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Genetics

सेमीकंडक्टर आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर एन्यूप्लोइडी के लिए प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल अर्धचालक-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर एन्यूप्लोइडी के लिए पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण में आवश्यक समग्र इन-लैब प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करता है। यहां हम प्रतिनिधि परिणामों के साथ पूरे जीनोम प्रवर्धन, डीएनए टुकड़ा चयन, पुस्तकालय निर्माण, टेम्पलेट तैयारी और अनुक्रमण कार्य प्रवाह के विस्तृत चरण प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने आनुवंशिक वेरिएंट के निर्धारण में नैदानिक अनुप्रयोग में बढ़ते महत्व को प्राप्त किया है। प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्ट में, इस तकनीक के स्केलेबिलिटी, थ्रूपुट और लागत में इसके अनूठे फायदे हैं। एन्यूप्लोइडी विश्लेषण के लिए पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण के लिए, यहां प्रस्तुत अर्धचालक-आधारित अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) प्रणाली 8 एमबी के न्यूनतम रिज़ॉल्यूशन पर संरचनात्मक आनुवंशिक वेरिएंट निर्धारित करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करती है। नमूना अधिग्रहण से लेकर अंतिम रिपोर्ट तक, कार्य प्रक्रिया को प्रोटोकॉल के करीब पालन के साथ कई चरणों की आवश्यकता होती है। चूंकि विभिन्न महत्वपूर्ण कदम प्रवर्धन के परिणाम, पुस्तकालय की गुणवत्ता, पढ़ने के कवरेज और डेटा के आउटपुट को निर्धारित कर सकते हैं, शब्दों के अलावा दृश्य प्रदर्शन के साथ वर्णनात्मक जानकारी ऑपरेशन और हेरफेर के लिए अधिक विवरण प्रदान कर सकती है, जिसका सभी महत्वपूर्ण चरणों के परिणामों पर बहुत प्रभाव पड़ सकता है। यहां प्रस्तुत विधियां बायोप्सीड ट्रोफेक्टोडर्म (टीई) कोशिकाओं, जीनोमिक लाइब्रेरी निर्माण, सीक्वेंसर प्रबंधन और अंत में, कॉपी नंबर वेरिएंट की रिपोर्ट उत्पन्न करने के पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) में शामिल प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करेंगी।

Introduction

एन्यूप्लोइडी एक या एक से अधिक अतिरिक्त गुणसूत्रों की उपस्थिति या एक या एक से अधिक गुणसूत्रों की अनुपस्थिति से गुणसूत्रों की संख्या में असामान्यता है। भ्रूण जो कुछ प्रकार के एन्यूप्लोइडी ले जाते हैं, जैसे कि एक एक्स गुणसूत्र (टर्नर सिंड्रोम), ऑटोसोम की अतिरिक्त प्रतियां, जैसे ऑटोसोम 21 (डाउन सिंड्रोम), 13 (पटाऊ सिंड्रोम), और 18 (एडवर्ड्स सिंड्रोम), या अतिरिक्त सेक्स गुणसूत्र जैसे 47, एक्सएक्सवाई (क्लाइनफेल्टर सिंड्रोम) और 47, एक्सएक्सएक्स (ट्रिपल एक्स सिंड्रोम), जन्म दोषके साथ जीवित रह सकते हैं। एन्यूप्लोइडी पहली तिमाही के गर्भपात और इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) विफलता का प्राथमिक कारणहै 2. यह बताया गया है कि आईवीएफ अभ्यास3 में प्राकृतिक चक्र और औषधीय नियंत्रण समूह की विभिन्न आयु परतों के माध्यम से एन्यूप्लोइडी दर 25.4% -84.5% तक हो सकती है।

अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक नैदानिक रूप से आनुवंशिक जानकारी के निर्धारण में बेतहाशा लागू हो रही है; यह दक्षता और उच्च थ्रूपुट के साथ जीनोम अनुक्रम तक व्यावहारिक पहुंच प्रदान करता है। विशेष रूप से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने जीनोम 4 में असामान्यता के लिए आनुवंशिक कारकों और परीक्षणों के साथ विकारों के निदान में भी क्रांतिला दी। डिजिटल डेटा में जैव-प्रतिक्रिया अनुक्रमण में रासायनिक संकेतों को सीधे स्थानांतरित करने के लिए अर्धचालक अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करते हुए, अर्धचालक-आधारित अनुक्रम प्रणाली 3-7 घंटे 5,6 में अनुक्रम डेटा के लिए एक प्रत्यक्ष, वास्तविक समय का पता लगाने प्रदान करती है।

आईवीएफ प्रक्रिया में, पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण (पीजीटी) आईवीएफ परिणाम में सुधार करने और नवजात शिशुओं में आनुवंशिक विकारों के जोखिम को कम करने के लिए गर्भाशय में स्थानांतरित होने से पहले भ्रूण की आनुवंशिक प्रोफ़ाइल की जांच करता है। एनजीएस तकनीकों के साथ संयुक्त पीजीटी में, 10 से कम कोशिकाओं से निकाली गई आनुवंशिक सामग्री को पूरे जीनोम प्रवर्धन किट या स्वतंत्र रूप से विकसित पूरे जीनोम प्रवर्धन अभिकर्मक के साथ प्रवर्धित किया जाता है। इसके लिए प्रवर्धन चरण में केवल एक चरण की आवश्यकता होती है और पूरे जीनोम प्रवर्धन उत्पादों को प्राप्त करने के लिए पूर्व-प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं होती है। कॉपी नंबर संस्करण और विशेष जीन लोकी अनुक्रमण के लिए प्राइमर या पैनल बनाए गए पुस्तकालय में डिज़ाइन और लागू किए जाते हैं।

एनजीएस में प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग-एन्यूप्लोइडी (पीजीटी-ए) के एक विशिष्ट वर्कफ़्लो में धारावाहिक प्रक्रियाएं शामिल हैं, और प्रयोगशाला कर्मियों के गहन कार्यभार की आवश्यकता होतीहै 8. प्रक्रिया रोल-बैक के कारण कुछ गलत संचालन से प्रयोगशाला के समय और संसाधनों दोनों का अवांछित नुकसान हो सकता है। पीजीएस-एनजीएस वर्कफ़्लो के लिए एक संक्षिप्त और स्पष्ट मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) सहायक है; हालाँकि, शब्द-प्रारूप प्रोटोकॉल नमूना प्रसंस्करण, डिवाइस हेरफेर और उपकरणों की सेटिंग्स पर अधिक विस्तृत जानकारी प्रस्तुत नहीं कर सकते हैं, जिसे वीडियो प्रोटोकॉल में देखा जा सकता है। इस लेख में, ऑपरेटिंग विवरण के एक विज़ुअलाइज्ड प्रदर्शन के साथ संयुक्त एक मान्य वर्कफ़्लो अर्धचालक अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म पर पीजीटी अभ्यास में अधिक प्रत्यक्ष और सहज ज्ञान युक्त संदर्भ प्रोटोकॉल प्रदान कर सकता है।

यहां प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो समानांतर में 16 भ्रूण बायोप्सी तक बैचिंग का समर्थन करता है। बड़े बैचों के लिए, अर्धचालक अनुक्रमण के लिए एक वाणिज्यिक किट-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि रिप्रोस-पीजीएस।

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Protocol

इस अध्ययन में लागू सभी प्रोटोकॉल और ट्रॉफेक्टोडर्म (टीई) बायोप्सी (1.1.1.1 अनुभाग) की समीक्षा की गई और 18 सितंबर, 2017 को नंबर 924 अस्पताल की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (नहीं: पीएलए 924-2017-59)। प्रतिभागियों ने इस अध्ययन में भाग लेने के लिए अपनी लिखित सूचित सहमति प्रदान की।

1. मानव भ्रूण बायोप्सी और पूरे जीनोमिक प्रवर्धन से डीएनए अलगाव

  1. पूरे जीनोम प्रवर्धन 9,10 के लिए प्रोटोकॉल
    नोट: पिको प्लेक्स डब्ल्यूजीए किट का उपयोग पूरे जीनोम प्रवर्धन करने के लिए किया जाता है।
    1. नमूना संग्रह और भंडारण
      1. ट्रोफेक्टोडर्म बायोप्सी: निम्नलिखित प्रवर्धन के लिए डीएनए की योग्य मात्रा प्राप्त करने के लिए सहायता प्राप्त करने के बाद डी 5/6 भ्रूण के हर्नियेटेड टीई से औसतन छह से नौ कोशिकाओं को आकर्षित करें।
      2. पीबीएस के 5 μL में एक पीसीआर ट्यूब के लिए नमूना कोशिकाओं स्थानांतरण।
      3. प्रोटोकॉल सीधे डीएनए निष्कर्षण के लिए आगे नहीं बढ़ता है, तो तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज।
    2. सेल लिसिस
      नोट: पूरक फ़ाइल 1 सूचीबद्ध करता है और सेल लाइसिस और 1, 8, 16, और 32 नमूनों के बैचों के पूरे जीनोम प्रवर्धन के दौरान मास्टर मिश्रण तैयार करते समय प्रत्येक घटक की अनुशंसित मात्रा के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है (पाइपिंग त्रुटियों को समायोजित करने के लिए ओवरएज के साथ)। इस प्रोटोकॉल के अन्य मास्टर घोला जा सकता है तैयार करते समय, प्रत्येक घटक की मात्रा अतिरिक्त रूप से दोहराया पाइपिंग के कारण घटक खपत को समायोजित करने के लिए वृद्धि हुई है। सभी संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूजेशन कमरे के तापमान (आरटी) पर 2-10 एस के लिए टेबलटॉप मिनी अपकेंद्रित्र पर किया जाता है, जिसमें 5,300 एक्स जी के केन्द्रापसारक बल के साथ 10,000 का एक निश्चित आरपीएम होता है। केन्द्रापसारक बल 2,000 एक्स जी और 12,000 एक्स जी के बीच होना चाहिए।
      1. निष्कर्षण एंजाइम कमजोर पड़ने बफर के 4.8 μL और नमूना प्रति सेल निष्कर्षण एंजाइम के 0.2 μL के साथ सेल लसीका मिश्रण तैयार करें।
      2. पीसीआर ट्यूबों में प्रत्येक 5 μL सेल नमूने में ताजा तैयार सेल लसीका मिश्रण के पिपेट 5 μL, और संक्षेप में 5 एस के लिए आरटी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। ट्यूब भंवर मत करो।
      3. 75 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट: निम्नानुसार एक थर्मल साइक्लर में नमूना सेते हैं; 95 डिग्री सेल्सियस, 4 मिनट; 25 डिग्री सेल्सियस, 14 मिनट। संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) इनक्यूबेशन के बाद ट्यूब।
    3. पूरे जीनोम डीएनए का पूर्व-प्रवर्धन
      1. पूर्व-एम्प बफर के 4.8 μL और नमूना प्रति पूर्व-amp एंजाइम के 0.2 μL के साथ पूर्व प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें।
      2. ट्यूब की दीवारों के माध्यम से नमूना ट्यूबों में पूर्व प्रवर्धन मिश्रण के पिपेट 5 μL, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र 3 एस के लिए। ट्यूब के नीचे तक पहुंचने वाली टिप से बचें, और ट्यूब को भंवर न करें।
      3. तालिका 1 में उल्लिखित थर्मल साइक्लर कार्यक्रम के अनुसार नमूना सेते हैं।
    4. पूरे जीनोम डीएनए प्रवर्धन
      1. संक्षेप में 5 एस के लिए नमूना अपकेंद्रित्र और बर्फ पर पूर्व इनक्यूबेशन उत्पाद जगह।
      2. प्रवर्धन बफर के 25 μL, प्रवर्धन एंजाइम के 0.8 μL, और नमूना प्रति नाभिक मुक्त पानी के 34.2 μL के साथ पूरे जीनोम प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें।
      3. पूर्व-एम्प इनक्यूबेशन उत्पाद के 15 μL के साथ ताजा तैयार पूरे जीनोम प्रवर्धन मिश्रण के 60 μL मिश्रण; कुल आयतन 75 μL होना चाहिए। संक्षेप में 5 s के लिए अपकेंद्रित्र। ट्यूब के नीचे तक पहुंचने वाली टिप से बचें, और ट्यूब को भंवर न करें।
      4. थर्मल साइक्लर पर पीसीआर ट्यूब रखें और तालिका 2 में उल्लिखित थर्मल साइक्लर प्रोग्राम चलाएं।
      5. 5 एस के लिए संक्षेप में ट्यूबों अपकेंद्रित्र और उत्पादों को एक नए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      6. फ्लोरोमीटर11 के साथ डब्ल्यूजीए उत्पाद एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। नमूनों को अस्थायी रूप से 2 महीने से कम समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है यदि अगले चरण में आगे नहीं बढ़ाया जाता है।
  2. स्वतंत्र रूप से विकसित डब्ल्यूजीए अभिकर्मकों का प्रोटोकॉल।
    1. नमूना संग्रह और भंडारण
      1. निम्नलिखित प्रवर्धन के लिए सहायता प्राप्त हैचिंग के बाद डी 5/6 भ्रूण से कोशिकाओं को ड्रा करें।
      2. पीबीएस के 2 μL युक्त एक पीसीआर ट्यूब में पीबीएस के 1.5 μL के साथ नमूना कोशिकाओं स्थानांतरण।
        नोट: पीबीएस एमजी2 + और सीए2 + से मुक्त है।
      3. -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत नमूने फ्रीज अगर सीधे डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के लिए आगे नहीं बढ़े।
    2. सेल लिसिस
      1. सेल लिसिस बफर (40 एमएम ट्रिस (पीएच 8), 100 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए), 1% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100, 5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 2 एमएम β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 0.1% एसडीएस) को आरटी पर पिघलाएं और इसे बर्फ पर रखें। प्रत्येक नमूने के लिए सेल लाइसिस बफर के 2 μL जोड़ें, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस)।
        नोट: ट्यूब भंवर मत करो, और प्रतिक्रिया प्रणाली से बाहर कोशिकाओं या डीएनए लाने से बचने के लिए ट्यूब में तरल सतह को छूने विंदुक टिप से बचें।
      2. 55 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट: निम्नानुसार एक थर्मल साइक्लर में नमूना सेते हैं; 95 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस, पकड़ो। संक्षेप में इनक्यूबेशन के बाद 10 एस के लिए आरटी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    3. पूरे जीनोम डीएनए प्रवर्धन
      1. संक्षेप में 5 एस के लिए सेल लाइसिस उत्पाद को अपकेंद्रित्र करें और इसे बर्फ पर रखें।
      2. प्रवर्धन पूर्व मिश्रित समाधान के 16 μL, प्रवर्धन एंजाइम के 1 μL, और न्यूक्लियस मुक्त पानी के 28 μL के साथ मिश्रण करके प्रत्येक नमूने के लिए पूरे जीनोम प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें। धीरे से मिलाएं, संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस), और मिश्रण को बर्फ पर रखें। ट्यूब भंवर मत करो।
      3. चरण 1.2.2.2 में तैयार सेल लिसिस उत्पाद में ताजा तैयार पूरे जीनोम प्रवर्धन मिश्रण के पिपेट 45 μL; धीरे-धीरे मिलाएं और 5 एस के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।
        नोट: ट्यूब भंवर और ट्यूब में तरल को छूने विंदुक टिप से बचने के लिए।
      4. थर्मल साइक्लर पर पीसीआर ट्यूब रखें और तालिका 3 में विस्तृत कार्यक्रम चलाएं।
      5. 5 एस के लिए जल्द ही ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और उत्पादों को एक नए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      6. फ्लोरोमीटर11 के साथ डब्ल्यूजीए उत्पाद एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और क्यूए (गुणवत्ता विश्लेषण) शीट पर परिणाम रिकॉर्ड करें। योग्य सांद्रता वाले उत्पादों को अगले चरण में आगे नहीं बढ़ने पर 2 महीने से कम समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अस्थायी रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।

2. प्रवर्धन टुकड़ा चयन

नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली सामग्री लाइब्रेरी तैयारी किट (सामग्री की तालिका) में उपलब्ध है।

  1. शुरू करने से पहले तैयारी
    1. 30 मिनट के लिए आरटी पर शुद्धि के लिए चुंबकीय मोती (एन एक्स 100 μL) को संतुलित करें।
    2. पिछले डब्ल्यूजीए उत्पाद को आरटी में पुनर्स्थापित करें भंवर इसे संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करने से पहले 30 एस के लिए आरटी पर उत्पाद।
    3. ताजा 70% इथेनॉल तैयार करें।
  2. टुकड़ा चयन प्रक्रिया
    1. डब्ल्यूजीए उत्पादों के पिपेट 25 μL और न्यूक्लियस मुक्त पानी प्रीलोडेड के 25 μL के साथ एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरण।
    2. भंवर और डीएनए शुद्धि मोती अच्छी तरह से मिश्रण। प्रत्येक नमूना ट्यूब (मूल नमूना: मोती (मात्रा) = 1: 1), भंवर, और अपकेंद्रित्र संक्षेप में (5 एस) में इसका 50 μL विभाज्य। डीएनए बाध्यकारी प्रक्रिया के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब सेट करें।
    3. एक चुंबक रैक में 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती ट्यूब के साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला एक नए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरण। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    4. मूल नमूना मात्रा के अनुसार, विंदुक 30 μL (मूल नमूना: मोती (मात्रा) = 1: 0.6) चुंबकीय मोती, भंवर, और अपकेंद्रित्र संक्षेप में (5 एस)। डीएनए बाध्यकारी प्रक्रिया के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब सेट करें।
    5. चुंबक रैक में 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब डालें, और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती ट्यूब के साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    6. पिपेट 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 70% इथेनॉल के 300 μL, धीरे एक 180 ° कोण के साथ दो बार ट्यूब बारी बारी से, और एक पूरी तरह से धोने के लिए ट्यूब की दीवार के साथ मोती ले जाएँ। पिपेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    7. धोने की प्रक्रिया को एक बार दोहराएं।
    8. चुंबक रैक और अपकेंद्रित्र से जल्द ही (5 एस) 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें। ट्यूबों को चुंबक रैक में वापस डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती ट्यूब के साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों।
    9. ध्यान से तल पर शेष तरल बाहर विंदुक। 3-5 मिनट के लिए आरटी पर मोती सूखने के लिए ट्यूब खुला रखें। मोतियों से नमी दूर रखें।
      नोट: मोतियों की गोली पर कोई दरार उभरने पर ढक्कन को तुरंत बंद करें।
    10. चुंबकीय रैक से ट्यूबों निकालें, एक ट्यूब में डीएनए क्षालन बफर के पिपेट 25-30 μL, और टोपी और भंवर बंद करें। ट्यूब के नीचे टर्बिड तरल प्राप्त करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस), और 5 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब सेट करें।
    11. ट्यूबों को चुंबकीय रैक में वापस डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी मोती ट्यूब साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों और सतह पर तैरनेवाला पारदर्शी हो जाए। ध्यान से नए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डीएनए समाधान हस्तांतरण। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    12. फ्लोरोमीटर11 के साथ टुकड़ा चयन के बाद डीएनए की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें, इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आमतौर पर, चयनित डीएनए टुकड़े की एकाग्रता 1.5-2.4 एनजी /

3. डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी12

नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली सामग्री लाइब्रेरी तैयारी किट (सामग्री की तालिका) में उपलब्ध है।

  1. मरम्मत समाप्त करें
    1. 30 मिनट के लिए आरटी पर चुंबकीय मोती को संतुलित करें।
    2. चरण 2.2.12 में टुकड़ा चयन के डीएनए उत्पाद को आरटी तक संतुलित करें डीएनए युक्त प्रत्येक शीशी पर टैग की जांच करें और रिकॉर्ड करें।
    3. डीएनए उत्पादों के 30 μL, अंत मरम्मत बफर के 10 μL, अंत मरम्मत एंजाइम के 0.5 μL, और एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में न्यूक्लियस मुक्त पानी के 9.5 μL के साथ डीएनए अंत-मरम्मत प्रणाली तैयार करें। ट्यूब तल करने के लिए सभी तरल पाने के लिए आरटी पर संक्षेप में (5 एस) 30 एस और अपकेंद्रित्र के लिए ट्यूब भंवर।
    4. 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) इनक्यूबेशन के बाद ट्यूब।
    5. भंवर या रिवर्स चुंबकीय मोती मिश्रण, और अंत मरम्मत डीएनए नमूने (मूल नमूना: मोती (मात्रा) = 1: 1.5) युक्त एक ट्यूब में चुंबकीय मोती के 75 μL हस्तांतरण। पिपेट या धीरे भंवर मोती अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) ट्यूब के नीचे सभी निलंबन स्पिन करने के लिए। डीएनए बाध्यकारी प्रक्रिया के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब सेट करें। मोतियों को फैलाने के लिए ट्यूबों को धीरे-धीरे फ्लिप करें।
    6. चुंबक रैक में अपकेंद्रित्र ट्यूबों डालें, और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों और सतह पर तैरनेवाला पारदर्शी न हो जाए। सतह पर तैरनेवाला निकालें, और पाइपिंग करते समय रैक पर ट्यूबों को रखते हुए, मोतियों को पाइप करने से बचें।
    7. ट्यूबों में नए तैयार 70% इथेनॉल के 300 μL स्थानांतरण, धीरे एक 180 ° कोण पर दो बार ट्यूबों बारी बारी से, और एक पूरी तरह से धोने के लिए ट्यूब की दीवार के साथ मोती ले जाएँ। पिपेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    8. धोने की प्रक्रिया को एक बार दोहराएं।
    9. चुंबक रैक से 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों को निकालें, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस)। ट्यूबों को चुंबक रैक में वापस डालें, और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती ट्यूब के साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों।
    10. ध्यान से नीचे में शेष तरल बाहर विंदुक। 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों की टोपी खोलें और 3-5 मिनट के लिए आरटी पर मोती सूखी। मोतियों से नमी दूर रखें।
      नोट: मोतियों की गोली पर कोई दरार उभरने पर ढक्कन को तुरंत बंद करें।
    11. एक ट्यूब में डीएनए क्षालन बफर के पिपेट 33 μL, टोपी बंद करें, और भंवर। ट्यूब के नीचे टर्बिड निलंबन प्राप्त करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) और 5 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब सेट करें।
    12. ट्यूबों को चुंबकीय रैक में वापस डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी मोती साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों और समाधान पारदर्शी हो जाए। ध्यान से उचित टैग के साथ नए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डीएनए समाधान हस्तांतरण, मोतियों को बाहर पाइपिंग से परहेज।
  2. बारकोड बंधाव
    1. सभी जमे हुए अभिकर्मकों को पिघलाने के लिए बर्फ पर चरण 3.2.2 में बारकोड बंधाव अभिकर्मकों रखें।
    2. अंत-मरम्मत डीएनए उत्पादों के 32 μL, न्यूक्लियस मुक्त पानी के 10 μL, लिगेज बफर के 5 μL, लिगेज के 1 μL, और P1 के 1 μL के साथ बंधाव प्रणाली तैयार करें एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अनुकूलन। एक नमूने के लिए ट्यूब में समाधान मिश्रण में प्रत्येक बारकोड अभिकर्मक के 1 μL से बाहर पिपेट, 5 एस के लिए भंवर, और ट्यूब तल में सभी तरल पाने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस)।
      नोट: बारकोड जोड़ते समय, पुष्टि करें कि बारकोड और नमूनों की संख्या मेल खाती है; बारकोड के मिश्रित प्रदूषण से बचने के लिए प्रत्येक समय केवल एक बारकोड शीशी खोलें; जोड़े गए प्रत्येक पांच या छह बारकोड के लिए दस्ताने बदलें।
    3. 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
    4. पिपेट 75 μL (मूल नमूना: मोती (मात्रा) = 1: 1.5) एक ट्यूब में चुंबकीय मोती के, और पिपेट या धीरे भंवर अच्छी तरह से मोती मिश्रण करने के लिए। मनका एकत्रीकरण से परहेज करते हुए, सभी निलंबन को नीचे तक स्पिन करने के लिए संक्षेप में (5 एस) अपकेंद्रित्र करें। डीएनए बाध्यकारी प्रक्रिया के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब सेट करें। मोतियों को छितरा रखने के लिए ट्यूबों को धीरे-धीरे फ्लिप करें।
    5. चुंबक रैक में अपकेंद्रित्र ट्यूब डालें, और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों और सतह पर तैरनेवाला पारदर्शी न हो जाए। सतह पर तैरनेवाला निकालें और मोती को पाइप करने से बचें, पाइपिंग करते समय रैक पर ट्यूबों को रखें।
    6. ट्यूबों में नए तैयार 70% इथेनॉल के 300 μL स्थानांतरण, धीरे एक 180 ° कोण पर दो बार ट्यूबों बारी बारी से, और एक पूरी तरह से धोने के लिए ट्यूब की दीवार के साथ मोती ले जाएँ। पिपेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    7. धोने की प्रक्रिया को एक बार दोहराएं।
    8. चुंबक रैक और अपकेंद्रित्र संक्षेप में (5 एस) से 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों निकालें। ट्यूबों को चुंबक रैक में वापस डालें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती ट्यूब के साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों। ध्यान से तल में शेष सतह पर तैरनेवाला बाहर विंदुक।
    9. 3-5 मिनट के लिए आरटी पर मोती सूखने के लिए ट्यूब टोपी खुला रखें। मोतियों से नमी दूर रखें।
      नोट: मोतियों की गोली पर कोई दरार उभरने पर ढक्कन को तुरंत बंद करें।
    10. ट्यूब में डीएनए क्षालन बफर के पिपेट 15 μL। ट्यूब के नीचे मोती गोली कुल्ला, टोपी सील, और भंवर। ट्यूब के नीचे टर्बिड निलंबन प्राप्त करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) और 5 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब स्थिर रखने के लिए।
  3. टुकड़ा प्रवर्धन
    1. जमे हुए अभिकर्मक के घुलने पर पुस्तकालय भवन एजेंटों को बर्फ पर रखें।
    2. एंजाइम मिश्रण के 47.5 μL और प्राइमर मिश्रण के 2.5 μL एल्यूटेड डीएनए और मोती युक्त ट्यूब में स्थानांतरण, 5 एस के लिए भंवर, और ट्यूब तल करने के लिए सभी तरल प्राप्त करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस)।
    3. 5 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब सेट करें। ट्यूबों को चुंबकीय रैक में वापस डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी मोती साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों और सतह पर तैरनेवाला पारदर्शी हो जाए। ध्यान से स्पष्ट रूप से चिह्नित टैग के साथ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में डीएनए समाधान हस्तांतरण, और मोतियों को बाहर पाइपिंग से बचें।
    4. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक थर्मल साइक्लर सेट में नमूना सेते हैं: 72 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट; 98 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट; 98 डिग्री सेल्सियस, 15 एस; 62 डिग्री सेल्सियस, 15 एस; 70 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट (6 चक्र); 70 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट। संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) ट्यूब जब प्रतिक्रिया समाप्त हो जाती है और उत्पादों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करती है।
    5. पीसीआर उत्पादों को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (कम लगाव) में स्थानांतरित करें। ट्यूब में चुंबकीय मोतियों के 97.5 μL (मूल नमूना मात्रा: मोती (मात्रा) = 1: 1.5) जोड़ें जब प्रतिक्रिया समाप्त होती है, पिपेट या धीरे भंवर मोती अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) सभी तरल नीचे स्पिन करने के लिए। मोतियों के एकत्रीकरण से बचें। 5 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब सेट करें। मोतियों को छितरा रखने के लिए ट्यूबों को धीरे-धीरे फ्लिप करें।
    6. चुंबक रैक में अपकेंद्रित्र ट्यूबों डालें, और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों और सतह पर तैरनेवाला पारदर्शी हो जाए। सतह पर तैरनेवाला निकालें, मोतियों को पाइप करने से बचें, और रैक पर ट्यूबों को स्थिर रखें।
    7. ट्यूबों में नए तैयार 70% इथेनॉल के 300 μL स्थानांतरण, धीरे एक 180 ° कोण पर दो बार ट्यूबों बारी बारी से, और एक पूरी तरह से धोने के लिए ट्यूब की दीवार के साथ मोती ले जाएँ। पिपेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मोतियों को बाहर निकालने से बचें।
    8. धोने की प्रक्रिया को एक बार दोहराएं।
    9. चुंबक रैक और अपकेंद्रित्र संक्षेप में (5 एस) से 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें। ट्यूब चुंबक रैक में वापस डालें, और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी चुंबकीय मोती ट्यूब के साइडवॉल की ओर आकर्षित न हों। ध्यान से नीचे में शेष तरल बाहर विंदुक।
    10. 3-5 मिनट के लिए आरटी पर मोती सूखने के लिए ट्यूब टोपी खुला रखें। मोतियों से नमी दूर रखें।
      नोट: मोतियों की गोली पर कोई दरार उभरने पर ढक्कन को तुरंत बंद करें।
    11. ट्यूब में डीएनए क्षालन बफर के पिपेट 22 μL, मोती गोली नीचे कुल्ला, और टोपी और भंवर बंद करें। ट्यूब के नीचे टर्बिड तरल प्राप्त करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) और 5 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब सेट करें।
    12. फ्लोरोमीटर11 के साथ निर्मित डीएनए लाइब्रेरी की एकाग्रता को मापें और निर्मित डीएनए लाइब्रेरी को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; चयनित डीएनए टुकड़े की एकाग्रता 0.6-10 एनजी / μL से होती है लाइब्रेरी डेटाबेस में लाइब्रेरी जानकारी को फिर से कोड करें और तदनुसार नमूनों को संग्रहीत करें।

4. अनुक्रमण टेम्पलेट की तैयारी13,14

नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली सामग्री अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं यूनिवर्सल किट (सामग्री की तालिका) के टेम्पलेट तैयारी किट सेट (अभिकर्मकों / समाधान / सामग्री) में उपलब्ध हैं।

  1. पुस्तकालय मिश्रण
    1. सर्वर सिस्टम में प्री-रन रिकॉर्ड शीट के रूप में भरें और लाइब्रेरी एकाग्रता और बारकोड नंबर के साथ नमूना ट्यूब को टैग करें। एक रन में विभिन्न नमूनों पर एक ही बारकोड का उपयोग करने से बचें।
    2. भंवर और पुस्तकालय के नमूने मिश्रण, और अपकेंद्रित्र संक्षेप में (5 एस)। न्यूक्लियस मुक्त पानी, 30 एस के लिए भंवर के साथ 100 पीएम के लिए सभी नमूनों को पतला करें, और संक्षेप में नमूने को अपकेंद्रित्र करें।
      नोट: यह देखते हुए कि डीएनए की औसत लंबाई 260 बीपी है, और 1 बीपी 660 ग्राम / मोल है, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके पीएम में एनजी / μL के रूपांतरण की गणना करें: 1 एनजी / μL = 5,827.5 पीएम / एल।
    3. पिपेट 100 पीएम पतला पुस्तकालय के 10 μL एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब, 30 एस के लिए भंवर, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र 2 एस के लिए। मिश्रित पुस्तकालय को बर्फ पर रखें।
  2. टेम्पलेट की तैयारी
    1. टेम्पलेट प्रवर्धन प्रणाली शुरू करें और स्वच्छ कार्यक्रम चुनें। ट्यूब के 1/2 में प्रतिक्रिया तेल जोड़ें, और ट्यूब के 1/3 में पायसीकारी तोड़ने वाले समाधान को जोड़ें।
    2. पुष्टि करें कि प्रवर्धन प्लेट और धोने एडाप्टर पर स्थिति में सेट कर रहे हैं। कचरे की बोतल को साफ करें, और कचरे को इकट्ठा करने के लिए एक नई 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक सुई डालें। टेम्पलेट प्रवर्धन प्रणाली की स्क्रीन पर संसाधित चरणों की पुष्टि करें। एक स्वच्छ कार्यक्रम शुरू करने के लिए अगला दबाएं, जिसमें लगभग 15 मिनट लगेंगे।
    3. स्वच्छ कार्यक्रम के बाद एक नए के साथ प्रवर्धन प्लेट को बदलें, रोटर में 150 μL ब्रेकिंग समाधान द्वितीय युक्त संग्रह ट्यूब डालें, और संग्रह ट्यूबों पर पुल रखें। ट्यूब के 1/2 में प्रतिक्रिया तेल और ट्यूब के 1/3 के लिए पायसीकारी तोड़ने वाले समाधान जोड़ें।
    4. पीसीआर अभिकर्मक तैयारी को पायसीकारी करें: आरटी पर पायसीकृत पीसीआर बफर को तब तक संतुलित करें जब तक कि यह घुल न जाए, संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस) सभी अभिकर्मकों, और उपयोग से पहले उन्हें बर्फ पर रखें।
    5. पायसीकृत पीसीआर एंजाइम मिश्रण के पिपेट 120 μL, टेम्पलेट आयन क्षेत्र कण (आईएसपी) बफर के 100 μL, न्यूक्लियस मुक्त पानी के 170.5 μL, और मिश्रित पुस्तकालय (100 पीएम) के 9.5 μL एक ट्यूब में पायसीकृत पीसीआर बफर के 2,000 μL युक्त एक ट्यूब में। बार-बार पाइपिंग के साथ समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: मिश्रित समाधान 15 मिनट के भीतर टेम्पलेट प्रवर्धन प्रणाली पर लोड किया जाना चाहिए; आरटी पर सभी प्रक्रियाएं करें।
    6. नमूना पोर्टल ऊपर की ओर के साथ ट्यूब रैक पर स्थिर टेम्पलेट तैयारी के लिए एक नया फिल्टर रखें। भंवर 5 एस के लिए समाधान, संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस), और बार-बार 800 μL तीन बार पाइपिंग के बाद फिल्टर के नमूना पोर्टल में समाधान हस्तांतरण। पिछले इंजेक्शन से पहले बुलबुले को कम करने के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। फिल्टर में हवा इंजेक्ट करने से बचें। मिश्रित समाधान के बाद प्रतिक्रिया तेल द्वितीय के 200 μL इंजेक्ट करें।
    7. फ़िल्टर के नमूना पोर्टल को नीचे की ओर घुमाएं, और फ़िल्टर के साथ धोने के अनुकूलन को प्रतिस्थापित करें। रोटर ढक्कन के केंद्र छेद में नमूना सुई डालें और फिर सुई को नीचे दबाएं।
    8. स्क्रीन पर रन बटन दबाएं, संबंधित किट के अनुसार प्रोग्राम चुनें, और सभी चरणों की जांच करने के लिए असिस्टेड दबाएं। रन प्रारंभ होने तक अगला दबाएँ; इसे खत्म करने में लगभग 4.5 घंटे लगते हैं।
    9. प्रोग्राम समाप्त होने पर अगला दबाएँ; सिस्टम 10 मिनट सेंट्रीफ्यूजेशन शुरू करेगा। जब सेंट्रीफ्यूजेशन बंद हो जाता है, तो ओपन लिड बटन दबाएं और संग्रह ट्यूबों को रैक में ले जाएं। यदि प्रक्रिया 15 मिनट में अगले चरण में नहीं जाती है, तो पुन: अपकेंद्रित्र के लिए अंतिम स्पिन पर दबाएं।
    10. ट्यूब में समाधान के 100 μL छोड़कर, संग्रह ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला निकालें। पाइपिंग द्वारा शेष नमूने को मिलाएं और नमूने को ओटी (एक स्पर्श 2 प्रणाली) चिह्नित नए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: सतह पर तैरनेवाला पाइपिंग करते समय, पक्ष के साथ ट्यूब तल को छूने से बचें।
    11. संग्रह ट्यूबों में से प्रत्येक में न्यूक्लियस मुक्त पानी के पिपेट 100 μL, और दोहराया पाइपिंग के साथ धोया ओटी ट्यूब के लिए हस्तांतरण समाधान। कुल मात्रा 1 एमएल, 30 एस के लिए भंवर, और 8 मिनट के लिए 15,500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र बनाने के लिए ओटी ट्यूब में न्यूक्लियस मुक्त पानी के 600 μL जोड़ें।
    12. धीरे 100 μL शेष के साथ ओटी ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला निकालें और तेल परत को अच्छी तरह से त्यागने के लिए टिप का उपयोग करें। न्यूक्लियस मुक्त पानी के 900 μL जोड़ें, 30 एस के लिए भंवर, और 8 मिनट के लिए 15,500 x g पर अपकेंद्रित्र।
    13. सतह पर तैरनेवाला निकालें जब तक कि 20 μL छोड़ दिया जाता है, वॉल्यूम 100 μL बनाने के लिए टेम्पलेट पुन: निलंबित समाधान जोड़ें, 30 एस के लिए भंवर, और संक्षेप में 2 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
      नोट: इस चरण में प्राप्त समाधान को 12 घंटे से कम समय में अगले चरण में आगे बढ़ना चाहिए।
    14. इसकी शक्ति को बंद करने से पहले टेम्पलेट प्रवर्धन प्रणाली पर स्वच्छ प्रोग्राम चलाएं।
  3. टेम्पलेट संवर्धन
    1. ट्वीन -80 के 280 μL और 1 एम एनएओएच के 40 μL के साथ पिघल-बंद मिश्रण तैयार करें।
    2. सी 1 मोती धो लें। भंवर 30 एस के लिए सी 1 मोती समाधान। एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए मोती के 100 μL स्थानांतरण, 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब डालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. 30 एस के लिए ट्यूब और भंवर में सी 1 मोती धोने के समाधान के 1 एमएल स्थानांतरण। संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस), ट्यूब को 2 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में डालें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ट्यूब में सी 1 मनका पुन: निलंबन समाधान के पिपेट 130 μL, और दोहराया विंदुक द्वारा मोती मिश्रण। बुलबुले बनाने से बचें।
    4. पतला पुस्तकालय के 100 μL लोड, सी 1 मोती के 130 μL, 300 μL x 3 टेम्पलेट धोने समाधान, और पिघल बंद समाधान के 300 μL आठ अच्छी तरह से स्ट्रिप्स के लिए, के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया है।
    5. संवर्धन मॉड्यूल पर आठ अच्छी तरह से स्ट्रिप्स स्थापित करें, पाइपिंग टिप लोड करें, और संग्रह की स्थिति में 200 μL अपकेंद्रित्र ट्यूब सेट करें। प्रोग्राम चलाने के लिए स्टार्ट पर दबाएं; इसमें लगभग 35 मिनट लगते हैं।
    6. नमूना स्वचालित रूप से 200 μL अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र किया जाएगा; ढक्कन बंद करें और इसे 5 मिनट के लिए 15,500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें। यह सत्यापित करने के लिए ट्यूब नीचे की जाँच करें कि क्या कोई सी 1 मोती रहता है।
    7. यदि सी 1 मोती शेष हैं, तो बार-बार टेम्पलेट समाधान 10x पिपेट करें और 4 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूब डालें। 5 मिनट के लिए 15,500 एक्स जी पर एक नया 0.2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र करने के लिए सभी सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    8. यदि कोई दृश्यमान सी 1 मोती शेष नहीं है, तो सतह पर तैरनेवाला को तब तक त्यागें जब तक कि 10 μL नहीं बचा है, 200 μL न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और 10x पाइपिंग करके मिलाएं। 5 मिनट के लिए 15,500 x g पर अपकेंद्रित्र।
    9. 10 μL शेष के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 100 μL की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए न्यूक्लियस मुक्त पानी के 90 μL जोड़ें. पिपेट ऊपर और नीचे 10x समाधान मिश्रण करने के लिए, 5 एस के लिए भंवर, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र (5 एस)। समाधान को 3 दिनों से कम समय के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 9,15

नोट:: इस खंड में सभी कार्यविधियों DA8600 अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म पर किए जाते हैं। इस खंड में उपयोग की जाने वाली सामग्री अनुक्रमण प्रतिक्रियाएं यूनिवर्सल किट (सामग्री की तालिका) के अनुक्रमण किट सेट (अभिकर्मकों / समाधान / सामग्री) में उपलब्ध हैं।

  1. रन-ऑन अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म में आवश्यक सभी अभिकर्मकों और सामग्रियों की जाँच करें।
    1. अनुक्रमण अभिकर्मक: अनुक्रमण एंजाइम समाधान (6 μL), अनुक्रमण प्राइमरों (20 μL), गुणवत्ता नियंत्रण टेम्पलेट (5 μL), और डीजीटीपी /
    2. अनुक्रमण समाधान: अनुक्रमण समाधान द्वितीय (100 एमएल), अनुक्रमण समाधान III (50 एमएल), एनीलिंग बफर (1,015 μL), लोडिंग बफर (10 μL), फोमिंग एजेंट (2 μL), क्लोरीन टैबलेट (1 टैबलेट), और स्ट्रेप्टाविडिन मोती (100 μL) की उपलब्धता की जाँच करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
    3. सामग्री: आरटी पर संग्रहीत 250 एमएल अभिकर्मक ट्यूब (8), 250 अभिकर्मक ट्यूब कैप (8), सिपर द्वितीय (8), सिपर (1), 2 एल अभिकर्मक बोतल (1), और अनुक्रमण चिप (1) की उपलब्धता की जांच करें।
  2. उपयोग करने से पहले चिप को धो लें।
    1. एक काम करने वाली प्लेट पर एक चिप स्थिर सेट करें, नमूना छेद में न्यूक्लियस मुक्त पानी के 100 μL इंजेक्ट करें, आउट पोर्टल में समाधान निकालें, और प्रक्रिया को दोहराएं।
    2. चिप में 0.1 एम एनएओएच समाधान के 100 μL इंजेक्ट करें और आरटी पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. नमूना छेद में आइसोप्रोपेनॉल के 100 μL इंजेक्ट करें, आउट पोर्टल में अतिरिक्त समाधान निकालें, और प्रक्रिया को फिर से दोहराएं।
    4. एक फिल्टर पेपर के साथ आउट पोर्टल को कवर करें, चिप के प्रवाह सेल में शेष आइसोप्रोपेनॉल को सूखने के लिए नाइट्रोजन में प्रवाहित करें, और आरटी पर उपयोग के लिए तैयार चिप रखें।
  3. सीक्वेंसर दीक्षा
    1. नाइट्रोजन वाल्व पर स्विच करें और दबाव को 30 पीएसआई पर ट्यून करें। सीक्वेंसर शुरू करें, मुख्य स्क्रीन पर क्लीन दबाएं, और तदनुसार मशीन को धोने के लिए पानी या क्लोराइड चुनें।
      नोट: हर रन से पहले पानी से धोएं, हर हफ्ते क्लोराइड से धोएं या जिस समय मशीन 48 घंटे से अधिक अभिकर्मकों के साथ खड़ी होती है।
    2. क्लोराइड वॉश: क्लोराइड धोने के लिए निर्दिष्ट एक अभिकर्मक बोतल चुनें, बोतल को 18 एमΩ पानी से दो बार धोएं और बोतल को 18 एमΩ पानी के 1 एल से भरें। बोतल में एक क्लोराइड टैबलेट रखो, 10 मिनट के लिए टैबलेट को भंग करें, 1 एम एनएओएच के 1 एमएल जोड़ें, और फिर समाधान मिश्रण करने के लिए बोतल को उलट दें। तैयारी के बाद 3 घंटे के भीतर क्लोराइड समाधान का उपयोग करें।
    3. एक 0.45 μm फिल्टर के साथ क्लोराइड समाधान के 100 मिलीलीटर फ़िल्टर और दो ट्यूबों के साथ इकट्ठा. दो क्लोराइड ट्यूबों को सी 1 और सी 2 की स्थिति में स्थापित करें। मुख्य स्क्रीन पर क्लीन दबाएं, और क्लोराइड धोने के लिए एक चिप से लैस करें।
    4. अगला पर दबाएं और वॉश प्रोग्राम शुरू करने के लिए स्क्रीन पर सभी चरणों की जांच करें; कार्यक्रम 30 मिनट में समाप्त हो जाएगा। क्लोराइड धोने के बाद पानी से धोना शुरू करें।
    5. पानी धोना: सी 1 और सी 2 के साथ पानी के लिए विशिष्ट दो ट्यूबों को चिह्नित करें, और ट्यूबों को दो बार 18 एमΩ पानी से धो लें। प्रत्येक वॉटर वॉश ट्यूब में 18 एमΩ पानी के 100 एमएल जोड़ें, और उन्हें क्रमशः सी 1 और सी 2 स्थितियों में सेट करें।
    6. स्वच्छ प्रोग्राम चुनें, पानी धोने के लिए तैयार चिप स्थापित करें, अगला दबाएं, और फिर वॉश प्रोग्राम शुरू करने के लिए स्क्रीन पर सभी चरणों की जांच करें।
  4. प्रारंभ
    1. धोने की बोतल को धोने के घोल II से साफ करें, इसे W2 के रूप में चिह्नित करें, और इसे 18 MΩ पानी से तीन बार धो लें।
    2. नाइट्रोजन ट्यूब को हवा से रखे कागज के साथ साफ करें, इसे ट्यूब तल में डालें, और एयरफ्लो को 0.5 एल / बोतल में ऑक्सीजन डिस्चार्ज करें और बोतल को 18 एमΩ पानी के 1,920 एमएल से भरें। बोतल में अनुक्रम समाधान द्वितीय और 1 एम एनएओएच के 10 μL जोड़ें, टोपी बंद करें, और समाधान मिश्रण करने के लिए बोतल को कई बार रिवर्स करें।
    3. डब्ल्यू 1 और डब्ल्यू 3 के रूप में दो नई ट्यूबों को चिह्नित करें। डब्ल्यू 1 में 1 एम एनएओएच के 32 μL जोड़ें, W3 के लिए 1x अनुक्रम समाधान III के 40-50 एमएल जोड़ें, और टोपी बंद करें।
      नोट: 1x अनुक्रम समाधान III पहली बार इस्तेमाल किया जब 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में होना चाहिए। अनुक्रम समाधान द्वितीय प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए और आरटी पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। 20 बार उपयोग किए जाने के बाद धोने की बोतल को एक नए के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।
    4. मुख्य स्क्रीन पर इनिशियलाइज़ दबाएं , डब्ल्यू 1, डब्ल्यू 2 और डब्ल्यू 3 पदों पर सिपर बदलें, ट्यूबों को तदनुसार अपनी स्थिति में सेट करें, और रोटेशन द्वारा उन्हें कसकर सील करें। प्रारंभ करने के लिए एक चिप स्थापित करें और मशीन के राज्य मापदंडों की जांच करें।
    5. प्रारंभ कार्यक्रम प्रारंभ करने के लिए अगला दबाएँ; पहले खंड में 40 मिनट लगते हैं।
      नोट: सिपर के शरीर को दूषित करने से बचने के लिए नए सिपर को बदलने से पहले दस्ताने को बदलना चाहिए। एक बार पानी धोने और आरंभीकरण के लिए उपयोग किए जाने के बाद, चिप्स को प्रारंभिककरण पर लागू किया जा सकता है, लेकिन प्रारंभिककरण के लिए क्लोराइड-वॉश चिप्स के लिए उपयोग किए जाने वाले चिप्स का उपयोग न करें।
    6. मिश्रण करने के लिए बर्फ पर डीजीटीपी, डीसीटीपी, डीएटीपी और डीटीटीपी को भंग करें। जी, सी, ए, और टी के रूप में चार नई ट्यूबों को चिह्नित करें, और ट्यूब के टैग के अनुसार समाधान के पिपेट 70 μL।
  5. चलाने के लिए लाइब्रेरी तैयार करें।
    1. बर्फ पर गुणवत्ता नियंत्रण टेम्पलेट, प्राइमर और एंजाइम समाधान रखें।
    2. डीएनए लाइब्रेरी तैयार करें जब प्रारंभिक कार्यक्रम में लगभग 20 मिनट बचे हों। मिश्रण करने के लिए 30 एस के लिए गुणवत्ता नियंत्रण टेम्पलेट भंवर, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र 2 एस के लिए। टेम्पलेट समाधान में गुणवत्ता नियंत्रण टेम्पलेट के 5 μL स्थानांतरण, 5 एस के लिए भंवर, और 5 मिनट के लिए 15,500 x g के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। ध्यान से पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें, गोली को छूने से बचें, और ट्यूब में 10 μL मात्रा छोड़ दें।
    3. ट्यूब में एनीलिंग बफर के 15 μL जोड़ें; समाधान का कुल आयतन 25 μL है।
    4. अनुक्रम प्राइमरों को भंवर करें जब यह पूरी तरह से बर्फ पर घुल जाता है और 2 एस के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र होता है। पूर्व चरण से ट्यूब में अनुक्रम प्राइमरों के 20 μL स्थानांतरण, 5 एस के लिए भंवर, जल्द ही 2 एस के लिए अपकेंद्रित्र, और फिर उपयोग से पहले आरटी पर स्टोर करें।
  6. नमूना और अनुक्रमण लोड हो रहा है
    1. पिछले चरण में तैयार नमूना समाधान के पिपेट 55 μL और चिप के नमूना छेद में इसे इंजेक्ट।
    2. अपकेंद्रित्र पर चिप सेट करें; बाहर की ओर पायदान रखें और नमूना पोर्टल अंदर, इसे एक और इस्तेमाल की गई चिप के साथ संतुलित करें, और 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. लोडिंग समाधान तैयार करें।
      1. 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एनीलिंग बफर के 0.5 एमएल और न्यूक्लियस मुक्त पानी के 0.5 एमएल मिलाएं। इसे 50% एनीलिंग बफर के रूप में चिह्नित करें और 7 दिनों के भीतर उपयोग करें।
      2. आइसोप्रोपेनोल समाधान के 0.5 मिलीलीटर और एनीलिंग बफर के 0.5 एमएल मिलाएं। इसे 50% धोने बफर के रूप में चिह्नित करें और 24 घंटे के भीतर उपयोग करें।
      3. अनुक्रम एंजाइम के 6 μL और 50% एनीलिंग बफर के 60 μL मिलाएं। इसे एंजाइम प्रतिक्रिया बफर के रूप में चिह्नित करें, और तैयारी के बाद समाधान को बर्फ पर रखें।
      4. 50% एनीलिंग बफर के 49 μL और फोमिंग एजेंट के 1 μL मिलाएं, और इसे फोमिंग समाधान के रूप में चिह्नित करें।
    4. फोमिंग समाधान में हवा के 100 μL झटका, बार-बार बुलबुले एक घने फोमिंग अवस्था में हैं जब तक समाधान विंदुक, और 250 μL के आसपास फोम की मात्रा रखने।
    5. अपकेंद्रित्र के बाद बेंच पर चिप रखें, नमूना छेद में फोम के 100 μL इंजेक्ट करें, और बाहर पोर्टल में बाहर निकाले गए समाधान को हटा दें। चिप को अपकेंद्रित्र में वापस सेट करें, और 30 एस के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।
    6. चरण 5.6.4-5.6.5 दोहराएँ।
    7. दो बार 50% धोने बफर के 100 μL इंजेक्ट करें, और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद बाहर पोर्टल में एक्सट्रूडेड समाधान को हटा दें।
    8. तीन बार 50% एनीलिंग बफर के 100 μL इंजेक्ट करें, और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद बाहर पोर्टल में एक्सट्रूडेड समाधान को हटा दें।
    9. 50% एंजाइम प्रतिक्रिया बफर के 65 μL इंजेक्ट करें, बुलबुले से बचें, और आउट पोर्टल में एक्सट्रूडेड समाधान को हटा दें।
    10. 5 मिनट के लिए आरटी पर लोड चिप को स्थिर करें, और सीक्वेंसर चिप पोर्टल पर चिप स्थापित करें। चरण 6 में प्रोग्राम की गई योजना चुनें, जानकारी की जांच करें, और रन शुरू करें; इसे खत्म करने में लगभग 1.5 घंटे लगते हैं।
    11. रन समाप्त होने के बाद 72 घंटे के भीतर पानी धोने कार्यक्रम करें। समय 72 घंटे से अधिक होने पर पानी धोने से पहले क्लोराइड वॉश करें। सीक्वेंसर को बंद करें, और नाइट्रोजन के वाल्व को बंद करें।

6. रिपोर्टर सर्वर सिस्टम 16 में एक निर्देशित अनुक्रमण चलाने की योजना बनाएं

नोट: इस खंड में सभी प्रक्रियाओं रिपोर्टर सर्वर सिस्टम के साथ आयन प्रोटॉन सीक्वेंसर पर किया जाता है।

  1. सर्वर सिस्टम में साइन इन करें, योजना टैब का चयन करें, और योजना टेम्पलेट रन पर क्लिक करें। रन प्रकार के रूप में संपूर्ण जीनोम चुनें, और नियोजित रन टेम्पलेट्स की सूची से उपयुक्त टेम्पलेट का चयन करें।
  2. योजना टैब में, निम्न चयन दर्ज करें या करें:
    1. नमूनों के बैच के अनुसार एक नया रन प्लान नाम दर्ज करें, संदर्भ लाइब्रेरी ड्रॉपडाउन सूची से एचजी 19 (होमो सेपियन्स) का चयन करें, और लक्ष्य क्षेत्रों और हॉटस्पॉट क्षेत्र ड्रॉपडाउन सूचियों में से कोई नहीं का चयन करें।
    2. नमूना सेट में उपयोग किए जाने वाले बारकोड की संख्या दर्ज करें, प्रत्येक नमूने के लिए ड्रॉपडाउन सूची से एक बारकोड का चयन करें, और एक अद्वितीय, वर्णनात्मक नाम दर्ज करें, जो नमूने को समूहीकृत और ट्रैक करने में सहायक हो सकता है। डिफ़ॉल्ट नमूना 1 और इतने पर के उपयोग से बचें।
    3. आयन रिपोर्टर टैब में कोई नहीं का चयन करें, अगलाक्लिक करें, और लक्ष्य तकनीक के रूप में अनुप्रयोग और पूरे जीनोम में डीएनए का चयन करें।
    4. किट टैब में, चयन सत्यापित करें, या रन के लिए उपयुक्त होने पर परिवर्तन करें।
      1. लाइब्रेरी किट प्रकार ड्रॉपडाउन सूची से आयन प्लस फ्रैगमेंट लाइब्रेरी किट का चयन करें। टेम्पलेट किट ड्रॉपडाउन सूची में आयन पीआई हाय-क्यू ओटी 2 200 किट का चयन करें, और डिफ़ॉल्ट के रूप में वनटच चुनें। अनुक्रमण किट ड्रॉपडाउन सूची से आयन पीआई हाय-क्यू अनुक्रमण 200 किट का चयन करें।
      2. 300 प्रवाह दर्ज करें, चिप प्रकार ड्रॉपडाउन सूची से आयन पीआईटीएम चिप का चयन करें, और बारकोड सेट ड्रॉपडाउन सूची से आयनएक्सप्रेस का चयन करें।
      3. डुप्लिकेट पढ़ने के रूप में चिह्नित करें का चयन रद्द करें और पुन: संरेखण सक्षम करें का चयन रद्द करें.
    5. चरण 7 में डेटा विश्लेषण करने के लिए प्लगइन्स टैब में उपयुक्त प्लगइन चुनें। प्रोजेक्ट चरण में चयन पूरा करें, अगला पर क्लिक करें, और नियोजित रनों को सूचीबद्ध करने के लिए निचले दाएं कोने में योजना चलाएँ पर क्लिक करें।
    6. नियोजित रन टैब में, नए बनाए गए रन का चयन करें और समीक्षा विंडो में सभी सेटिंग्स की जाँच करें।

7. डेटा विश्लेषण

  1. जैव सूचना विज्ञान वर्कफ़्लो का उपयोग करके कॉपी नंबर वेरिएंट (सीएनवी) का विश्लेषण करें।
    नोट: सीएनवी का विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान वर्कफ़्लो में एक छिपे हुए मार्कोव मॉडल (एचएमएम) 17 के आधार पर एक एल्गोरिथ्म के कार्यान्वयन के साथ किया गया था; मॉडल कॉपी नंबर या पूर्ण-संख्या की स्थिति (यानी, 0, 1, 2, 3, आदि) की भविष्यवाणी करने के लिए जीनोम भर में रीड कवरेज का उपयोग करता है। समग्र जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन एक अनुक्रम सर्वर प्रणाली है, जो चित्रा 2 में प्रदर्शित किया गया है के प्लगइन में बनाया गया था। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण कदम को पूरा करने में औसतन 4 घंटे लगते हैं।

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Representative Results

जैसा कि मशीन में चल रही प्रक्रिया के बाद अनुक्रम योजना समाप्त हो जाती है, अनुक्रम सर्वर सिस्टम उत्पन्न डेटा, चिप स्थिति, आईएसपी लोडिंग दर और पुस्तकालय की गुणवत्ता की वर्णनात्मक जानकारी के साथ सारांश की रिपोर्ट करता है, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है। इस परिणाम प्रदर्शन में, कुल आधार में 17.6 जी डेटा प्राप्त किया गया था, और चिप के कुल कुओं में आईएसपी की समग्र लोडिंग दर 88% थी; गर्मी के नक्शे से पता चला है कि नमूना चिप (चित्रा 2 ए) के कुल क्षेत्र पर समान रूप से लोड किया गया था। प्रतिनिधि रन में, 99,761,079 कुल रीड प्राप्त किए गए थे, जिसमें 77% उपयोग करने योग्य थे; आईएसपी से भरे सभी कुओं में, 100% में टेम्पलेट्स समृद्ध थे, जिनमें 78% क्लोनल थे। सभी क्लोनल टेम्पलेट्स में से, 97% अंतिम पुस्तकालय (चित्रा 2 बी) के रूप में योग्य थे। पढ़ने की औसत लंबाई क्रमशः औसत, माध्यिका और मोड के साथ 117 बीपी, 176 बीपी और 174 बीपी थी (चित्रा 2 सी)। टेम्पलेट्स के अनुकूलन में टी, सी और ए की पीक गिनती ~ 76 थी, जो 50 (चित्रा 2 डी) की योग्य कट-ऑफ लाइन से अधिक है। लाइव आईएसपी के साथ सभी एड्रेसेबल कुओं में, 99.5% निर्मित पुस्तकालय के रूप में योग्य थे, और 20% पॉलीक्लोनल और निम्न गुणवत्ता वाली लाइब्रेरी को फ़िल्टर किया गया था। 76.6% आईएसपी आगे के विश्लेषण (चित्रा 2 ई) के लिए योग्य थे।

एक एकल नमूना एस 19030109-3 से कॉपी नंबर वेरिएंट का परिणाम चित्रा 3 में प्रदर्शित किया गया है; ब्लैक डैश लाइन को 22 ऑटोसोम और सेक्स गुणसूत्रों में एक यूप्लोइडी सेगमेंट के रूप में सामान्यीकृत किया जाता है, लाल रेखा को एन्यूप्लोइडी गुणसूत्र क्षेत्र के रूप में सामान्यीकृत किया जाता है जो गुणसूत्र 4 पर पी 16.3-क्यू 35.2 के 182.16 एमबी मोज़ेक ट्राइसॉमी का प्रतिनिधित्व करता है, और गुणसूत्र 22 पर क्यू 11.1-क्यू 13.33 का 33.13 एमबी मोनोसॉमी खंड।

स्वतंत्र रूप से विकसित डब्ल्यूजीए अभिकर्मकों का उपयोग करके एक-चरण विधि द्वारा डब्ल्यूजीए किट और 13 नमूनों का उपयोग करके 12 नमूनों की प्रतिनिधि रिपोर्ट क्रमशः तालिका 4 और तालिका 5 में दिखाई गई है, जिसमें बारकोड आईडी, नमूना नाम, अद्वितीय रीड्स गिनती की सारांश जानकारी शामिल है, संरेखित पढ़ता है मतलब लंबाई, औसत गहराई, जीसी सामग्री का प्रतिशत, और गुणसूत्र वेरिएंट चिह्न। गुणसूत्र वेरिएंट चिह्न ने सेक्स गुणसूत्र, स्थान और दोहराव के आकार और गुणसूत्रों पर विलोपन का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: 8-अच्छी तरह से पट्टी पर नमूना लोडिंग स्थिति का आरेख। लोडिंग सामग्री के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से क्रमशः इंगित किया गया है। यू संयुक्त राष्ट्र समृद्ध नमूने के लिए खड़ा है, बी मोतियों के लिए खड़ा है, और डब्ल्यू धोने के समाधान के लिए खड़ा है; खाली कुओं को भी आंकड़े में नोट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: रनिंग सारांश: डेटा आकार, आईएसपी लोडिंग और लाइब्रेरी गुणवत्ता के मैट्रिक्स( ए) गर्मी मानचित्र के साथ कुल ठिकानों, कुंजी सिग्नल और आईएसपी लोडिंग दर सहित समग्र स्थिति। (बी) कुल पढ़ता है, प्रयोग करने योग्य पढ़ता है दर, और प्रत्येक प्रतिक्रिया चरण में आईएसपी जानकारी का सारांश। (सी) पढ़ने की लंबाई का हिस्टोग्राम। (डी) सर्वसम्मति कुंजी टीसीए की 1-मेर। (ई) एड्रेसेबल कुएं और आईपीएस क्लोनल स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: विज़ुअलाइज़ कॉपी नंबर वेरिएंट प्लॉट का उदाहरण: एस 19030109-3। कॉपी नंबर (सीएन) सिग्नल को एक दूसरे के बगल में गुणसूत्रों के लिए नीले और हरे अंतराल के साथ एक भूखंड में देखा जाता है। दिया गया उदाहरण गुणसूत्र 4 में सीएन के बढ़ते अवलोकन और गुणसूत्र 22 में सीएन के कम अवलोकन को दर्शाता है, क्योंकि लाल फॉल्स में नोट की गई औसत सीएनवी रेखा 2 से ऑफसेट होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नहीं। चक्रों की तापमान समय
1 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
12 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
15 डिग्री सेल्सियस 50 सेकंड
25 डिग्री सेल्सियस 40 सेकंड
35 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
65 डिग्री सेल्सियस 40 सेकंड
75 डिग्री सेल्सियस 40 सेकंड
1 चक्र 4 डिग्री सेल्सियस पकड

तालिका 1: पूर्व प्रवर्धन के लिए थर्मल चक्र कार्यक्रम। तापमान, समय और चक्र जैसी थर्मल प्रतिक्रिया की स्थिति दिखाई जाती है।

क़दम तापमान समय नहीं। चक्रों की
1 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 1
2 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड 14
65 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
75 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
3 4 डिग्री सेल्सियस पकड 1

तालिका 2: पूरे जीनोम प्रवर्धन किट के साथ पूरे जीनोम प्रवर्धन के लिए थर्मल चक्र कार्यक्रम। तापमान, समय और चक्र जैसी थर्मल प्रतिक्रिया की स्थिति दिखाई जाती है।

क़दम तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय नहीं। चक्रों की
1 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 30 सेकंड 1
2 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 6
25 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
0.3 डिग्री सेल्सियस /सेकंड से 72 डिग्री सेल्सियस ——
72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड
3 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 20
62 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
4 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 1
5 4 डिग्री सेल्सियस पकड 1

तालिका 3: स्वतंत्र रूप से विकसित अभिकर्मकों के साथ पूरे जीनोम प्रवर्धन के लिए थर्मल चक्र कार्यक्रम। तापमान, समय और चक्र जैसी थर्मल प्रतिक्रिया की स्थिति दिखाई जाती है।

नमूना नाम अद्वितीय पढ़ता है गिनती संरेखित पढ़ता है औसत लंबाई माध्य गहराई सीजी% एसडी निशान
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 एक्सवाई
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 एक्सएक्स, +सीएचआर 8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 एक्सएक्स, +सीएचआर 4{पी 16.3->क्यू 35.2 (182.16 एमबी)},
-सीएचआर 22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 एक्सवाई
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 एक्सवाई
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 एक्सएक्स, +सीएचआर 11{पी 15.5->क्यू 25 (128.36 एमबी)},
-सीएचआर 7{पी 22.3->क्यू 36.3 (151.74 एमबी)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 एक्सवाई
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 एक्सएक्स
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 एक्सएक्स
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 एक्सवाई, + सीएचआर 15
{q11.1->q21.1(23.93MB)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX, -chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 एक्सवाई

तालिका 4: सर्वर सिस्टम रिपोर्ट में पूरे जीनोम प्रवर्धन किट का उपयोग करके कॉपी संख्या भिन्नता का उदाहरण आउटपुट। एक विशिष्ट आउटपुट शीट में नमूना नाम, अद्वितीय रीड्स काउंट, संरेखित रीड्स, माध्य लंबाई, माध्य गहराई, सीजी प्रतिशत, लंबाई का मानक विचलन, और अधिकांश के लिए, एक्सवाई के साथ टैग किए गए सेक्स गुणसूत्र के साथ गुणसूत्र स्थिति का निशान और निष्कर्ष निकाला सीएनवी विस्तार जैसे पैरामीटर शामिल हैं। एक पता लगाया सीएनवी गुणसूत्र स्थान और टुकड़ा आकार के साथ चिह्नित है।

नमूना नाम अद्वितीय पढ़ता है गिनती संरेखित पढ़ता है माध्य लंबाई माध्य गहराई जीसी% एसडी निशान
एस 21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 एक्सवाई
एस 21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 एक्सएक्स
एस 21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 एक्सवाई, + सीएचआर 21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
एस 21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX, -chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
एस 21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 एक्सएक्स
एस 21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 एक्सवाईवाई, + सीएचआर 2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
एस 21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 एक्सवाई
एस 21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 एक्सएक्स
एस 21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX, -chr22
{q11.1->क्यू13.33(33.13एमबी)}
एस 21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 एक्सवाई
एस 21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 एक्सएक्स, + सीएचआर 15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+सीएचआर 2 {पी 25.3->पी 25.1 (11.19 एमबी)}
एस 21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 एक्सएक्स
एस 21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 एक्सवाई

तालिका 5: सर्वर सिस्टम रिपोर्ट में स्वतंत्र रूप से विकसित पूरे जीनोम प्रवर्धन अभिकर्मकों के साथ एक-चरण विधि द्वारा प्रतिलिपि संख्या भिन्नता का उदाहरण आउटपुट। एक विशिष्ट आउटपुट शीट में नमूना नाम, अद्वितीय रीड्स काउंट, संरेखित रीड्स, माध्य लंबाई, माध्य गहराई, सीजी प्रतिशत, लंबाई का मानक विचलन, और अधिकांश के लिए, एक्सवाई के साथ टैग किए गए सेक्स गुणसूत्र के साथ गुणसूत्र स्थिति का निशान और निष्कर्ष निकाला सीएनवी विस्तार जैसे पैरामीटर शामिल हैं। एक पता लगाया सीएनवी गुणसूत्र स्थान और टुकड़ा आकार के साथ चिह्नित है।

अनुपूरक फ़ाइल 1: विभिन्न बैच आकारों का मास्टर मिश्रण तैयार करते समय प्रत्येक घटक की अनुशंसित मात्रा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

भ्रूण का क्रोमोसोमल एन्यूप्लोइडी गर्भावस्था के नुकसान के एक बड़े अनुपात का कारण है, चाहे स्वाभाविक रूप से या इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) में कल्पना की गई हो। आईवीएफ के नैदानिक अभ्यास में, यह प्रस्तावित है कि भ्रूण एन्यूप्लोइडी की जांच और यूप्लोइडी भ्रूण को स्थानांतरित करने से आईवीएफ के परिणाम में सुधार हो सकता है। सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति लिंग चयन और पीजीटी-ए के लिए अपनाई गई सबसे पुरानी तकनीक है; हालाँकि, इस तकनीक को प्रयोगशाला कर्मियों से अधिक तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है और अपेक्षाकृत श्रम-गहन है। सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति का उपयोग करके पीजीटी-ए के बढ़ते अध्ययन से पता चलता है कि जीवित जन्म दर17,18 में कोई सुधार नहीं हुआ है।

हालांकि, पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण में कॉपी संख्या विश्लेषण का आकलन करने के लिए प्रौद्योगिकियों में तेजी से प्रगति की गई है; विभिन्न तरीकों के अपने पेशेवरों और विपक्ष हैं। मात्रात्मक प्रतिदीप्ति पीसीआर, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) सरणी, सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (एसीजीएच), और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसी नई विकसित व्यापक आणविकतकनीकों ने आईवीएफ परिणामों में सुधार करने में वादा दिखाया 7. इनमें से, एनजीएस में इसकी स्केलेबिलिटी, उच्च थ्रूपुट, आसान स्वचालन और लागत 19,20,21 को कम करने की अधिक क्षमता के बावजूद सरणी-तुलनात्मक जीनोमिक संकरण के साथ उच्च स्थिरता है।

डब्ल्यूजीए तकनीकों के संयोजन में, भ्रूण बायोप्सी का एनजीएस विश्लेषण अधिक सटीक अनुक्रम जानकारी प्रदान कर सकता है, और एकल न्यूक्लियोटाइड स्तर के अधिक लक्ष्यों के लिए एक व्यवहार्य विस्तार भी है। आनुवंशिक असामान्यता का पता लगाने में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बढ़ते अनुप्रयोग के साथ, प्रयोगशाला और नैदानिक अभ्यास22,23,24 दोनों में नमूना / डेटा प्रक्रिया के लिए मानकों का निर्माण करने की तत्काल आवश्यकता है।

पीजीटी-ए प्रक्रिया के पृथक्करण से एन्यूप्लोइडी पहचान के मार्ग में, प्रमुख चरणों में पृथक्करण, पूरे जीनोम प्रवर्धन विधि का चयन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का चयन और अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण शामिल है। संपूर्ण जीनोम प्रवर्धन प्रक्रिया पीजीटी-ए में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, जो अनुक्रमण डेटा की अखंडता और एकरूपता निर्धारित करती है। पिछले अध्ययन में तीन पूरे जीनोम प्रवर्धन रणनीतियों की तुलना की गई थी, और यह साबित हुआ है कि पिकोप्लेक्स अर्ध-यादृच्छिक प्राइमर विधि अनुक्रमण डेटा25 की अखंडता और एकरूपता के संदर्भ में लगभग कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) विधियों का प्रदर्शन करती है। चूंकि नैदानिक अभ्यास पीजीटी-ए में एकल न्यूक्लियोटाइड भिन्नता के बजाय ~ 10 एमबीपी के रिज़ॉल्यूशन पर कॉपी नंबर विविधताओं (सीएनवी) पर केंद्रित है, इसलिए पिकोप्लेक्स डब्ल्यूजीए किट और स्वतंत्र रूप से विकसित डब्ल्यूजीए अभिकर्मकों को आर्थिक चिंताओं के कारण चुना गया था। प्रवर्धन चरण में, उत्तरार्द्ध को पूर्व-प्रवर्धन की आवश्यकता के बिना, पूरे जीनोम के प्रवर्धन को पूरा करने के लिए केवल एक कदम की आवश्यकता होती है।

वर्तमान में पीजीटी के लिए उपयोग किए जा रहे बाजार में दो मुख्य वाणिज्यिक प्लेटफ़ॉर्म हैं: इलुमिना26 से मिसेक और थर्मो-फिशर वैज्ञानिक27 से आयन प्रोटॉन। मिसेक और प्रोटॉन दोनों पूरे गुणसूत्र एन्यूप्लोइडी की पहचान कर सकते हैं, लेकिन मिसेक को केवल पूरे गुणसूत्र के एन्यूप्लोइडी की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि प्रोटॉन बड़े विलोपन (डेल्स) या दोहराव (डुप्स) की भी पहचान कर सकता है, जिसमें नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण डेल्स या डुप्स लगभग 800 केबी से 1 एमबी28 के रिज़ॉल्यूशन तक नीचे आते हैं। प्रोटॉन प्लेटफ़ॉर्म में लागत लाभ और मजबूत स्थानीय तकनीकी सहायता है। इन कारणों से, प्रोटॉन प्लेटफ़ॉर्म को बाद के नैदानिक अभ्यास के लिए चुना गया था।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा का जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण नैदानिक अनुप्रयोगों में चिकित्सकों के लिए जटिल और चुनौतीपूर्ण है। मानव आनुवंशिक वेरिएंट के सार्वजनिक संग्रह में डेटा की वृद्धि और क्लिंवर29, 1000 जीनोम30, और ऑनलाइन मेंडेलियन इनहेरिटेंस इन मैन (ओएमआईएम) 31 जैसे व्याख्याओं के साथ, अधिक सीएनवी एनोटेशन सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन विकसित किए गए हैं और सार्वजनिक और निजी उपयोग32,33 के लिए उपलब्ध हैं। यहां, पीजीटी-ए34 के नैदानिक अभ्यास में एक क्लिक के साथ सीएनवी डेटा विश्लेषण को पूरा करने के लिए प्रयोगशाला कर्मचारियों और चिकित्सकों की सहायता के लिए स्थानीय रूप से डिज़ाइन की गई सूचना प्रणाली, दारुई-एलआईएमएस लागू की गई थी।

हमारे तरीके विशेष रूप से पीजीटी-ए के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और रिज़ॉल्यूशन, सटीकता और लागत के बीच एक अच्छा संतुलन है। आनुवंशिक सामग्री प्रसंस्करण और जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन में मानक प्रक्रियाएं नैदानिक विश्लेषण के लिए सुसंगत डेटा का उत्पादन कर सकती हैं। एनजीएस प्रणाली के आधार पर प्रौद्योगिकियों में नई प्रगति के साथ, अतिरिक्त गुणसूत्र संरचनात्मक असामान्यताएं जैसे अनुवाद का परीक्षण किया जा सकता है और पीजीटी चक्र35,36 में नैदानिक प्रवर्धन के लिए निदान किया जा सकता है। इन परीक्षणों के लिए, अधिक विशिष्ट तरीकों को विकसित करने और लागू करने की आवश्यकता है। फिर भी, पीजीटी-ए के नैदानिक अभ्यास का मार्गदर्शन करने के लिए एक विनिर्देश के रूप में, ये विधियां डीए 8600 अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर पीजीटी-ए के प्रयोगशाला अभ्यास में प्रयोगशाला कर्मचारियों और चिकित्सकों के लिए सहायक होंगी।

हालाँकि, इस पद्धति की कुछ सीमाएँ हैं। प्रोटोकॉल में, नमूनों की अधिकतम संख्या जो एक चुंबकीय रैक का समर्थन कर सकती है वह 16 है; बेशक, नैदानिक नमूनों की वास्तविक संख्या के आधार पर, कोई भी एक समय में अधिक नमूनों का समर्थन करने के लिए एक चुंबकीय रैक चुन सकता है या अधिक नमूना संचालन करने के लिए चुंबकीय रैक की संख्या बढ़ा सकता है। हालांकि, इससे परिचालन त्रुटियों का खतरा बढ़ सकता है। इसलिए, अर्धचालक अनुक्रमण पर आधारित वाणिज्यिक किट की सिफारिश की जाती है जब 32 नमूनों या उससे बड़े के बैचों पर काम किया जाता है, जैसे कि थर्मो-फिशर वैज्ञानिक के आयन रिप्रोसेक पीजीएस किट।

चाइना नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर फूड एंड ड्रग कंट्रोल द्वारा प्रख्यापित प्रीइम्प्लांटेशन क्रोमोसोमल एन्यूप्लोइडी डिटेक्शन अभिकर्मकों (उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण) की गुणवत्ता नियंत्रण प्रौद्योगिकी के लिए तकनीकी मूल्यांकन दिशानिर्देशों के अनुसार, एक नमूने की वैध डेटा मात्रा की आवश्यकता 1 एम से कम नहीं है। आयन पीआई उत्पाद अवलोकन के अनुसार प्रति चिप 60-80 एम पढ़ता है, और प्रयोगात्मक अनुभव के आधार पर, वैध अद्वितीय रीड्स संख्या मूल डेटा के 50% से कम नहीं है। गणना के बाद, प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने की प्रभावी डेटा मात्रा 2 एम से कम नहीं है। इसलिए, प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, हम 16 नमूनों की अधिकतम क्षमता की सलाह देते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

झांगयोंग मिंग और श्री रोंगजी होउ को एलआईएमएस विस्तारित एप्लिकेशन पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। यह अध्ययन परिवार नियोजन के लिए पीएलए विशेष अनुसंधान परियोजनाओं (17जेएस008, 20जेएसजेड08), चयापचय रोग अनुसंधान की गुआंग्शी कुंजी प्रयोगशाला के फंड (संख्या 20-065-76), और गुआंगज़ौ नागरिक स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान परियोजना (201803010034) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

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References

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  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
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  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
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आनुवंशिकी अंक 186
सेमीकंडक्टर आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर एन्यूप्लोइडी के लिए प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग
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Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

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