Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Предимплантационное генетическое тестирование анеуплоидии на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Протокол представляет общие лабораторные процедуры, необходимые для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию на основе полупроводниковой платформы секвенирования следующего поколения. Здесь мы представляем подробные этапы амплификации всего генома, выбора фрагментов ДНК, построения библиотеки, подготовки шаблонов и секвенирования рабочего потока с репрезентативными результатами.

Abstract

Секвенирование следующего поколения приобретает все большее значение в клиническом применении при определении генетических вариантов. В предимплантационном генетическом тесте этот метод имеет свои уникальные преимущества в масштабируемости, пропускной способности и стоимости. Для предимплантационного генетического теста для анализа анеуплоидии представленная здесь полупроводниковая система секвенирования следующего поколения (NGS) обеспечивает комплексный подход к определению структурных генетических вариантов с минимальным разрешением 8 Мб. От получения образца до окончательного отчета рабочий процесс требует нескольких этапов с строгим соблюдением протоколов. Поскольку различные критические шаги могут определять результат усиления, качество библиотеки, охват чтения и вывод данных, описательная информация с визуальной демонстрацией, отличной от слов, может предложить более подробную информацию об операции и манипуляции, что может оказать большое влияние на результаты всех критических шагов. Способы, представленные в настоящем описании, будут отображать процедуры, участвующие в амплификации всего генома (WGA) биопсий клеток трофэктодермы (TE), построении геномной библиотеки, управлении секвенсорами и, наконец, генерации отчетов о вариантах номеров копий.

Introduction

Анеуплоидия — это аномалия в количестве хромосом при наличии одной или нескольких лишних хромосом или отсутствии одной или нескольких хромосом. Эмбрионы, которые несут некоторый тип анеуплоидии, такой как потеря одной Х-хромосомы (синдром Тернера), дополнительные копии аутосом, таких как трисомы аутосомы 21 (синдром Дауна), 13 (синдром Патау) и 18 (синдром Эдвардса), или дополнительные половые хромосомы, такие как 47, XXY (синдром Клайнфельтера) и 47, XXX (синдром Тройного X), могут дожить до срока с врожденными дефектами1. Анеуплоидия является основной причиной выкидышей в первом триместре и неудачи экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)2. Сообщается, что частота анеуплоидии может варьироваться от 25,4% до 84,5% через различные возрастные слои естественного цикла и медикаментозную контрольную группу в практике ЭКО3.

Технология секвенирования следующего поколения получает широкое применение при клиническом определении генетической информации; он обеспечивает практический доступ к последовательности генома с эффективностью и высокой пропускной способностью. В частности, секвенирование следующего поколения также произвело революцию в диагностике расстройств с генетическими факторами и тестах на аномалию в геноме4. Используя технологию секвенирования полупроводников для непосредственной передачи химических сигналов при секвенировании биореакций в цифровые данные, система последовательностей на основе полупроводников обеспечивает прямое обнаружение в режиме реального времени для последовательности данных за 3-7 ч 5,6.

В процедуре ЭКО предимплантационное генетическое тестирование (PGT) исследует генетический профиль эмбриона перед переносом в матку для улучшения результатов ЭКО и снижения риска генетических нарушений у новорожденных 1,7. В PGT в сочетании с методами NGS генетический материал, извлеченный из менее чем 10 клеток, амплментируется с помощью наборов для амплификации всего генома или независимо разработанного реагента амплификации всего генома. Это требует только одного шага в фазе амплификации и не требует предварительной амплификации для получения продуктов амплификации всего генома. В построенной библиотеке разработаны и применены праймеры или панели для варианта номера копии и специального секвенирования локусов генов.

Типичный рабочий процесс предимплантационного генетического тестирования-анеуплоидии (PGT-A) в NGS включает в себя последовательные процедуры и требует интенсивной рабочей нагрузки лабораторного персонала8. Некоторая неправильная работа, вызванная откатом процедуры, может привести к нежелательной потере как времени, так и ресурсов лаборатории. Полезна краткая и четкая стандартная операционная процедура (СОП) для рабочего процесса PGS-NGS; однако протоколы текстового формата не могут предоставлять более подробную информацию об обработке образцов, манипулировании устройствами и настройках инструментов, которая может быть визуализирована в видеопротоколе. В этой статье проверенный рабочий процесс в сочетании с визуализированной демонстрацией рабочих деталей может предложить более прямые и интуитивно понятные ссылающиеся протоколы в практике PGT на платформе секвенирования полупроводников.

Протокол здесь описывает метод, который поддерживает пакетирование до 16 биопсий эмбрионов параллельно. Для больших партий рекомендуется использовать коммерческий протокол секвенирования полупроводников на основе комплектов, такой как Reproes-PGS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы и биопсия трофэктодермы (TE) (раздел 1.1.1.1), примененные в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены комитетом по этике исследований человека больницы No 924 18 сентября 2017 года (NO: PLA924-2017-59). Пациенты/участники предоставили свое письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

