Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen presenterer de generelle prosedyrene i laboratoriet som kreves i genetisk testing før implantasjon for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform. Her presenterer vi de detaljerte trinnene for helgenomforsterkning, DNA-fragmentvalg, bibliotekkonstruksjon, malforberedelse og sekvensering av arbeidsflyt med representative resultater.

Abstract

Neste generasjons sekvensering har fått økende betydning i den kliniske anvendelsen ved bestemmelse av genetiske varianter. I den genetiske testen før implantasjon har denne teknikken sine unike fordeler i skalerbarhet, gjennomstrømning og kostnad. For preimplantasjonsgenetisk test for aneuploidianalyse gir det halvlederbaserte neste generasjons sekvenseringssystemet (NGS) som presenteres her en omfattende tilnærming for å bestemme strukturelle genetiske varianter med en minimumsoppløsning på 8 Mb. Fra prøveinnsamling til sluttrapport krever arbeidsprosessen flere trinn med nær overholdelse av protokoller. Siden ulike kritiske trinn kan bestemme utfallet av forsterkning, kvaliteten på biblioteket, dekning av leser og utdata av data, kan beskrivende informasjon med annen visuell demonstrasjon enn ord gi mer detaljer til operasjonen og manipulasjonen, noe som kan ha stor innvirkning på resultatene av alle kritiske trinn. Metodene som presenteres her, vil vise prosedyrene som er involvert i helgenomforsterkning (WGA) av biopsierte trofektoverm (TE) celler, genomisk bibliotekkonstruksjon, sequencerhåndtering, og til slutt generering av kopinummervarianters rapporter.

Introduction

Aneuploidy er abnormiteten i antall kromosomer ved tilstedeværelse av en eller flere ekstra kromosomer eller fraværet av ett eller flere kromosomer. Embryoer som bærer noen form for aneuploidi, for eksempel tap av ett X-kromosom (Turners syndrom), ekstra kopier av autosomer, som trisomier av autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) og 18 (Edwards syndrom), eller ekstra kjønnskromosomer som 47, XXY (Klinefelter syndrom) og 47, XXX (Triple X syndrom), kan overleve til termin med fødselsskader1. Aneuploidi er den primære årsaken til spontanaborter i første trimester og in vitro fertilisering (IVF) svikt2. Det er rapportert at aneuploidi-frekvensen kan variere fra 25,4% -84,5% gjennom de forskjellige alderslagene i den naturlige syklusen og medisinert kontrollgruppen i IVF-praksis3.

Neste generasjons sekvenseringsteknologi blir vilt brukt til å bestemme genetisk informasjon klinisk; Det gir praktisk tilgang til genomsekvens med effektivitet og høy gjennomstrømning. Spesielt revolusjonerte neste generasjons sekvensering også diagnosen lidelser med genetiske faktorer og tester for abnormitet i genomet4. Ved hjelp av halvledersekvenseringsteknologi for direkte overføring av kjemiske signaler ved sekvensering av bioreaksjon til digitale data, gir det halvlederbaserte sekvenssystemet en direkte sanntidsdeteksjon til sekvensdata i 3-7 timer 5,6.

I en IVF-prosedyre undersøker preimplantasjonsgenetisk testing (PGT) den genetiske profilen til embryoet før det overføres til livmoren for å forbedre IVF-utfallet og redusere risikoen for genetiske lidelser hos nyfødte 1,7. I PGT kombinert med NGS-teknikker forsterkes genetisk materiale ekstrahert fra mindre enn 10 celler med fullgenomforsterkningssett eller et uavhengig utviklet fullgenomamplifikasjonsreagens. Dette krever bare ett trinn i forsterkningsfasen og krever ikke forforsterkning for å oppnå fullgenomforsterkningsprodukter. Primere eller paneler for kopinummervariant og spesiell gen loci sekvensering er utformet og anvendt i biblioteket konstruert.

En typisk arbeidsflyt for preimplantasjon genetisk testing-aneuploidi (PGT-A) i NGS innebærer serielle prosedyrer, og krever en intens arbeidsbelastning av laboratoriepersonell8. Noen feiloperasjoner forårsaket prosedyren roll-back kan føre til uønsket tap av både tid og ressurser på laboratoriet. En kortfattet og tydelig standard driftsprosedyre (SOP) for PGS-NGS-arbeidsflyt er nyttig; Word-formatprotokoller kan imidlertid ikke presentere mer detaljert informasjon om prøvebehandling, enhetsmanipulering og instrumentinnstillinger, som kan visualiseres i en videoprotokoll. I denne artikkelen kan en validert arbeidsflyt kombinert med en visualisert demonstrasjon av driftsdetaljer tilby mer direkte og intuitive henvisningsprotokoller i PGT-praksis på en halvledersekvenseringsplattform.

Protokollen her beskriver en metode som støtter batching av opptil 16 embryobiopsier parallelt. For større partier anbefales det å bruke en kommersiell settbasert protokoll for sekvensering av halvledere, for eksempel Reproes-PGS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller og trophectoderm (TE) biopsi (1.1.1.1 seksjon) anvendt i denne studien ble gjennomgått og godkjent av human research ethics committee of No. 924 hospital 18. september 2017 (NO: PLA924-2017-59). Pasientene/deltakerne ga skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien.

1. DNA-isolasjon fra human embryobiopsi og genomisk forsterkning

  1. Protokoll for helgenomforsterkning 9,10
    MERK: Pico PLEX WGA Kit brukes til å utføre fullgenomforsterkning.
    1. Prøveinnsamling og lagring
      1. Trophectoderm biopsi: Tegn i gjennomsnitt seks til ni celler fra herniated TE av D5/6 embryo etter assistert klekking for å oppnå en kvalifisert mengde DNA for følgende forsterkning.
      2. Overfør prøvecellene til et PCR-rør i 5 μL PBS.
      3. Frys prøvene umiddelbart ved -80 °C hvis protokollen ikke går direkte videre til DNA-ekstraksjonen.
    2. Cellelyse
      MERK: Tilleggsfil 1 lister og fungerer som referanse for de anbefalte volumene av hver komponent ved tilberedning av hovedblandingen under cellelyse og helgenomforsterkning av partier på 1, 8, 16 og 32 prøver (med overforbruk for å imøtekomme pipetteringsfeil). Ved formulering av andre masterblandinger av denne protokollen økes volumet av hver komponent i tillegg for å imøtekomme komponentforbruket forårsaket av gjentatt pipettering. All kort sentrifugering utføres på en bordplate mini sentrifuge for 2-10 s ved romtemperatur (RT), med et fast turtall på 10.000 med en sentrifugalkraft på 5.300 x g. Sentrifugalkraften må være mellom 2,000 x g og 12,000 x g.
      1. Forbered cellelyseblandingen med 4,8 μL av ekstraksjonsenzymets fortynningsbuffer og 0,2 μL av celleekstraksjonsenzymet per prøve.
      2. Pipette 5 μL av den nytilberedte cellelyseblandingen blandes i hver 5 μL celleprøve i PCR-rør, og sentrifugerer kort røret ved RT i 5 s. Ikke virvle røret.
      3. Inkuber prøven i en termisk syklus som følger: 75 ° C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Kort sentrifuge (5 s) røret etter inkubasjonen.
    3. Forforsterkning av hele genom-DNA
      1. Forbered forforsterkningsblandingen med 4,8 μL av forforsterkerbufferen og 0,2 μL av pre-amp-enzymet per prøve.
      2. Pipette 5 μL av forforsterkningsblandingen inn i prøverørene gjennom rørets vegger, og kort sentrifuge i 3 s. Unngå at spissen når bunnen av røret, og ikke virvle røret.
      3. Inkuber prøven i henhold til det termiske syklusprogrammet nevnt i tabell 1.
    4. Helgenom-DNA-forsterkning
      1. Sentrifuger prøven kort i 5 s og legg pre-amp-inkubasjonsproduktet på is.
      2. Forbered hele genomamplifikasjonsblandingen med 25 μL av amplifikasjonsbufferen, 0,8 μL av amplifikasjonsenzymet og 34,2 μL nukleasfritt vann per prøve.
      3. Bland 60 μL av den nytilberedte helgenomforsterkningsblandingen med 15 μL pre-amp inkubasjonsprodukt; det totale volumet må være 75 μL. Kort sentrifuge for 5 s. Unngå at spissen når bunnen av røret, og ikke virvle røret.
      4. Plasser PCR-røret på den termiske syklisten og kjør det termiske syklusprogrammet nevnt i tabell 2.
      5. Sentrifuge rørene kort i 5 s og overføre produktene til et nytt 1,5 ml sentrifugerør.
      6. Kvantifiser WGA-produktkonsentrasjonen med et fluorometer11. Prøver kan lagres midlertidig ved -20 °C i mindre enn 2 måneder hvis de ikke går videre til neste trinn.
  2. Protokoll av de uavhengig utviklede WGA-reagensene.
    1. Prøveinnsamling og lagring
      1. Tegn cellene fra D5/6-embryoet etter assistert klekking for følgende forsterkning.
      2. Overfør prøvecellene med 1,5 μL PBS til et PCR-rør som inneholder 2 μL PBS.
        MERK: PBS er fri for Mg 2+ og Ca2+.
      3. Frys prøvene umiddelbart ved -80 °C hvis de ikke går direkte videre til DNA-ekstraksjonsprotokollen.
    2. Cellelyse
      1. Smelt cellelysebufferen (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM etylenglykoltetraeddiksyre (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfat, 2 mM β-glycerofosfat, 0,1% SDS) ved RT og legg den på isen. Tilsett 2 μL cellelysebuffer til hver prøve, og sentrifuger kort (5 s).
        MERK: Ikke virvle røret, og unngå at pipettespissen berører væskeoverflaten i røret for å unngå å bringe celler eller DNA ut av reaksjonssystemet.
      2. Inkuber prøven i en termisk syklus som følger: 55 ° C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, hold. Sentrifuger kort røret ved RT i 10 s etter inkubasjonen.
    3. Helgenom-DNA-forsterkning
      1. Sentrifuger kort cellelyseproduktet i 5 s og legg det på is.
      2. Forbered hele genomamplifikasjonsblandingen for hver prøve ved å blande med 16 μL amplifikasjonsforblandet løsning, 1 μL amplifikasjonsenzym og 28 μL nukleasfritt vann. Bland forsiktig, sentrifugen kort (5 s), og legg blandingen på is. Ikke virvle røret.
      3. Pipette 45 μL av den nylagde helgenomamplifikasjonsblandingen i cellelyseproduktet fremstilt i trinn 1.2.2.2; Bland forsiktig og sentrifuger kort i 5 s.
        MERK: Ikke virvle røret og unngå at pipettespissen berører væsken i røret.
      4. Plasser PCR-røret på den termiske syklusen og kjør programmet som beskrevet i tabell 3.
      5. Sentrifuge rørene kort for 5 s og overføre produktene til en ny 1,5 ml sentrifuge rør.
      6. Kvantifiser WGA-produktkonsentrasjonen med et fluorometer11 og registrer resultatene på QA-arket (kvalitetsanalyse). Produkter med kvalifiserte konsentrasjoner kan lagres midlertidig ved -20 °C i mindre enn 2 måneder hvis de ikke går videre til neste trinn.

2. Valg av forsterkningsfragment

MERK: Materialer som brukes i denne delen er tilgjengelige i bibliotekets forberedelsessett (materialtabell).

  1. Forberedelse før start
    1. Balanser de magnetiske perlene (n x 100 μL) for rensing ved RT i 30 minutter.
    2. Gjenopprett det forrige WGA-produktet til RT. Vortex produktet på RT i 30 s før du sentrifugerer det kort.
    3. Tilbered fersk 70% etanol.
  2. Prosedyre for valg av fragment
    1. Pipette 25 μL av WGA-produktene og overfør til et 1,5 ml sentrifugerør med 25 μL nukleasefritt vann forhåndslastet.
    2. Vortex og bland DNA-rensingsperlene godt. Aliquot 50 μL av det i hvert prøverør (opprinnelig prøve: perler (volum) = 1: 1), virvel og sentrifuge kort (5 s). Sett røret i 5 minutter ved RT for DNA-bindingsprosessen.
    3. Sett 1,5 ml sentrifugerøret inn i et magnetstativ, og vent til alle magnetperlene er tiltrukket av rørets sidevegg. Overfør supernatanten forsiktig til et nytt 1,5 ml sentrifugerør. Unngå pipettering av perlene.
    4. I henhold til det opprinnelige prøvevolumet, pipette 30 μL (original prøve: perler (volum) = 1: 0,6) av magnetiske perler, vortex og sentrifuge kort (5 s). Sett røret i 5 minutter ved RT for DNA-bindingsprosessen.
    5. Sett de 1,5 ml sentrifugerørene inn i magnetstativet, og vent i 5 minutter til alle magnetperlene er tiltrukket av rørets sidevegg. Fjern og kast supernatanten forsiktig. Unngå pipettering av perlene.
    6. Pipette 300 μL 70% etanol inn i 1,5 ml sentrifugerøret, roter røret forsiktig to ganger med en 180 ° vinkel, og flytt perlene langs rørveggen for grundig vask. Pipette og kast supernatanten. Unngå pipettering av perlene.
    7. Gjenta vaskeprosedyren en gang.
    8. Fjern 1,5 ml sentrifugerøret fra magnetstativet og sentrifugen kort tid (5 s). Sett rørene tilbake i magnetstativet, og vent til alle magnetperlene er tiltrukket av rørets sidevegg.
    9. Pipette forsiktig ut den gjenværende væsken i bunnen. Hold røret åpent for å tørke perlene ved RT i 3-5 min. Hold fuktighet av perlene.
      MERK: Lukk lokket umiddelbart hvis det oppstår sprekker på pelleten av perler.
    10. Fjern rørene fra magnetstativet, pipette 25-30 μL av DNA-elueringsbufferen i et rør, og lukk hetten og virvelen. Sentrifuge kort (5 s) for å få den uklare væsken til bunnen av røret, og sett røret på RT i 5 minutter.
    11. Sett rørene tilbake i magnetstativene, og vent til alle perlene er tiltrukket av rørets sidevegg og supernatanten blir gjennomsiktig. Overfør DNA-oppløsningen forsiktig til nye 1,5 ml sentrifugerør. Unngå pipettering av perlene.
    12. Kvantifiser konsentrasjonen av DNA etter fragmentvalg med et fluorometer11, lagre det ved -20 ° C. Vanligvis varierer konsentrasjonen av det valgte DNA-fragmentet fra 1,5-2,4 ng / μL.

3. Forberedelse av DNA-biblioteket12

MERK: Materialer som brukes i denne delen er tilgjengelige i bibliotekets forberedelsessett (materialtabell).

  1. Avslutt reparasjon
    1. Balanser de magnetiske perlene ved RT i 30 min.
    2. Balanser DNA-produktet av fragmentvalg i trinn 2.2.12 til RT. Kontroller og registrer taggen på hvert hetteglass som inneholder DNA.
    3. Forbered DNA-sluttreparasjonssystemet med 30 μL DNA-produkter, 10 μL sluttreparasjonsbuffer, 0,5 μL sluttreparasjonsenzym og 9,5 μL nukleasefritt vann i et 1,5 ml sentrifugerør. Vortex røret for 30 s og sentrifuge kort (5 s) ved RT for å få all væske til rørbunnen.
    4. Inkuber ved 25 °C i 30 minutter, og sentrifuger kort (5 s) røret etter inkubering.
    5. Vortex eller omvendt-bland de magnetiske perlene, og overfør 75 μL av de magnetiske perlene til et rør som inneholder sluttreparerte DNA-prøver (originalprøve: perler (volum) = 1: 1.5). Pipette eller vortex forsiktig for å blande perlene godt og kort sentrifuge (5 s) for å spinne all suspensjonen ned til bunnen av røret. Sett røret i 5 minutter ved RT for DNA-bindingsprosessen. Vend rørene forsiktig for å holde perlene spredt.
    6. Sett sentrifugerørene inn i magnetstativet, og vent i 5 minutter til alle magnetiske perler er tiltrukket av sideveggen og supernatanten blir gjennomsiktig. Fjern supernatanten, og unngå å pipettere perlene ut, og hold rørene på risten når du pipetterer.
    7. Overfør 300 μL av den nylig tilberedte 70% etanolen inn i rørene, roter rørene forsiktig to ganger i en 180 ° vinkel, og flytt perlene langs rørveggen for en grundig vask. Pipette og kast supernatanten. Unngå pipettering av perlene.
    8. Gjenta vaskeprosedyren en gang.
    9. Fjern 1,5 ml sentrifugerørene fra magnetstativet, og sentrifugen kort (5 s). Sett rørene tilbake i magnetstativet, og vent i 5 minutter til alle magnetperlene er tiltrukket av rørets sidevegg.
    10. Pipetter forsiktig ut den gjenværende væsken i bunnen. Åpne hetten på 1,5 ml sentrifugerør og tørk perlene ved RT i 3-5 min. Hold fuktighet av perlene.
      MERK: Lukk lokket umiddelbart hvis det oppstår sprekker på pelleten av perler.
    11. Pipette 33 μL DNA-elueringsbuffer inn i et rør, lukk hetten og virvelen. Sentrifuge kort (5 s) for å få den uklare suspensjonen til bunnen av røret og sett røret på RT i 5 minutter.
    12. Sett rørene tilbake i magnetstativene, og vent til alle perlene er tiltrukket av sideveggen og løsningen blir gjennomsiktig. Overfør DNA-løsningen forsiktig til nye 1,5 ml sentrifugerør med riktig merkelapp, unngå pipettering av perlene.
  2. Strekkode ligering
    1. Plasser strekkodeligeringsreagensene i trinn 3.2.2 på is for å smelte alle de frosne reagensene.
    2. Forbered ligeringssystemet med 32 μL ende-reparerte DNA-produkter, 10 μL nukleasefritt vann, 5 μL ligasebuffer, 1 μL ligase og 1 μL P1 tilpasse seg i et 1,5 ml sentrifugerør. Pipetter ut 1 μL av hvert strekkodereagens i løsningsblandingen i røret for en prøve, virvel i 5 s og sentrifuge kort (5 s) for å få all væske i rørbunnen.
      MERK: Når du legger til strekkodene, må du bekrefte at antall strekkoder og prøver samsvarer; åpne bare ett strekkodeflaske hver gang for å unngå blandet forurensning av strekkoder; Bytt hanskene for hver femte eller sjette strekkode som legges til.
    3. Inkuber rørene ved 25 °C i 30 minutter.
    4. Pipette 75 μL (original prøve: perler (volum) = 1:1.5) av magnetperlene i et rør, og pipette eller forsiktig vortex for å blande perlene godt. Sentrifuge kort (5 s) for å spinne all suspensjonen ned til bunnen, og unngå perleaggregering. Sett røret i 5 minutter ved RT for DNA-bindingsprosessen. Vend rørene forsiktig for å holde perlene spredt.
    5. Sett sentrifugerørene inn i magnetstativet, og vent i 5 minutter til alle magnetperlene er tiltrukket av sideveggen og supernatanten blir gjennomsiktig. Fjern supernatanten og unngå å pipette perlene ut, hold rørene på risten når du pipetterer.
    6. Overfør 300 μL av den nylig tilberedte 70% etanol i rør, roter forsiktig rørene to ganger i en 180 ° vinkel, og flytt perlene langs rørveggen for en grundig vask. Pipette og kast supernatanten. Unngå pipettering av perlene.
    7. Gjenta vaskeprosedyren en gang.
    8. Fjern 1,5 ml sentrifugerørene fra magnetstativet og sentrifugen kort (5 s). Sett rørene tilbake i magnetstativet og vent i 5 minutter til alle magnetiske perler er tiltrukket av rørets sidevegg. Pipette forsiktig ut den gjenværende supernatanten i bunnen.
    9. Hold rørhetten åpen for å tørke perlene ved RT i 3-5 min. Hold fuktighet av perlene.
      MERK: Lukk lokket umiddelbart hvis det oppstår sprekker på pelleten av perler.
    10. Pipette 15 μL av DNA-elueringsbufferen inn i røret. Skyll perlenes pellet ned til bunnen av røret, forsegl hetten og virvelen. Sentrifuge kort (5 s) for å få den uklare suspensjonen til bunnen av røret og holde røret stødig ved RT i 5 minutter.
  3. Fragmentforsterkning
    1. Legg bibliotekets reagenser på is når det frosne reagenset oppløses.
    2. Overfør 47,5 μL av enzymblandingen og 2,5 μL av primerblandingen inn i røret som inneholder eluert DNA og perler, virvel i 5 s og sentrifuge kort (5 s) for å få all væske til rørbunnen.
    3. Sett røret på RT i 5 min. Sett rørene tilbake i magnetiske stativer, og vent til alle perler er tiltrukket av sideveggen og supernatanten blir gjennomsiktig. Overfør DNA-løsningen forsiktig til 0,2 ml PCR-rør med tagger merket tydelig, og unngå pipettering av perlene ut.
    4. Inkuber prøven i et termisk syklussett med følgende program: 72 ° C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 sykluser); 70 °C, 5 min. Sentrifuger (5 s) slangen kort når reaksjonen er ferdig, og oppbevar produktene ved 4 °C.
    5. Overfør PCR-produktene til et 1,5 ml sentrifugerør (lavt feste). Tilsett 97,5 μL (opprinnelig prøvevolum: perler (volum) = 1:1,5) magnetiske perler i røret når reaksjonen slutter, pipette eller forsiktig virvel for å blande perlene godt, og kort sentrifuge (5 s) for å spinne all væske ned til bunnen. Unngå perler aggregering. Sett røret på RT i 5 min. Vend rørene forsiktig for å holde perlene spredt.
    6. Sett sentrifugerørene inn i magnetstativet, og vent i 5 minutter til alle magnetiske perler tiltrekkes av sideveggen og supernatanten blir gjennomsiktig. Fjern supernatanten, unngå pipettering av perlene ut, og hold rørene stødige på risten.
    7. Overfør 300 μL av den nylig tilberedte 70% etanol i rør, roter forsiktig rørene to ganger i en 180 ° vinkel, og flytt perlene langs rørveggen for en grundig vask. Pipette og kast supernatanten. Unngå pipettering av perlene.
    8. Gjenta vaskeprosedyren en gang.
    9. Fjern 1,5 ml sentrifugerøret fra magnetstativet og sentrifugen kort (5 s). Sett røret tilbake i magnetstativet, og vent i 5 minutter til alle magnetiske perler er tiltrukket av rørets sidevegg. Pipetter forsiktig ut den gjenværende væsken i bunnen.
    10. Hold rørhetten åpen for å tørke perlene ved RT i 3-5 min. Hold fuktighet av perlene.
      MERK: Lukk lokket umiddelbart hvis det oppstår sprekker på pelleten på perlene.
    11. Pipette 22 μL av DNA-elueringsbufferen inn i røret, skyll perlenes pellet ned og lukk hetten og virvelen. Sentrifuge kort (5 s) for å få den uklare væsken til bunnen av røret og sett røret på RT i 5 minutter.
    12. Kvantifisere konsentrasjonen av konstruert DNA-bibliotek med et fluorometer11 og lagre det konstruerte DNA-biblioteket ved -20 ° C; konsentrasjonen av det valgte DNA-fragmentet varierer fra 0,6-10 ng/μL. Omkode bibliotekinformasjonen i bibliotekdatabasen og lagre prøvene deretter.

4. Utarbeidelse av sekvenseringsmal13,14

MERK: Materialer som brukes i denne delen er tilgjengelige i malforberedelsessettet (reagenser / løsninger / materialer) i sekvenseringsreaksjoner Universal Kit (materialfortegnelse).

  1. Bibliotek mix
    1. Fyll ut skjemaet for et pre-run-postark i serversystemet og merk prøverøret med bibliotekkonsentrasjon og strekkodenummer. Unngå å bruke de samme strekkodene på forskjellige prøver i én kjøring.
    2. Vortex og bland bibliotekprøven, og sentrifuger kort (5 s). Fortynn alle prøvene til 100 pM med nukleasefritt vann, virvel i 30 s, og sentrifuger prøven kort.
      MERK: Gitt at DNA har en gjennomsnittlig lengde på 260 bp, og 1 bp er 660 g / mol, beregne omdannelsen av ng / μL til pM ved hjelp av følgende ligning: 1 ng / μL = 5,827,5 pM / L.
    3. Pipette 10 μL med 100 pM fortynnet bibliotek i et 1,5 ml sentrifugerør, virvel i 30 s og kort sentrifuge for 2 s. Hold det blandede biblioteket på is.
  2. Forberedelse av mal
    1. Start malforsterkningssystemet og velg det rene programmet. Tilsett reaksjonsoljen til 1/2 av røret, og tilsett emulgatorbrytningsoppløsningen til 1/3 av røret.
    2. Bekreft at forsterkningsplaten og vaskeadapteren er satt i PÅ-posisjon . Rengjør avfallsflasken, og stikk en nål inn i et nytt 50 ml sentrifugerrør for å samle avfall. Bekreft de behandlede trinnene på skjermen til malforsterkningssystemet. Trykk på NEXT for å starte et rent program, som vil ta omtrent 15 minutter.
    3. Bytt ut forsterkningsplaten med en ny etter rengjøringsprogrammet, sett oppsamlingsrørene som inneholder 150 μL bryteløsning II inn i rotoren, og plasser broen på oppsamlingsrørene. Tilsett reaksjonsoljen til 1/2 av røret og emulgatorbryteoppløsningen til 1/3 av røret.
    4. Emulgere PCR-reagenspreparat: Likevekt den emulgerte PCR-bufferen ved RT til den oppløses, sentrifuger kort (5 s) alle reagenser og legg dem på is før bruk.
    5. Pipette 120 μL av den emulgerte PCR-enzymblandingen, 100 μL malionsfærepartikkel (ISPs) buffer, 170,5 μL nukleasefritt vann og 9,5 μL av det blandede biblioteket (100 pM) i et rør som inneholder 2000 μL emulgert PCR-buffer. Bland løsningen godt med gjentatt pipettering.
      MERK: Den blandede løsningen må lastes på malforsterkningssystemet innen 15 minutter; utføre alle prosedyrer på RT.
    6. Plasser et nytt filter for malklargjøring stødig på rørstativet med prøveportalen oppover. Vortex løsningen for 5 s, sentrifuge kort (5 s), og overfør løsningen inn i prøveportalen til filteret etter gjentatte pipettering 800 μL tre ganger. Sentrifuge røret for å redusere bobler før siste injeksjon. Unngå å injisere luft inn i filteret. Injiser 200 μL reaksjonsolje II etter blandet oppløsning.
    7. Vri filterets prøveportal nedover, og bytt ut vasketilpasningen med filteret. Stikk prøvekanylen inn i det midterste hullet på rotorlokket og trykk deretter nålen til bunnen.
    8. Trykk på RUN-knappen på skjermen, velg programmet i henhold til det tilsvarende settet, og trykk på ASSISTED for å sjekke alle trinnene. Trykk på NESTE til kjøringen er startet; Det tar omtrent 4,5 timer å fullføre.
    9. Trykk på NESTE når programmet er ferdig; Systemet vil starte en 10 min sentrifugering. Når sentrifugeringen stopper, trykker du på Åpne lokk-knappen og flytter oppsamlingsrørene til stativer. Hvis prosedyren ikke går til neste trinn på 15 minutter, trykker du på Final Spin for å sentrifugere på nytt.
    10. Fjern supernatanten i oppsamlingsslangen, og la 100 μL oppløsning ligge i røret. Bland den gjenværende prøven ved pipettering og overfør prøven til de nye 1,5 ml sentrifugerørene merket OT (One touch 2-system).
      MERK: Når du pipetterer supernatanten, må du unngå å berøre rørbunnen langs siden.
    11. Pipette 100 μL nukleasefritt vann inn i hvert av oppsamlingsrørene, og overføringsløsning til OT-røret vasket med gjentatt pipettering. Tilsett 600 μL nukleasefritt vann til OT-røret for å gjøre totalvolumet 1 ml, virvel i 30 s og sentrifuge ved 15 500 x g i 8 minutter.
    12. Fjern supernatanten forsiktig i OT-røret med 100 μL igjen og bruk spissen til å kaste oljelaget grundig. Tilsett 900 μL nukleasefritt vann, virvel i 30 s, og sentrifuge ved 15 500 x g i 8 minutter.
    13. Fjern supernatanten til 20 μL er igjen, legg til mal resuspenderingsløsning for å gjøre volumet 100 μL, vortex for 30 s, og kort sentrifuge for 2 s.
      MERK: Løsningen oppnådd i dette trinnet må fortsette til neste trinn på mindre enn 12 timer.
    14. Kjør det rene programmet på malforsterkningssystemet før du slår av strømmen.
  3. Mal berikelse
    1. Forbered smelteblandingen med 280 μL tween-80 og 40 μL på 1 M NaOH.
    2. Vask C1-perlene. Vortex C1-perleløsningen i 30 s. Overfør 100 μL perler til et 1,5 ml sentrifugerør, sett røret på et magnetisk stativ i 2 minutter og kast supernatanten.
    3. Overfør 1 ml av C1-perlene vaskeløsning inn i røret og virvelen i 30 s. Sentrifuge kort (5 s), sett røret inn i magnetstativet i 2 minutter, og kast supernatanten. Pipette 130 μL C1 perle resuspension løsning inn i røret, og bland perlene ved gjentatt pipettering. Unngå å lage bobler.
    4. Last 100 μL av det fortynnede biblioteket, 130 μL C1-perler, 300 μL x 3 malvaskeløsning og 300 μL av smelteløsningen til åttebrønnsstrimlene, som vist i figur 1.
    5. Monter de åtte brønnstrimlene på anrikningsmodulen, last pipettertspissen og sett 200 μL sentrifugerøret i oppsamlingsposisjon. Trykk på START for å kjøre programmet; Det tar ca 35 min.
    6. Prøven vil automatisk bli samlet i 200 μL sentrifugerøret; Lukk lokket og sentrifuger det på 15 500 x g i 5 minutter. Kontroller rørbunnen for å bekrefte om noen C1-perler forblir.
    7. Hvis C1-perler er igjen, pipetter du malløsningen gjentatte ganger 10x og setter røret på magnetstativet i 4 minutter. Overfør all supernatanten til et nytt 0,2 ml sentrifugerrør og sentrifuge ved 15 500 x g i 5 minutter.
    8. Hvis det ikke er synlige C1-perler igjen, kast supernatanten til 10 μL er igjen, tilsett 200 μL nukleasfritt vann og bland ved pipettering 10x. Sentrifuge ved 15 500 x g i 5 minutter.
    9. Kast supernatanten med 10 μL igjen, og tilsett 90 μL nukleasefritt vann for å nå et totalt volum på 100 μL. Pipette opp og ned 10x for å blande løsningen, virvel i 5 s og kort sentrifuge (5 s). Oppløsningen kan oppbevares ved 2-8 °C i mindre enn 3 dager.

5. Neste generasjons sekvensering 9,15

MERK: Alle prosedyrer i denne delen utføres på DA8600-sekvenseringsplattformen. Materialer som brukes i denne delen, er tilgjengelige i sekvenseringssettsettet (reagenser / løsninger / materialer) i sekvenseringsreaksjoner Universal Kit (materialfortegnelse).

  1. Kontroller alle reagenser og materialer som kreves i en kjøre-på-sekvenseringsplattform.
    1. Sekvenseringsreagens: Kontroller tilgjengeligheten av sekvenseringsenzymløsning (6 μL), sekvenseringsprimere (20 μL), kvalitetskontrollmal (5 μL) og dGTP / dCTP / dATP / dTTP (70 μL), lagret mellom -30-10 ° C.
    2. Sekvenseringsløsning: Kontroller tilgjengeligheten av sekvenseringsløsning II (100 ml), sekvenseringsløsning III (50 ml), glødeløsning (1 015 μL), belastningsbuffer (10 μL), skummemiddel (2 μL), klortablett (1 tablett) og Streptavidin-perler (100 μL), lagret ved 4 °C.
    3. Materialer: Kontroller tilgjengeligheten av 250 ml reagensrør (8), 250 reagenser rørhette (8), sipper II (8), sipper (1), 2 L reagensflaske (1) og sekvenseringsbrikke (1), lagret på RT.
  2. Vask brikken før bruk.
    1. Sett en brikke stødig på en arbeidsplate, injiser 100 μL nukleasefritt vann i prøvehullet, fjern løsningen i utportalen og gjenta prosedyren.
    2. Injiser 100 μL 0,1 M NaOH-oppløsning i brikken og inkuber i 1 min ved RT.
    3. Injiser 100 μL isopropanol i prøvehullet, fjern ekstra oppløsning i utportalen, og gjenta prosedyren igjen.
    4. Dekk ut portalen med et filterpapir, flyt i nitrogenet for å tørke den gjenværende isopropanol i brikkens strømningscelle, og hold bruksklar chip på RT.
  3. Sequencer initiering
    1. Slå på nitrogenventilen og still trykket til 30 psi. Start sequenceren, trykk CLEAN på hovedskjermen, og velg vann eller klorid for å vaske maskinen deretter.
      MERK: Vask med vann før hver løpetur, vask med klorid hver uke eller tiden maskinen står klar med reagenser over 48 timer.
    2. Kloridvask: Velg en reagensflaske spesifisert for kloridvask, vask flasken to ganger med 18 MΩ vann og fyll flasken med 1 liter 18 MΩ vann. Sett en kloridtablett i flasken, oppløs tabletten i 10 minutter, tilsett 1 ml 1 M NaOH, og reverser deretter flasken for å blande oppløsningen. Bruk kloridoppløsningen innen 3 timer etter tilberedning.
    3. Filtrer 100 ml kloridoppløsning med et 0,45 μm filter og samle med to rør. Monter de to kloridrørene i posisjonene C1 og C2. Trykk CLEAN på hovedskjermen, og utstyr en brikke for kloridvask.
    4. Trykk på NESTE og sjekk alle trinnene på skjermen for å starte vaskeprogrammet; Programmet avsluttes om 30 minutter. Start en vask med vann etter kloridvask.
    5. Vannvask: Merk to rør som er spesifikke for vann med C1 og C2, og vask rørene med 18 MΩ vann to ganger. Tilsett 100 ml 18 MΩ vann til hvert av vannvaskerørene, og sett dem i henholdsvis C1- og C2-posisjoner.
    6. Velg CLEAN-programmet , installer brikken som er klargjort for vannvask, trykk NEXT, og sjekk deretter alle trinnene på skjermen for å starte vaskeprogrammet.
  4. Initialisering
    1. Rengjør vaskeflasken med vaskeløsning II, merk den som W2, og vask den tre ganger med 18 MΩ vann.
    2. Rengjør nitrogenrøret med luftlagt papir, sett det inn i rørbunnen og juster luftstrømmen til 0,5 l / min. Tøm oksygenet i flasken og fyll flasken med 1,920 ml 18 MΩ vann. Tilsett sekvensløsning II og 10 μL på 1 M NaOH i flasken, lukk korken og snu flasken flere ganger for å blande oppløsningen.
    3. Merk to nye rør som W1 og W3. Tilsett 32 μL 1 M NaOH til W1, tilsett 40-50 ml 1x sekvensløsning III til W3, og lukk hettene.
      MERK: 1x sekvensløsning III må være i et vannbad på 37 °C i 30 minutter når den først brukes. Sekvensløsning II skal beskyttes mot lys og oppbevares ved RT. Vaskeflasken må byttes ut med en ny etter bruk 20 ganger.
    4. Trykk INITIALIZE på hovedskjermen, bytt sipper på W1, W2 og W3 posisjoner, sett rørene til deres posisjon tilsvarende, og forsegle dem tett ved rotasjon. Installer en brikke for initialisering og kontroller maskinens tilstandsparametere.
    5. Trykk på NEXT for å starte initialiseringsprogrammet; det tar 40 min i den første delen.
      MERK: Hanskene må skiftes før du bytter den nye sipperen for å unngå å forurense kroppen til sipperen. Når de er brukt til vannvask og initialisering, kan sjetongene brukes til initialisering, men ikke bruk sjetongene som brukes til kloridvaskeflis for initialisering.
    6. Løs opp dGTP, dCTP, dATP og dTTP på is, og virvler som skal blandes. Merk fire nye rør som G, C, A og T, og pipette 70 μL av løsningen i henhold til rørets merke.
  5. Klargjør biblioteket for løping.
    1. Legg kvalitetskontrollmalen, primerne og enzymløsningen på isen.
    2. Forbered DNA-biblioteket når initialiseringsprogrammet har omtrent 20 minutter igjen. Vortex kvalitetskontrollmalen for 30 s å blande, og kort sentrifuge for 2 s. Overfør 5 μL av kvalitetskontrollmalen til malløsningen, virvel i 5 s, og sentrifuger røret i 15 500 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten ved forsiktig pipettering, unngå å berøre pelleten og la et volum på 10 μL ligge i røret.
    3. Tilsett 15 μL glødebuffer i røret; det totale volumet av løsningen er 25 μL.
    4. Vortex sekvensen primere når den oppløses helt på is og sentrifuge kort for 2 s. Overfør 20 μL av sekvensprimerne inn i røret fra det tidligere trinnet, virvel i 5 s, kort sentrifuge i 2 s, og lagre deretter ved RT før bruk.
  6. Laste inn prøven og sekvensere
    1. Pipette 55 μL av prøveoppløsningen fremstilt i forrige trinn og injiser den i prøvehullet på brikken.
    2. Sett brikken på sentrifugen; Hold hakket mot utsiden og prøveportalen inne, balanser den med en annen brukt brikke, og sentrifuger i 10 minutter.
    3. Forbered lasteløsningen.
      1. Bland 0,5 ml glødebufferen og 0,5 ml nukleasfritt vann i et 1,5 ml sentrifugerør. Merk det som 50% annealing buffer og bruk innen 7 dager.
      2. Bland 0,5 ml isopropanoloppløsning og 0,5 ml glødebuffer. Merk den som 50% vaskebuffer og bruk innen 24 timer.
      3. Bland 6 μL sekvensenzym og 60 μL 50% glødebuffer. Merk det som enzymreaksjonsbuffer, og legg løsningen på is etter tilberedning.
      4. Bland 49 μL 50% glødebuffer og 1 μL skummemiddel, og merk det som skummende løsning.
    4. Blås 100 μL luft inn i den skummende løsningen, pipetter løsningen gjentatte ganger til boblene er i tett skummende tilstand, og hold skumvolumet rundt 250 μL.
    5. Plasser brikken på benken etter sentrifuge, injiser 100 μL skum i prøvehullet, og fjern den ekstruderte løsningen i utportalen. Sett brikken tilbake i sentrifugen, og sentrifugen kort i 30 s.
    6. Gjenta trinn 5.6.4-5.6.5.
    7. Injiser 100 μL 50 % vaskebuffer to ganger, og fjern den ekstruderte oppløsningen i utportalen etter hver injeksjon.
    8. Injiser 100 μL 50 % glødebuffer tre ganger, og fjern den ekstruderte oppløsningen i utportalen etter hver injeksjon.
    9. Injiser 65 μL 50% enzymreaksjonsbuffer, unngå bobler og fjern den ekstruderte løsningen i utportalen.
    10. Stabiliser den lastede brikken på RT i 5 minutter, og installer brikken på sequencer-chipportalen. Velg planen som er programmert i trinn 6, sjekk informasjonen og start kjøringen; Det tar omtrent 1,5 time å fullføre.
    11. Utfør vannvaskeprogrammet innen 72 timer etter at kjøringen er avsluttet. Utfør kloridvask før vannvask når tiden overstiger 72 timer. Steng av sequenceren, og lukk ventilen til nitrogenet.

6. Planlegg en instruert sekvenseringskjøring i reporterserversystemet16

MERK: Alle prosedyrer i denne delen utføres på Ion Proton Sequencer med reporterserversystemet.

  1. Logg på serversystemet, velg Plan-fanen og klikk på Plan Template Run. Velg hele genomet som kjøretype, og velg riktig mal fra listen over planlagte kjøremaler.
  2. I kategorien Plan angir eller gjør du følgende valg:
    1. Skriv inn et nytt kjøreplannavn i henhold til bunken med prøver, velg hg19 (Homo sapiens) fra rullegardinlisten Referansebibliotek , og velg Ingen fra rullegardinlistene Målregioner og Hotspot-regioner .
    2. Angi antall strekkoder som brukes i eksempelsettet, velg en strekkode fra rullegardinlisten for hvert eksempel, og skriv inn et unikt, beskrivende navn, som kan være nyttig for å gruppere og spore eksemplet. Unngå bruk av standard eksempel 1 og så videre.
    3. Velg Ingen i Ion Reporter-fanen , klikk Neste, og velg DNA i applikasjonen og Whole Genome som målteknikk.
    4. Kontroller valgene i Kits-fanen, eller gjør endringer mens de passer for en kjøring.
      1. Plukke ut Ion Plus Fragment Library Kit fra rullegardinlisten Library Kit Type . Velg Ion PI HI-Q OT2 200 kit i rullegardinlisten Template Kit , og velg OneTouch som standard. Velg Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit fra rullegardinlisten Sekvenseringssett .
      2. Skriv inn 300 flyter, velg Ion PITM Chip fra rullegardinlisten Chip Type , og velg IonXpress fra rullegardinlisten Strekkodesett .
      3. Avbryte merkingen av Merk som duplikater leser og valget av Aktiver justering.
    5. Velg riktig plugin-modul i kategorien Plugin-moduler for å utføre dataanalyse i trinn 7. Fullfør valgene i prosjekttrinnet, klikk på Neste, og klikk på Planlegg kjøring i nedre høyre hjørne for å liste opp planlagte kjøringer.
    6. I kategorien Planlagte kjøringer velger du den nyopprettede kjøringen og kontrollerer alle innstillingene i gjennomgangsvinduet.

7. Dataanalyse

  1. Analyser kopinummervariantene (CNVer) ved hjelp av en arbeidsflyt for bioinformatikk.
    MERK: CNVene ble analysert i bioinformatikk arbeidsflyt med implementering av en algoritme basert på en skjult Markov-modell (HMM) 17; Modellen bruker lesedekning på tvers av genomet for å forutsi kopinummeret eller heltallsploidistatus (dvs. 0, 1, 2, 3, etc.). Den samlede bioinformatikkrørledningen ble bygget i pluginet til et sekvensserversystem, som er demonstrert i figur 2. Bioinformatikkanalysetrinnet tar i gjennomsnitt 4 timer å fullføre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når sekvensplanen er ferdig etter at kjøreprosessen i maskinen, rapporterer sekvensserversystemet sammendraget med beskrivende informasjon om genererte data, brikkestatus, ISP-lastehastighet og bibliotekkvalitet, som vist i figur 2. I denne resultatdemonstrasjonen ble det oppnådd 17, 6 G data i den totale basen, og den totale lastehastigheten til ISP var 88% i de totale brønnene i brikken; varmekartet viste at prøven var jevnt lastet på det totale arealet av brikken (figur 2A). I representantløpet ble det oppnådd 99.761.079 totale avlesninger, hvor 77% var brukbare; i alle brønner lastet med ISP, hadde 100% maler beriket, der 78% var klonale. Av alle klonale maler var 97% kvalifisert som det endelige biblioteket (figur 2B). Gjennomsnittlig lengde på lesingen var henholdsvis 117 bp, 176 bp og 174 bp med gjennomsnitt, median og modus (figur 2C). Toppantallet på T, C og A i tilpasning av maler var ~76, som er over den kvalifiserte grenselinjen på 50 (figur 2D). I alle adresserbare brønner med live ISP-er ble 99,5% kvalifisert som det konstruerte biblioteket, og et 20% polyklonalt og lavkvalitetsbibliotek ble filtrert ut. 76,6 % av internettleverandørene var kvalifisert for videre analyse (figur 2E).

Resultatet av kopinummervarianter fra en enkelt prøve S19030109-3 er vist i figur 3; den svarte streklinjen normaliseres som et euploidisegment over 22 autosomer og kjønnskromosomer, den røde linjen normaliseres som aneuploidikromosomregion som representerer en 182,16 Mb mosaikktrisomi av p16,3-q35,2 på kromosom 4, og et 33,13 Mb monosomisegment av q11,1-q13,33 på kromosom 22.

Representative rapporter om 12 prøver ved bruk av WGA-sett og 13 prøver ved hjelp av ett-trinns metode ved bruk av uavhengig utviklede WGA-reagenser er henholdsvis vist i tabell 4 og tabell 5, som inkluderer sammendragsinformasjon om strekkode-ID, prøvenavn, unikt antall avlesninger, justert leser gjennomsnittlig lengde, gjennomsnittlig dybde, prosentandel av GC-innhold og kromosomvarianter. Kromosomvariantenes merke viste kjønnskromosom, plassering og størrelse på duplisering og delesjon på kromosomer.

Figure 1
Figur 1: Diagram over prøvelastingsposisjon på 8-brønns stripe. Hver brønn med lastinnhold angitt hhv. U står for ikke-beriket prøve, B står for perler, og W står for vaskeløsning; De tomme brønnene er også notert i figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Løpende sammendrag: datastørrelse, ISP-innlasting og beregninger av bibliotekkvalitet. (A) Den generelle statusen, inkludert totalbaser, nøkkelsignal og ISP-lastehastighet med et varmekart. (B) Totalt antall avlesninger, brukbar lesefrekvens og sammendrag av ISP-informasjon i hvert reaksjonstrinn. (C) Histogrammet for leselengde. (d) Konsensus Nøkkel 1-Mer av TCA. (E) Adresserbare brønner og IPS klonal status. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på visualiserte kopinummervarianter plott: S19030109-3. Kopinummer (CN) signaler visualiseres i et plott med blå og grønne intervaller for kromosomer ved siden av hverandre. Det gitte eksemplet viser en økt observasjon av CN i kromosom 4 og en redusert observasjon av CN i kromosom 22, da den gjennomsnittlige CNV-linjen notert i rødt faller kompensert fra 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Nei. Antall sykluser Temperatur Tid
1 syklus 95 °C 2 minutter
12 sykluser 95 °C 15 s
15 °C 50 s
25 °C 40 s
35 °C 30 s
65 °C 40 s
75 °C 40 s
1 syklus 4 °C Holde

Tabell 1: Termisk syklusprogram for forforsterkning. Termiske reaksjonsbetingelser som temperatur, tid og sykluser vises.

Skritt Temperatur Tid Nei. Antall sykluser
1 95 °C 2 minutter 1
2 95 °C 15 s 14
65 °C 1 min
75 °C 1 min
3 4 °C holde 1

Tabell 2: Termisk syklusprogram for fullgenomforsterkning med fullgenomforsterkningssett. Termiske reaksjonsbetingelser som temperatur, tid og sykluser vises.

Skritt Temperatur (°C) Tid Nei. Antall sykluser
1 95 °C 2 min 30 s 1
2 95 °C 30 s 6
25 °C 2 minutter
0,3 °C/s til 72 °C ——
72 °C 1 min 30 s
3 95 °C 30 s 20
62 °C 30 s
72 °C 1 min
4 72 °C 2 minutter 1
5 4 °C holde 1

Tabell 3: Termisk syklusprogram for fullgenomforsterkning med de uavhengig utviklede reagensene. Termiske reaksjonsbetingelser som temperatur, tid og sykluser vises.

Eksempel på navn Unike Leser Count Justerte leser Gjennomsnittlig lengde Gjennomsnittlig dybde CG% Sd Markere
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 XY
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 XY
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 XY
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 XY
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 Xx
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 Xx
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 XY

Tabell 4: Eksempel på utdata for kopinummervariasjon ved bruk av helgenomforsterkningssett i serversystemrapport. Et typisk utgangsark inneholder parametere som prøvenavn, unike avlesninger, justerte avlesninger, gjennomsnittlig lengde, gjennomsnittlig dybde, CG-prosentandel, standardavviket for lengde, og for de fleste, merket av kromosomstatus med kjønnskromosom merket med XY og avsluttet CNV-detalj. En påvist CNV er merket med kromosomplassering og fragmentstørrelse.

Eksempel på navn Unike Leser Count Justerte leser Gjennomsnittlig lengde Gjennomsnittlig dybde GC% Sd Markere
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 XY
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 Xx
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 Xx
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 XY
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 Xx
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 XY
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 Xx
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 XY

Tabell 5: Eksempel på utdata for kopinummervariasjon etter ett-trinns metode med de uavhengig utviklede fullgenomamplifikasjonsreagensene i serversystemrapporten. Et typisk utgangsark inneholder parametere som prøvenavn, unike avlesninger, justerte avlesninger, gjennomsnittlig lengde, gjennomsnittlig dybde, CG-prosentandel, standardavviket for lengde, og for de fleste, merket av kromosomstatus med kjønnskromosom merket med XY og avsluttet CNV-detalj. En påvist CNV er merket med kromosomplassering og fragmentstørrelse.

Tilleggsfil 1: Det anbefalte volumet av hver komponent ved tilberedning av en hovedblanding av forskjellige batchstørrelser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kromosomal aneuploidi av embryoer er årsaken til en stor andel av graviditetstap, enten unnfanget naturlig eller in vitro befruktning (IVF). I den kliniske praksisen med IVF foreslås det at screening av embryoaneuploidien og overføring av euploidi-embryoet kan forbedre utfallet av IVF. Fluorescens in situ hybridisering er den tidligste teknikken som er vedtatt for kjønnsvalg og PGT-A; Denne teknikken krever imidlertid mer teknisk kompetanse fra laboratoriepersonell og er relativt arbeidskrevende. Økende studier av PGT-A ved bruk av fluorescens in situ hybridisering viser ingen forbedring i levende fødselsrater17,18.

Imidlertid har det blitt gjort raske fremskritt innen teknologier for å vurdere kopinummeranalysen i genetisk testing før implantasjon; Ulike metoder har sine fordeler og ulemper. Nyutviklede omfattende molekylære teknikker som kvantitativ fluorescens PCR, single nucleotide polymorphism (SNP) array, array comparative genomic hybridization (aCGH) og neste generasjons sekvensering viste løfte om å forbedre IVF-utfall7. Blant disse har NGS høy konsistens med array-comparative genomisk hybridisering til tross for skalerbarhet, høyere gjennomstrømning, enklere automatisering og mer potensial for å redusere kostnadene 19,20,21.

I kombinasjon med WGA-teknikker kan NGS-analyse av embryobiopsi gi mer nøyaktig sekvensinformasjon, og har også en levedyktig utvidelse for flere mål for enkeltnukleotidnivå. Med den økende anvendelsen av neste generasjons sekvensering for å oppdage genetisk abnormitet, er det et presserende behov for å bygge standarder for prøve- / dataprosess både i laboratoriet og klinisk praksis22,23,24.

I veien fra separasjon til aneuploidi-identifisering av PGT-A-prosessen inkluderer nøkkeltrinnene separasjon, valg av helgenomforsterkningsmetode, valg av neste generasjons sekvenseringsplattform og analyse av sekvenseringsdata. Hele genomforsterkningsprosessen er det mest kritiske trinnet i PGT-A, som bestemmer integriteten og ensartetheten til sekvenseringsdata. Tre helgenomforsterkningsstrategier ble sammenlignet i en tidligere studie, og det er bevist at picoPLEX kvasi-tilfeldig primermetode utfører nesten like godt som MDA-metoder (multiple displacement amplification) når det gjelder integritet og ensartethet av sekvenseringsdata25. Siden klinisk praksis fokuserer på kopinummervariasjoner (CNVer) med en oppløsning på ~ 10 Mbp i stedet for enkeltnukleotidvariasjon i PGT-A, ble picoPLEX WGA-settet og de uavhengig utviklede WGA-reagensene valgt på grunn av økonomiske bekymringer. I forsterkningstrinnet krever sistnevnte bare ett trinn for å fullføre forsterkningen av hele genomet, uten behov for forforsterkning.

Det er to viktigste kommersielle plattformer i markedet som for tiden brukes til PGT: MiSeq fra Illumina26 og Ion Proton fra Thermo-Fisher Scientific27. Både Miseq og Proton kan identifisere hele kromosomet aneuploidi, men Miseq er bare designet for å identifisere aneuploidi av hele kromosomet, mens Proton også kan identifisere store delesjoner (dels) eller dupliseringer (dups), inkludert klinisk signifikante dels eller dups ned til en oppløsning på omtrent 800 kb til 1 Mb28. Proton-plattformen har kostnadsfordeler og sterk lokal teknisk støtte. Av disse grunner ble Proton-plattformen valgt for senere klinisk praksis.

Bioinformatikkanalysen av neste generasjons sekvenseringsdata er komplisert og utfordrende for klinikere i kliniske applikasjoner. Med økningen av data i det offentlige arkivet av menneskelige genetiske varianter og tolkninger som Clinvar29, 1000 genom 30 og Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)31, har flere CNV-merknadsprogrammer blitt utviklet og er tilgjengelige for offentlig og privat bruk32,33. Her ble et lokalt designet informasjonssystem, Darui-LIMS, brukt til å hjelpe laboratoriepersonell og klinikere med å fullføre CNV-dataanalysen med ett klikk i klinisk praksis av PGT-A34.

Våre metoder er designet spesielt for PGT-A og har en god balanse mellom oppløsning, nøyaktighet og kostnad. Standard prosedyrer i genetisk materiale behandling og bioinformatikk rørledningen kan produsere konsistente data for klinisk analyse. Med nye fremskritt innen teknologier basert på NGS-systemet, kan ytterligere kromosom strukturelle abnormiteter som translokasjon testes og diagnostiseres for klinisk forsterkning i PGT-syklusen35,36. For disse testene må mer spesialiserte metoder utvikles og brukes. Likevel, som en spesifikasjon for å veilede den kliniske praksisen til PGT-A, vil disse metodene være nyttige for laboratoriepersonell og klinikere i laboratoriepraksis av PGT-A på neste generasjons sekvenseringsplattform DA8600.

Denne metoden har imidlertid visse begrensninger. I protokollen er maksimalt antall prøver som et magnetisk rack kan støtte 16; Selvfølgelig, avhengig av det faktiske antallet kliniske prøver, kan man også velge et magnetisk rack for å støtte flere prøver om gangen eller øke antallet magnetiske rack for å utføre flere prøveoperasjoner. Dette kan imidlertid øke risikoen for driftsfeil. Derfor anbefales kommersielle sett basert på halvledersekvensering når du arbeider med partier med 32 prøver eller større, for eksempel Ion ReproSeq PGS Kits fra Thermo-Fisher Scientific.

I henhold til de tekniske evalueringsretningslinjene for kvalitetskontrollteknologi for preimplantasjonskromosomale aneuploidideteksjonsreagenser (High Throughput Sequencing) kunngjort av China National Institutes for Food and Drug Control, er kravet til gyldig datavolum for en enkelt prøve ikke mindre enn 1 M. Det er 60-80 M leser per brikke i henhold til Ion PI Produktoversikt, og basert på eksperimentell erfaring, er de gyldige unike leser tallene ikke mindre enn 50% av de opprinnelige dataene. Etter beregning er det effektive datavolumet for hver eksperimentell prøve ikke mindre enn 2 M. Derfor, for å sikre nøyaktigheten av eksperimentelle resultater, anbefaler vi en maksimal kapasitet på 16 prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Dr. Zhangyong Ming og Mr. Rongji Hou for deres råd om LIMS utvidet søknad. Denne studien støttes av PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) og Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Tags

Genetikk utgave 186
Preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter