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Genetics

Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

O protocolo apresenta os procedimentos gerais em laboratório necessários em testes genéticos pré-implantação para aneuploide em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Aqui apresentamos as etapas detalhadas de amplificação completa do genoma, seleção de fragmentos de DNA, construção de bibliotecas, preparação de modelos e sequenciamento do fluxo de trabalho com resultados representativos.

Abstract

O sequenciamento de última geração ganhou cada vez mais importância na aplicação clínica na determinação de variantes genéticas. No teste genético pré-implantação, essa técnica tem suas vantagens únicas em escalabilidade, throughput e custo. Para o teste genético pré-implantação para análise de aneuploide, o sistema de sequenciamento de última geração (NGS) baseado em semicondutores apresentado aqui fornece uma abordagem abrangente para determinar variantes genéticas estruturais a uma resolução mínima de 8 Mb. Desde a aquisição da amostra até o relatório final, o processo de trabalho requer múltiplas etapas com adesão próxima aos protocolos. Uma vez que várias etapas críticas poderiam determinar o resultado da amplificação, qualidade da biblioteca, cobertura de leituras e saída de dados, informações descritivas com demonstração visual diferente das palavras poderiam oferecer mais detalhes para a operação e manipulação, o que pode ter um grande impacto nos resultados de todas as etapas críticas. Os métodos aqui apresentados exibirão os procedimentos envolvidos em toda a amplificação do genoma (WGA) de células biópsias de Trophectoderme (TE), construção de biblioteca genômica, gerenciamento de sequenciadores e, finalmente, gerando relatórios de variantes de número de cópia.

Introduction

Aneuploidia é a anormalidade no número de cromossomos pela presença de um ou mais cromossomos extras ou a ausência de um ou mais cromossomos. Embriões que carregam algum tipo de aneuploidia, como a perda de um cromossomo X (síndrome de Turner), cópias extras de autossósmos, como trissomias de autossóssomo 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) e 18 (síndrome de Edwards), ou cromossomos sexuais extras como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) e 47, XXX (síndrome do X triplo), podem sobreviver a termo com defeitos de nascimento1. A aneuploidia é a principal causa de abortos no primeiro trimestre e falha na fertilização in vitro (FIV)2. Relata-se que a taxa de aneuploidia pode variar de 25,4%a 84,5% através das diferentes camadas etárias do ciclo natural e do grupo de controle medicado na práticade FIV 3.

A tecnologia de sequenciamento de última geração está se tornando extremamente aplicada na determinação de informações genéticas clinicamente; proporciona acesso prático à sequência de genomas com eficiência e alto rendimento. Particularmente, o sequenciamento de próxima geração também revolucionou o diagnóstico de distúrbios com fatores genéticos e testes de abnormidade no genoma4. Usando a tecnologia de sequenciamento de semicondutores para transferir diretamente sinais químicos no sequenciamento da bio-reação em dados digitais, o sistema de sequência baseado em semicondutores fornece uma detecção direta e em tempo real para sequenciar dados em 3-7 h 5,6.

Em um procedimento de FIV, o teste genético pré-implantação (PGT) investiga o perfil genético do embrião antes de ser transferido para o útero para melhorar o resultado da FIV e reduzir o risco de desordens genéticas em recém-nascidos 1,7. Em PGT combinado com técnicas de NGS, o material genético extraído de menos de 10 células é amplificado com kits inteiros de amplificação do genoma ou um reagente de amplificação de genoma inteiro desenvolvido de forma independente. Isso requer apenas uma etapa na fase de amplificação e não requer pré-amplificação, para obter produtos de amplificação de genoma inteiro. Primers ou painéis para variante de número de cópia e sequenciamento especial de loci genético são projetados e aplicados na biblioteca construída.

Um fluxo de trabalho típico de teste genético pré-implantação-aneuploidia (PGT-A) em NGS envolve procedimentos seriais, e requer uma carga de trabalho intensa do pessoal de laboratório8. Alguns erros de operação causaram o retrocesso do procedimento pode levar à perda indesejada de tempo e recursos do laboratório. Um procedimento operacional padrão conciso e claro (SOP) para o fluxo de trabalho PGS-NGS é útil; no entanto, os protocolos de formato de texto não podem apresentar informações mais detalhadas sobre processamento de amostras, manipulação de dispositivos e configurações de instrumentos, que podem ser visualizadas em um protocolo de vídeo. Neste artigo, um fluxo de trabalho validado combinado com uma demonstração visualizada de detalhes operacionais poderia oferecer protocolos de referência mais diretos e intuitivos na prática pgt em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores.

O protocolo aqui descreve um método que suporta loteamento de até 16 biópsias de embriões em paralelo. Para lotes maiores, recomenda-se o uso de um protocolo comercial baseado em kit para sequenciamento de semicondutores, como o Reproes-PGS.

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Protocol

Todos os protocolos e a biópsia do trophectoderm (TE) (seção 1.1.1.1) aplicada neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética em pesquisa humana do hospital nº 924 em 18 de setembro de 2017 (NO: PLA924-2017-59). Os pacientes/participantes forneceram seu consentimento por escrito informado para participar deste estudo.

