wanneer de tijd hoger is dan 72 uur. Sluit de sequencer af en sluit de klep van de stikstof.

6. Plan een geïnstrueerde sequencing-run in het reporterserversysteem16

OPMERKING: Alle procedures in deze sectie worden uitgevoerd op Ion Proton Sequencer met het reporterserversysteem.

  1. Meld u aan bij het serversysteem, selecteer het tabblad Plan en klik op PlanSjabloon uitvoeren. Kies het hele genoom als uitvoeringstype en selecteer de juiste sjabloon in de lijst met sjablonen voor geplande uitvoeringen.
  2. Voer op het tabblad Plan de volgende selecties in of maak deze:
    1. Voer een nieuwe naam van het runplan in op basis van de batch monsters, selecteer hg19 (Homo sapiens) in de vervolgkeuzelijst Referentiebibliotheek en selecteer Geen in de vervolgkeuzelijst Doelregio's en Hotspotregio's .
    2. Voer het aantal streepjescodes in dat in de voorbeeldset is gebruikt, selecteer een streepjescode in de vervolgkeuzelijst voor elk voorbeeld en voer een unieke, beschrijvende naam in, die nuttig kan zijn om het voorbeeld te groeperen en bij te houden. Vermijd het gebruik van het standaardvoorbeeld 1 enzovoort.
    3. Selecteer Geen op het tabblad Ion Reporter , klik op Volgende en selecteer DNA in de toepassing en Het hele genoom als doeltechniek.
    4. Controleer op het tabblad Kits de selecties of breng wijzigingen aan terwijl dit geschikt is voor een uitvoering.
      1. Selecteer Ion Plus Fragment Library Kit in de vervolgkeuzelijst Type bibliotheekkit . Selecteer Ion PI HI-Q OT2 200 kit in de vervolgkeuzelijst Template Kit en kies OneTouch als standaard. Selecteer Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit in de vervolgkeuzelijst Sequencing Kit .
      2. Voer 300 stromen in, selecteer Ion PITM-chip in de vervolgkeuzelijst Chiptype en selecteer IonXpress in de vervolgkeuzelijst Streepjescodeset .
      3. Annuleer de selectie van Markeren als duplicaten leest en de selectie van Herschikking inschakelen.
    5. Kies de juiste plug-in op het tabblad Plug-ins om gegevensanalyse uit te voeren in stap 7. Voltooi de selecties in de projectstap, klik op Volgende en klik op Planrun in de rechterbenedenhoek om de geplande runs weer te geven.
    6. Selecteer op het tabblad Geplande runs de nieuw gemaakte uitvoering en controleer alle instellingen in het revisievenster.

7. Data-analyse

  1. Analyseer de varianten van het kopieernummer (CNV's) met behulp van een bioinformatica-workflow.
    OPMERKING: De CNV's werden geanalyseerd in de bioinformatica-workflow met de implementatie van een algoritme op basis van een verborgen Markov-model (HMM)17; het model gebruikt leesdekking over het hele genoom om het kopienummer of de ploïdiestatus van het hele getal te voorspellen (d.w.z. 0, 1, 2, 3, enz.). De algemene bioinformatica-pijplijn is gebouwd in de plug-in van een sequentieserversysteem, wat wordt gedemonstreerd in figuur 2. De bioinformatica-analysestap duurt gemiddeld 4 uur om te voltooien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Terwijl het sequentieplan eindigt na het lopende proces op de machine, rapporteert het sequentieserversysteem de samenvatting met beschrijvende informatie over gegenereerde gegevens, chipstatus, laadsnelheid van ISP en bibliotheekkwaliteit, zoals weergegeven in figuur 2. In deze resultaten werden 17,6 G-gegevens in de totale basis verkregen en de totale belastingssnelheid van ISP was 88% in de totale putten van de chip; de heatmap liet zien dat het monster gelijkmatig was geladen op de totale oppervlakte van de chip (figuur 2A). In de representatieve run werden in totaal 99.761.079 reads verkregen, waarbij 77% bruikbaar was; in alle putten geladen met ISP, had 100% sjablonen verrijkt, waarin 78% klonaal was. Van alle klonale sjablonen werd 97% gekwalificeerd als de uiteindelijke bibliotheek (figuur 2B). De gemiddelde lengte van de aflezing was respectievelijk 117 bp, 176 bp en 174 bp met gemiddelde, mediaan en modus (figuur 2C). Piektellingen van T, C en A in adapt van sjablonen waren ~ 76, wat meer is dan de gekwalificeerde cut-off lijn van 50 (figuur 2D). In alle adresseerbare putten met live ISP's werd 99,5% gekwalificeerd als de geconstrueerde bibliotheek en werd een 20% polyklonale en lage kwaliteit bibliotheek uitgefilterd. 76,6% van de ISP's kwam in aanmerking voor verdere analyse (figuur 2E).

Het resultaat van varianten van het kopienummer van een enkel monster S19030109-3 is weergegeven in figuur 3; de zwarte streepjeslijn wordt genormaliseerd als een euploïdiesegment over 22 autosomen en geslachtschromosomen, de rode lijn wordt genormaliseerd als aneuploïdiechromosoomgebied dat een mozaïektrisomie van 182,16 Mb van p16,3-q35,2 op chromosoom 4 vertegenwoordigt en een 33,13 Mb monosomiesegment van q11,1-q13,33 op chromosoom 22.

Representatieve rapporten van 12 monsters met WGA-kits en 13 monsters volgens de eenstapsmethode met behulp van onafhankelijk ontwikkelde WGA-reagentia worden respectievelijk weergegeven in tabel 4 en tabel 5, die samenvattende informatie bevatten over barcode-ID, monsternaam, aantal unieke leeswaarden, uitgelijnde leesgemiddelde lengte, gemiddelde diepte, percentage van het GC-gehalte en chromosoomvariantenmarkering. De chromosoomvarianten markeren aangetoond geslachtschromosoom, locatie en grootte van duplicatie en deletie op chromosomen.

Figure 1
Figuur 1: Diagram van de laadpositie van het monster op de strook met 8 putten. Elke put met laadinhoud aangegeven respectievelijk. U staat voor ongerijkt monster, B staat voor kralen en W staat voor wasoplossing; de lege putten zijn ook genoteerd in de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Lopende samenvatting: gegevensgrootte, laden van ISP's en statistieken van bibliotheekkwaliteit. (A) De algehele status, inclusief totale bases, sleutelsignaal en laadsnelheid van ISP's met een heatmap. (B) Totaal leeswaarden, bruikbare leessnelheid en samenvatting van ISP-informatie in elke reactiestap. (C) Het histogram van de leeslengte. (D) Consensussleutel 1-Mer van TCA. (E) Adresseerbare putten en IPS-klonale status. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeeld van gevisualiseerde kopienummervarianten plot: S19030109-3. Copy number (CN) signalen worden gevisualiseerd in een plot met blauwe en groene intervallen voor chromosomen naast elkaar. Het gegeven voorbeeld toont een verhoogde observatie van CN in chromosoom 4 en een verminderde observatie van CN in chromosoom 22, omdat de gemiddelde CNV-lijn die in rood wordt genoteerd, offset valt van 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nee. aantal cycli Temperatuur Tijd
1 cyclus 95 °C 2 min.
12cycles 95 °C 15 s
15 °C 50 s
25 °C 40 s
35 °C 30 s
65 °C 40 s
75 °C 40 s
1 cyclus 4 °C Houden

Tabel 1: Thermisch cyclusprogramma voor voorversterking. Thermische reactieomstandigheden zoals temperatuur, tijd en cycli worden weergegeven.

Stap Temperatuur Tijd Nee. aantal cycli
1 95 °C 2 min. 1
2 95 °C 15 s 14
65 °C 1 min
75 °C 1 min
3 4 °C houden 1

Tabel 2: Thermisch cyclusprogramma voor volledige genoomversterking met versterkingskits voor het hele genoom. Thermische reactieomstandigheden zoals temperatuur, tijd en cycli worden weergegeven.

Stap Temperatuur (°C) Tijd Nee. aantal cycli
1 95 °C 2 min 30 s 1
2 95 °C 30 s 6
25°C 2 min.
0,3 °C/s tot 72 °C ——
72 °C 1 min 30 s
3 95 °C 30 s 20
62 °C 30 s
72 °C 1 min
4 72 °C 2 min. 1
5 4 °C houden 1

Tabel 3: Thermisch cyclusprogramma voor versterking van het hele genoom met de onafhankelijk ontwikkelde reagentia. Thermische reactieomstandigheden zoals temperatuur, tijd en cycli worden weergegeven.

