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Genetics

반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 Aneuploidy에 대한 이식 전 유전자 검사

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 이수성에 대한 이식 전 유전자 검사에 필요한 전체 실험실 내 절차를 제시합니다. 여기에서는 전체 게놈 증폭, DNA 단편 선택, 라이브러리 구축, 템플릿 준비 및 대표적인 결과와 함께 시퀀싱 작업 흐름의 자세한 단계를 제시합니다.

Abstract

차세대 시퀀싱은 유전자 변이의 결정에서 임상 적용에서 점점 더 중요해지고 있다. 이식 전 유전자 검사에서이 기술은 확장 성, 처리량 및 비용면에서 고유 한 이점을 가지고 있습니다. 이수성 분석을 위한 이식 전 유전자 검사의 경우, 여기에 제시된 반도체 기반 차세대 염기서열 분석(NGS) 시스템은 최소 8Mb의 분해능으로 구조적 유전 변이를 결정하는 포괄적인 접근법을 제공합니다. 샘플 수집에서 최종 보고서에 이르기까지 작업 프로세스에는 프로토콜을 밀접하게 준수하는 여러 단계가 필요합니다. 다양한 중요한 단계가 증폭의 결과, 라이브러리의 품질, 읽기 범위 및 데이터 출력을 결정할 수 있기 때문에 단어 이외의 시각적 데모를 통한 설명 정보는 모든 중요한 단계의 결과에 큰 영향을 줄 수있는 작업 및 조작에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 본원에 제시된 방법은 생검된 트로피오배엽 (TE) 세포의 전체 게놈 증폭 (WGA), 게놈 라이브러리 구축, 시퀀서 관리, 및 마지막으로 카피 번호 변이체 생성 보고에 관여하는 절차를 디스플레이할 것이다.

Introduction

Aneuploidy는 하나 이상의 여분의 염색체의 존재 또는 하나 이상의 염색체의 부재에 의한 염색체 수의 이상이다. 하나의 X 염색체 손실 (터너 증후군), 상염색체 21 (다운 증후군), 13 (파타우 증후군) 및 18 (에드워즈 증후군)의 트리솜과 같은 상염색체의 여분의 사본 또는 47, XXY (Klinefelter syndrome) 및 47, XXX (트리플 X 증후군)와 같은 여분의 성 염색체와 같은 일부 유형의 이수성을 지닌 배아는 출생 결함1과 함께 용어까지 생존 할 수 있습니다. Aneuploidy는 첫 번째 삼 분기 유산 및 체외 수정 (IVF) 실패의 주요 원인입니다2. 이수성 비율은 IVF 연습3에서 자연주기와 약용 대조군의 다른 연령층을 통해 25.4 % -84.5 %의 범위 일 수 있다고보고되었습니다.

차세대 염기서열 분석 기술은 임상적으로 유전 정보의 결정에 격렬하게 적용되고있다; 그것은 효율성과 높은 처리량으로 게놈 서열에 대한 실질적인 접근을 제공합니다. 특히, 차세대 시퀀싱은 유전 적 요인을 가진 장애의 진단과 게놈 4의 비정상성에 대한 검사에 혁명을일으켰습니다. 반도체 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱 바이오 반응의 화학 신호를 디지털 데이터로 직접 전송하는 반도체 기반 시퀀스 시스템은 3-7 h 5,6의 시퀀스 데이터에 대한 직접적이고 실시간 감지를 제공합니다.

IVF 절차에서 이식 전 유전자 검사 (PGT)는 IVF 결과를 개선하고 신생아의 유전 질환의 위험을 줄이기 위해 자궁으로 옮겨지기 전에 배아의 유전 적 프로파일을 조사합니다 1,7. NGS 기술과 결합된 PGT에서, 10개 미만의 세포로부터 추출된 유전 물질은 전체 게놈 증폭 키트 또는 독립적으로 개발된 전체 게놈 증폭 시약으로 증폭된다. 이것은 증폭 단계에서 단 한 단계만을 필요로 하며, 전체 게놈 증폭 산물을 얻기 위해 사전 증폭을 필요로 하지 않는다. 카피 수 변이체 및 특수 유전자 유전자좌 시퀀싱을 위한 프라이머 또는 패널은 구축된 라이브러리에 설계되고 적용된다.

NGS에서 이식 전 유전자 검사-이수성(PGT-A)의 전형적인 워크플로우는 일련의 절차를 포함하며, 실험실 인력의 집중적인 작업량을 필요로 한다8. 일부 오작동으로 인해 절차 롤백이 발생하면 실험실의 시간과 자원이 바람직하지 않게 손실 될 수 있습니다. PGS-NGS 워크플로우를 위한 간결하고 명확한 표준 운영 절차(SOP)가 도움이 됩니다. 그러나 단어 형식 프로토콜은 비디오 프로토콜에서 시각화할 수 있는 샘플 처리, 장치 조작 및 계측기 설정에 대한 자세한 정보를 제공할 수 없습니다. 이 기사에서는 검증된 워크플로우와 작동 세부 사항에 대한 시각화된 데모가 결합되어 반도체 시퀀싱 플랫폼의 PGT 관행에서 보다 직접적이고 직관적인 참조 프로토콜을 제공할 수 있습니다.

여기의 프로토콜은 최대 16 개의 배아 생검을 병렬로 일괄 처리하는 것을 지원하는 방법을 설명합니다. 더 큰 배치의 경우 Reproes-PGS와 같은 반도체 시퀀싱을 위한 상용 키트 기반 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다.

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Protocol

본 연구에 적용된 모든 프로토콜과 트로피코더럴(TE) 생검(1.1.1.1 섹션)은 2017년 9월 18일 제924호 병원의 인간 연구 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었다(NO: PLA924-2017-59). 환자 / 참가자는이 연구에 참여하기 위해 서면 정보에 입각 한 동의서를 제공했습니다.

1. 인간 배아 생검 및 전체 게놈 증폭으로부터의 DNA 분리

  1. 전체 게놈 증폭을 위한 프로토콜 9,10
    참고: Pico PLEX WGA 키트는 전체 게놈 증폭을 수행하는 데 사용됩니다.
    1. 샘플 수집 및 저장
      1. Trophectoderm 생검: 보조 부화 후 D5/6 배아의 탈장 TE로부터 평균 6 내지 9개의 세포를 끌어내어 다음 증폭을 위한 적격 양의 DNA를 수득한다.
      2. 샘플 세포를 5 μL의 PBS의 PCR 튜브로 옮긴다.
      3. 프로토콜이 DNA 추출을 직접 진행하지 않는 경우 -80°C에서 샘플을 즉시 동결시킨다.
    2. 세포 용해
      참고: 보충 파일 1은 세포 용해 및 1, 8, 16 및 32개 샘플의 배치의 전체 게놈 증폭 동안 마스터 믹스를 준비할 때 각 구성 요소의 권장 볼륨에 대한 참조 역할을 합니다(피펫팅 오류를 수용하기 위해 초과분). 이 프로토콜의 다른 마스터 믹스를 공식화할 때, 반복되는 피펫팅으로 인한 성분 소비를 수용하기 위해 각 성분의 부피가 추가로 증가한다. 모든 간단한 원심분리는 5,300 x g의 원심력으로 10,000의 고정 RPM으로 실온 (RT)에서 2-10 초 동안 탁상 미니 원심 분리기에서 수행됩니다. 원심력은 2,000 x g에서 12,000 x g 사이여야 합니다.
      1. 시료 당 4.8 μL의 추출효소 희석액과 0.2 μL의 세포추출효소로 세포 용해 믹스를 준비한다.
      2. 갓 제조된 세포 용해 믹스 5 μL의 피펫을 PCR 튜브에 각각 5 μL 세포 샘플에 넣고, 튜브를 RT에서 5초 동안 간단히 원심분리한다. 튜브를 와류하지 마십시오.
      3. 샘플을 다음과 같이 열 사이클러에서 인큐베이션한다: 75°C, 10분; 95°C, 4분; 25°C, 14분 인큐베이션 후 튜브를 간단히 원심분리(5초)한다.
    3. 전체 게놈 DNA의 사전 증폭
      1. 샘플 당 4.8 μL의 프리 앰프 버퍼 및 0.2 μL의 프리 앰프 효소로 예비 증폭 믹스를 준비한다.
      2. 5 μL의 피펫을 예비-증폭하여 튜브의 벽을 통해 샘플 튜브에 넣고, 3초 동안 간단히 원심분리한다. 팁이 튜브 바닥에 닿지 않도록하고 튜브를 와류하지 마십시오.
      3. 샘플을 표 1에 언급된 열 사이클러 프로그램에 따라 인큐베이션한다.
    4. 전체 게놈 DNA 증폭
      1. 샘플을 5초 동안 간단히 원심분리하고 프리앰프 인큐베이션 생성물을 얼음 위에 놓는다.
      2. 전체 게놈 증폭 믹스를 샘플 당 25 μL의 증폭 완충액, 0.8 μL의 증폭 효소, 및 34.2 μL의 뉴클레아제 무함유 물로 준비한다.
      3. 갓 제조된 전체 게놈 증폭 믹스 60 μL와 15 μL의 프리-앰프 인큐베이션 생성물을 혼합하는 단계; 총 부피는 75 μL이어야 한다. 5 초 동안 간단히 원심분리한다. 팁이 튜브 바닥에 닿지 않도록하고 튜브를 와류하지 마십시오.
      4. PCR 튜브를 열 사이클러 위에 놓고 표 2에 언급된 열 사이클러 프로그램을 실행한다.
      5. 튜브를 5초 동안 잠깐 원심분리하고 생성물을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
      6. WGA 생성물 농도를 플루오로미터11로 정량한다. 샘플은 다음 단계로 진행하지 않을 경우 2개월 미만 동안 -20°C에서 일시적으로 보관할 수 있습니다.
  2. 독립적으로 개발된 WGA 시약의 프로토콜.
    1. 샘플 수집 및 저장
      1. 다음 증폭을 위해 보조 부화 후 D5/6 배아에서 세포를 뽑습니다.
      2. 샘플 세포를 1.5 μL의 PBS와 함께 2 μL의 PBS를 함유하는 PCR 튜브로 옮긴다.
        참고: PBS는Mg2+ 및 Ca2+ 가없습니다.
      3. DNA 추출 프로토콜을 직접 진행하지 않을 경우 샘플을 -80°C에서 즉시 동결시킨다.
    2. 세포 용해
      1. RT에서 세포 용해 완충액 (40 mM 트리스 (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA), 1 % (v/v) 트리톤 X-100, 5 mM 피로인산나트륨, 2 mM β-글리세로포스페이트, 0.1% SDS)을 녹이고 얼음 위에 놓는다. 2 μL의 세포 용해 완충액을 각 샘플에 첨가하고, 간단히 원심분리한다(5초).
        참고: 튜브를 와류하지 말고, 피펫 팁이 튜브의 액체 표면에 닿지 않도록 하여 세포나 DNA가 반응 시스템에서 나오지 않도록 하십시오.
      2. 샘플을 다음과 같이 열 사이클러에서 인큐베이션한다: 55°C, 20분; 95°C, 10분; 4 °C, 홀드. 인큐베이션 후 튜브를 RT에서 10초 동안 간단히 원심분리한다.
    3. 전체 게놈 DNA 증폭
      1. 세포 용해 생성물을 5초 동안 간단히 원심분리하여 얼음 위에 놓는다.
      2. 16 μL의 증폭 예비혼합 용액, 1 μL의 증폭 효소, 및 28 μL의 뉴클레아제가 없는 물과 혼합하여 각 샘플에 대한 전체 게놈 증폭 혼합물을 제조하였다. 부드럽게 섞고, 원심 분리기를 잠깐 (5 초) 하고, 혼합물을 얼음 위에 놓는다. 튜브를 와류하지 마십시오.
      3. 갓 제조된 전체 게놈 증폭 혼합물 중 45 μL를 피펫 1.2.2.2에서 제조된 세포 용해 생성물에 넣는 단계; 부드럽게 섞어서 5초 동안 원심분리한다.
        참고: 튜브를 와류하지 말고 피펫 팁이 튜브의 액체에 닿지 않도록 하십시오.
      4. PCR 튜브를 열 사이클러 위에 놓고 표 3에 설명된 대로 프로그램을 실행한다.
      5. 튜브를 5초 동안 곧 원심분리하고 생성물을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      6. WGA 제품 농도를 형광계(11 )로 정량하고, 그 결과를 QA(품질 분석) 시트에 기록한다. 적격 농도의 제품은 다음 단계로 진행되지 않을 경우 -20°C에서 2개월 미만 동안 일시적으로 보관할 수 있습니다.

2. 증폭 단편 선택

참고: 이 섹션에서 사용되는 자료는 라이브러리 준비 키트(자료 표)에서 사용할 수 있습니다.

  1. 시작하기 전 준비
    1. 자성 비드 (nx 100 μL)를 RT에서 30분 동안 정제하기 위해 평형화시킨다.
    2. 이전 WGA 제품을 RT로 복원합니다. 제품을 RT에서 30초 동안 소용돌이치한 후 간단히 원심분리합니다.
    3. 신선한 70 % 에탄올을 준비하십시오.
  2. 조각 선택 절차
    1. WGA 생성물 25 μL를 피펫하고, 25 μL의 뉴클레아제-비함유 물이 예비로딩된 1.5 mL 원심분리 튜브 내로 옮긴다.
    2. 소용돌이 및 DNA 정제 비드를 잘 혼합한다. 50 μL의 분취량을 각 샘플 튜브에 넣고(원래 샘플: 비드(부피) = 1:1), 와류, 및 원심분리기를 간략하게 (5초) 한다. DNA 결합 과정을 위해 RT에서 5분 동안 튜브를 설정한다.
    3. 1.5 mL 원심분리 튜브를 자석 랙에 넣고 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 기다리십시오. 조심스럽게 상청액을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    4. 원래 샘플 부피에 따르면, 피펫 30 μL (원래 샘플 : 비드 (부피) = 1 : 0.6)의 자기 비드, 와류 및 원심 분리기를 간략하게 (5 초). DNA 결합 과정을 위해 RT에서 5분 동안 튜브를 설정한다.
    5. 1.5 mL 원심분리 튜브를 자석 랙에 삽입하고 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 조심스럽게 상청액을 제거하고 버리십시오. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    6. 피펫 300 μL의 70% 에탄올을 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브를 180° 각도로 두 번 부드럽게 회전시키고 튜브 벽을 따라 비드를 움직여 철저히 세척합니다. 피펫을 하고 상청액을 버린다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    7. 세척 절차를 한 번 반복하십시오.
    8. 자석 랙으로부터 1.5 mL 원심분리 튜브를 제거하고 곧 원심분리기(5초)합니다. 튜브를 자석 랙에 다시 삽입하고 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 기다리십시오.
    9. 조심스럽게 바닥에 남아있는 액체를 피펫으로 꺼냅니다. 튜브를 열어 RT에서 구슬을 3-5 분 동안 말리십시오. 구슬에서 습기를 유지하십시오.
      참고: 구슬 알갱이에 균열이 생기면 뚜껑을 즉시 닫으십시오.
    10. 마그네틱 랙에서 튜브를 분리하고, 25-30 μL의 DNA 용출 완충액을 튜브에 피펫하고, 캡과 볼록을 닫는다. 튜브의 바닥에 탁한 액체를 얻기 위해 간단히 (5 초) 원심분리하고, 튜브를 5 분 동안 RT로 설정한다.
    11. 튜브를 다시 마그네틱 랙에 삽입하고 모든 비드가 튜브 측벽에 끌리고 상층액이 투명해질 때까지 기다리십시오. DNA 용액을 조심스럽게 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    12. 단편 선택 후 DNA의 농도를 형광계11로 정량화하고, 이를 -20°C에 보관한다. 전형적으로, 선택된 DNA 단편의 농도는 1.5-2.4 ng/μL의 범위이다.

3. DNA 라이브러리의 제조12

참고: 이 섹션에서 사용되는 자료는 라이브러리 준비 키트(자료 표)에서 사용할 수 있습니다.

  1. 수리 종료
    1. 마그네틱 비드를 RT에서 30분 동안 평형화시킨다.
    2. 단계 2.2.12에서 단편 선택의 DNA 생성물을 RT로 평형화시킨다. DNA를 함유하는 각 바이알에 태그를 확인하고 기록한다.
    3. 1.5 mL 원심분리 튜브에서 30 μL의 DNA 제품, 10 μL의 말단 수리 완충액, 0.5 μL의 말단 수리 효소 및 9.5 μL의 뉴클레아제가 없는 물로 DNA 최종 복구 시스템을 제조하였다. 튜브를 30초 동안 소용돌이치고, RT에서 간단히 원심분리기(5초)하여 모든 액체를 튜브 바닥에 공급합니다.
    4. 25°C에서 30분 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 후 튜브를 간단히 원심분리(5초)한다.
    5. 자성 비드를 볼텍스 또는 역-혼합하고, 75 μL의 자성 비드를 최종 수리된 DNA 샘플을 함유하는 튜브로 옮긴다(원래 샘플: 비드(부피) = 1:1.5). 피펫 또는 부드럽게 와류하여 비드를 잘 혼합하고 간단히 원심분리기(5초)하여 모든 현탁액을 튜브의 바닥으로 아래로 회전시킨다. DNA 결합 과정을 위해 RT에서 5분 동안 튜브를 설정한다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 비드가 분산되도록 합니다.
    6. 원심분리 튜브를 자석 랙에 삽입하고 모든 자기 비드가 측벽에 끌리고 상층액이 투명해질 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 상층액을 제거하고 피펫팅을 할 때 튜브를 랙에 보관하여 비드를 피펫팅하지 마십시오.
    7. 새로 준비된 70% 에탄올 300μL를 튜브에 옮기고, 튜브를 180° 각도로 두 번 부드럽게 회전시키고, 튜브 벽을 따라 비드를 움직여 철저히 세척합니다. 피펫을 하고 상청액을 버린다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    8. 세척 절차를 한 번 반복하십시오.
    9. 자석 랙으로부터 1.5 mL 원심분리 튜브를 분리하고, 원심분리기를 잠깐 (5 초) 한다. 튜브를 자석 랙에 다시 삽입하고 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 5 분 동안 기다리십시오.
    10. 조심스럽게 바닥에 남아있는 액체를 피펫하십시오. 1.5 mL 원심분리 튜브의 뚜껑을 열고 비드를 RT에서 3-5분 동안 건조시킨다. 구슬에서 습기를 유지하십시오.
      참고: 구슬 알갱이에 균열이 생기면 뚜껑을 즉시 닫으십시오.
    11. 33 μL의 DNA 용출 완충액을 튜브에 피펫팅하고, 캡을 닫고, 와류한다. 원심분리기를 잠깐 (5 초) 하여 탁한 현탁액을 튜브의 바닥에 도착시키고 튜브를 5분 동안 RT로 설정한다.
    12. 튜브를 다시 마그네틱 랙에 삽입하고 모든 비드가 측벽에 끌리고 용액이 투명해질 때까지 기다리십시오. DNA 용액을 적절한 태그가있는 새로운 1.5 mL 원심 분리 튜브로 조심스럽게 옮기고 비드가 피펫팅되는 것을 피펫팅하지 마십시오.
  2. 바코드 결찰
    1. 단계 3.2.2에서 바코드 라이게이션 시약을 얼음 위에 놓고 모든 냉동된 시약을 녹인다.
    2. 1.5 mL 원심분리 튜브에 적응된 32 μL의 최종 수리 DNA 생성물, 10 μL의 뉴클레아제-프리 물, 5 μL의 리가아제 완충액, 1 μL의 리가아제 및 1 μL의 P1로 라이게이션 시스템을 준비한다. 각 바코드 시약 1 μL를 피펫 꺼내어 하나의 시료를 튜브에 섞어 용액으로 하고, 5초 동안 와류하고, 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 얻기 위해 간단히 원심분리(5 s)한다.
      주: 바코드를 추가할 때 바코드와 샘플 수가 일치하는지 확인하십시오. 바코드의 혼합 오염을 피하기 위해 매번 하나의 바코드 바이알 만 엽니 다. 바코드가 다섯 개 또는 여섯 개마다 추가될 때마다 장갑을 교체합니다.
    3. 튜브를 25°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
    4. 자성 비드의 피펫 75 μL (원래 샘플: 비드(volume) = 1:1.5)를 튜브에 넣고, 피펫 또는 부드럽게 와류하여 비드를 잘 혼합한다. 원심분리기를 잠깐 (5초) 하여 모든 현탁액을 바닥으로 회전시켜 비드 응집을 피한다. DNA 결합 과정을 위해 RT에서 5분 동안 튜브를 설정한다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 비드가 분산되도록 합니다.
    5. 원심분리 튜브를 자석 랙에 삽입하고 모든 자기 비드가 측벽에 끌리고 상층액이 투명해질 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 상층액을 제거하고 피펫팅을 할 때 튜브를 랙에 보관하여 비드를 피펫팅하지 마십시오.
    6. 새로 준비된 70% 에탄올 300μL를 튜브로 옮기고, 튜브를 180° 각도로 두 번 부드럽게 회전시키고, 튜브 벽을 따라 비드를 움직여 철저히 세척합니다. 피펫을 하고 상청액을 버린다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    7. 세척 절차를 한 번 반복하십시오.
    8. 자석 랙에서 1.5 mL 원심분리 튜브를 분리하고 간단히 원심분리기(5초)합니다. 튜브를 자석 랙에 다시 삽입하고 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 조심스럽게 바닥에 남아있는 상청액을 피펫하십시오.
    9. 튜브 캡을 열어 RT에서 3-5 분 동안 구슬을 말리십시오. 구슬에서 습기를 유지하십시오.
      참고: 구슬 알갱이에 균열이 생기면 뚜껑을 즉시 닫으십시오.
    10. 15 μL의 DNA 용출 완충액을 튜브 내로 피펫한다. 비드의 펠렛을 튜브 바닥으로 헹구고 뚜껑을 밀봉하고 와류하십시오. 원심분리기를 잠깐 (5초) 하여 탁한 현탁액을 튜브의 바닥에 도달시키고 튜브를 5분 동안 RT에서 일정하게 유지한다.
  3. 단편 증폭
    1. 냉동 시약이 용해 될 때 도서관 건물 시약을 얼음 위에 놓습니다.
    2. 47.5 μL의 효소 믹스와 2.5 μL의 프라이머 믹스를 용출된 DNA 및 비드가 들어있는 튜브에 옮기고, 5초 동안 와류하고, 원심분리(5초)하여 모든 액체를 튜브 바닥에 취한다.
    3. 튜브를 RT에서 5 분 동안 설정하십시오. 튜브를 다시 마그네틱 랙에 삽입하고 모든 비드가 측벽에 끌리고 상층액이 투명해질 때까지 기다리십시오. DNA 용액을 태그가 명확하게 표시된 0.2 mL PCR 튜브로 조심스럽게 옮기고 비드를 피펫팅하지 마십시오.
    4. 다음 프로그램으로 설정된 열 사이클러에서 샘플을 인큐베이션하십시오 : 72 ° C, 20 분; 98°C, 2분; 98°C, 15초; 62°C, 15초; 70°C, 1분(6사이클); 70°C, 5분 반응이 끝나면 튜브를 간단히 원심분리(5 s)하고 생성물을 4°C에서 저장한다.
    5. PCR 산물을 1.5 mL 원심분리 튜브 (낮은 부착)로 옮긴다. 반응이 끝날 때 97.5 μL의 자성 비드 (원래 샘플 부피: 비드 (부피) = 1:1.5)를 튜브에 넣고, 피펫 또는 부드럽게 와류하여 비드를 잘 혼합하고, 간단히 원심분리 (5 초)하여 모든 액체를 바닥으로 스핀 다운시킨다. 구슬 응집을 피하십시오. 튜브를 RT에서 5 분 동안 설정하십시오. 튜브를 부드럽게 뒤집어 비드가 분산되도록 합니다.
    6. 원심분리 튜브를 자석 랙에 삽입하고 모든 자기 비드가 측벽에 끌리고 상층액이 투명해질 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 상층액을 제거하고 비드를 피펫팅하지 말고 튜브를 랙에 안정적으로 유지하십시오.
    7. 새로 준비된 70% 에탄올 300μL를 튜브로 옮기고, 튜브를 180° 각도로 두 번 부드럽게 회전시키고, 튜브 벽을 따라 비드를 움직여 철저히 세척합니다. 피펫을 하고 상청액을 버린다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
    8. 세척 절차를 한 번 반복하십시오.
    9. 자석 랙으로부터 1.5 mL 원심분리 튜브를 분리하고 원심분리기를 잠깐 (5 초) 한다. 튜브를 자석 랙에 다시 삽입하고 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 조심스럽게 바닥에 남아있는 액체를 피펫하십시오.
    10. 튜브 캡을 열어 RT에서 3-5 분 동안 구슬을 말리십시오. 구슬에서 습기를 유지하십시오.
      참고: 구슬의 펠릿에 균열이 생기면 즉시 뚜껑을 닫으십시오.
    11. 22 μL의 DNA 용출 완충액을 튜브에 피펫하고, 비드의 펠렛을 아래로 헹구고, 캡과 볼텍스를 닫는다. 원심분리기를 잠깐 (5초) 하여 탁한 액체를 튜브 바닥에 놓고 튜브를 RT에서 5분 동안 설정한다.
    12. 구축된 DNA 라이브러리의 농도를 형광계(11 )로 정량하고, 구축된 DNA 라이브러리를 -20°C에서 저장하는 단계; 선택된 DNA 단편의 농도는 0.6-10 ng/μL의 범위이며, 라이브러리 데이터베이스에 라이브러리 정보를 다시 코딩하고 그에 따라 샘플을 저장합니다.

4. 시퀀싱 템플릿의 제조13,14

참고: 이 섹션에서 사용되는 재료는 시퀀싱 반응 범용 키트(재료 표)의 템플릿 준비 키트 세트(시약/솔루션/재료)에서 사용할 수 있습니다.

  1. 라이브러리 혼합
    1. 서버 시스템에서 사전 실행 기록 시트 형태를 채우고 샘플 튜브에 라이브러리 농도 및 바코드 번호를 태그합니다. 한 번의 실행으로 다른 샘플에서 동일한 바코드를 사용하지 마십시오.
    2. 라이브러리 샘플을 볼텍스와 혼합하고, 원심분리기를 간략하게 (5초) 한다. 모든 샘플을 뉴클레아제가 없는 물로 100 pM로 희석하고, 30초 동안 와류하고, 샘플을 간단히 원심분리한다.
      참고: DNA의 평균 길이가 260bp이고 1bp가 660g/mol인 경우 다음 방정식을 사용하여 ng/μL에서 pM으로의 전환율을 계산합니다: 1ng/μL = 5,827.5pM/L.
    3. 100 pM 라이브러리를 희석한 100 μL의 피펫을 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣고, 30 초 동안 와류하고, 2 초 동안 간단히 원심분리한다. 혼합 된 라이브러리를 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 템플릿 준비
    1. 템플릿 증폭 시스템을 시작하고 깨끗한 프로그램을 선택하십시오. 튜브의 1/2에 반응 오일을 첨가하고, 유화제 파단 용액을 튜브의 1/3에 첨가한다.
    2. 증폭판과 세척 어댑터가 ON 위치에 설정되어 있는지 확인합니다. 폐기물 병을 청소하고, 바늘을 새로운 50 mL 원심분리 튜브에 넣어 폐기물을 수집한다. 템플릿 증폭 시스템의 화면에서 처리된 단계를 확인합니다. NEXT 를 눌러 깨끗한 프로그램을 시작하면 약 15 분이 걸립니다.
    3. 깨끗한 프로그램 후에 증폭 플레이트를 새 것으로 교체하고, 150 μL 파단 용액 II가 들어있는 수집 튜브를 로터에 삽입하고, 수집 튜브 위에 브릿지를 놓습니다. 반응 오일을 튜브의 1/2에 첨가하고 유화제 파단 용액을 튜브의 1/3에 첨가하십시오.
    4. 유화 PCR 시약 준비: 유화 PCR 버퍼가 용해될 때까지 RT에서 평형화하고, 모든 시약을 간단히 원심분리(5초)한 다음, 사용 전에 얼음 위에 놓습니다.
    5. 120 μL의 유화 PCR 효소 믹스, 100 μL의 주형 이온 스피어 입자(ISP) 버퍼, 170.5 μL의 뉴클레아제-프리 물, 및 9.5 μL의 혼합 라이브러리(100 pM)를 2,000 μL의 유화 PCR 버퍼를 포함하는 튜브에 피펫을 넣었다. 반복적 인 피펫팅으로 용액을 잘 섞으십시오.
      참고 : 혼합 용액은 15 분 이내에 템플릿 증폭 시스템에로드해야합니다. RT에서 모든 절차를 수행하십시오.
    6. 템플릿 준비를 위한 새 필터를 샘플 포털을 위쪽으로 향하게 하여 튜브 랙에 안정적으로 배치합니다. 용액을 5 s 동안 소용돌이치고, 원심분리기를 간략하게 (5 s), 800 μL를 세 번 피펫팅을 반복한 후에 용액을 필터의 샘플 포털 내로 옮긴다. 튜브를 원심분리하여 마지막 주입 전에 기포를 줄입니다. 필터에 공기를 주입하지 마십시오. 혼합 용액에 이어 200 μL의 반응 오일 II를 주입한다.
    7. 필터의 샘플 포털을 아래쪽으로 돌리고 세척 적응을 필터로 교체합니다. 로터 뚜껑의 중앙 구멍에 샘플 바늘을 넣은 다음 바늘을 바닥으로 누릅니다.
    8. 화면에서 RUN 버튼을 누르고 해당 키트에 따라 프로그램을 선택한 다음 ASSISTD 를 눌러 모든 단계를 확인하십시오. 실행이 시작될 때까지 다음을 누릅니다. 완료하는 데 약 4.5 시간이 걸립니다.
    9. 프로그램이 끝나면 다음을 누릅니다. 시스템은 10분 원심분리를 시작할 것이다. 원심분리가 중지되면 뚜껑 열기 버튼을 누르고 수집 튜브를 랙으로 옮깁니다. 절차가 15 분 안에 다음 단계로 진행되지 않으면 Final Spin을 눌러 다시 원심분리하십시오.
    10. 수집 튜브에서 상층액을 제거하고 튜브에 100 μL의 용액을 남겨 둡니다. 피펫팅에 의해 나머지 샘플을 혼합하고, 샘플을 OT로 표시된 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브(원터치 2 시스템)로 옮긴다.
      참고: 상층액을 피펫팅할 때는 측면을 따라 튜브 바닥을 만지지 마십시오.
    11. 100 μL의 뉴클레아제-비함유 물을 각각의 수집 튜브에 피펫하고, 용액을 OT 튜브로 이송하여 반복 피펫팅으로 세척하였다. 600 μL의 뉴클레아제-프리 물을 OT 튜브에 첨가하여 총 부피를 1 mL로 만들고, 30초 동안 와류하고, 8분 동안 15,500 x g 에서 원심분리한다.
    12. 100 μL가 남아있는 OT 튜브에서 상층액을 부드럽게 제거하고 팁을 사용하여 오일층을 완전히 버립니다. 900 μL의 뉴클레아제 프리 물, 30초 동안 와류, 및 15,500 x g 에서 8분 동안 원심분리기를 첨가한다.
    13. 20 μL가 남을 때까지 상층액을 제거하고, 템플리트 재현탁 용액을 첨가하여 부피 100 μL를 만들고, 30 초 동안 와류하고, 2 초 동안 간단히 원심분리한다.
      참고: 이 단계에서 얻은 솔루션은 12시간 이내에 다음 단계로 진행해야 합니다.
    14. 전원을 끄기 전에 템플릿 증폭 시스템에서 클린 프로그램을 실행하십시오.
  3. 템플릿 보강
    1. 용융 혼합액을 280 μL의 트윈-80 및 40 μL의 1 M NaOH로 제조하였다.
    2. C1 비드를 씻으십시오. C1 비드 용액을 30초 동안 소용돌이치십시오. 비드 100μL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 튜브를 자기 랙에 2분 동안 삽입하고, 상층액을 버린다.
    3. C1 비드 세척액 1 mL를 튜브에 넣고 30초 동안 와류시킨다. 원심분리기를 잠깐 (5초) 하고, 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 삽입하고, 상층액을 버린다. 130 μL의 C1 비드 재현탁 용액을 튜브에 피펫하고, 반복 피펫팅에 의해 비드를 혼합한다. 거품을 만들지 마십시오.
    4. 도 1에 도시된 바와 같이, 희석된 라이브러리 100 μL, C1 비드 130 μL, 300 μL x 3 주형 세척액, 및 300 μL의 용융 용액을 8-웰 스트립에 로딩한다.
    5. 농축 모듈에 여덟 웰 스트립을 설치하고, 피펫팅 팁을 로드하고, 수집 위치에 200μL 원심분리 튜브를 설정합니다. START 를 눌러 프로그램을 실행하십시오. 약 35 분이 걸립니다.
    6. 샘플은 200 μL 원심분리 튜브에서 자동으로 수집됩니다. 뚜껑을 닫고 15,500 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 튜브 바닥을 점검하여 C1 비드가 남아 있는지 확인하십시오.
    7. C1 비드가 남아 있으면 템플릿 용액 10x를 반복적으로 피펫하고 튜브를 마그네틱 랙에 4 분 동안 삽입하십시오. 모든 상층액을 새로운 0.2 mL 원심분리 튜브로 옮기고 5분 동안 15,500 x g 에서 원심분리한다.
    8. 눈에 보이는 C1 비드가 남아 있지 않으면 10 μL가 남을 때까지 상층액을 버리고 뉴클레아제가없는 물 200 μL를 넣고 10x 피펫팅하여 혼합하십시오. 15,500 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
    9. 10 μL가 남아있는 상층액을 버리고, 뉴클레아제가 없는 물 90 μL를 첨가하여 총 부피 100 μL에 도달한다. 피펫을 10x 상하로 상하로 혼합하고, 용액을 5초 동안 와류하고, 간단히 원심분리(5초)한다. 용액은 2-8°C에서 3일 미만 동안 저장될 수 있다.

5. 차세대 염기서열 분석 9,15

참고: 이 섹션의 모든 절차는 DA8600 시퀀싱 플랫폼에서 수행됩니다. 이 섹션에서 사용되는 재료는 시퀀싱 반응 유니버설 키트(재료 표)의 시퀀싱 키트 세트(시약/솔루션/재료)에서 사용할 수 있습니다.

  1. 런온 시퀀싱 플랫폼에 필요한 모든 시약 및 재료를 확인하십시오.
    1. 시퀀싱 시약: -30-10°C 사이에 보관된 시퀀싱 효소 용액(6μL), 시퀀싱 프라이머(20μL), 품질 관리 주형(5μL) 및 dGTP/dCTP/dATP/dTTP(70μL)의 가용성을 확인합니다.
    2. 시퀀싱 용액: 시퀀싱 용액 II (100 mL), 시퀀싱 용액 III (50 mL), 어닐링 완충액 (1,015 μL), 로딩 완충액 (10 μL), 발포제 (2 μL), 염소 정제 (1 정), 및 스트렙타비딘 비드 (100 μL)의 가용성을 확인하고, 4°C에서 보관하였다.
    3. 재료: RT에 저장된 250mL 시약 튜브(8), 250개의 시약 튜브 캡(8), 시퍼 II(8), 시퍼(1), 2L 시약 병(1) 및 시퀀싱 칩(1)의 가용성을 확인합니다.
  2. 사용하기 전에 칩을 씻으십시오.
    1. 하나의 칩을 작업 플레이트에 안정적으로 놓고 100μL의 뉴클레아제가없는 물을 샘플 구멍에 주입하고 아웃 포털에서 용액을 제거한 다음 절차를 반복하십시오.
    2. 칩에 0.1 M NaOH 용액 100 μL를 주입하고 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다.
    3. 100 μL의 이소프로판올을 샘플 구멍에 주입하고, 아웃 포털에서 여분의 용액을 제거한 다음, 절차를 다시 반복하십시오.
    4. 아웃 포털을 여과지로 덮고, 질소를 흘려 칩의 플로우 셀에 남아있는 이소프로판올을 건조시키고, 바로 사용할 수 있는 칩을 RT에 보관하십시오.
  3. 시퀀서 개시
    1. 질소 밸브를 켜고 압력을 30 psi로 조정하십시오. 시퀀서를 시작하고 메인 화면에서 CLEAN 을 누른 다음 물이나 염화물을 선택하여 적절하게 기계를 씻으십시오.
      참고 : 모든 실행 전에 물로 씻고, 매주 염화물로 씻거나 기계가 48 시간 이상의 시약으로 대기하는 시간을 씻으십시오.
    2. 염화물 세척: 염화물 세척에 지정된 시약 병 1개를 선택하고, 18MΩ 물로 병을 두 번 세척하고, 18MΩ 물 1L로 병을 채웁니다. 1 개의 염화물 정제를 병에 넣고 10 분 동안 정제를 용해시키고 1 mL의 1 M NaOH를 첨가 한 다음 병을 역전시켜 용액을 혼합하십시오. 준비 후 3 시간 이내에 염화물 용액을 사용하십시오.
    3. 염화물 용액 100 mL를 0.45 μm 필터로 여과하고 두 개의 튜브로 수집한다. 두 개의 염화물 튜브를 위치 C1과 C2에 설치하십시오. 메인 화면에서 CLEAN 을 누르고 염화물 세척을위한 칩을 장착하십시오.
    4. NEXT를 누르고 화면의 모든 단계를 확인하여 세척 프로그램을 시작하십시오. 프로그램은 30 분 안에 끝납니다. 염화물 세척 후 물로 세척을 시작하십시오.
    5. 물 세척: C1 및 C2로 물에 특정한 튜브 2개를 표시하고 18MΩ 물로 튜브를 두 번 세척합니다. 100 mL의 18 MΩ 물을 각각의 물 세척관에 첨가하고, 각각을 C1 및 C2 위치에 놓는다.
    6. CLEAN 프로그램을 선택하고 물 세척을 위해 준비된 칩을 설치하고 NEXT를 누른 다음 화면의 모든 단계를 확인하여 세척 프로그램을 시작하십시오.
  4. 초기화
    1. 세척액 II로 세척병을 닦고 W2로 표시한 다음 18MΩ의 물로 세 번 세척하십시오.
    2. 공기 주입 종이로 질소 튜브를 청소하고 튜브 바닥에 삽입 한 다음 공기 흐름을 0.5L / min으로 조정하십시오. 병에 산소를 배출하고 병에 1,920 mL의 18 MΩ 물을 채 웁니다. 서열 용액 II 및 10 μL의 1 M NaOH를 병에 첨가하고, 뚜껑을 닫고, 병을 여러 번 역전시켜 용액을 혼합한다.
    3. 두 개의 새 튜브를 W1 및 W3으로 표시합니다. 32 μL의 1 M NaOH를 W1에 첨가하고, 40-50 mL의 1x 서열 용액 III을 W3에 첨가하고, 캡을 닫는다.
      참고: 1x 시퀀스 용액 III은 처음 사용할 때 30분 동안 37°C 수조에 있어야 합니다. 시퀀스 솔루션 II는 빛으로부터 보호되고 RT에 저장되어야 합니다. 세척 병은 20 번 사용한 후 새 병으로 교체해야합니다.
    4. 메인 화면에서 초기화 를 누르고 W1, W2 및 W3 위치의 시퍼를 변경하고 튜브를 그에 따라 위치로 설정하고 회전하여 단단히 밀봉하십시오. 초기화를위한 칩을 설치하고 기계의 상태 매개 변수를 확인하십시오.
    5. NEXT를 눌러 초기화 프로그램을 시작하십시오. 첫 번째 섹션에서 40 분이 걸립니다.
      참고: 시퍼의 몸체를 오염시키지 않도록 새 시퍼를 교체하기 전에 장갑을 교체해야 합니다. 일단 물 세척 및 초기화에 사용되면, 칩은 초기화에 적용될 수 있지만, 초기화를 위해 염화물 세척 칩에 사용되는 칩은 사용하지 않는다.
    6. 얼음 위에 dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP를 녹이고 와류를 혼합합니다. 네 개의 새로운 튜브를 G, C, A 및 T로 표시하고 튜브의 태그에 따라 용액의 피펫 70μL를 표시합니다.
  5. 실행을 위해 라이브러리를 준비합니다.
    1. 품질 관리 주형, 프라이머 및 효소 용액을 얼음 위에 놓습니다.
    2. 초기화 프로그램이 약 20분 남았을 때 DNA 라이브러리를 준비하십시오. 품질 관리 템플릿을 30초 동안 볼텍스하여 혼합하고, 2초 동안 간단히 원심분리한다. 품질 관리 템플릿 5 μL를 템플릿 용액 내로 옮기고, 5초 동안 와류하고, 튜브를 5분 동안 15,500 x g 동안 원심분리한다. 조심스럽게 피펫팅하여 상청액을 제거하고, 펠렛을 만지지 말고, 튜브에 10 μL 부피를 남겨 둡니다.
    3. 15 μL의 어닐링 완충액을 튜브 내로 첨가하는 단계; 용액의 총 부피는 25 μL이다.
    4. 서열 프라이머가 얼음 위에 완전히 용해될 때 소용돌이치고 2초 동안 간단히 원심분리한다. 서열 프라이머 20 μL를 이전 단계로부터 튜브 내로 옮기고, 5초 동안 와류하고, 2초 동안 잠시 원심분리한 다음, 사용 전에 RT에 보관한다.
  6. 샘플 로드 및 시퀀싱
    1. 이전 단계에서 준비된 샘플 용액 55 μL를 피펫하고 이를 칩의 샘플 구멍에 주입한다.
    2. 칩을 원심 분리기에 놓으십시오. 노치를 외부와 샘플 포털을 안쪽으로 향하게 유지하여 다른 사용 된 칩과 균형을 맞추고 10 분 동안 원심 분리하십시오.
    3. 로딩 용액을 준비하십시오.
      1. 어닐링 버퍼 0.5 mL와 뉴클레아제가 없는 물 0.5 mL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 섞는다. 50 % 어닐링 버퍼로 표시하고 7 일 이내에 사용하십시오.
      2. 이소프로판올 용액 0.5mL와 어닐링 완충액 0.5mL를 섞는다. 50 % 세척 완충액으로 표시하고 24 시간 이내에 사용하십시오.
      3. 6 μL의 서열 효소와 60 μL의 50% 어닐링 완충액을 혼합한다. 효소 반응 완충액으로 표시하고 준비 후 용액을 얼음 위에 놓습니다.
      4. 49μL의 50% 어닐링 버퍼와 1μL의 발포제를 혼합하고 발포 용액으로 표시하십시오.
    4. 100 μL의 공기를 발포 용액으로 불어 넣고, 거품이 조밀 한 발포 상태에 도달 할 때까지 용액을 반복적으로 피펫하고, 거품의 부피를 약 250 μL로 유지하십시오.
    5. 원심분리 후 칩을 벤치에 놓고, 100 μL의 거품을 샘플 구멍에 주입하고, 밖으로 포털에서 압출 된 용액을 제거한다. 칩을 원심분리기에 다시 넣고 30초 동안 간단히 원심분리한다.
    6. 5.6.4-5.6.5단계를 반복합니다.
    7. 50% 세척 완충액 100 μL를 두 번 주입하고, 매 주입 후 포털 밖으로 압출된 용액을 제거하였다.
    8. 100 μL의 50% 어닐링 버퍼를 세 번 주입하고, 매 주입 후 포털 밖으로 압출된 용액을 제거하였다.
    9. 65 μL의 50% 효소 반응 완충액을 주입하고, 기포를 피하고, 외출부에서 압출된 용액을 제거한다.
    10. 로드된 칩을 RT에서 5분 동안 안정화하고 칩을 시퀀서 칩 포털에 설치합니다. 단계 6에서 프로그래밍된 계획을 선택하고, 정보를 확인하고, 실행을 시작하십시오. 완료하는 데 약 1.5 시간이 걸립니다.
    11. 실행이 끝난 후 72 시간 이내에 물 세척 프로그램을 수행하십시오. 시간이 72 h를 초과하는 경우 물 세척 전에 염화물 세척을 수행하십시오. 시퀀서를 종료하고 질소의 밸브를 닫습니다.

6. 리포터 서버 시스템(16)에서 지시된 시퀀싱 실행을 계획한다.

참고: 이 섹션의 모든 절차는 리포터 서버 시스템이 있는 Ion Proton Sequencer에서 수행됩니다.

  1. 서버 시스템에 로그인하고 계획 탭을 선택한 다음 계획 템플릿 실행을 클릭합니다. 전체 게놈을 실행 유형으로 선택하고 계획된 실행 템플릿 목록에서 적절한 템플릿을 선택합니다.
  2. 계획 탭에서 다음을 입력하거나 선택합니다.
    1. 샘플 배치에 따라 새 실행 계획 이름을 입력하고 참조 라이브러리 드롭다운 목록에서 hg19(Homo sapiens)를 선택한 다음 대상 지역 및 핫스팟 영역 드롭다운 목록에서 없음을 선택합니다.
    2. 샘플 세트에 사용된 바코드 수를 입력하고, 각 샘플의 드롭다운 목록에서 바코드를 선택하고, 샘플을 그룹화하고 추적하는 데 도움이 될 수 있는 고유한 설명이 포함된 이름을 입력합니다. 기본 샘플 1 등을 사용하지 마십시오.
    3. 이온 리포터 탭에서 없음을 선택하고 다음을 클릭한 다음 응용 프로그램에서 DNA를 선택하고 전체 게놈을 대상 기술로 선택합니다.
    4. 키트 탭에서 선택 사항을 확인하거나 실행에 적합한 동안 변경합니다.
      1. 라이브러리 키트 유형 드롭다운 목록에서 Ion Plus 조각 라이브러리 키트를 선택합니다. 템플릿 키트 드롭다운 목록에서 Ion PI HI-Q OT2 200 키트를 선택하고 OneTouch를 기본값으로 선택합니다. 시퀀싱 키트 드롭다운 목록에서 Ion PI HI-Q 시퀀싱 200 키트를 선택합니다.
      2. 300개의 흐름을 입력하고 칩 유형 드롭다운 목록에서 이온 PITM 칩을 선택한 다음 바코드 세트 드롭다운 목록에서 IonXpress를 선택합니다.
      3. 중복 읽기로 표시 선택 및 재정렬 사용 선택을 취소합니다.
    5. 플러그인 탭에서 적절한 플러그인을 선택하여 7단계에서 데이터 분석을 수행합니다. 프로젝트 단계에서 선택을 완료하고 다음을 클릭한 후 오른쪽 아래 모서리에 있는 계획 실행을 클릭하여 계획된 실행을 나열합니다.
    6. 계획된 실행 탭에서 새로 만든 실행을 선택하고 검토 창에서 모든 설정을 확인합니다.

7. 데이터 분석

  1. 생물 정보학 워크 플로우를 사용하여 사본 수 변형 (CNV)을 분석하십시오.
    참고: CNV는 숨겨진 마르코프 모델(HMM)17에 기반한 알고리즘의 구현과 함께 생물정보학 워크플로우에서 분석되었다. 모델은 게놈 전반에 걸친 판독 커버리지를 사용하여 카피 수 또는 전체 수 ploidy 상태 (즉, 0, 1, 2, 3 등)를 예측합니다. 전체 생물 정보학 파이프 라인은 시퀀스 서버 시스템의 플러그인으로 구축되었으며, 이는 그림 2에서 보여줍니다. 생물정보학 분석 단계를 완료하는 데 평균 4시간이 걸립니다.

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Representative Results

시퀀스 계획이 머신에서 실행 중인 프로세스 후에 완료되면 시퀀스 서버 시스템은 그림 2와 같이 생성된 데이터, 칩 상태, ISP 로딩 속도 및 라이브러리 품질에 대한 설명 정보와 함께 요약을 보고합니다. 이 결과 데모에서 총 베이스에서 17.6G 데이터가 얻어졌으며 ISP의 전체 로딩 속도는 칩의 총 웰에서 88 %였습니다. 히트 맵은 샘플이 칩의 전체 면적에 고르게 로딩되었음을 보여주었습니다 (그림 2A). 대표적인 실행에서는 99,761,079 건의 총 판독이 이루어졌으며 77 %를 사용할 수있었습니다. ISP가로드 된 모든 우물에서 100 %는 템플릿이 풍부 해졌으며 78 %는 클론이었습니다. 모든 클론 템플릿 중에서 97%가 최종 라이브러리로 인증되었습니다(그림 2B). 판독의 평균 길이는 각각 평균, 중앙값 및 모드에서 각각 117bp, 176bp 및 174bp였다(도 2C). 템플릿 적응에서 T, C 및 A의 피크 카운트는 ~76이었으며, 이는 50의 적격 컷오프 라인을 초과합니다(그림 2D). 라이브 ISP가있는 모든 주소 지정 가능한 우물에서 99.5 %가 건설 된 라이브러리로 자격을 얻었으며 20 %의 다클론 및 저품질 라이브러리가 필터링되었습니다. ISP의 76.6%가 추가 분석 자격을 갖추었습니다(그림 2E).

단일 샘플 S19030109-3으로부터의 카피 수 변이체의 결과는 도 3에 입증된다; 검은 대시선은 22개의 상염색체 및 성 염색체에 걸친 유플로이드 세그먼트로서 정규화되고, 적색 선은 염색체 4 상의 p16.3-q35.2의 182.16 Mb 모자이크 삼염색체 영역, 및 22번 염색체 상의 q11.1-q13.33의 33.13 Mb 단염색체 세그먼트를 나타내는 이수성 염색체 영역으로서 정규화된다.

독립적으로 개발된 WGA 시약을 이용한 원스텝 방법에 의한 WGA 키트 및 13개의 샘플을 사용한 12개의 샘플에 대한 대표적인 보고는 각각 표 4 및 표 5에 제시되어 있으며, 여기에는 바코드 ID, 샘플 이름, 고유 판독 횟수, 정렬된 판독 평균 길이, 평균 깊이, GC 함량의 백분율 및 염색체 변이체 마크의 요약 정보가 포함된다. 염색체 변이체 마크는 성염색체, 중복의 위치 및 크기, 염색체에서의 결실을 입증했다.

Figure 1
그림 1: 8웰 스트립의 샘플 로딩 위치 다이어그램. 로딩 내용물이 각각 표시된 각 웰. U는 농축되지 않은 샘플, B는 비드, W는 세척 용액을 의미합니다. 빈 우물도 그림에 기록되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 실행 요약: 데이터 크기, ISP 로드 및 라이브러리 품질 메트릭. (A) 히트 맵이 있는 총 베이스, 키 신호 및 ISP 로딩 속도를 포함한 전체 상태입니다. (B) 각 반응 단계에서 총 판독률, 사용 가능한 판독률 및 ISP 정보의 요약. (C) 판독 길이의 히스토그램. (D) TCA의 합의 키 1-메르. (E) 주소 지정 가능한 웰 및 IPS 클론 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 시각화된 사본 번호 변형 플롯의 예: S19030109-3. 복사 수 (CN) 신호는 서로 옆에있는 염색체에 대한 파란색과 녹색 간격이있는 플롯으로 시각화됩니다. 주어진 예는 4번 염색체에서 CN의 증가된 관찰과 22번 염색체에서 CN의 감소된 관찰을 보여주는데, 이는 적색에서 관찰된 평균 CNV 선이 2로부터 상쇄되기 때문이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

아니요. 주기의 온도 시간
1 사이클 95 도 2 분
12사이클 95 도 15초
15 도 50초
25 °C 40초
35 °C 30초
65 °C 40초
75 °C 40초
1 사이클 4 °C 들다

표 1: 사전 증폭을 위한 열 사이클 프로그램. 온도, 시간 및 사이클과 같은 열 반응 조건이 표시됩니다.

걸음 온도 시간 아니요. 주기의
1 95 도 2 분 1
2 95 도 15초 14
65 °C 1 분
75 °C 1 분
3 4 °C 들다 1

표 2: 전체 게놈 증폭 키트를 사용한 전체 게놈 증폭을 위한 열 주기 프로그램. 온도, 시간 및 사이클과 같은 열 반응 조건이 표시됩니다.

걸음 온도(°C) 시간 아니요. 주기의
1 95 도 2분 30초 1
2 95 도 30초 6
25°C 2 분
0.3 °C/s ~ 72 °C ——
72 °C 1분 30초
3 95 도 30초 20
62 °C 30초
72 °C 1 분
4 72 °C 2 분 1
5 4 °C 들다 1

표 3: 독립적으로 개발된 시약을 사용한 전체 게놈 증폭을 위한 열 주기 프로그램. 온도, 시간 및 사이클과 같은 열 반응 조건이 표시됩니다.

샘플 이름 고유 읽기 수 정렬된 읽기 평균 길이 평균 깊이 CG% 증권 시세 표시기 마르크
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 증권 시세 표시기
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 증권 시세 표시기
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 증권 시세 표시기
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 증권 시세 표시기
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 XX
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 XX
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY, + chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 증권 시세 표시기

표 4: 서버 시스템 보고서에서 전체 게놈 증폭 키트를 사용한 카피 수 변이의 출력 예. 일반적인 출력 시트에는 샘플 이름, 고유 판독 횟수, 정렬 된 읽기, 평균 길이, 평균 깊이, CG 백분율, 길이의 표준 편차 및 대부분의 경우 XY로 태그가 지정된 성 염색체가있는 염색체 상태 표시 및 CNV 세부 사항과 같은 매개 변수가 포함됩니다. 검출된 CNV는 염색체 위치 및 단편 크기로 표시된다.

샘플 이름 고유 읽기 수 정렬된 읽기 평균 길이 평균 깊이 GC % 증권 시세 표시기 마르크
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 증권 시세 표시기
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 XX
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY, + chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 XX
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY, + chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 증권 시세 표시기
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 XX
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 증권 시세 표시기
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX, + chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 XX
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 증권 시세 표시기

표 5: 서버 시스템에서 독립적으로 개발된 전체 게놈 증폭 시약을 사용한 원스텝 방법에 의한 카피 수 변이의 실시예 출력 보고. 일반적인 출력 시트에는 샘플 이름, 고유 판독 횟수, 정렬 된 읽기, 평균 길이, 평균 깊이, CG 백분율, 길이의 표준 편차 및 대부분의 경우 XY로 태그가 지정된 성 염색체가있는 염색체 상태 표시 및 CNV 세부 사항과 같은 매개 변수가 포함됩니다. 검출된 CNV는 염색체 위치 및 단편 크기로 표시된다.

보충 파일 1: 서로 다른 배치 크기의 마스터 믹스를 준비할 때 각 구성 요소의 권장 볼륨입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

배아의 염색체 이수성은 자연적으로 임신하든 체외 수정 (IVF)이든 임신 손실의 큰 비율의 원인입니다. IVF의 임상 실습에서, 배아 이수성을 스크리닝하고 유플로이드 배아를 옮기는 것이 IVF의 결과를 향상시킬 수 있다고 제안된다. 계내 형광 혼성화는 PGT-A성 선택 및 PGT-A를 위해 채택된 최초의 기술이다; 그러나이 기술은 실험실 직원으로부터보다 기술적 인 전문 지식이 필요하며 상대적으로 노동 집약적입니다. 계내 혼성화에서 형광을 사용하는 PGT-A의 증가된 연구는 출생률17,18에서 개선되지 않음을 보여준다.

그러나 이식 전 유전자 검사에서 복제 수 분석을 평가하기위한 기술의 급속한 발전이 이루어졌습니다. 다른 방법에는 장단점이 있습니다. 정량적 형광 PCR, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 어레이, 어레이 비교 게놈 혼성화 (aCGH) 및 차세대 시퀀싱과 같은 새로 개발 된 포괄적 인 분자 기술은 IVF 결과 개선에 대한 약속을 보여주었습니다7. 이 중 NGS는 확장성, 높은 처리량, 쉬운 자동화 및19,20,21 비용을 절감 할 수있는 더 많은 잠재력에도 불구하고 어레이 비교 게놈 혼성화와 높은 일관성을 가지고 있습니다.

WGA 기술과 결합하여, 배아 생검의 NGS 분석은 보다 정확한 서열 정보를 제공할 수 있고, 또한 단일 뉴클레오티드 수준의 더 많은 표적에 대해 실행 가능한 확장을 갖는다. 유전자 이상 검출에 차세대 시퀀싱의 적용이 증가함에 따라 실험실 및 임상 실습 모두에서 샘플 / 데이터 프로세스에 대한 표준을 구축해야 할 긴급한 필요성이 있습니다22,23,24.

분리에서 PGT-A 공정의 이수성 확인까지의 경로에서, 주요 단계는 분리, 전체 게놈 증폭 방법의 선택, 차세대 시퀀싱 플랫폼의 선택, 및 시퀀싱 데이터의 분석을 포함한다. 전체 게놈 증폭 과정은 PGT-A에서 가장 중요한 단계로, 시퀀싱 데이터의 무결성과 균일성을 결정합니다. 세 가지 전체 게놈 증폭 전략이 이전 연구에서 비교되었고, picoPLEX 준 랜덤 프라이머 방법이 시퀀싱 데이터의 무결성 및 균일성 측면에서 거의 뿐만 아니라 다중 변위 증폭 (MDA) 방법도 수행한다는 것이 입증되었습니다25. 임상 실습은 PGT-A의 단일 뉴클레오티드 변이보다는 ~10 Mbb의 분해능에서 카피 수 변이(CNVs)에 초점을 맞추기 때문에, picoPLEX WGA 키트와 독립적으로 개발된 WGA 시약은 경제적 우려로 인해 선택되었다. 증폭 단계에서, 후자는 사전 증폭의 필요없이 전체 게놈의 증폭을 완료하기 위해 단 하나의 단계 만 필요로합니다.

현재 PGT에 사용되는 시장에는 두 가지 주요 상용 플랫폼이 있습니다 : 일루미나26 의 MiSeq 및 Thermo-Fisher Scientific27의 이온 양성자. Miseq와 Proton은 모두 전체 염색체 이수성을 식별 할 수 있지만 Miseq는 전체 염색체의 이수성을 식별하기 위해서만 설계되었으며 양성자는 약 800kb ~ 1Mb28의 해상도로 임상적으로 유의미한 dels 또는 dups를 포함하여 큰 결실 (dels) 또는 중복 (dups)을 식별 할 수 있습니다. Proton 플랫폼은 비용 이점과 강력한 현지 기술 지원을 제공합니다. 이러한 이유로, 양성자 플랫폼은 나중에 임상 실습을 위해 선택되었습니다.

차세대 시퀀싱 데이터의 생물정보학 분석은 임상 응용 분야의 임상의에게 복잡하고 어려운 과제입니다. Clinvar29, 1000 게놈 30 및 OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)31과 같은 인간 유전 변이 및 해석의 공개 아카이브의 데이터가 증가함에 따라 더 많은 CNV 주석 소프트웨어 응용 프로그램이 개발되었으며 공공 및 민간 용도로 사용할 수 있습니다32,33. 여기에서, 현지에서 설계된 정보 시스템인 Darui-LIMS가 적용되어 실험실 직원 및 임상의가 PGT-A(34)의 임상 실습에서 한 번의 클릭으로 CNV 데이터 분석을 완료할 수 있도록 지원하였다.

당사의 방법은 PGT-A를 위해 특별히 설계되었으며 분해능, 정확도 및 비용 간의 균형이 잘 잡혀 있습니다. 유전 물질 처리 및 생물 정보학 파이프 라인의 표준 절차는 임상 분석을위한 일관된 데이터를 생성 할 수 있습니다. NGS 시스템에 기반한 기술의 새로운 발전으로 전좌와 같은 추가적인 염색체 구조적 이상을 PGT 주기35,36에서 임상 증폭을 위해 테스트하고 진단할 수 있습니다. 이러한 테스트의 경우보다 전문화 된 방법을 개발하고 적용해야합니다. 그럼에도 불구하고, PGT-A의 임상 실습을 안내하기위한 사양으로서, 이러한 방법은 DA8600 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 PGT-A의 실험실 실습에서 실험실 직원 및 임상의에게 도움이 될 것입니다.

그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜에서 마그네틱 랙이 지원할 수 있는 최대 샘플 수는 16개입니다. 물론 실제 임상 샘플 수에 따라 한 번에 더 많은 샘플을 지원하거나 더 많은 샘플 작업을 수행하기 위해 마그네틱 랙의 수를 늘릴 수있는 마그네틱 랙을 선택할 수도 있습니다. 그러나 이로 인해 작동 오류의 위험이 높아질 수 있습니다. 따라서 반도체 시퀀싱을 기반으로 하는 상용 키트는 Thermo-Fisher Scientific의 Ion ReproSeq PGS 키트와 같이 32개 이상의 샘플 배치에서 작업할 때 권장됩니다.

중국 국립 식품 의약품 통제 연구소 (China National Institutes for Food and Drug Control)가 공표 한 이식 전 염색체 Aneuploidy 검출 시약 (High Throughput Sequencing)의 품질 관리 기술에 대한 기술 평가 지침에 따르면 단일 샘플의 유효한 데이터 볼륨에 대한 요구 사항은 1M 이상입니다. Ion PI 제품 개요에 따라 칩 당 60-80M 판독 값이 있으며 실험 경험을 기반으로 유효한 고유 판독 수치는 원본 데이터의 50 % 이상입니다. 계산 후, 각 실험 샘플의 유효 데이터 부피는 2 M 이상이다. 따라서 실험 결과의 정확성을 보장하기 위해 최대 16 개의 샘플을 사용하는 것이 좋습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 LIMS 확장 응용 프로그램에 대한 조언에 대해 Zhangyong Ming 박사와 Rongji Hou 씨에게 감사드립니다. 이 연구는 PLA 가족 계획 특별 연구 프로젝트 (17JS008, 20JSZ08), 광시 대사 질환 연구 연구소 기금 (No.20-065-76) 및 광저우 시민 건강 과학 기술 연구 프로젝트 (201803010034)가 지원합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

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References

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  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
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  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
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유전학 문제 186
반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 Aneuploidy에 대한 이식 전 유전자 검사
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Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

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