1. Isolamento de DNA da biópsia humana e amplificação genômica total

  1. Protocolo para amplificação total do genoma 9,10
    NOTA: O Kit Pico PLEX WGA é usado para realizar a amplificação completa do genoma.
    1. Coleta e armazenamento de amostras
      1. Biópsia de trofetoderme: Retire em média de seis a nove células de te hérnia de embrião D5/6 após a eclosão assistida para obter uma quantidade qualificada de DNA para a seguinte amplificação.
      2. Transfira as células amostrais para um tubo PCR em 5 μL de PBS.
      3. Congele imediatamente as amostras a -80 °C se o protocolo não prosseguir diretamente para a extração do DNA.
    2. Lise celular
      NOTA: O Arquivo Suplementar 1 lista e serve como referência para os volumes recomendados de cada componente ao preparar a mistura mestre durante a lise celular e a amplificação de genoma inteiro de lotes de 1, 8, 16 e 32 amostras (com excesso de volume para acomodar erros de pipetação). Ao formular outras misturas mestras deste protocolo, o volume de cada componente é adicionalmente aumentado para acomodar o consumo de componentes causado pela repetida pipetação. Toda centrifugação breve é realizada em uma mini centrífuga de mesa para 2-10 s à temperatura ambiente (RT), com um RPM fixo de 10.000 com uma força centrífuga de 5.300 x g. A força centrífuga deve estar entre 2.000 x g e 12.000 x g.
      1. Prepare a mistura de lise celular com 4,8 μL do tampão de diluição da enzima de extração e 0,2 μL da enzima de extração celular por amostra.
      2. Pipeta 5 μL da lise celular recém-preparada mistura em cada amostra de célula de 5 μL em tubos PCR, e centrifugar brevemente o tubo em RT para 5 s. Não vórtice do tubo.
      3. Incubar a amostra em um ciclor térmico da seguinte forma: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Centrifugar brevemente (5 s) o tubo após a incubação.
    3. Pré-amplificação de todo o DNA do genoma
      1. Prepare a mistura de pré-amplificação com 4,8 μL do buffer pré-amplificador e 0,2 μL da enzima pré-amplificação por amostra.
      2. Pipeta 5 μL da mistura de pré-amplificação nos tubos de amostra através das paredes do tubo, e brevemente centrífuga para 3 s. Evite que a ponta atinja a parte inferior do tubo e não faça o vórtice do tubo.
      3. Incubar a amostra de acordo com o programa de cicloviário térmico mencionado na Tabela 1.
    4. Amplificação de DNA de genoma inteiro
      1. Centrifufique brevemente a amostra para 5 s e coloque o produto de incubação pré-amplificador no gelo.
      2. Prepare toda a mistura de amplificação do genoma com 25 μL do tampão de amplificação, 0,8 μL da enzima de amplificação e 34,2 μL de água sem nuclease por amostra.
      3. Misture 60 μL da mistura de amplificação completa do genoma recém-preparada com os 15 μL do produto de incubação pré-amplificação; o volume total precisa ser de 75 μL. Breve centrífuga para 5 s. Evite que a ponta atinja a parte inferior do tubo e não faça o vórtice do tubo.
      4. Coloque o tubo PCR no cicloviário térmico e execute o programa de cicloviário térmico mencionado na Tabela 2.
      5. Centrifugar os tubos brevemente para 5 s e transferir os produtos para um novo tubo de centrífugo de 1,5 mL.
      6. Quantifique a concentração do produto WGA com um fluorômetro11. As amostras podem ser armazenadas temporalmente a -20°C por menos de 2 meses se não forem procedidas para o próximo passo.
  2. Protocolo dos reagentes WGA desenvolvidos independentemente.
    1. Coleta e armazenamento de amostras
      1. Retire as células do embrião D5/6 após a eclosão assistida para a seguinte amplificação.
      2. Transfira as células amostrais com 1,5 μL de PBS em um tubo PCR contendo 2 μL de PBS.
        NOTA: A PBS está livre de Mg2+ e Ca2+.
      3. Congele as amostras imediatamente a -80 °C se não for diretamente procedido ao protocolo de extração de DNA.
    2. Lise celular
      1. Derreta o tampão de lise celular (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ácido tetraacetic (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM pirofosfato de sódio, 2 mM β-gliceriosfato, 0,1% SDS) na RT e colocá-lo no gelo. Adicione 2 μL de tampão de lise celular a cada amostra e centrífuga brevemente (5 s).
        NOTA: Não faça o vórtice do tubo e evite que a ponta da pipeta toque na superfície líquida do tubo para evitar tirar células ou DNA do sistema de reação.
      2. Incubar a amostra em um ciclor térmico da seguinte forma: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, espere. Centrifufique brevemente o tubo em RT por 10 s após a incubação.
    3. Amplificação de DNA de genoma inteiro
      1. Centrifufique brevemente o produto de lise celular para 5 s e coloque-o no gelo.
      2. Prepare toda a mistura de amplificação do genoma para cada amostra misturando-se com 16 μL de solução pré-misturada de amplificação, 1 μL de enzima de amplificação e 28 μL de água sem nuclease. Misture suavemente, centrífuga brevemente (5 s) e coloque a mistura no gelo. Não vórtice do tubo.
      3. Pipeta 45 μL da mistura de amplificação completa do genoma recém-preparada no produto de lise celular preparado na etapa 1.2.2.2; misture suavemente e centrífuga brevemente para 5 s.
        NOTA: Não faça o vórtice do tubo e evite que a ponta da pipeta toque o líquido no tubo.
      4. Coloque o tubo PCR no cicloviário térmico e execute o programa conforme detalhado na Tabela 3.
      5. Centrifugar os tubos em breve para 5 s e transferir os produtos para um novo tubo de centrífugo de 1,5 mL.
      6. Quantifique a concentração do produto WGA com um fluorômetro11 e regise os resultados na folha de QA (análise de qualidade). Produtos com concentrações qualificadas podem ser armazenados temporalmente a -20 °C por menos de 2 meses se não forem procedidos para o próximo passo.

2. Seleção de fragmentos de amplificação

NOTA: Os materiais utilizados nesta seção estão disponíveis no Kit de Preparação da Biblioteca (Tabela de Materiais).

  1. Preparação antes de começar
    1. Equilibre as contas magnéticas (n x 100 μL) para purificação em RT por 30 min.
    2. Restaure o produto WGA anterior para RT. Vortex o produto em RT por 30 s antes de centrifuá-lo brevemente.
    3. Prepare 70% de etanol fresco.
  2. Processo de seleção de fragmentos
    1. Pipeta 25 μL dos produtos WGA e transfira para um tubo de centrífugas de 1,5 mL com 25 μL de água sem nuclease pré-carregada.
    2. Vórtice e misture bem as contas de purificação de DNA. Alíquota de 50 μL em cada tubo de amostra (amostra original: contas (volume) = 1:1), vórtice e centrífuga brevemente (5 s). Coloque o tubo por 5 minutos no RT para o processo de ligação de DNA.
    3. Insira o tubo de centrífugas de 1,5 mL em um rack de ímã e espere até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo. Transfira cuidadosamente o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Evite encanar as contas.
    4. De acordo com o volume amostral original, pipeta 30 μL (amostra original: contas (volume) = 1:0.6) de contas magnéticas, vórtice e centrífuga brevemente (5 s). Coloque o tubo por 5 minutos no RT para o processo de ligação de DNA.
    5. Insira os tubos de centrífugas de 1,5 mL no rack de ímã e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo. Remova cuidadosamente e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.
    6. Pipeta 300 μL de 70% de etanol no tubo centrífugo de 1,5 mL, gire suavemente o tubo duas vezes com um ângulo de 180° e mova as contas ao longo da parede do tubo para uma lavagem completa. Pipeta e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.
    7. Repita o procedimento de lavagem uma vez.
    8. Remova o tubo de centrífuga de 1,5 mL do rack de ímã e centrífuga em breve (5 s). Insira os tubos de volta no rack de ímãs, e espere até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo.
    9. Pipeta cuidadosamente o líquido restante na parte inferior. Mantenha o tubo aberto para secar as contas na RT por 3-5 min. Mantenha a umidade fora das contas.
      NOTA: Feche a tampa imediatamente se surgirem rachaduras na pelota de contas.
    10. Remova os tubos do rack magnético, pipeta 25-30 μL do tampão de eluição de DNA em um tubo, e feche a tampa e o vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para obter o líquido turvo para o fundo do tubo, e definir o tubo em RT por 5 minutos.
    11. Insira os tubos de volta nos racks magnéticos, e espere até que todas as contas sejam atraídas para a parede lateral do tubo e o supernatante se torne transparente. Transfira cuidadosamente a solução de DNA para novos tubos de centrífugas de 1,5 mL. Evite encanar as contas.
    12. Quantifique a concentração de DNA após a seleção do fragmento com um fluorômetro11, armazene-o a -20°C. Normalmente, a concentração do fragmento de DNA selecionado varia de 1,5-2,4 ng/μL.

3. Preparação da biblioteca de DNA12

NOTA: Os materiais utilizados nesta seção estão disponíveis no Kit de Preparação da Biblioteca (Tabela de Materiais).

  1. Reparação final
    1. Equilibre as contas magnéticas em RT por 30 minutos.
    2. Equilibre o produto de DNA da seleção de fragmentos na etapa 2.2.12 para RT. Verifique e regise a tag em cada frasco contendo o DNA.
    3. Prepare o sistema de reparação final de DNA com 30 μL de produtos de DNA, 10 μL de tampão de reparação final, 0,5 μL de enzima de reparação final e 9,5 μL de água sem nuclease em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Vórtice do tubo para 30 s e centrífuga brevemente (5 s) em RT para obter todo o líquido para o fundo do tubo.
    4. Incubar a 25 °C por 30 min e centrífugas brevemente (5 s) o tubo após a incubação.
    5. Vórtice ou mistura reversa das contas magnéticas, e transfira 75 μL das contas magnéticas para um tubo contendo amostras de DNA reparadas por extremidade (amostra original: contas (volume) = 1:1,5). Pipeta ou vórtice suavemente para misturar bem as contas e brevemente centrífuga (5 s) para girar toda a suspensão até o fundo do tubo. Coloque o tubo por 5 minutos no RT para o processo de ligação de DNA. Vire os tubos suavemente para manter as contas dispersas.
    6. Insira os tubos de centrífugas no rack de ímã, e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral e o sobrenatante se torne transparente. Remova o supernatante e evite a pipetar as contas, mantendo os tubos no rack ao pipetar.
    7. Transfira 300 μL do recém-preparado 70% de etanol para os tubos, gire suavemente os tubos duas vezes em um ângulo de 180° e mova as contas ao longo da parede do tubo para uma lavagem completa. Pipeta e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.
    8. Repita o procedimento de lavagem uma vez.
    9. Remova os tubos de centrífugas de 1,5 mL do rack de ímã e centrífugas brevemente (5 s). Insira os tubos de volta no rack de ímãs, e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo.
    10. Pipeta cuidadosamente o líquido restante na parte inferior. Abra a tampa de tubos de centrífugas de 1,5 mL e seque as contas no RT por 3-5 min. Mantenha a umidade fora das contas.
      NOTA: Feche a tampa imediatamente se surgirem rachaduras na pelota de contas.
    11. Pipeta 33 μL de tampão de eluição de DNA em um tubo, feche a tampa e o vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para obter a suspensão turva para o fundo do tubo e definir o tubo em RT por 5 minutos.
    12. Insira os tubos de volta nos racks magnéticos, e espere até que todas as contas sejam atraídas para a parede lateral e a solução se torne transparente. Transfira cuidadosamente a solução de DNA para novos tubos de centrífugas de 1,5 mL com a etiqueta adequada, evitando a pipetação das contas.
  2. Ligadura de código de barras
    1. Coloque os reagentes de ligadura de código de barras na etapa 3.2.2 no gelo para derreter todos os reagentes congelados.
    2. Prepare o sistema de ligadura com 32 μL de produtos de DNA reparados a ponta, 10 μL de água sem nuclease, 5 μL de tampão ligase, 1 μL de ligase e 1 μL de P1 adaptado em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Pipeta 1 μL de cada reagente de código de barras na mistura de solução no tubo para uma amostra, vórtice para 5 s e centrífuga brevemente (5 s) para obter todo o líquido no fundo do tubo.
      NOTA: Ao adicionar os códigos de barras, confirme que o número de códigos de barras e amostras correspondem; abrir apenas um frasco de código de barras a cada momento para evitar a poluição mista de códigos de barras; Troque as luvas para cada cinco ou seis códigos de barras adicionados.
    3. Incubar os tubos a 25 °C por 30 min.
    4. Pipeta 75 μL (amostra original: contas (volume) = 1:1.5) das contas magnéticas em um tubo, e pipeta ou vórtice suavemente para misturar bem as contas. Centrifugar brevemente (5 s) para girar toda a suspensão até o fundo, evitando a agregação de contas. Coloque o tubo por 5 minutos no RT para o processo de ligação de DNA. Vire suavemente os tubos para manter as contas dispersas.
    5. Insira os tubos de centrífugas no rack de ímã, e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral e o sobrenatário se torne transparente. Remova o supernatante e evite estoizar as contas, mantendo os tubos no rack ao pipetar.
    6. Transfira 300 μL do recém-preparado 70% de etanol em tubos, gire suavemente os tubos duas vezes em um ângulo de 180° e mova as contas ao longo da parede do tubo para uma lavagem completa. Pipeta e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.
    7. Repita o procedimento de lavagem uma vez.
    8. Remova os tubos de centrífugas de 1,5 mL do rack de ímã e centrífugas brevemente (5 s). Insira os tubos de volta no rack de ímã e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo. Pipeta cuidadosamente o restante sobrenatante na parte inferior.
    9. Mantenha a tampa do tubo aberta para secar as contas na RT por 3-5 min. Mantenha a umidade fora das contas.
      NOTA: Feche a tampa imediatamente se surgirem rachaduras na pelota de contas.
    10. Pipeta 15 μL do tampão de elução de DNA no tubo. Enxágüe a pelota das contas até o fundo do tubo, sele a tampa e o vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para obter a suspensão turva para o fundo do tubo e manter o tubo estável em RT por 5 minutos.
  3. Amplificação de fragmentos
    1. Coloque os prédios da biblioteca no gelo quando o reagente congelado se dissolver.
    2. Transfira 47,5 μL da mistura de enzimas e 2,5 μL da mistura de primer no tubo contendo DNA e contas elucidadas, vórtice para 5 s e centrífuga brevemente (5 s) para obter todo o líquido para o fundo do tubo.
    3. Coloque o tubo em RT por 5 minutos. Insira os tubos de volta em racks magnéticos, e espere até que todas as contas sejam atraídas para a parede lateral e o supernatante fique transparente. Transfira cuidadosamente a solução de DNA para tubos PCR de 0,2 mL com etiquetas marcadas claramente, e evite a pipetação das contas.
    4. Incubar a amostra em um conjunto de ciclofaixa térmica com o seguinte programa: 72°C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 ciclos); 70 °C, 5 min. Centrifugar brevemente (5 s) o tubo quando a reação estiver concluída e armazenar os produtos a 4 °C.
    5. Transfira os produtos PCR para um tubo de centrífuga de 1,5 mL (baixa fixação). Adicione 97,5 μL (volume amostral original: contas (volume) = 1:1,5) de contas magnéticas no tubo quando a reação terminar, pipeta ou vórtice suavemente para misturar bem as contas, e brevemente centrífuga (5 s) para girar todo o líquido até o fundo. Evite a agregação de contas. Coloque o tubo em RT por 5 minutos. Vire suavemente os tubos para manter as contas dispersas.
    6. Insira os tubos de centrífugas no rack de ímã, e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral e o sobrenatante se torne transparente. Remova o supernatante, evite encanar as contas e mantenha os tubos estáveis no rack.
    7. Transfira 300 μL do recém-preparado 70% de etanol em tubos, gire suavemente os tubos duas vezes em um ângulo de 180° e mova as contas ao longo da parede do tubo para uma lavagem completa. Pipeta e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.
    8. Repita o procedimento de lavagem uma vez.
    9. Remova o tubo de centrífuga de 1,5 mL do rack de ímã e centrífuga brevemente (5 s). Insira o tubo de volta no rack de ímã, e espere por 5 minutos até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo. Pipeta cuidadosamente o líquido restante na parte inferior.
    10. Mantenha a tampa do tubo aberta para secar as contas na RT por 3-5 min. Mantenha a umidade fora das contas.
      NOTA: Feche a tampa imediatamente se surgirem rachaduras na pelota das contas.
    11. Pipeta 22 μL do tampão de elução de DNA no tubo, enxaguar a pelota das contas para baixo, e fechar a tampa e o vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para obter o líquido turvo para o fundo do tubo e definir o tubo em RT por 5 minutos.
    12. Quantifique a concentração da biblioteca de DNA construída com um fluorômetro11 e armazene a biblioteca de DNA construída a -20 °C; a concentração do fragmento de DNA selecionado varia de 0,6-10 ng/μL. Recodunfique as informações da biblioteca no banco de dados da biblioteca e armazene as amostras de acordo.

4. Preparação do modelo de sequenciamento 13,14

NOTA: Os materiais utilizados nesta seção estão disponíveis no Conjunto de Kits de Preparação de Modelos (Reagentes/Soluções/Materiais) do Kit Universal de Reações de Sequenciamento (Tabela de Materiais).

  1. Mix de biblioteca
    1. Preencha a forma de uma folha de registros pré-executada no sistema do servidor e marque o tubo de amostra com concentração de biblioteca e número de código de barras. Evite usar os mesmos códigos de barras em amostras diferentes em uma corrida.
    2. Vórtice e misture a amostra da biblioteca e centrífuga brevemente (5 s). Diluir todas as amostras para 100 pM com água sem nuclease, vórtice para 30 s e centrifugar brevemente a amostra.
      NOTA: Dado que o DNA tem um comprimento médio de 260 bp, e 1 bp é 660 g/mol, calcule a conversão de ng/μL para pM usando a seguinte equação: 1 ng/μL = 5.827,5 pM/L.
    3. Pipeta 10 μL de biblioteca diluída de 100 pM em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, vórtice para 30 s e breve centrífuga para 2 s. Mantenha a biblioteca mista no gelo.
  2. Preparação de modelos
    1. Inicie o sistema de amplificação do modelo e escolha o programa limpo. Adicione o óleo de reação a 1/2 do tubo e adicione a solução de quebra do emulsificador a 1/3 do tubo.
    2. Confirme se a placa de amplificação e o adaptador de lavagem estão definidos na posição ON . Limpe a garrafa de resíduos e coloque uma agulha em um novo tubo de centrífugas de 50 mL para coletar resíduos. Confirme as etapas processadas na tela do sistema de amplificação do modelo. Pressione AO LADO para iniciar um programa limpo, que levará cerca de 15 minutos.
    3. Substitua a placa de amplificação por uma nova após o programa limpo, insira os tubos de coleta contendo 150 μL de solução de quebra II no rotor e coloque a ponte nos tubos de coleta. Adicione o óleo de reação a 1/2 do tubo e a solução de quebra do emulsificador a 1/3 do tubo.
    4. Emulsionar a preparação do reagente PCR: Equilibre o buffer PCR emulsificado no RT até dissolver, brevemente centrífugas (5 s) todos os reagentes e coloque-os no gelo antes de usar.
    5. Pipeta 120 μL da mistura de enzima PCR emulsificada, 100 μL de tampão de partícula de esfera de íon (ISPs) de modelo, 170,5 μL de água sem nuclease e 9,5 μL da biblioteca mista (100 pM) em um tubo contendo 2.000 μL de tampão PCR emulizado. Misture bem a solução com a pipetação repetida.
      NOTA: A solução mista deve ser carregada no sistema de amplificação do modelo dentro de 15 minutos; realizar todos os procedimentos na RT.
    6. Coloque um novo filtro para a preparação do modelo estável no rack do tubo com o portal de amostra para cima. Vortex a solução para 5 s, centrífuga brevemente (5 s) e transferir a solução para o portal de amostra do filtro depois de tubos repetidamente 800 μL três vezes. Centrifugar o tubo para diminuir bolhas antes da última injeção. Evite injetar ar no filtro. Injete 200 μL de óleo de reação II seguindo a solução mista.
    7. Gire o portal de amostras do filtro para baixo e substitua a adaptação de lavagem pelo filtro. Insira a agulha da amostra no orifício central da tampa do rotor e, em seguida, pressione a agulha até o fundo.
    8. Pressione o botão RUN na tela, escolha o programa de acordo com o kit correspondente e pressione ASSISTIDO para verificar todas as etapas. Pressione NEXT até que a corrida seja iniciada; leva cerca de 4,5 h para terminar.
    9. Pressione NEXT quando o programa estiver concluído; o sistema iniciará uma centrifugação de 10 min. Quando a centrifugação parar, pressione o botão Abra a Tampa e mova os tubos de coleta para racks. Se o procedimento não for para o próximo passo em 15 minutos, pressione no Giro Final para re-centrífugas.
    10. Remova o supernatante no tubo de coleta, deixando 100 μL de solução no tubo. Misture a amostra restante por pipetação e transfira a amostra para os novos tubos de centrífugas de 1,5 mL marcados OT (Sistema One touch 2).
      NOTA: Ao pipetar o supernatante, evite tocar o fundo do tubo ao longo do lado.
    11. Pipeta 100 μL de água sem nuclease em cada um dos tubos de coleta, e transferir solução para o tubo OT lavado com tubulação repetida. Adicione 600 μL de água sem nuclease ao tubo OT para fazer o volume total de 1 mL, vórtice para 30 s e centrífuga a 15.500 x g por 8 min.
    12. Remova suavemente o supernatante no tubo OT com 100 μL restantes e use a ponta para descartar bem a camada de óleo. Adicione 900 μL de água sem nuclease, vórtice para 30 s e centrífuga a 15.500 x g por 8 min.
    13. Remova o supernatante até que reste 20 μL, adicione a solução de resususante de modelo para fazer o volume de 100 μL, vórtice para 30 s e centrífuga brevemente por 2 s.
      NOTA: A solução obtida nesta etapa deve avançar para o próximo passo em menos de 12 h.
    14. Execute o programa limpo no sistema de amplificação do modelo antes de desligar sua energia.
  3. Enriquecimento de modelo
    1. Prepare a mistura de derretimento com 280 μL de interpolação-80 e 40 μL de 1 M NaOH.
    2. Lave as contas C1. Vortex a solução de contas C1 para 30 s. Transfira 100 μL de contas para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, insira o tubo em um rack magnético por 2 minutos e descarte o supernasal.
    3. Transfira 1 mL da solução de lavagem de contas C1 para o tubo e vórtice para 30 s. Centrífuga brevemente (5 s), insira o tubo no rack magnético por 2 minutos, e descarte o sobrenante. Pipeta 130 μL de solução de resuspensão de contas C1 no tubo, e misture as contas por tubulação repetida. Evite criar bolhas.
    4. Carregar 100 μL da biblioteca diluída, 130 μL de contas C1, 300 μL x 3 solução de lavagem de modelos e 300 μL da solução de derretimento para as tiras de oito poços, como mostrado na Figura 1.
    5. Instale as tiras de oito poços no módulo de enriquecimento, carregue a ponta de pipetação e coloque o tubo de centrífuga de 200 μL na posição de coleta. Pressione o START para executar o programa; leva cerca de 35 min.
    6. A amostra será coletada automaticamente no tubo de centrífuga de 200 μL; fechar a tampa e centrifuá-la a 15.500 x g por 5 min. Verifique a parte inferior do tubo para verificar se restam as contas C1.
    7. Se permanecerem contas C1, pipeta repetidamente a solução de modelo 10x e insira o tubo no rack magnético por 4 minutos. Transfira todo o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 0,2 mL e centrífuga a 15.500 x g por 5 min.
    8. Se não houver contas C1 visíveis, descarte o supernasciente até que reste 10 μL, adicione 200 μL de água sem nuclease e misture por pipetar 10x. Centrífuga a 15.500 x g por 5 min.
    9. Descarte o supernasciente com 10 μL restantes e adicione 90 μL de água sem nuclease para atingir um volume total de 100 μL. Pipeta para cima e para baixo 10x para misturar a solução, vórtice para 5 s e brevemente centrífuga (5 s). A solução pode ser armazenada a 2-8 °C por menos de 3 dias.

5. Sequenciamento da próxima geração 9,15

NOTA: Todos os procedimentos nesta seção são realizados na plataforma de sequenciamento DA8600. Os materiais utilizados nesta seção estão disponíveis no Conjunto de Kits de Sequenciamento (Reagentes/Soluções/Materiais) do Kit Universal de Reações de Sequenciamento (Tabela de Materiais).

  1. Verifique todos os reagentes e materiais necessários em uma plataforma de sequenciamento run-on.
    1. Reagente de sequenciamento: Verifique a disponibilidade de solução enzimada sequenciadora (6 μL), primers de sequenciamento (20 μL), modelo de controle de qualidade (5 μL) e dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), armazenado entre -30-10 °C.
    2. Solução de sequenciamento: Verifique a disponibilidade da solução de sequenciamento II (100 mL), solução de sequenciamento III (50 mL), tampão de enraizamento (1.015 μL), tampão de carregamento (10 μL), agente espumante (2 μL), tablete de cloro (1 comprimido) e contas Streptavidina (100 μL), armazenadas a 4 °C.
    3. Materiais: Verifique a disponibilidade de tubo de reagente de 250 mL (8), tampa de tubo de 250 reagentes (8), sipper II (8), sipper (1), garrafa de reagente 2 L (1) e chip de sequenciamento (1), armazenado na RT.
  2. Lave o chip antes de usar.
    1. Coloque um chip estável em uma placa de trabalho, injete 100 μL de água sem nuclease no orifício da amostra, remova a solução no portal out e repita o procedimento.
    2. Injete 100 μL de solução NaOH de 0,1 M no chip e incubar por 1 min na RT.
    3. Injete 100 μL de isopropanol no orifício da amostra, remova a solução extra no portal out e repita o procedimento novamente.
    4. Cubra o portal de saída com um papel filtro, flua no nitrogênio para secar o isopropanol restante na célula de fluxo do chip e mantenha o chip pronto para uso no RT.
  3. Iniciação do sequenciador
    1. Ligue a válvula de nitrogênio e ajuste a pressão a 30 psi. Inicie o sequenciador, pressione CLEAN na tela principal e escolha água ou cloreto para lavar a máquina de acordo.
      NOTA: Lave com água antes de cada corrida, lave com cloreto toda semana ou o tempo que a máquina ficar com reagentes acima de 48 h.
    2. Lavagem de cloreto: Escolha uma garrafa de reagente especificada para lavagem de cloreto, lave a garrafa duas vezes com água de 18 MΩ e encha a garrafa com 1 L de 18 MΩ de água. Coloque um comprimido de cloreto na garrafa, dissolva o comprimido por 10 minutos, adicione 1 mL de 1 M NaOH e, em seguida, inverta a garrafa para misturar a solução. Use a solução de cloreto dentro de 3 horas após a preparação.
    3. Filtrar 100 mL de solução de cloreto com um filtro de 0,45 μm e coletar com dois tubos. Instale os dois tubos de cloreto nas posições C1 e C2. Pressione CLEAN na tela principal e equipe um chip para lavagem de cloreto.
    4. Pressione o NEXT e verifique todas as etapas na tela para iniciar o programa de lavagem; o programa terminará em 30 minutos. Comece uma lavagem com água após a lavagem do cloreto.
    5. Lavagem de água: Marque dois tubos específicos para água com C1 e C2, e lave os tubos com 18 MΩ de água duas vezes. Adicione 100 mL de água de 18 MΩ a cada um dos tubos de lavagem de água e coloque-os em posições C1 e C2, respectivamente.
    6. Escolha o programa CLEAN , instale o chip preparado para lavagem de água, pressione NEXT e, em seguida, verifique todas as etapas na tela para iniciar o programa de lavagem.
  4. Inicialização
    1. Limpe a garrafa de lavagem com a solução de lavagem II, marque-a como W2 e lave-a três vezes com água de 18 MΩ.
    2. Limpe o tubo de nitrogênio com papel colocado a ar, insira-o na parte inferior do tubo e ajuste o fluxo de ar para 0,5 L/min. Descarregar o oxigênio na garrafa e encher a garrafa com 1.920 mL de água de 18 MΩ. Adicione a solução sequencial II e 10 μL de 1 M NaOH à garrafa, feche a tampa e reverta a garrafa várias vezes para misturar a solução.
    3. Marque dois novos tubos como W1 e W3. Adicione 32 μL de 1 M NaOH ao W1, adicione 40-50 mL de solução de sequência de 1x III ao W3 e feche as tampas.
      NOTA: A solução de sequência 1x III deve estar em um banho de água de 37 °C por 30 minutos quando usado pela primeira vez. A solução sequencial II deve ser protegida contra a luz e armazenada em RT. A garrafa de lavagem deve ser substituída por uma nova depois de ser usada 20 vezes.
    4. Pressione INICIALIZE na tela principal, altere o sipper nas posições W1, W2 e W3, ajuste os tubos para sua posição de acordo e sele-os firmemente por rotação. Instale um chip para inicialização e verifique os parâmetros estaduais da máquina.
    5. Pressione AO LADO para iniciar o programa de inicialização; leva 40 minutos na primeira seção.
      NOTA: As luvas devem ser trocadas antes de trocar o novo sípper para evitar contaminar o corpo do sípere. Uma vez utilizados para lavagem e inicialização de água, os chips podem ser aplicados à inicialização, mas não usam os chips usados para lascas de lavagem de cloreto para inicialização.
    6. Dissolver dGTP, dCTP, dATP e dTTP no gelo e vórtice para misturar. Marque quatro novos tubos como G, C, A e T, e pipeta 70 μL da solução de acordo com a etiqueta do tubo.
  5. Prepare a biblioteca para correr.
    1. Coloque o modelo de controle de qualidade, primers e solução enzimás em gelo.
    2. Prepare a biblioteca de DNA quando o programa de inicialização tiver cerca de 20 minutos. Vortex o modelo de controle de qualidade para 30 s para misturar, e brevemente centrífuga para 2 s. Transfira 5 μL do modelo de controle de qualidade para a solução de modelo, vórtice para 5 s e centrifugar o tubo por 15.500 x g por 5 min. Remova o supernatante por pipeta cuidadosamente, evite tocar na pelota e deixe um volume de 10 μL no tubo.
    3. Adicionar 15 μL de tampão de ressarcimento no tubo; o volume total da solução é de 25 μL.
    4. Vórtice os primers sequenciais quando se dissolve totalmente no gelo e centrífuga brevemente para 2 s. Transfira 20 μL dos primers de sequência para o tubo do passo anterior, vórtice para 5 s, em breve centrífuga para 2 s e, em seguida, armazene no RT antes de usar.
  6. Carregando a amostra e sequenciamento
    1. Pipeta 55 μL da solução amostral preparada na etapa anterior e injetá-la no orifício amostral do chip.
    2. Coloque o chip na centrífuga; manter o entalhe em direção ao exterior e ao portal de amostra dentro, equilibrando-o com outro chip usado, e centrífuga por 10 minutos.
    3. Prepare a solução de carregamento.
      1. Misture 0,5 mL do tampão de renascimento e 0,5 mL de água sem nuclease em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Marque-o como 50% de tampão de ressarcimento e use dentro de 7 dias.
      2. Misture 0,5 mL de solução isopropanol e 0,5 mL de tampão de ressarcimento. Marque-o como 50% de tampão de lavagem e use dentro de 24 horas.
      3. Misture 6 μL de enzima sequencial e 60 μL de tampão de 50% de enalagem. Marque-o como tampão de reação enzimática, e coloque a solução no gelo após a preparação.
      4. Misture 49 μL de tampão de 50% de ressarcimento e 1 μL de agente espuma, e marque-o como solução de espuma.
    4. Sopre 100 μL de ar na solução de espuma, pipete repetidamente a solução até que as bolhas estejam em um estado de espuma densa, e mantenha o volume de espuma em torno de 250 μL.
    5. Coloque o chip no banco após a centrífuga, injete 100 μL de espuma no orifício da amostra e remova a solução extrudada no portal out. Coloque o chip de volta na centrífuga, e centrífuga brevemente por 30 s.
    6. Repetição passos 5.6.4-5.6.5.
    7. Injete 100 μL de 50% de tampão de lavagem duas vezes e remova a solução extrudada no portal out após cada injeção.
    8. Injete 100 μL de 50% de tampão de ressarcimento três vezes e remova a solução extrudada no portal out após cada injeção.
    9. Injete 65 μL de tampão de reação de enzima de 50%, evite bolhas e remova a solução extrudada no portal out.
    10. Estabilize o chip carregado em RT por 5 minutos e instale o chip no portal do chip sequenciador. Escolha o plano programado na etapa 6, verifique as informações e inicie a execução; leva cerca de 1,5h para terminar.
    11. Realize o programa de lavagem de água dentro de 72 horas após o término da corrida. Realize a lavagem do cloreto antes da lavagem da água quando o tempo exceder 72 h. Desligue o sequenciador e feche a válvula do nitrogênio.

6. Planeje uma sequência instruída executada no sistema do servidor repórter16

NOTA: Todos os procedimentos nesta seção são realizados no Ion Proton Sequencer com o sistema do servidor repórter.

  1. Faça login no sistema do servidor, selecione a guia Plano e clique em Plan Template Run. Escolha o Genoma Inteiro como tipo de execução e selecione o modelo apropriado na lista de modelos de execução planejados.
  2. Na guia Plano , digite ou faça as seguintes seleções:
    1. Digite um novo nome de plano de execução de acordo com o lote de amostras, selecione hg19 (Homo sapiens) na lista suspensa da Biblioteca de Referência e selecione Nenhuma das regiões-alvo e listas suspensas de Regiões de Hotspot .
    2. Digite o número de códigos de barras usados no conjunto de amostras, selecione um código de barras na lista suspensa para cada amostra e digite um nome único e descritivo, que pode ser útil para agrupar e rastrear a amostra. Evite o uso da amostra padrão 1 e assim por diante.
    3. Selecione Nenhum na guia Ion Reporter , clique em Next e selecione DNA na aplicação e Genoma Completo como a técnica de destino.
    4. Na guia Kits , verifique as seleções ou faça alterações enquanto for apropriado para uma corrida.
      1. Selecione o Kit de Biblioteca de Fragmentos Ion Plus na lista suspensa do Tipo de Kit de Biblioteca . Selecione o kit Ion PI HI-Q OT2 200 na lista suspensa do Kit de Modelo e escolha o OneTouch como padrão. Selecione o kit sequenciamento ion PI HI-Q 200 na lista suspensa do Kit Sequencing .
      2. Digite 300 fluxos, selecione Ion PITM Chip na lista suspensa do Tipo Chip e selecione IonXpress na lista de dropdown do Conjunto de Código de Barras .
      3. Cancele a seleção de Marcos como Leituras Duplicadas e a seleção de Ativar Realinhamento.
    5. Escolha o plugin apropriado na guia Plugins para realizar a análise de dados na etapa 7. Complete as seleções na etapa de projetos, clique em Next e clique no Plan Run no canto inferior direito para listar as Corridas Planejadas.
    6. Na guia Planned Runs , selecione a execução recém-criada e verifique todas as configurações na janela de revisão.

7. Análise de dados

  1. Analise as variantes de número de cópia (CNVs) usando um fluxo de trabalho bioinformática.
    NOTA: As CNVs foram analisadas no fluxo de trabalho bioinformática com a implementação de um algoritmo baseado em um modelo Markov oculto (HMM)17; o modelo usa a cobertura de leitura em todo o genoma para prever o número de cópia ou o status ploidy de número inteiro (ou seja, 0, 1, 2, 3, etc.). O pipeline global de bioinformática foi construído no plugin de um sistema de servidor de sequência, o que é demonstrado na Figura 2. A etapa de análise de bioinformática leva em média 4h para ser concluída.

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Representative Results

À medida que o plano de sequências termina após o processo de execução na máquina, o sistema de servidor de sequência relata o resumo com informações descritivas dos dados gerados, status do chip, taxa de carregamento isp e qualidade da biblioteca, como mostrado na Figura 2. Nesta demonstração de resultados, foram obtidos dados de 17,6 G na base total, e a taxa global de carregamento de ISP foi de 88% no total de poços do chip; o mapa de calor mostrou que a amostra foi carregada uniformemente na área total do chip (Figura 2A). Na corrida representativa, foram obtidas 99.761.079 leituras totais, nas quais 77% eram utilizáveis; em todos os poços carregados com ISP, 100% tiveram modelos enriquecidos, nos quais 78% eram clonais. De todos os modelos clonais, 97% foram classificados como biblioteca final (Figura 2B). O comprimento médio da leitura foi de 117 bp, 176 bp e 174 bp com média, mediana e modo, respectivamente (Figura 2C). As contagens máximas de T, C e A em adaptação de modelos foram ~76, que é sobre a linha de corte qualificada de 50 (Figura 2D). Em todos os poços endereçados com ISPs vivos, 99,5% foram qualificados como biblioteca construída, e uma biblioteca policlonal e de baixa qualidade de 20% foi filtrada. 76,6% dos ISPs foram qualificados para análise suplementar (Figura 2E).

O resultado das variantes numéricas de cópia de uma única amostra S19030109-3 é demonstrado na Figura 3; a linha de traço preto é normalizada como um segmento de euploidia em 22 autossómos e cromossomos sexuais, a linha vermelha é normalizada como região cromossomo aneuploidy representando uma trisomia mosaica de 182,16 Mb de p16,3-q35,2 no cromossomo 4, e um segmento monossomia de 33,13 Mb do q11.13.33 no cromossomo 22.

Relatórios representativos de 12 amostras usando kits WGA e 13 amostras pelo método de uma etapa usando reagentes WGA desenvolvidos independentemente são respectivamente mostrados na Tabela 4 e Tabela 5, que incluem informações sumárias de identificação de código de barras, nome da amostra, contagem de leituras únicas, leituras alinhadas comprimento médio, profundidade média, porcentagem de conteúdo GC e marca de variantes cromossômicas. As variantes do cromossomo marcam cromossomo sexual demonstrado, localização e tamanho de duplicação, e exclusão em cromossomos.

Figure 1
Figura 1: Diagrama da posição de carregamento da amostra na tira de 8 poços. Cada poço com o conteúdo de carregamento indicado, respectivamente. U significa amostra não enriquecida, B significa contas, e W significa solução de lavagem; os poços vazios também são notados na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resumo em execução: tamanho dos dados, carregamento de ISP e métricas de qualidade da biblioteca. (A) O status geral, incluindo bases totais, sinal-chave e taxa de carregamento de ISP com um mapa de calor. (B) Leituras totais, taxa de leitura utilizável e resumo das informações do ISP em cada etapa de reação. (C) O histograma do comprimento da leitura. (D) Chave de Consenso 1-Mer do TCA. (E) Poços endereçaveis e status clonal IPS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Exemplo de gráfico de variantes de número de cópia visualizado: S19030109-3. Os sinais de número de cópia (CN) são visualizados em um gráfico com intervalos azuis e verdes para cromossomos próximos um do outro. O exemplo dado mostra um aumento da observação da CN no cromossomo 4 e uma diminuição da observação da CN no cromossomo 22, uma vez que a linha CNV média observada em quedas vermelhas compensada a partir de 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não. de ciclos Temperatura Hora
1 ciclo 95 °C 2 min.
12º ciclos 95 °C 15 s
15 °C 50 s
25 °C 40 s
35 °C 30 s
65 °C 40 s
75 °C 40 s
1 ciclo 4 °C Segurar

Tabela 1: Programa de ciclo térmico para pré-amplificação. Condições de reação térmica, como temperatura, tempo e ciclos são mostradas.

Passo Temperatura Hora Não. de ciclos
1 95 °C 2 min. 1
2 95 °C 15 s 14
65 °C 1 min.
75 °C 1 min.
3 4 °C segurar 1

Tabela 2: Programa de ciclo térmico para amplificação completa do genoma com kits inteiros de amplificação do genoma. Condições de reação térmica, como temperatura, tempo e ciclos são mostradas.

Passo Temperatura (°C) Hora Não. de ciclos
1 95 °C 2 min 30 s 1
2 95 °C 30 s 6
25°C 2 min.
0,3 °C/s a 72 °C ——
72 °C 1 min 30 s
3 95 °C 30 s 20
62 °C 30 s
72 °C 1 min.
4 72 °C 2 min. 1
5 4 °C segurar 1

Tabela 3: Programa de ciclo térmico para amplificação total do genoma com os reagentes desenvolvidos independentemente. Condições de reação térmica, como temperatura, tempo e ciclos são mostradas.

Nome da amostra Contagem de leituras únicas Leituras alinhadas Comprimento médio Profundidade Média CG% Sd Assinalar
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 XY
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 XY
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 XY
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 XY
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 Xx
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 Xx
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 XY

Tabela 4: Exemplo de saída de variação de número de cópia usando kits inteiros de amplificação de genoma no relatório do sistema do servidor. Uma folha de saída típica inclui parâmetros como nome da amostra, contagem de leituras exclusivas, leituras alinhadas, comprimento médio, profundidade média, porcentagem de CG, o desvio padrão de comprimento e, para a maioria, a marca do status do cromossomo com cromossomo sexual marcado com XY e detalhes concluídos cnv. Um CNV detectado é marcado com localização cromossômica e tamanho do fragmento.

Nome da amostra Contagem de leituras únicas Leituras alinhadas Comprimento médio Profundidade Média GC% Sd Assinalar
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 XY
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 Xx
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 Xx
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 XY
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 Xx
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 XY
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 Xx
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 XY

Tabela 5: Exemplo de saída da variação do número de cópia por método de uma etapa com os reagentes de amplificação de genoma desenvolvidos independentemente no relatório do sistema do servidor. Uma folha de saída típica inclui parâmetros como nome da amostra, contagem de leituras exclusivas, leituras alinhadas, comprimento médio, profundidade média, porcentagem de CG, o desvio padrão de comprimento e, para a maioria, a marca do status do cromossomo com cromossomo sexual marcado com XY e detalhes concluídos cnv. Um CNV detectado é marcado com localização cromossômica e tamanho do fragmento.

Arquivo suplementar 1: O volume recomendado de cada componente ao preparar uma mistura mestre de diferentes tamanhos de lote. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

A aneuploide cromossômica dos embriões é a causa de uma grande proporção de perda de gravidez, concebida naturalmente ou in vitro (FIV). Na prática clínica da FIV, propõe-se que a triagem da aneuploidia do embrião e a transferência do embrião euploidy possam melhorar o resultado da FIV. Fluorescência na hibridização situ é a técnica mais antiga adotada para seleção sexual e PGT-A; no entanto, essa técnica requer mais conhecimento técnico do pessoal do laboratório e é relativamente trabalhosa. Estudos crescentes de PGT-A usando fluorescência na hibridização situ não mostram melhora nas taxas de natalidade ao vivo17,18.

No entanto, foram feitos rápidos avanços nas tecnologias para avaliar a análise do número de cópias em testes genéticos pré-implantação; diferentes métodos têm seus prós e contras. Técnicas moleculares abrangentes recém-desenvolvidas, como pcr de fluorescência quantitativa, matriz de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), hibridização genômica comparativa de matriz (aCGH) e sequenciamento de próxima geração mostraram-se promissores na melhoria dos resultadosda FIV 7. Entre elas, a NGS tem alta consistência com hibridização genômica comparativa de array, apesar de sua escalabilidade, maior rendimento, automação mais fácil e mais potencial para reduzir o custo 19,20,21.

Em combinação com as técnicas da WGA, a análise de NGS da biópsia de embriões poderia fornecer informações de sequência mais precisas, e também tem uma extensão viável para mais alvos de nível único de nucleotídeos. Com a crescente aplicação do sequenciamento de próxima geração na detecção de anormalidade genética, há uma necessidade urgente de construir padrões para o processo amostral/dados tanto no laboratório quanto na clínica 22,23,24.

No caminho da separação à identificação aneuploidy do processo PGT-A, os principais passos incluem a separação, a seleção de todo o método de amplificação do genoma, a seleção da plataforma de sequenciamento de próxima geração e a análise de dados de sequenciamento. Todo o processo de amplificação do genoma é o passo mais crítico no PGT-A, que determina a integridade e uniformidade dos dados de sequenciamento. Três estratégias completas de amplificação do genoma foram comparadas em um estudo anterior, e é comprovado que o método de primer quase aleatório picoPLEX executa quase, bem como métodos de amplificação de deslocamento múltiplo (MDA) em termos de integridade e uniformidade dos dados de sequenciamento25. Uma vez que a prática clínica se concentra em variações numédias de cópia (CNVs) na resolução de ~10 Mbp em vez de variação de nucleotídeo único em PGT-A, o kit picoPLEX WGA e os reagentes WGA desenvolvidos independentemente foram selecionados devido a preocupações econômicas. Na fase de amplificação, este último requer apenas um passo para completar a amplificação de todo o genoma, sem a necessidade de pré-amplificação.

Existem duas principais plataformas comerciais no mercado atualmente sendo utilizadas para PGT: o MiSeq da Illumina26 e o Ion Proton da Thermo-Fisher Scientific27. Tanto Miseq quanto Proton podem identificar aneuploide de cromossomo inteiro, mas Miseq é projetado apenas para identificar aneuploidy de todo o cromossomo, enquanto o Próton também pode identificar grandes exclusões (dels) ou duplicações (dups), incluindo dels clinicamente significativos ou dups até uma resolução de aproximadamente 800 kb a 1 Mb28. A plataforma Proton tem vantagens de custo e forte suporte técnico local. Por essas razões, a plataforma Proton foi selecionada para posterior prática clínica.

A análise bioinformática dos dados de sequenciamento de próxima geração é complicada e desafiadora para os médicos em aplicações clínicas. Com o aumento de dados no arquivo público de variantes e interpretações genéticas humanas como Clinvar29, 1000 genoma30 e Herança Mendeliana Online no Homem (OMIM)31, mais aplicações de software de anotações CNV foram desenvolvidas e estão disponíveis para uso público e privado32,33. Aqui, um sistema de informações projetado localmente, Darui-LIMS, foi aplicado para auxiliar a equipe de laboratório e médicos a concluir a análise de dados da CNV com um clique na prática clínica do PGT-A34.

Nossos métodos são projetados especificamente para PGT-A e têm um bom equilíbrio entre resolução, precisão e custo. Procedimentos padrão no processamento de materiais genéticos e no pipeline de bioinformática poderiam produzir dados consistentes para análises clínicas. Com novos avanços em tecnologias baseadas no sistema NGS, anormalidades estruturais adicionais de cromossomo, como a translocação, podem ser testadas e diagnosticadas para amplificação clínica no cicloPGT 35,36. Para esses testes, é preciso desenvolver e aplicar métodos mais especializados. Mesmo assim, como especificação para orientar a prática clínica do PGT-A, esses métodos seriam úteis para equipes de laboratório e médicos na prática laboratorial do PGT-A na plataforma de sequenciamento de última geração DA8600.

No entanto, este método tem certas limitações. No protocolo, o número máximo de amostras que um rack magnético pode suportar é de 16; é claro que, dependendo do número real de amostras clínicas, pode-se também escolher um rack magnético para suportar mais amostras de cada vez ou aumentar o número do rack magnético para realizar mais operações de amostra. No entanto, isso pode aumentar o risco de erros operacionais. Portanto, kits comerciais baseados em sequenciamento de semicondutores são recomendados ao trabalhar em lotes de 32 amostras ou maiores, como os Kits Ion ReproSeq PGS da Thermo-Fisher Scientific.

De acordo com as Diretrizes técnicas de Avaliação para Tecnologia de Controle de Qualidade de Reagentes de Detecção de Aneuploides Cromossômicas (Sequenciamento de Alto Rendimento) promulgadas pelos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Medicamentos da China, a exigência do volume de dados válido de uma única amostra não é inferior a 1 M. Existem leituras de 60-80 M por chip de acordo com a visão geral do Produto Ion PI, e com base na experiência experimental, os números de leituras exclusivas válidos não são inferiores a 50% dos dados originais. Após o cálculo, o volume efetivo de dados de cada amostra experimental não é inferior a 2 M. Portanto, para garantir a precisão dos resultados experimentais, recomendamos uma capacidade máxima de 16 amostras.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Zhangyong Ming e ao Sr. Rongji Hou por seus conselhos sobre a aplicação expandida lims. Este estudo é apoiado pelo PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Genética Edição 186
Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores
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