Voorbeeldnaam Unieke reads count Uitgelijnde reads Gemiddelde lengte Gemiddelde diepte CG% Sd Merken
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 XY
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
s19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 XY
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 XY
s19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 XY
S19030401-9-190 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 Xx
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 Xx
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 XY

Tabel 4: Voorbeelduitvoer van variatie in het aantal kopieën met behulp van amplificatiekits voor het hele genoom in het serversysteemrapport. Een typisch uitvoerblad bevat parameters zoals monsternaam, aantal unieke leeswaarden, uitgelijnde waarden, gemiddelde lengte, gemiddelde diepte, CG-percentage, de standaardafwijking van de lengte en voor de meesten het teken van chromosoomstatus met geslachtschromosoom gemarkeerd met XY en afgesloten CNV-detail. Een gedetecteerd CNV wordt gemarkeerd met chromosoomlocatie en fragmentgrootte.

Voorbeeldnaam Unieke reads count Uitgelijnde reads Gemiddelde lengte Gemiddelde diepte GC% Sd Merken
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 XY
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 Xx
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
s21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 Xx
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
s21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 XY
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 Xx
s21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 XY
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 Xx
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 XY

Tabel 5: Voorbeelduitvoer van variatie in het aantal kopieën door middel van eenstapsmethode met de onafhankelijk ontwikkelde reagentia voor volledige genoomversterking in het serversysteemrapport. Een typisch uitvoerblad bevat parameters zoals monsternaam, aantal unieke leeswaarden, uitgelijnde waarden, gemiddelde lengte, gemiddelde diepte, CG-percentage, de standaardafwijking van de lengte en voor de meesten het teken van chromosoomstatus met geslachtschromosoom gemarkeerd met XY en afgesloten CNV-detail. Een gedetecteerd CNV wordt gemarkeerd met chromosoomlocatie en fragmentgrootte.

Aanvullend bestand 1: Het aanbevolen volume van elk onderdeel bij het voorbereiden van een hoofdmix van verschillende batchgroottes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chromosomale aneuploïdie van embryo's is de oorzaak van een groot deel van het zwangerschapsverlies, of het nu op natuurlijke wijze is verwekt of in-vitrofertilisatie (IVF). In de klinische praktijk van IVF wordt voorgesteld dat het screenen van de embryo-aneuploïdie en het terugplaatsen van het euploïdie-embryo de uitkomst van IVF zou kunnen verbeteren. Fluorescentie in situ hybridisatie is de vroegste techniek die wordt toegepast voor geslachtsselectie en PGT-A; deze techniek vereist echter meer technische expertise van laboratoriumpersoneel en is relatief arbeidsintensief. Toenemende studies van PGT-A met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie tonen geen verbetering in levende geboortecijfers17,18.

Er is echter snelle vooruitgang geboekt in technologieën om de analyse van het aantal kopieën te beoordelen in genetische tests vóór implantatie; verschillende methoden hebben hun voor- en nadelen. Nieuw ontwikkelde uitgebreide moleculaire technieken zoals kwantitatieve fluorescentie PCR, single nucleotide polymorphism (SNP) array, array comparative genomic hybridization (aCGH) en next-generation sequencing toonden belofte in het verbeteren van IVF-uitkomsten7. Onder deze heeft NGS een hoge consistentie met array-vergelijkende genomische hybridisatie ondanks de schaalbaarheid, hogere doorvoer, eenvoudigere automatisering en meer potentieel om de kostenmet 19,20,21 te verlagen.

In combinatie met WGA-technieken zou NGS-analyse van embryobiopsie nauwkeurigere sequentie-informatie kunnen opleveren en heeft het ook een levensvatbare uitbreiding voor meer doelen van enkel nucleotideniveau. Met de toenemende toepassing van next-generation sequencing bij het detecteren van genetische afwijkingen, is er een dringende behoefte om normen op te stellen voor monster- / gegevensprocessen, zowel in het laboratorium als in de klinische praktijk 22,23,24.

In het pad van scheiding naar aneuploïdie-identificatie van het PGT-A-proces omvatten de belangrijkste stappen de scheiding, de selectie van de hele genoomversterkingsmethode, de selectie van het sequencingplatform van de volgende generatie en de analyse van sequencinggegevens. Het hele genoomversterkingsproces is de meest kritieke stap in PGT-A, die de integriteit en uniformiteit van sequencinggegevens bepaalt. Drie strategieën voor het versterken van het hele genoom werden vergeleken in een eerdere studie, en het is bewezen dat de picoPLEX quasi-willekeurige primermethode bijna net zo goed presteert als multiple displacement amplification (MDA) -methoden in termen van de integriteit en uniformiteit van sequencinggegevens25. Aangezien de klinische praktijk zich richt op copy number variations (CNV's) met een resolutie van ~ 10 Mbp in plaats van enkelvoudige nucleotidevariatie in PGT-A, werden de picoPLEX WGA-kit en de onafhankelijk ontwikkelde WGA-reagentia geselecteerd vanwege economische overwegingen. In de amplificatiefase vereist de laatste slechts één stap om de amplificatie van het hele genoom te voltooien, zonder de noodzaak van pre-amplificatie.

Er zijn twee belangrijke commerciële platforms op de markt die momenteel worden gebruikt voor PGT: de MiSeq van Illumina26 en de Ion Proton van Thermo-Fisher Scientific27. Zowel Miseq als Proton kunnen hele chromosoomaneuploïdie identificeren, maar Miseq is alleen ontworpen voor het identificeren van aneuploïdie van het hele chromosoom, terwijl het Proton ook grote deleties (dels) of duplicaties (dups) kan identificeren, inclusief klinisch significante dels of dups tot een resolutie van ongeveer 800 kb tot 1 Mb28. Het Proton-platform heeft kostenvoordelen en sterke lokale technische ondersteuning. Om deze redenen werd het Proton-platform geselecteerd voor latere klinische praktijk.

De bioinformatica-analyse van next-generation sequencinggegevens is ingewikkeld en uitdagend voor clinici in klinische toepassingen. Met de toename van gegevens in het openbare archief van menselijke genetische varianten en interpretaties zoals Clinvar29, 1000 genome30 en Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)31, zijn er meer CNV-annotaties softwaretoepassingen ontwikkeld en beschikbaar voor publiek en privaat gebruik32,33. Hier werd een lokaal ontworpen informatiesysteem, Darui-LIMS, toegepast om laboratoriumpersoneel en clinici te helpen de CNV-gegevensanalyse met één klik in de klinische praktijk van PGT-A34 te voltooien.

Onze methoden zijn speciaal ontworpen voor PGT-A en hebben een goede balans tussen resolutie, nauwkeurigheid en kosten. Standaardprocedures in de verwerking van genetisch materiaal en de pijplijn van bio-informatica kunnen consistente gegevens opleveren voor klinische analyse. Met nieuwe ontwikkelingen in technologieën op basis van het NGS-systeem kunnen aanvullende chromosoomstructurele afwijkingen zoals translocatie worden getest en gediagnosticeerd voor klinische amplificatie in de PGT-cyclus35,36. Voor deze tests moeten meer gespecialiseerde methoden worden ontwikkeld en toegepast. Toch, als een specificatie voor het begeleiden van de klinische praktijk van PGT-A, zouden deze methoden nuttig zijn voor laboratoriumpersoneel en clinici in de laboratoriumpraktijk van PGT-A op het DA8600 next-generation sequencing platform.

Deze methode heeft echter bepaalde beperkingen. In het protocol is het maximale aantal monsters dat een magnetisch rek kan ondersteunen 16; natuurlijk, afhankelijk van het werkelijke aantal klinische monsters, kan men ook een magnetisch rek kiezen om meer monsters tegelijk te ondersteunen of het aantal magnetische rekken te verhogen om meer monsterbewerkingen uit te voeren. Dit kan echter het risico op operationele fouten vergroten. Daarom worden commerciële kits op basis van halfgeleidersequencing aanbevolen bij het werken aan batches van 32 monsters of groter, zoals Ion ReproSeq PGS-kits van Thermo-Fisher Scientific.

Volgens de technische evaluatierichtlijnen voor kwaliteitscontroletechnologie van pre-implantatiechromosomale aneuploïdiedetectiereagentia (High Throughput Sequencing), afgekondigd door de China National Institutes for Food and Drug Control, is de vereiste voor het geldige gegevensvolume van een enkel monster niet minder dan 1 M. Er zijn 60-80 M reads per chip volgens het Ion PI Productoverzicht, en op basis van de experimentele ervaring zijn de geldige unieke leesgetallen niet minder dan 50% van de oorspronkelijke gegevens. Na berekening bedraagt het effectieve gegevensvolume van elk experimenteel monster niet minder dan 2 M. Daarom, om de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten te garanderen, raden we een maximale capaciteit van 16 monsters aan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen Dr. Zhangyong Ming en de heer Rongji Hou bedanken voor hun advies over de uitgebreide toepassing van LIMS. Deze studie wordt ondersteund door PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) en Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Tags

Genetica Nummer 186
Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter