Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yeni nesil dizileme, genetik varyantların belirlenmesinde klinik uygulamada giderek daha fazla önem kazanmıştır. İmplantasyon öncesi genetik testte, bu tekniğin ölçeklenebilirlik, verim ve maliyet açısından benzersiz avantajları vardır. Anöploidi analizi için implantasyon öncesi genetik test için, burada sunulan yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme (NGS) sistemi, yapısal genetik varyantları minimum 8 Mb çözünürlükte belirlemek için kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır. Örnek alımından nihai rapora kadar, çalışma süreci protokollere sıkı sıkıya bağlı kalarak birden fazla adım gerektirir. Çeşitli kritik adımlar amplifikasyonun sonucunu, kütüphanenin kalitesini, okumaların kapsamını ve verilerin çıktısını belirleyebildiğinden, kelimeler dışında görsel gösterim içeren açıklayıcı bilgiler, tüm kritik adımların sonuçları üzerinde büyük bir etkisi olabilecek işlem ve manipülasyon için daha fazla ayrıntı sunabilir. Burada sunulan yöntemler, biyopsi yapılan Trofektoderm (TE) hücrelerinin tüm genom amplifikasyonunda (WGA), genomik kütüphane yapımında, sıralayıcı yönetiminde ve son olarak kopya numarası varyantlarının raporlarının oluşturulmasında yer alan prosedürleri gösterecektir.
Giriş
Anöploidi, bir veya daha fazla ekstra kromozomun varlığı veya bir veya daha fazla kromozomun yokluğu ile kromozom sayısındaki anormalliktir. Bir X kromozomunun kaybı (Turner sendromu), otozom 21 (Down sendromu), 13 (Patau sendromu) ve 18 (Edwards sendromu) trizomileri gibi otozomların ekstra kopyaları veya 47, XXY (Klinefelter sendromu) ve 47, XXX (Triple X sendromu) gibi ekstra cinsiyet kromozomları gibi bir tür anöploidi taşıyan embriyolar, doğum kusurları1 ile terim olarak hayatta kalabilir. Anöploidi, ilk trimester düşüklerinin ve in vitro fertilizasyon (IVF) başarısızlığının birincil nedenidir2. IVF pratiği....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada uygulanan tüm protokoller ve trofektoderm (TE) biyopsisi (1.1.1.1 bölümü) 18 Eylül 2017 tarihinde 924 No'lu hastanenin insan araştırmaları etik kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (NO: PLA924-2017-59). Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını vermişlerdir.
1. İnsan embriyo biyopsisinden DNA izolasyonu ve tüm genomik amplifikasyon
- Tüm genom amplifikasyonu için protokol 9,10
NOT: Pico PLEX WGA Kiti, tüm genom amplifikasyonunu gerçekleştirmek için kullanılır.- Örnek toplama ve d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Makinede çalıştırma işleminden sonra dizi planı sona erdiğinde, dizi sunucusu sistemi, Şekil 2'de gösterildiği gibi, oluşturulan verilerin, çip durumunun, ISS yükleme hızının ve kitaplık kalitesinin açıklayıcı bilgileriyle özeti raporlar. Bu sonuç gösteriminde, toplam bazda 17.6 G veri elde edildi ve çipin toplam kuyularında ISP'nin toplam yükleme oranı% 88 idi; ısı haritası, numunenin çipin toplam alanına eşit olarak yüklendiğini göstermiştir (Şekil 2A). Temsil.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Embriyoların kromozomal anöploidisi, doğal olarak veya in vitro fertilizasyon (IVF) olarak gebe kalmış olsun, gebelik kaybının büyük bir kısmının nedenidir. IVF'nin klinik pratiğinde, embriyo anöploidisinin taranması ve öploidi embriyosunun transferinin IVF'nin sonucunu iyileştirebileceği önerilmektedir. Floresan in situ hibridizasyon, cinsiyet seçimi ve PGT-A için benimsenen en eski tekniktir; Bununla birlikte, bu teknik laboratuvar personelinden daha fazla teknik uzmanlık gerektirir ve nispeten emek y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Dr. Zhangyong Ming ve Bay Rongji Hou'ya LIMS genişletilmiş uygulaması hakkındaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma PLA Aile Planlaması Özel Araştırma Projeleri (17JS008, 20JSZ08), Guangxi Anahtar Metabolik Hastalıklar Araştırma Laboratuvarı Fonu (No.20-065-76) ve Guangzhou Vatandaş Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Projesi (201803010034) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m Şırınga Filtre Ünitesi | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tüpleri | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tüpler | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tüpleri | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tüpler | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Tamponu (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polimeraz | FAPON | ||
| AMPure XP reaktifi (dna bağlama için manyetik boncuklar) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Hücre Lizis tamponu | Güney Tıp Üniversitesi | 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), %1 (h/h) Triton X-100, 5 mM sodyum içeren hücre lizis tamponu pirofosfat, 2 mM ve beta;-gliserofosfat, %0,1 SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elüsyon tamponu | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Mıknatıs Yaşam Teknolojileri | 12321D | ||
| Etil alkol | Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası Thermo Fisher Bilimsel | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Bağımsız olarak geliştirilen tüm genom amplifikasyon reaktifleri | Güney Tıp Üniversitesi | Reaktifler aşağıdaki bileşenlerden oluşur: 1. Hücre Lizisi 2. Amplifikasyon Önceden karıştırılmış çözelti 1) Astar WGA-P2 (10 μ M) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Tamponu (Mg2 + < / sup> Plus) 3. Amplifikasyon Enzimi 1) Anstart Musluk DNA Polimeraz (5 U/μ L) | |
| İyon PI Hi-Q OT2 200 Kiti | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kiti adım 4.2.8'de belirtilen |
| Ion PI Hi-Q Dizileme 200 Kiti ve nbsp; | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| İyon Proton Sistemi | Yaşam Teknolojileri | 4476610 | |
| İyon Muhabiri Sunucu Sistemi Ömrü | Teknolojileri | 4487118 | |
| izopropanol | Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Kütüphane Hazırlama Kiti | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nükleaz İçermeyen Su | Ömrü Teknolojileri | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNn NNNNATGTGG-3'OneTouch | |
| 2 Sistem | Ömrü Teknolojileri | 4474779 | Şablon amplifikasyon ve zenginleştirme sistemi |
| PCR tüpleri | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kiti | Takara Bio ABD | R300671 | |
| Pipet uçları | Kaliteli Bilimsel Ürünler | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Taşınabilir Mini Santrifüj LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Florometre | Yaşam Teknolojileri | Q33216 | Florometre |
| Kübit Test Tüpleri | Yaşam Teknolojileri | Q32856 | |
| Kübit dsDNA HS Test Kiti | Yaşam Teknolojileri | Q32851 | |
| Sıralayıcı sunucu sistemi | Thermo Fisher Scientific Torrent | Suite Yazılım | |
| Sıralama Reaksiyonları Evrensel Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html Bu kit aşağıdaki bileşenleri içerir: 1. Şablon Hazırlama Kiti Seti 1.1 Şablon Hazırlama Kiti: Emülsiyon PCR tamponu Emülsiyon PCR enzim karışımı Şablon taşıyıcı çözümü 1.2 Şablon Hazırlama çözümleri: Şablon hazırlama reaksiyon yağı I emülgatör kırma çözeltisi II Şablon Hazırlama Reaksiyon Yağı II Nükleaz içermeyen su Tween Çözüm Emülsifikasyon çözümü I Şablon yıkama solüsyonu C1 boncuk yıkama solüsyonu C1 boncuk yeniden süspansiyon çözümü Şablon yeniden süspansiyonu çözümü 1.3 Şablon Hazırlama Malzemeleri: Reaktif tüpü I konektörü Toplama tüpü Reaktif tüp pipeti I Amplifikasyon plakası 8 kuyu strip Özel uçlar Şablon hazırlama yıkama adaptörü Şablon hazırlama filtresi 2. Sıralama Kiti Seti 2.1 Sıralama Kiti: dGTP dCTP dATP dTTP Dizileme enzim çözeltisi Sıralama primerleri Kalite kontrol şablonları 2.2 Sıralama Çözümleri: < br / > Sıralama çözeltisi II Sıralama çözeltisi IIII Tavlama tamponu Yükleme tamponu Köpürtücü ajan Klor tabletleri C1 boncuk 2.3 Sıralama Malzemeleri: Reaktif Tüpü II Reaktif tüp kapağı Reaktif tüpü yudumlayıcı II Reaktif şişesi sipper Reaktif şişeleri 3. Chip |
| Sodyum hidroksit çözeltisi | Sigma | 72068-100ML | |
| Termal Döngüleyici | Yaşam Teknolojileri | 4375786 |
Kaynaklar
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