1. Выделение ДНК из биопсии эмбриона человека и цельная геномная амплификация

  1. Протокол амплификации всего генома 9,10
    ПРИМЕЧАНИЕ: Pico PLEX WGA Kit используется для выполнения амплификации всего генома.
    1. Сбор и хранение образцов
      1. Биопсия трофэктодермы: Извлечение в среднем от шести до девяти клеток из грыжи TE эмбриона D5/6 после вспомогательного вылупления для получения квалифицированного количества ДНК для последующей амплификации.
      2. Переведите образцы клеток в ПЦР-трубку в 5 мкл PBS.
      3. Немедленно заморозьте образцы при -80 °C, если протокол не приступает непосредственно к извлечению ДНК.
    2. Лизис клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный файл 1 перечисляет и служит справочным материалом для рекомендуемых объемов каждого компонента при приготовлении мастер-микса во время лизиса клеток и амплификации всего генома партий из 1, 8, 16 и 32 образцов (с превышением для учета ошибок пипетирования). При формулировании других мастер-миксов этого протокола объем каждого компонента дополнительно увеличивается, чтобы приспособиться к потреблению компонентов, вызванному повторным пипетированием. Все кратковременное центрифугирование выполняется на настольной мини-центрифуге в течение 2-10 с при комнатной температуре (RT), с фиксированной частотой вращения 10 000 с центробежной силой 5 300 x g. Центробежная сила должна составлять от 2 000 х г до 12 000 х г.
      1. Готовят смесь лизиса клеток с 4,8 мкл буфера разбавления фермента экстракции и 0,2 мкл фермента экстракции клеток на образец.
      2. Пипетку 5 мкл свежеприготовленного лизиса клеток смешивают с каждым образцом клетки 5 мкл в пробирках ПЦР и кратковременно центрифугируют пробирку при РТ в течение 5 с. Не вращайте трубку.
      3. Инкубировать образец в термоциклере следующим образом: 75 °C, 10 мин; 95 °C, 4 мин; 25 °C, 14 мин. Ненадолго центрифугируют (5 с) трубку после инкубации.
    3. Предварительная амплификация ДНК всего генома
      1. Приготовьте смесь предварительного амплификации с 4,8 мкл буфера предварительного усилителя и 0,2 мкл фермента предварительного усилителя на образец.
      2. Пипетку 5 мкл предварительного усиления смешивают с пробоотборниками через стенки трубки и ненадолго центрифугируют в течение 3 с. Избегайте того, чтобы наконечник достигал дна трубки, и не вихряйте трубку.
      3. Инкубируйте образец в соответствии с программой теплового циклера, указанной в таблице 1.
    4. Амплификация ДНК всего генома
      1. Кратковременно центрифугируйте образец на 5 с и поместите продукт инкубации предварительного усилителя на лед.
      2. Подготовьте смесь амплификации всего генома с 25 мкл буфера амплификации, 0,8 мкл фермента амплификации и 34,2 мкл воды без нуклеазы на образец.
      3. Смешайте 60 мкл свежеприготовленной смеси для амплификации всего генома с 15 мкл продукта инкубации предварительного амплирования; общий объем должен быть 75 мкл. Кратковременно центрифугировать в течение 5 с. Избегайте того, чтобы наконечник достигал дна трубки, и не вихряйте трубку.
      4. Поместите трубку ПЦР на термоциклер и запустите программу термоциклера, указанную в таблице 2.
      5. Центрифугируйте трубки ненадолго в течение 5 с и переложите продукты в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      6. Количественная оценка концентрации продукта WGA с помощью флуорометра11. Образцы могут временно храниться при -20°C менее 2 месяцев, если не перейти к следующему этапу.
  2. Протокол самостоятельно разработанных реагентов WGA.
    1. Сбор и хранение образцов
      1. Нарисуйте клетки из эмбриона D5/6 после вспомогательного вылупления для последующего усиления.
      2. Перенесите образцы клеток с 1,5 мкл PBS в ПЦР-трубку, содержащую 2 мкл PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: PBS не содержит Mg2+ и Ca2+.
      3. Заморозьте образцы немедленно при -80 °C, если не перешли непосредственно к протоколу экстракции ДНК.
    2. Лизис клеток
      1. Растопить буфер лизиса клеток (40 мМ Трис (рН 8), 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ этиленгликоля тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1% (в/об) Тритон Х-100, 5 мМ пирофосфата натрия, 2 мМ β-глицерофосфата, 0,1% SDS) в RT и поместить его на лед. Добавьте 2 мкл буфера лизиса клеток к каждому образцу и ненадолго (5 с) центрифугируйте.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихряйте трубку и избегайте прикосновения кончика пипетки к поверхности жидкости в трубке, чтобы избежать вывода клеток или ДНК из реакционной системы.
      2. Инкубировать образец в термоциклере следующим образом: 55 °C, 20 мин; 95 °C, 10 мин; 4 °C, тр. Кратковременно центрифугируют трубку на RT в течение 10 с после инкубации.
    3. Амплификация ДНК всего генома
      1. Кратковременно центрифугируйте продукт лизиса клеток на 5 с и поместите его на лед.
      2. Подготовьте смесь амплификации всего генома для каждого образца, смешивая с 16 мкл амплификационного предварительно смешанного раствора, 1 мкл фермента амплификации и 28 мкл воды без нуклеазы. Аккуратно перемешайте, ненадолго центрифугируйте (5 с) и положите смесь на лед. Не вращайте трубку.
      3. Пипетка 45 мкл свежеприготовленной смеси для амплификации всего генома в продукт лизиса клеток, приготовленный на стадии 1.2.2.2; аккуратно перемешать и ненадолго центрифугировать в течение 5 с.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихряйте трубку и избегайте прикосновения кончика пипетки к жидкости в трубке.
      4. Поместите трубку ПЦР на термоциклер и запустите программу, как описано в таблице 3.
      5. Центрифугируйте трубки в течение 5 с и переложите продукты в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      6. Количественная оценка концентрации продукта WGA с помощью флуорометра11 и запись результатов в лист QA (анализ качества). Продукты с квалифицированными концентрациями могут временно храниться при -20 °C в течение менее 2 месяцев, если не перейти к следующему этапу.

2. Выбор фрагмента усиления

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, используемые в этом разделе, доступны в комплекте для подготовки библиотеки (Таблица материалов).

  1. Подготовка перед началом
    1. Уравновешивайте магнитные шарики (n x 100 мкл) для очистки при RT в течение 30 мин.
    2. Восстановите предыдущее изделие WGA до RT. Вихрьте продукт на RT в течение 30 с, прежде чем ненадолго центрифугировать его.
    3. Готовят свежий 70% этанол.
  2. Процедура выбора фрагмента
    1. Пипетка 25 мкл продуктов WGA и перенос в центрифужную трубку объемом 1,5 мл с предварительно загруженным 25 мкл воды без нуклеазы.
    2. Вихрь и хорошо перемешайте бусины очистки ДНК. Аликвота 50 мкл его в каждую пробирку (исходный образец: шарики (объем) = 1:1), вихрь и центрифуга кратковременно (5 с). Установите трубку на 5 минут при RT для процесса связывания ДНК.
    3. Вставьте трубку центрифуги объемом 1,5 мл в магнитную стойку и подождите, пока все магнитные шарики не притянутся к боковой стенке трубки. Осторожно перенесите супернатант в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Избегайте пипетки бусин.
    4. Согласно исходному объему образца, пипетка 30 мкл (исходный образец: бусины (объем) = 1:0,6) магнитных шариков, вихря и центрифуги кратковременно (5 с). Установите трубку на 5 минут при RT для процесса связывания ДНК.
    5. Вставьте трубки центрифуги объемом 1,5 мл в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковой стенке трубки. Осторожно удалите и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.
    6. Пипетка 300 мкл 70% этанола в трубку центрифуги объемом 1,5 мл, осторожно поверните трубку дважды под углом 180° и переместите шарики вдоль стенки трубки для тщательной промывки. Пипетку и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.
    7. Повторите процедуру умывания один раз.
    8. Извлеките трубку центрифуги объемом 1,5 мл из магнитной стойки и центрифуги в ближайшее время (5 с). Вставьте трубки обратно в магнитную стойку и подождите, пока все магнитные шарики не притянутся к боковине трубки.
    9. Осторожно выложите оставшуюся жидкость на дно. Держите трубку открытой, чтобы высушить шарики при RT в течение 3-5 минут. Держите влагу вне бисера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно закройте крышку, если на гранулах бусин появятся трещины.
    10. Извлеките трубки из магнитной стойки, пипетку 25-30 мкл буфера элюирования ДНК в трубку и закройте колпачок и вихрь. Центрифугу ненадолго (5 с), чтобы доставить мутную жидкость на дно трубки, и установить трубку на RT на 5 мин.
    11. Вставьте трубки обратно в магнитные стойки и подождите, пока все бусины не притянутся к боковине трубки и супернатант не станет прозрачным. Осторожно перенесите раствор ДНК в новые центрифужные трубки объемом 1,5 мл. Избегайте пипетки бусин.
    12. Количественно оценивают концентрацию ДНК после выбора фрагмента с помощью флуорометра11, хранят его при -20°C. Как правило, концентрация выбранного фрагмента ДНК колеблется в пределах 1,5-2,4 нг/мкл.

3. Подготовка библиотеки ДНК12

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, используемые в этом разделе, доступны в комплекте для подготовки библиотеки (Таблица материалов).

  1. Завершение ремонта
    1. Уравновешивайте магнитные шарики на RT в течение 30 мин.
    2. Уравновешивайте ПРОДУКТ ДНК выбора фрагментов на этапе 2.2.12 до RT. Проверьте и запишите метку на каждом флаконе, содержащем ДНК.
    3. Подготовьте систему конечной репарации ДНК с 30 мкл продуктов ДНК, 10 мкл конечного репарирующего буфера, 0,5 мкл конечного репарирующего фермента и 9,5 мкл воды без нуклеазы в центрифужной трубке объемом 1,5 мл. Вращайте трубку в течение 30 с и ненадолго (5 с) центрифугируйте на RT, чтобы доставить всю жидкость на дно трубки.
    4. Инкубировать при 25 °C в течение 30 мин и ненадолго центрифугировать (5 с) трубку после инкубации.
    5. Вихревое или обратное смешивание магнитных шариков и перенос 75 мкл магнитных шариков в трубку, содержащую окончательно восстановленные образцы ДНК (исходный образец: бусины (объем) = 1:1,5). Пипетку или аккуратно вихрь, чтобы хорошо перемешать шарики и ненадолго центрифугировать (5 с), чтобы раскрутить всю суспензию до дна трубки. Установите трубку на 5 минут при RT для процесса связывания ДНК. Осторожно переверните трубки, чтобы шарики рассеялись.
    6. Вставьте трубки центрифуги в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковине и супернатант не станет прозрачным. Удалите супернатант и избегайте пипетки шариков, удерживая трубки на стойке при пипетке.
    7. Переложите 300 мкл вновь приготовленного 70% этанола в трубки, осторожно поверните трубки дважды под углом 180° и переместите шарики вдоль стенки трубки для тщательной промывки. Пипетку и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.
    8. Повторите процедуру умывания один раз.
    9. Извлеките трубки центрифуги объемом 1,5 мл из магнитной стойки и ненадолго (5 с) центрифугируйте. Вставьте трубки обратно в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковине трубки.
    10. Осторожно выложите оставшуюся жидкость на дно. Откройте колпачок из трубок центрифуги объемом 1,5 мл и высушите шарики на RT в течение 3-5 мин. Держите влагу вне бисера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно закройте крышку, если на гранулах бусин появятся трещины.
    11. Пипетка 33 мкл буфера элюирования ДНК в трубку, закройте колпачок и вихрь. Центрифугу ненадолго (5 с) доставить мутную суспензию на дно трубки и установить трубку на RT на 5 мин.
    12. Вставьте трубки обратно в магнитные стойки и подождите, пока все бусины притянутся к боковине и раствор станет прозрачным. Осторожно перенесите раствор ДНК в новые центрифужные трубки объемом 1,5 мл с соответствующей меткой, избегая пипетки шариков.
  2. Перевязка штрих-кодом
    1. Поместите реагенты лигирования штрих-кода на этапе 3.2.2 на лед, чтобы растопить все замороженные реагенты.
    2. Подготовьте систему лигирования с 32 мкл конечных репарированных продуктов ДНК, 10 мкл воды без нуклеазы, 5 мкл лигазного буфера, 1 мкл лигазы и 1 мкл P1 в 1,5 мл центрифужной трубки. Пипетка выводит 1 мкл каждого реагента штрих-кода в раствор смеси в пробирке для одного образца, вихрь в течение 5 с и центрифугу ненадолго (5 с), чтобы получить всю жидкость в дно трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении штрих-кодов убедитесь, что количество штрих-кодов и образцов соответствует; каждый раз открывать только один флакон со штрих-кодом, чтобы избежать смешанного загрязнения штрих-кодов; Меняйте перчатки на каждые пять или шесть добавленных штрих-кодов.
    3. Инкубировать пробирки при 25 °C в течение 30 мин.
    4. Пипетка 75 мкл (исходный образец: бусины (объем) = 1:1,5) магнитных шариков в трубку, а пипетка или аккуратно вихрь для хорошего перемешивания бусин. Центрифуга ненадолго (5 с), чтобы раскрутить всю суспензию вниз до дна, избегая агрегации шариков. Установите трубку на 5 минут при RT для процесса связывания ДНК. Осторожно переверните трубки, чтобы шарики рассеялись.
    5. Вставьте трубки центрифуги в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковине и супернатант не станет прозрачным. Удалите супернатант и избегайте пипетки шариков, удерживая трубки на стойке при пипетке.
    6. Переложите 300 мкл вновь приготовленного 70% этанола в трубки, осторожно поверните трубки дважды под углом 180° и переместите шарики вдоль стенки трубки для тщательной промывки. Пипетку и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.
    7. Повторите процедуру умывания один раз.
    8. Извлеките трубки центрифуги объемом 1,5 мл из магнитной стойки и центрифуги ненадолго (5 с). Вставьте трубки обратно в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковине трубки. Осторожно выложите оставшийся супернатант в дно.
    9. Держите крышку трубки открытой, чтобы высушить шарики при RT в течение 3-5 минут. Держите влагу вне бисера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно закройте крышку, если на гранулах бусин появятся трещины.
    10. Пипетка 15 мкл буфера элюирования ДНК в трубку. Промойте гранулы бусин до дна трубки, запечатайте колпачок и вихрь. Центрифугу ненадолго (5 с), чтобы получить мутную суспензию на дно трубки и держать трубку устойчивой на RT в течение 5 мин.
  3. Фрагментарное усиление
    1. Поместите реагенты здания библиотеки на лед, когда замороженный реагент растворится.
    2. Перенесите 47,5 мкл ферментной смеси и 2,5 мкл праймерной смеси в трубку, содержащую элюированную ДНК и шарики, вихрь в течение 5 с и центрифугу ненадолго (5 с), чтобы доставить всю жидкость на дно трубки.
    3. Установите трубку на RT на 5 мин. Вставьте трубки обратно в магнитные стойки и подождите, пока все бусины притянутся к боковине и супернатант станет прозрачным. Осторожно перенесите раствор ДНК в ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл с четко обозначенными метками и избегайте пипетки шариков.
    4. Инкубировать образец в термоциклере со следующей программой: 72°C, 20 мин; 98 °C, 2 мин; 98 °C, 15 с; 62 °C, 15 с; 70 °C, 1 мин (6 циклов); 70 °C, 5 мин. Ненадолго центрифугируют (5 с) трубку, когда реакция закончена, и хранят продукты при 4 °С.
    5. Перенесите продукты ПЦР в центрифужную трубку объемом 1,5 мл (низкое крепление). Добавьте 97,5 мкл (исходный объем образца: бусины (объем) = 1:1,5) магнитных шариков в трубку, когда реакция заканчивается, пипетку или аккуратно вихрь, чтобы хорошо перемешать шарики, и ненадолго центрифугу (5 с), чтобы раскрутить всю жидкость до дна. Избегайте агрегации бисера. Установите трубку на RT на 5 мин. Осторожно переверните трубки, чтобы шарики рассеялись.
    6. Вставьте трубки центрифуги в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковине и супернатант не станет прозрачным. Удалите супернатант, избегайте пипетки шариков и держите трубки устойчивыми на стойке.
    7. Переложите 300 мкл вновь приготовленного 70% этанола в трубки, осторожно поверните трубки дважды под углом 180° и переместите шарики вдоль стенки трубки для тщательной промывки. Пипетку и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.
    8. Повторите процедуру умывания один раз.
    9. Извлеките трубку центрифуги объемом 1,5 мл из магнитной стойки и центрифуги ненадолго (5 с). Вставьте трубку обратно в магнитную стойку и подождите 5 минут, пока все магнитные шарики не притянутся к боковой стенке трубки. Осторожно выложите оставшуюся жидкость на дно.
    10. Держите крышку трубки открытой, чтобы высушить шарики при RT в течение 3-5 минут. Держите влагу вне бисера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно закройте крышку, если на гранулах бусин появятся трещины.
    11. Пипетка 22 мкл буфера элюирования ДНК попадает в трубку, промойте гранулы шариков вниз и закройте колпачок и вихрь. Центрифугу ненадолго (5 с) доставить мутную жидкость на дно трубки и установить трубку на RT на 5 мин.
    12. Количественно оценить концентрацию построенной библиотеки ДНК с помощью флуорометра11 и сохранить построенную библиотеку ДНК при -20 °C; концентрация выбранного фрагмента ДНК колеблется в пределах 0,6-10 нг/мкл. Перекодируйте библиотечную информацию в библиотечной базе данных и сохраните образцы соответствующим образом.

4. Подготовка шаблона последовательности13,14

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, используемые в этом разделе, доступны в наборе для подготовки шаблона (реагенты/растворы/материалы) универсального набора реакций секвенирования (таблица материалов).

  1. Библиотечный микс
    1. Заполните форму листа предпропускных записей в серверной системе и пометьте пробную трубку концентрацией библиотеки и номером штрих-кода. Избегайте использования одних и тех же штрих-кодов на разных образцах за один запуск.
    2. Вихрь и смешайте библиотечный образец, и центрифуг ненадолго (5 с). Разбавьте все образцы до 100 пМ водой без нуклеаз, вихрем в течение 30 с и ненадолго центрифугируйте образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что ДНК имеет среднюю длину 260 бп, а 1 бп равен 660 г/моль, рассчитайте превращение нг/мкл в пМ, используя следующее уравнение: 1 нг/мкл = 5 827,5 пМ/л.
    3. Пипетку 10 мкл 100 пМ разбавляют библиотекой в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, вихрь на 30 с и ненадолго центрифугу на 2 с. Храните смешанную библиотеку на льду.
  2. Подготовка шаблона
    1. Запустите систему усиления шаблона и выберите чистую программу. Добавьте реакционное масло в 1/2 пробирки, а эмульгатор раствором для разрушения на 1/3 пробирки.
    2. Убедитесь, что усилительная пластина и адаптер мойки установлены в положении ВКЛ . Очистите бутылку с отходами и поместите иглу в новую центрифужную трубку объемом 50 мл для сбора отходов. Подтвердите обработанные шаги на экране системы усиления шаблона. Нажмите NEXT , чтобы запустить чистую программу, которая займет около 15 минут.
    3. Замените усилительную пластину на новую после программы очистки, вставьте в ротор коллекторные трубки, содержащие 150 мкл разрывающего раствора II, и поместите мост на коллекторные трубки. Добавьте реакционное масло к 1/2 трубки и раствор эмульгатора, разбивающего на 1/3 пробирки.
    4. Эмульгировать препарат реагента ПЦР: Уравновешивайте эмульгированный буфер ПЦР на РТ до тех пор, пока он не растворится, ненадолго центрифугируйте (5 с) все реагенты и поместите их на лед перед использованием.
    5. Пипетка 120 мкл эмульгированной ферментной смеси ПЦР, 100 мкл буфера шаблонных частиц ионной сферы (ISP), 170,5 мкл воды без нуклеазы и 9,5 мкл смешанной библиотеки (100 пМ) в трубку, содержащую 2000 мкл эмульгированного буфера ПЦР. Хорошо перемешать раствор с повторным пипетированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный раствор должен быть загружен на систему усиления шаблона в течение 15 мин; выполнять все процедуры на RT.
    6. Поместите новый фильтр для подготовки шаблона на стойку для труб с порталом образца вверх. Вращайте раствор в течение 5 с, центрифугируйте ненадолго (5 с) и передавайте раствор в образец портала фильтра после многократного пипетирования 800 мкл три раза. Центрифугируйте трубку, чтобы уменьшить пузырьки перед последней инъекцией. Избегайте нагнетания воздуха в фильтр. Вводят 200 мкл реакционного масла II после смешанного раствора.
    7. Поверните портал образца фильтра вниз и замените промывочный приспособлен фильтром. Вставьте иглу образца в центральное отверстие крышки ротора, а затем прижмите иглу к дну.
    8. Нажмите кнопку RUN на экране, выберите программу в соответствии с соответствующим комплектом и нажмите ASSISTED , чтобы проверить все шаги. Нажимайте ДАЛЕЕ до начала запуска; для финиша требуется около 4,5 часов.
    9. Нажмите ДАЛЕЕ , когда программа будет завершена; система запустит 10-минутную центрифугирование. Когда центрифугирование прекратится, нажмите кнопку «Открыть крышку» и переместите трубки сбора в стойки. Если процедура не переходит к следующему шагу в течение 15 минут, нажмите на Final Spin для повторной центрифуги.
    10. Удалите супернатант в пробирке для сбора, оставив в пробирке 100 мкл раствора. Смешайте оставшийся образец путем пипетирования и перенесите образец в новые центрифужные трубки объемом 1,5 мл с маркировкой OT (система One touch 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При пипетке супернатанта избегайте касания дна трубки вдоль борта.
    11. Пипетка 100 мкл воды без нуклеазы в каждую из сборных трубок и перенос раствора в отеверженную трубку промывают с повторным пипетированием. Добавьте 600 мкл воды без нуклеазы в трубку OT, чтобы сделать общий объем 1 мл, вихрем в течение 30 с и центрифугой при 15 500 х г в течение 8 мин.
    12. Осторожно удалите супернатант в трубке OT с оставшимся 100 мкл и используйте наконечник, чтобы тщательно отбросить масляный слой. Добавьте 900 мкл воды без нуклеазы, вихрь в течение 30 с и центрифугу при 15 500 х г в течение 8 мин.
    13. Удалите супернатант до тех пор, пока не останется 20 мкл, добавьте шаблон повторного использования раствора, чтобы сделать объем 100 мкл, вихрь на 30 с и ненадолго центрифугу на 2 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор, полученный на этом этапе, должен перейти к следующему шагу менее чем за 12 ч.
    14. Запустите чистую программу на системе усиления шаблона перед выключением ее питания.
  3. Обогащение шаблона
    1. Приготовьте расплавленную смесь с 280 мкл анимации движения-80 и 40 мкл 1 М NaOH.
    2. Вымойте бусины С1. Вихрь бусин С1 раствор в течение 30 с. Переложите 100 мкл шариков в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, вставьте трубку на магнитную стойку на 2 мин и выбросьте супернатант.
    3. Переложите 1 мл раствора для промывки шариков С1 в трубку и вихрь в течение 30 с. Центрифугу ненадолго (5 с), вставьте трубку в магнитную стойку на 2 мин и выбросьте супернатант. Пипетка 130 мкл раствора для повторного суспензии шарика С1 в трубку и смешивание шариков путем повторного пипетирования. Избегайте создания пузырьков.
    4. Загрузите 100 мкл разбавленной библиотеки, 130 мкл шариков C1, 300 мкл х 3 шаблонного моющего раствора и 300 мкл расплавленного раствора в полосы восьми скважин, как показано на рисунке 1.
    5. Установите восьмискважинные полосы на модуль обогащения, загрузите наконечник для дозирования и установите трубку центрифуги объемом 200 мкл в положение сбора. Нажмите на START для запуска программы; это займет около 35 минут.
    6. Образец будет автоматически собран в центрифужной трубке объемом 200 мкл; закрыть крышку и центрифугировать ее при 15 500 х г в течение 5 мин. Проверьте дно трубки, чтобы убедиться, что остались бусины C1.
    7. Если шарики С1 остались, многократно пипетку шаблонного раствора 10х и вставьте трубку на магнитную стойку на 4 мин. Перенесите все супернатанты в новую центрифужную трубку объемом 0,2 мл и центрифугу при 15 500 х г в течение 5 мин.
    8. Если видимых шариков С1 не осталось, выбросьте супернатант до тех пор, пока не останется 10 мкл, добавьте 200 мкл воды без нуклеазы и перемешайте путем пипетирования 10x. Центрифуга при 15 500 х г в течение 5 мин.
    9. Отбросьте супернатант с оставшимся 10 мкл и добавьте 90 мкл воды без нуклеазы, чтобы достичь общего объема 100 мкл. Пипетка вверх и вниз 10x для смешивания раствора, вихрь в течение 5 с и кратковременно центрифуга (5 с). Раствор можно хранить при 2-8 °C менее 3 дней.

5. Секвенирование нового поколения 9,15

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные в этом разделе, выполняются на платформе виртуализации DA8600. Материалы, используемые в этом разделе, доступны в наборе для секвенирования (Реагенты/Растворы/Материалы) Универсального набора реакций секвенирования (Таблица материалов).

  1. Проверьте все реагенты и материалы, необходимые на платформе секвенирования.
    1. Реагент для секвенирования: Проверьте наличие раствора фермента секвенирования (6 мкл), праймеров для секвенирования (20 мкл), шаблона контроля качества (5 мкл) и dGTP / dCTP / dATP / dTTP (70 мкл), хранящихся при -30-10 °C.
    2. Секвенирующий раствор: Проверьте наличие раствора для секвенирования II (100 мл), раствора для секвенирования III (50 мл), буфера отжига (1015 мкл), буфера загрузки (10 мкл), пенообразователя (2 мкл), таблетки хлора (1 таблетка) и шариков стрептавидина (100 мкл), хранящихся при 4 °C.
    3. Материалы: Проверьте наличие 250 мл реагентов трубки (8), 250 реагентов колпачка трубки (8), глотка II (8), глотка (1), флакона реагента 2 л (1) и чипа секвенирования (1), хранящегося в RT.
  2. Вымойте чип перед использованием.
    1. Установите один чип на рабочую пластину, введите 100 мкл воды без нуклеазы в отверстие для образца, удалите раствор в выходном портале и повторите процедуру.
    2. Вводят в чип 100 мкл раствора 0,1 М NaOH и инкубируют в течение 1 мин при RT.
    3. Введите 100 мкл изопропанола в отверстие для образца, удалите лишний раствор в выходном портале и повторите процедуру снова.
    4. Закройте выходной портал фильтровальной бумагой, влейте азот, чтобы высушить оставшийся изопропанол в проточной ячейке чипа, и держите готовый к использованию чип на RT.
  3. Инициализация секвенсора
    1. Включите азотный клапан и настройте давление до 30 фунтов на квадратный дюйм. Запустите секвенсор, нажмите CLEAN на главном экране и выберите воду или хлорид для стирки машины соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мойте водой перед каждой пробежкой, мойте хлоридом каждую неделю или в то время, когда машина стоит с реагентами в течение 48 часов.
    2. Хлоридная промывка: Выберите одну бутылку с реагентом, предназначенную для промывки хлоридами, дважды вымойте бутылку водой 18 МОм и наполните бутылку 1 л воды 18 МОм. Поместите одну хлоридную таблетку во флакон, растворите таблетку в течение 10 мин, добавьте 1 мл 1 М NaOH, а затем переверните флакон, чтобы перемешать раствор. Используйте раствор хлорида в течение 3 ч после приготовления.
    3. Фильтровать 100 мл раствора хлорида фильтром 0,45 мкм и собирать с помощью двух пробирок. Установите две хлоридные трубки в положения C1 и C2. Нажмите CLEAN на главном экране, и оснастите чип для хлоридной промывки.
    4. Нажмите NEXT и проверьте все шаги на экране, чтобы запустить программу стирки; программа закончится через 30 минут. Начните промывку водой после хлоридной промывки.
    5. Промывка водой: отметьте две трубки, специфичные для воды с C1 и C2, и дважды промыть трубки водой 18 МОм. Добавьте 100 мл воды 18 МОм в каждую из труб для промывки воды и установите их в положения C1 и C2 соответственно.
    6. Выберите программу CLEAN , установите чип, подготовленный для стирки водой, нажмите NEXT, а затем проверьте все шаги на экране, чтобы запустить программу стирки.
  4. Инициализация
    1. Очистите бутылку для мытья раствором II, пометьте ее как W2 и трижды вымойте водой 18 МОм.
    2. Очистите азотную трубку бумагой, уложенной воздухом, вставьте ее в дно трубки и настройте воздушный поток до 0,5 л/мин. Выгрузите кислород в бутылку и наполните бутылку 1 920 мл воды 18 МОм. Добавьте последовательный раствор II и 10 мкл 1 M NaOH во флакон, закройте крышку и переверните флакон несколько раз, чтобы перемешать раствор.
    3. Отметьте две новые трубки как W1 и W3. Добавьте 32 мкл 1 M NaOH к W1, добавьте 40-50 мл 1x последовательного раствора ОТ III до W3 и закройте колпачки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x последовательный раствор III должен находиться на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 мин при первом использовании. Последовательность раствора II должна быть защищена от света и храниться в RT. Бутылка для стирки должна быть заменена новой после использования 20 раз.
    4. Нажмите INITIALIZE на главном экране, измените глоток в положениях W1, W2 и W3, установите трубки в соответствующее положение и плотно запечатайте их вращением. Установите чип для инициализации и проверьте параметры состояния машины.
    5. Нажмите NEXT , чтобы запустить программу инициализации; в первом разделе это займет 40 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки должны быть заменены перед заменой нового глотка, чтобы избежать загрязнения тела глотка. После использования для промывки водой и инициализации чипы могут быть применены для инициализации, но не используйте стружку, используемую для хлоридно-промывочной стружки для инициализации.
    6. Растворите dGTP, dCTP, dATP и dTTP на льду и вихрь для смешивания. Отметьте четыре новые трубки как G, C, A и T, и пипетку 70 мкл раствора в соответствии с меткой трубки.
  5. Подготовьте библиотеку к запуску.
    1. Поместите на лед шаблон контроля качества, грунтовки и раствор фермента.
    2. Подготовьте библиотеку ДНК, когда у программы инициализации осталось около 20 минут. Вихрь шаблона контроля качества в течение 30 с для смешивания, и кратковременная центрифуга в течение 2 с. Переложите 5 мкл шаблона контроля качества в шаблонный раствор, вихрь в течение 5 с и центрифугу трубки на 15 500 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант путем тщательной пипетки, избегайте прикосновения к грануле и оставьте объем 10 мкл в трубке.
    3. Добавьте в пробирку 15 мкл буфера отжига; общий объем раствора составляет 25 мкл.
    4. Вихревая последовательность праймеров, когда она полностью растворяется на льду и центрифугируется ненадолго в течение 2 с. Переложите 20 мкл последовательности праймеров в трубку с прежней ступени, вихревую в течение 5 с, коротко центрифугу на 2 с, а затем храните в RT перед использованием.
  6. Загрузка образца и секвенирование
    1. Пипетка 55 мкл образца раствора, приготовленного на предыдущей стадии, и вводит его в отверстие для образца чипа.
    2. Установите чип на центрифугу; держите выемку снаружи и портал образца внутри, балансируя ее с другим использованным чипом, и центрифугой в течение 10 минут.
    3. Подготовьте загрузочный раствор.
      1. Смешайте 0,5 мл буфера отжига и 0,5 мл воды без нуклеазы в трубке центрифуги объемом 1,5 мл. Пометьте его как 50% буфер отжига и используйте в течение 7 дней.
      2. Смешайте 0,5 мл раствора изопропанола и 0,5 мл буфера отжига. Отметьте его как 50% буфер для стирки и используйте в течение 24 ч.
      3. Смешайте 6 мкл фермента последовательности и 60 мкл 50% буфера отжига. Пометьте его как буфер реакции фермента и поместите раствор на лед после приготовления.
      4. Смешайте 49 мкл 50% буфера отжига и 1 мкл пенообразователя и пометьте его как пенообразующий раствор.
    4. Вдуйте 100 мкл воздуха в пенящийся раствор, многократно пипеткой раствор до тех пор, пока пузырьки не придут в плотное вспенивающееся состояние, и сохраните объем пены около 250 мкл.
    5. Поместите чип на скамейку после центрифуги, введите 100 мкл пены в отверстие для образца и удалите экструдированный раствор в наружном портале. Установите чип обратно в центрифугу, а центрифугу ненадолго на 30 с.
    6. Повторите шаги 5.6.4-5.6.5.
    7. Дважды вводят 100 мкл 50% промывочного буфера и удаляют экструдированный раствор в наружный портал после каждой инъекции.
    8. Вводят 100 мкл 50% буфера отжига три раза и удаляют экструдированный раствор в выходной портал после каждой инъекции.
    9. Введите 65 мкл 50% ферментного реакционного буфера, избегайте пузырьков и удалите экструдированный раствор в наружный портал.
    10. Стабилизируйте загруженный чип на RT в течение 5 минут и установите чип на портал чипа секвенсора. Выберите план, запрограммированный на шаге 6, проверьте информацию и начните запуск; для завершения требуется около 1,5 ч.
    11. Выполните программу промывки водой в течение 72 часов после окончания пробега. Выполняйте хлоридную промывку перед мытьем водой, когда время превышает 72 ч. Выключите секвенсор и закройте клапан азота.

6. Планирование запуска инструктированной последовательности в серверной системе репортеров16

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом разделе выполняются на Ion Proton Sequencer с системой репортерного сервера.

  1. Войдите в серверную систему, выберите вкладку План и нажмите кнопку Запуск шаблона плана. Выберите тип запуска Whole Genome (Весь геном ) и выберите соответствующий шаблон из списка шаблонов запланированного запуска.
  2. На вкладке План введите или выберите следующие параметры:
    1. Введите новое имя плана выполнения в соответствии с пакетом образцов, выберите hg19 (Homo sapiens) в раскрывающемся списке Справочная библиотека и выберите Нет в раскрывающихся списках Целевые регионы и Области горячих точек .
    2. Введите количество штрих-кодов, используемых в наборе образцов, выберите штрих-код из раскрывающегося списка для каждого образца и введите уникальное описательное имя, которое может быть полезно для группировки и отслеживания образца. Избегайте использования примера 1 по умолчанию и т. д.
    3. Выберите Нет на вкладке Ion Reporter , нажмите кнопку Далее и выберите ДНК в приложении и Весь геном в качестве целевого метода.
    4. На вкладке Комплекты проверьте выбранные параметры или внесите изменения, если это подходит для запуска.
      1. Выберите Комплект библиотеки фрагментов Ion Plus в раскрывающемся списке Тип набора библиотек . Выберите комплект Ion PI HI-Q OT2 200 в раскрывающемся списке Комплект шаблонов и выберите OneTouch в качестве комплекта по умолчанию. Выберите комплект Ion PI HI-Q Sequencing 200 из раскрывающегося списка Комплект секвенирования .
      2. Введите 300 потоков, выберите Ion PITM Chip из раскрывающегося списка Тип чипа и выберите IonXpress из раскрывающегося списка Набор штрихкодов .
      3. Отмените выбор параметра Пометить как дубликаты чтения и выбрать параметр Включить перегруппировку.
    5. Выберите соответствующий плагин на вкладке Плагины для выполнения анализа данных на шаге 7. Завершите выбор на шаге проектов, нажмите кнопку Далее и щелкните План выполнения в правом нижнем углу, чтобы вывести список Запланированные запуски.
    6. На вкладке Запланированные запуски выберите только что созданный запуск и проверьте все параметры в окне просмотра.

7. Анализ данных

  1. Анализируйте варианты номеров копий (CNV) с помощью рабочего процесса биоинформатики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CNV были проанализированы в рабочем процессе биоинформатики с реализацией алгоритма, основанного на скрытой марковской модели (HMM)17; модель использует покрытие считывания по всему геному для прогнозирования числа копий или статуса плоидии целого числа (т. Е. 0, 1, 2, 3 и т. Д.). Общий конвейер биоинформатики был встроен в плагин системы сервера последовательностей, что показано на рисунке 2. Этап анализа биоинформатики занимает в среднем 4 часа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поскольку план последовательностей завершается после запуска процесса на машине, система сервера последовательностей сообщает сводку с описательной информацией о сгенерированных данных, состоянии чипа, скорости загрузки ISP и качестве библиотеки, как показано на рисунке 2. В этой демонстрации результатов было получено 17,6 G данных в общей базе, а общая скорость загрузки ISP составила 88% в общих скважинах чипа; тепловая карта показала, что образец был равномерно загружен на общую площадь чипа (рисунок 2A). В ходе репрезентативного тиража было получено 99 761 079 считываний, из которых 77% были пригодны для использования; во всех скважинах, загруженных ISP, 100% имели обогащенные шаблоны, в которых 78% были клональными. Из всех клональных шаблонов 97% были квалифицированы как окончательная библиотека (рисунок 2B). Средняя длина считывания составила 117 bp, 176 bp и 174 bp со средним, медианным и режимом соответственно (рисунок 2C). Пиковые значения T, C и A в адаптации шаблонов составили ~76, что выше квалифицированной линии отсечения 50 (рисунок 2D). Во всех адресуемых скважинах с живыми интернет-провайдерами 99,5% были квалифицированы как построенная библиотека, а 20% поликлональной и некачественной библиотеки были отфильтрованы. 76,6% интернет-провайдеров были квалифицированы для дальнейшего анализа (рисунок 2E).

Результат вариантов номера копии из одного образца S19030109-3 показан на рисунке 3; черная линия тире нормализуется как сегмент эуплоидии через 22 аутосомы и половые хромосомы, красная линия нормализована как область хромосомы анеуплоидии, представляющая мозаичную трисомию 182,16 Мб p16,3-q35,2 на хромосоме 4 и сегмент моносомии 33,13 Мб q11,1-q13,33 на хромосоме 22.

Репрезентативные отчеты о 12 образцах с использованием наборов WGA и 13 образцах по одноэтапному методу с использованием независимо разработанных реагентов WGA приведены соответственно в Таблице 4 и Таблице 5, которые включают сводную информацию об идентификаторе штрих-кода, названии образца, количестве уникальных считываний, выровненной средней длине считывания, средней глубине, проценте содержания GC и отметке вариантов хромосом. Хромосомные варианты метки продемонстрировали половую хромосому, расположение и размер дупликации, а также делецию на хромосомах.

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма положения загрузки образца на 8-луночной полосе. Каждая скважина с указанием загрузочного содержимого указана соответственно. U означает необогащенный образец, B означает бусины, а W - моющий раствор; пустые скважины также отмечены на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сводка выполнения: размер данных, загрузка isP и метрики качества библиотеки. (A) Общее состояние, включая общие базы, ключевой сигнал и скорость загрузки ISP с тепловой картой. (B) Общее количество считываний, полезная скорость чтения и сводка информации ISP на каждом этапе реакции. (C) Гистограмма длины считывания. (D) Консенсусный ключ 1-Мер TCA. (E) Адресуемые скважины и клональный статус IPS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Пример визуализированного графика вариантов номера копии: S19030109-3. Сигналы числа копий (CN) визуализируются на графике с синими и зелеными интервалами для хромосом рядом друг с другом. Приведенный пример показывает повышенное наблюдение CN в хромосоме 4 и снижение наблюдения CN в хромосоме 22, поскольку средняя линия CNV, отмеченная красным цветом, смещена от 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Нет. циклов Температура Время
1 цикл 95 °С 2 мин
12циклов 95 °С 15 с
15 °С 50 с
25 °С 40 с
35 °С 30 с
65 °С 40 с
75 °С 40 с
1 цикл 4 °С Держать

Таблица 1: Программа теплового цикла для предварительного усиления. Показаны условия тепловой реакции, такие как температура, время и циклы.

Шаг Температура Время Нет. циклов
1 95 °С 2 мин 1
2 95 °С 15 с 14
65 °С 1 мин
75 °С 1 мин
3 4 °С держать 1

Таблица 2: Программа теплового цикла для амплификации всего генома с помощью комплектов амплификации всего генома. Показаны условия тепловой реакции, такие как температура, время и циклы.

Шаг Температура (°C) Время Нет. циклов
1 95 °С 2 мин 30 с 1
2 95 °С 30 с 6
25°С 2 мин
от 0,3 °C/с до 72 °C ——
72 °С 1 мин 30 с
3 95 °С 30 с 20
62 °С 30 с
72 °С 1 мин
4 72 °С 2 мин 1
5 4 °С держать 1

Таблица 3: Программа теплового цикла для амплификации всего генома с независимо разработанными реагентами. Показаны условия тепловой реакции, такие как температура, время и циклы.

Пример имени Количество уникальных считываний Выровненные чтения Средняя длина Средняя глубина КГ% СД Метка
С19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 XY
С19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
С19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
С19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 XY
С19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 XY
С19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
С19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 XY
С19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 ХХ
С19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 ХХ
С19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
С19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-хр22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
С19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 XY

Таблица 4: Пример вывода вариации числа копий с использованием комплектов амплификации всего генома в отчете серверной системы. Типичный выходной лист включает такие параметры, как имя образца, количество уникальных считываний, выровненные показания, средняя длина, средняя глубина, процент CG, стандартное отклонение длины и для большинства, отметка статуса хромосомы с половой хромосомой, помеченной XY и заключенной деталью CNV. Обнаруженный CNV отмечен расположением хромосомы и размером фрагмента.

Пример имени Количество уникальных считываний Выровненные чтения Средняя длина Средняя глубина ГК% СД Метка
С21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 XY
С21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 ХХ
С21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+хр21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
С21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
С21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 ХХ
С21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
С21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 XY
С21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 ХХ
С21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-хр22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
С21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 XY
С21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
С21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 ХХ
С21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 XY

Таблица 5: Пример вывода вариации числа копий одношаговым методом с независимо разработанными реагентами амплификации всего генома в отчете серверной системы. Типичный выходной лист включает такие параметры, как имя образца, количество уникальных считываний, выровненные показания, средняя длина, средняя глубина, процент CG, стандартное отклонение длины и для большинства, отметка статуса хромосомы с половой хромосомой, помеченной XY и заключенной деталью CNV. Обнаруженный CNV отмечен расположением хромосомы и размером фрагмента.

Дополнительный файл 1: Рекомендуемый объем каждого компонента при приготовлении мастер-микса различных размеров партии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хромосомная анеуплоидия эмбрионов является причиной большой доли потери беременности, будь то естественное оплодотворение или экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). В клинической практике ЭКО предполагается, что скрининг анеуплоидии эмбриона и перенос эмбриона эуплоидии может улучшить исход ЭКО. Флуоресцентная гибридизация in situ является самым ранним методом, принятым для выбора пола и PGT-A; однако этот метод требует большей технической экспертизы со стороны лабораторного персонала и является относительно трудоемким. Растущие исследования PGT-A с использованием флуоресцентной гибридизации in situ не показывают улучшения показателей рождаемости17,18.

Тем не менее, были достигнуты быстрые успехи в технологиях оценки анализа числа копий в предимплантационном генетическом тестировании; различные методы имеют свои плюсы и минусы. Недавно разработанные комплексные молекулярные методы, такие как количественная флуоресцентная ПЦР, массив однонуклеотидного полиморфизма (SNP), сравнительная геномная гибридизация массива (aCGH) и секвенирование следующего поколения, показали многообещающие результаты ЭКО7. Среди них NGS имеет высокую согласованность со сравнительной геномной гибридизацией массивов, несмотря на ее масштабируемость, более высокую пропускную способность, более простую автоматизацию и больший потенциал для снижения затрат 19,20,21.

В сочетании с методами WGA анализ NGS биопсии эмбриона может обеспечить более точную информацию о последовательности, а также имеет жизнеспособное расширение для большего количества мишеней уровня однонуклеотидов. В связи с растущим применением секвенирования следующего поколения при выявлении генетических аномалий возникает острая необходимость в разработке стандартов для процесса отбора проб /данных как в лабораторной, так и в клинической практике 22,23,24.

На пути от разделения до анеуплоидной идентификации процесса PGT-A ключевые этапы включают разделение, выбор метода амплификации всего генома, выбор платформы секвенирования следующего поколения и анализ данных секвенирования. Процесс амплификации всего генома является наиболее важным этапом в PGT-A, который определяет целостность и однородность данных секвенирования. Три стратегии амплификации всего генома сравнивались в предыдущем исследовании, и доказано, что метод квазислучайного праймера picoPLEX работает почти так же, как и методы амплификации множественного смещения (MDA) с точки зрения целостности и однородности данных секвенирования25. Поскольку клиническая практика фокусируется на вариациях числа копий (CNV) с разрешением ~ 10 Мбит/с, а не на вариации одного нуклеотида в PGT-A, набор picoPLEX WGA и независимо разработанные реагенты WGA были выбраны из-за экономических проблем. На стадии амплификации последнему требуется только один шаг для завершения амплификации всего генома без необходимости предварительной амплификации.

В настоящее время на рынке используются две основные коммерческие платформы: MiSeq от Illumina26 и Ion Proton от Thermo-Fisher Scientific27. Как Miseq, так и Proton могут идентифицировать анеуплоидию всей хромосомы, но Miseq предназначен только для идентификации анеуплоидии всей хромосомы, в то время как Proton также может идентифицировать большие делеции (dels) или дупликации (dups), включая клинически значимые dels или dups до разрешения примерно от 800 кб до 1 Mb28. Платформа Proton имеет ценовые преимущества и сильную локальную техническую поддержку. По этим причинам платформа «Протон» была выбрана для последующей клинической практики.

Биоинформатический анализ данных секвенирования следующего поколения является сложным и сложным для клиницистов в клинических приложениях. С увеличением данных в публичном архиве генетических вариантов и интерпретаций человека, таких как Clinvar29, 1000 genome30 и Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)31, было разработано больше программных приложений для аннотаций CNV, которые доступны для публичного и частного использования32,33. Здесь была применена локально разработанная информационная система Darui-LIMS, чтобы помочь персоналу лаборатории и клиницистам завершить анализ данных CNV одним щелчком мыши в клинической практике PGT-A34.

Наши методы разработаны специально для PGT-A и имеют хороший баланс между разрешением, точностью и стоимостью. Стандартные процедуры в области обработки генетического материала и биоинформатики могут дать последовательные данные для клинического анализа. С новыми достижениями в технологиях, основанных на системе NGS, дополнительные структурные аномалии хромосом, такие как транслокация, могут быть протестированы и диагностированы для клинической амплификации в цикле PGT35,36. Для этих тестов необходимо разработать и применить более специализированные методы. Тем не менее, в качестве спецификации для руководства клинической практикой PGT-A, эти методы будут полезны для лабораторного персонала и клиницистов в лабораторной практике PGT-A на платформе секвенирования следующего поколения DA8600.

Однако этот метод имеет определенные ограничения. В протоколе максимальное количество образцов, которое может поддерживать магнитная стойка, составляет 16; Конечно, в зависимости от фактического количества клинических образцов, можно также выбрать магнитную стойку для поддержки большего количества образцов за раз или увеличить количество магнитной стойки для выполнения большего количества операций с образцами. Однако это может увеличить риск эксплуатационных ошибок. Поэтому коммерческие комплекты, основанные на секвенировании полупроводников, рекомендуются при работе с партиями из 32 образцов или больше, такие как Ion ReproSeq PGS Kits компании Thermo-Fisher Scientific.

В соответствии с Руководством по технической оценке технологии контроля качества реагентов для детектирования хромосомной анеуплоидии (High Throughput Sequencing), обнародованным Китайским национальным институтом контроля за пищевыми продуктами и лекарственными средствами, требование к действительному объему данных одного образца составляет не менее 1 М. Существует 60-80 M считывания на чип в соответствии с обзором продукта Ion PI, и, исходя из экспериментального опыта, действительные уникальные числа считываний составляют не менее 50% от исходных данных. После расчета эффективный объем данных каждого экспериментального образца составляет не менее 2 М. Поэтому для обеспечения точности результатов экспериментов мы рекомендуем максимальную емкость в 16 образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжанъюн Мина и г-на Жунцзи Хоу за их советы по расширенному применению LIMS. Это исследование поддерживается Специальными исследовательскими проектами НОАК по планированию семьи (17JS008, 20JSZ08), Фондом Гуансийской ключевой лаборатории исследований метаболических заболеваний (No 20-065-76) и Научно-техническим исследовательским проектом гражданского здравоохранения Гуанчжоу (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Tags

Генетика выпуск 186
Предимплантационное генетическое тестирование анеуплоидии на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter