Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

يعرض البروتوكول الإجراءات الشاملة داخل المختبر المطلوبة في الاختبارات الجينية قبل الزرع لاختلال الصيغة الصبغية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات. نقدم هنا الخطوات التفصيلية لتضخيم الجينوم الكامل ، واختيار جزء الحمض النووي ، وبناء المكتبة ، وإعداد القالب ، وتسلسل تدفق العمل مع نتائج تمثيلية.

Abstract

اكتسب تسلسل الجيل التالي أهمية متزايدة في التطبيق السريري في تحديد المتغيرات الوراثية. في الاختبار الجيني قبل الزرع ، تتمتع هذه التقنية بمزاياها الفريدة في قابلية التوسع والإنتاجية والتكلفة. بالنسبة للاختبار الجيني قبل الزرع لتحليل اختلال الصيغة الصبغية ، يوفر نظام تسلسل الجيل التالي (NGS) القائم على أشباه الموصلات المعروض هنا نهجا شاملا لتحديد المتغيرات الجينية الهيكلية بدقة لا تقل عن 8 ميجا بايت. من الحصول على العينات إلى التقرير النهائي ، تتطلب عملية العمل خطوات متعددة مع الالتزام الوثيق بالبروتوكولات. وبما أن الخطوات الحرجة المختلفة يمكن أن تحدد نتيجة التضخيم، وجودة المكتبة، وتغطية القراءات، ومخرجات البيانات، فإن المعلومات الوصفية مع العرض المرئي بخلاف الكلمات يمكن أن تقدم المزيد من التفاصيل للتشغيل والتلاعب، مما قد يكون له تأثير كبير على نتائج جميع الخطوات الحرجة. ستعرض الطرق المعروضة هنا الإجراءات التي ينطوي عليها تضخيم الجينوم الكامل (WGA) لخلايا Trophectoderm الخزعة (TE) ، وبناء المكتبة الجينومية ، وإدارة التسلسل ، وأخيرا ، إنشاء تقارير متغيرات عدد النسخ.

Introduction

Aneuploidy هو خلل في عدد الكروموسومات من خلال وجود واحد أو أكثر من الكروموسومات الإضافية أو عدم وجود واحد أو أكثر من الكروموسومات. يمكن للأجنة التي تحمل نوعا من اختلال الصيغة الصبغية ، مثل فقدان كروموسوم X واحد (متلازمة تيرنر) ، أو نسخ إضافية من الأوسومات الذاتية ، مثل التثلث الصبغي من autosome 21 (متلازمة داون) ، و 13 (متلازمة باتاو) ، و 18 (متلازمة إدواردز) ، أو الكروموسومات الجنسية الإضافية مثل 47 ، XXY (متلازمة كلاينفلتر) و 47 ، XXX (متلازمة X الثلاثية) ، البقاء على قيد الحياة حتى نهاية العيوب الخلقية1. Aneuploidy هو السبب الرئيسي للإجهاض في الأشهر الثلاثة الأولى وفشل الإخصاب في المختبر (IVF)2. وتفيد التقارير أن معدل اختلال الصيغة الصبغية يمكن أن يتراوح من 25.4٪ -84.5٪ من خلال الطبقات العمرية المختلفة للدورة الطبيعية ومجموعة التحكم الطبية في ممارسة التلقيح الاصطناعي3.

أصبحت تكنولوجيا تسلسل الجيل التالي تطبق بشكل كبير في تحديد المعلومات الوراثية سريريا. يوفر وصولا عمليا إلى تسلسل الجينوم بكفاءة وإنتاجية عالية. على وجه الخصوص ، أحدث تسلسل الجيل التالي ثورة أيضا في تشخيص الاضطرابات ذات العوامل الوراثية واختبارات الشذوذ في الجينوم4. باستخدام تقنية تسلسل أشباه الموصلات لنقل الإشارات الكيميائية مباشرة في تسلسل التفاعل الحيوي إلى بيانات رقمية ، يوفر نظام التسلسل القائم على أشباه الموصلات كشفا مباشرا في الوقت الفعلي لتسلسل البيانات في 3-7 h 5,6.

في إجراء التلقيح الاصطناعي ، يقوم الاختبار الجيني قبل الزرع (PGT) بالتحقيق في الملف الجيني للجنين قبل نقله إلى الرحم لتحسين نتائج التلقيح الاصطناعي وتقليل خطر الاضطرابات الوراثية عند الأطفال حديثي الولادة 1,7. في PGT جنبا إلى جنب مع تقنيات NGS ، يتم تضخيم المواد الوراثية المستخرجة من أقل من 10 خلايا باستخدام مجموعات تضخيم الجينوم الكاملة أو كاشف تضخيم الجينوم الكامل الذي تم تطويره بشكل مستقل. وهذا يتطلب خطوة واحدة فقط في مرحلة التضخيم ولا يتطلب التضخيم المسبق ، للحصول على منتجات تضخيم الجينوم الكامل. يتم تصميم وتطبيق الاشعال أو اللوحات لمتغير رقم النسخ وتسلسل مواقع الجينات الخاصة في المكتبة التي تم إنشاؤها.

يتضمن سير العمل النموذجي للاختبار الجيني قبل الزرع - اختلال الصيغة الصبغية (PGT-A) في NGS إجراءات تسلسلية ، ويتطلب عبء عمل مكثفا من موظفي المختبر8. قد يؤدي بعض سوء التشغيل الناجم عن التراجع عن الإجراء إلى فقدان غير مرغوب فيه لكل من الوقت والموارد في المختبر. ومن المفيد وضع إجراء تشغيل موحد موجز وواضح لسير عمل PGS-NGS؛ ومع ذلك، لا يمكن لبروتوكولات تنسيق الكلمات تقديم معلومات أكثر تفصيلا حول معالجة العينات ومعالجة الأجهزة وإعدادات الأدوات، والتي يمكن تصورها في بروتوكول فيديو. في هذه المقالة ، يمكن أن يوفر سير العمل الذي تم التحقق منه جنبا إلى جنب مع عرض مرئي لتفاصيل التشغيل بروتوكولات إحالة أكثر مباشرة وبديهية في ممارسة PGT على منصة تسلسل أشباه الموصلات.

يصف البروتوكول هنا طريقة تدعم تجميع ما يصل إلى 16 خزعة جنين بالتوازي. بالنسبة للدفعات الأكبر ، يوصى باستخدام بروتوكول تجاري قائم على المجموعة لتسلسل أشباه الموصلات ، مثل Reproes-PGS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت مراجعة جميع البروتوكولات وخزعة الأديم التغصني (قسم 1.1.1.1) المطبقة في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في المستشفى رقم 924 في 18 سبتمبر 2017 (رقم: PLA924-2017-59). قدم المرضى / المشاركون موافقتهم الخطية المستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة.

1. عزل الحمض النووي عن خزعة الجنين البشري والتضخيم الجينومي الكامل

  1. بروتوكول لتضخيم الجينوم الكامل 9,10
    ملاحظة: تستخدم مجموعة بيكو بلكس WGA لأداء تضخيم الجينوم بالكامل.
    1. جمع العينات وتخزينها
      1. خزعة الأديم الغذائي: اسحب على ما معدله ست إلى تسع خلايا من TE المنفتق من جنين D5/6 بعد الفقس المساعد للحصول على كمية مؤهلة من الحمض النووي للتضخيم التالي.
      2. انقل خلايا العينة إلى أنبوب PCR في 5 ميكرولتر من PBS.
      3. قم بتجميد العينات على الفور عند -80 درجة مئوية إذا لم ينتقل البروتوكول مباشرة إلى استخراج الحمض النووي.
    2. تحلل الخلايا
      ملاحظة: يسرد الملف التكميلي 1 ويعمل كمرجع للأحجام الموصى بها لكل مكون عند إعداد المزيج الرئيسي أثناء تحلل الخلايا وتضخيم الجينوم الكامل لدفعات من العينات 1 و 8 و 16 و 32 (مع زيادة العمر لاستيعاب أخطاء السحب). عند صياغة خلطات رئيسية أخرى من هذا البروتوكول ، يتم زيادة حجم كل مكون بالإضافة إلى ذلك لاستيعاب استهلاك المكون الناجم عن السحب المتكرر. يتم إجراء جميع عمليات الطرد المركزي القصيرة على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة لمدة 2-10 ثوان في درجة حرارة الغرفة (RT) ، مع دورة ثابتة في الدقيقة تبلغ 10000 مع قوة طرد مركزي تبلغ 5300 × جم. يجب أن تكون قوة الطرد المركزي بين 2000 × جم و 12000 × جم.
      1. تحضير مزيج تحلل الخلايا مع 4.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخفيف إنزيم الاستخراج و 0.2 ميكرولتر من إنزيم استخراج الخلايا لكل عينة.
      2. تخلط ماصة 5 ميكرولتر من تحلل الخلايا المعد حديثا في كل عينة خلية 5 ميكرولتر في أنابيب PCR ، وتقوم بالطرد المركزي لفترة وجيزة للأنبوب في RT لمدة 5 ثوان. لا دوامة الأنبوب.
      3. احتضان العينة في دورة حرارية على النحو التالي: 75 درجة مئوية ، 10 دقائق ؛ 95 درجة مئوية ، 4 دقائق ؛ 25 درجة مئوية، 14 دقيقة. لفترة وجيزة جهاز الطرد المركزي (5 ثانية) الأنبوب بعد الحضانة.
    3. التضخيم المسبق للحمض النووي للجينوم بأكمله
      1. تحضير مزيج ما قبل التضخيم مع 4.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت قبل الأمبير و 0.2 ميكرولتر من إنزيم ما قبل الأمبير لكل عينة.
      2. ماصة 5 ميكرولتر من مزيج ما قبل التضخيم في أنابيب العينة من خلال جدران الأنبوب ، ولفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ثوان. تجنب وصول الطرف إلى أسفل الأنبوب ، ولا تقم بدوامة الأنبوب.
      3. احتضان العينة وفقا لبرنامج التدوير الحراري المذكور في الجدول 1.
    4. تضخيم الحمض النووي للجينوم الكامل
      1. قم بطرد العينة لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان وضع منتج حضانة ما قبل الأمبير على الجليد.
      2. قم بإعداد مزيج تضخيم الجينوم بالكامل باستخدام 25 ميكرولتر من مخزن التضخيم المؤقت ، و 0.8 ميكرولتر من إنزيم التضخيم ، و 34.2 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز لكل عينة.
      3. امزج 60 ميكرولتر من مزيج تضخيم الجينوم الكامل المعد حديثا مع 15 ميكرولتر من منتج حضانة ما قبل الأمبير ؛ يجب أن يكون الحجم الإجمالي 75 ميكرولتر. تجنب وصول الطرف إلى أسفل الأنبوب ، ولا تقم بدوامة الأنبوب.
      4. ضع أنبوب PCR على الدراجة الحرارية وقم بتشغيل برنامج التدوير الحراري المذكور في الجدول 2.
      5. الطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة لمدة 5 ثانية ونقل المنتجات إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل.
      6. حدد تركيز منتج WGA باستخدام مقياس الفلورومتر11. يمكن تخزين العينات مؤقتا عند -20 درجة مئوية لمدة تقل عن شهرين إذا لم يتم الانتقال إلى الخطوة التالية.
  2. بروتوكول كواشف WGA المطورة بشكل مستقل.
    1. جمع العينات وتخزينها
      1. اسحب الخلايا من جنين D5/6 بعد الفقس المساعد للتضخيم التالي.
      2. انقل خلايا العينة التي تحتوي على 1.5 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب PCR يحتوي على 2 ميكرولتر من PBS.
        ملاحظة: PBS خال من Mg 2+ و Ca2+.
      3. قم بتجميد العينات على الفور عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم الانتقال مباشرة إلى بروتوكول استخراج الحمض النووي.
    2. تحلل الخلايا
      1. قم بإذابة المخزن المؤقت لتحلل الخلايا (40 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 8) ، 100 mM NaCl ، 2 mM EDTA ، 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) ، 1٪ (v / v) Triton X-100 ، 5 mM pyrophosphate ، 2 mM β-glycerophosphate ، 0.1٪ SDS) في RT ووضعه على الجليد. أضف 2 ميكرولتر من مخزن تحلل الخلايا إلى كل عينة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان).
        ملاحظة: لا تقم بتدوير الأنبوب، وتجنب لمس طرف الماصة لسطح السائل في الأنبوب لتجنب إخراج الخلايا أو الحمض النووي من نظام التفاعل.
      2. احتضان العينة في دورة حرارية على النحو التالي: 55 درجة مئوية ، 20 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية ، 10 دقائق ؛ 4 درجة مئوية ، عقد. لفترة وجيزة الطرد المركزي للأنبوب في RT لمدة 10 ثانية بعد الحضانة.
    3. تضخيم الحمض النووي للجينوم الكامل
      1. لفترة وجيزة الطرد المركزي لمنتج تحلل الخلايا لمدة 5 ثانية ووضعه على الجليد.
      2. قم بإعداد خليط تضخيم الجينوم بالكامل لكل عينة عن طريق الخلط مع 16 ميكرولتر من محلول التضخيم المخلوط مسبقا ، و 1 ميكرولتر من إنزيم التضخيم ، و 28 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. اخلطي بلطف ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) ، وضعي الخليط على الجليد. لا دوامة الأنبوب.
      3. ماصة 45 ميكرولتر من خليط تضخيم الجينوم الكامل المحضر حديثا في منتج تحلل الخلايا المحضر في الخطوة 1.2.2.2 ؛ تخلط بلطف وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان.
        ملاحظة: لا تقم بدوامة الأنبوب وتجنب لمس طرف الماصة للسائل الموجود في الأنبوب.
      4. ضع أنبوب PCR على جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البرنامج كما هو مفصل في الجدول 3.
      5. الطرد المركزي للأنابيب قريبا لمدة 5 ثانية ونقل المنتجات إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل.
      6. حدد تركيز منتج WGA باستخدام مقياس الفلورومتر11 وسجل النتائج على ورقة ضمان الجودة (تحليل الجودة). يمكن تخزين المنتجات ذات التركيزات المؤهلة مؤقتا عند -20 درجة مئوية لمدة تقل عن شهرين إذا لم يتم الانتقال إلى الخطوة التالية.

2. تحديد جزء التضخيم

ملاحظة: المواد المستخدمة في هذا القسم متوفرة في مجموعة أدوات إعداد المكتبة (جدول المواد).

  1. التحضير قبل البدء
    1. قم بموازنة الخرز المغناطيسي (n x 100 μL) للتنقية في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. قم باستعادة منتج WGA السابق إلى RT. Vortex المنتج في RT لمدة 30 ثانية قبل الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    3. تحضير الإيثانول الطازج 70 ٪.
  2. إجراء تحديد الجزء
    1. ماصة 25 ميكرولتر من منتجات WGA ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل مع 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز المحمل مسبقا.
    2. دوامة وخلط خرز تنقية الحمض النووي جيدا. Aliquot 50 ميكرولتر منه في كل أنبوب عينة (العينة الأصلية: الخرز (الحجم) = 1: 1) ، دوامة ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثانية). اضبط الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT لعملية ربط الحمض النووي.
    3. أدخل أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل في رف مغناطيسي ، وانتظر حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 1.5 مل. تجنب سحب الخرز.
    4. وفقا لحجم العينة الأصلي ، ماصة 30 ميكرولتر (العينة الأصلية: الخرز (الحجم) = 1: 0.6) من الخرز المغناطيسي والدوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان). اضبط الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT لعملية ربط الحمض النووي.
    5. أدخل أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل في رف المغناطيس ، وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant. تجنب سحب الخرز.
    6. ماصة 300 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل ، وتدوير الأنبوب بلطف مرتين بزاوية 180 درجة ، وتحريك الخرز على طول جدار الأنبوب لغسل شامل. ماصة وتجاهل supernatant. تجنب سحب الخرز.
    7. كرر إجراء الغسيل مرة واحدة.
    8. قم بإزالة أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 1.5 مل من رف المغناطيس وأجهزة الطرد المركزي قريبا (5 ثوان). أدخل الأنابيب مرة أخرى في رف المغناطيس ، وانتظر حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب.
    9. ماصة بعناية السائل المتبقي في القاع. أبق الأنبوب مفتوحا لتجفيف الخرز في RT لمدة 3-5 دقائق. حافظ على الرطوبة بعيدا عن الخرز.
      ملاحظة: أغلق الغطاء على الفور في حالة ظهور أي تشققات على حبيبات الخرز.
    10. قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي ، وماصة 25-30 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي في أنبوب ، وأغلق الغطاء والدوامة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) للحصول على السائل العكر إلى أسفل الأنبوب ، وتعيين الأنبوب على RT لمدة 5 دقائق.
    11. أدخل الأنابيب مرة أخرى في الرفوف المغناطيسية ، وانتظر حتى تنجذب جميع الخرز إلى الجدار الجانبي للأنبوب ويتحول السوبرناتانت إلى شفاف. انقل محلول الحمض النووي بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة بسعة 1.5 مل. تجنب سحب الخرز.
    12. حدد تركيز الحمض النووي بعد اختيار الشظايا باستخدام مقياس الفلورومتر11 ، وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية. عادة ، يتراوح تركيز جزء الحمض النووي المختار من 1.5-2.4 نانوغرام / ميكرولتر.

3. إعداد مكتبة الحمض النووي12

ملاحظة: المواد المستخدمة في هذا القسم متوفرة في مجموعة أدوات إعداد المكتبة (جدول المواد).

  1. إنهاء الإصلاح
    1. قم بموازنة الخرز المغناطيسي في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بموازنة ناتج الحمض النووي لاختيار الجزء في الخطوة 2.2.12 إلى RT. تحقق من العلامة وسجلها على كل قارورة تحتوي على الحمض النووي.
    3. قم بإعداد نظام إصلاح الحمض النووي النهائي باستخدام 30 ميكرولتر من منتجات الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإصلاح النهاية ، و 0.5 ميكرولتر من إنزيم الإصلاح النهائي ، و 9.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثانية) في RT للحصول على كل السائل إلى قاع الأنبوب.
    4. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ولفترة وجيزة الطرد المركزي (5 ثانية) الأنبوب بعد الحضانة.
    5. دوامة أو عكس خلط الخرز المغناطيسي ، ونقل 75 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب يحتوي على عينات الحمض النووي التي تم إصلاحها في النهاية (العينة الأصلية: الخرز (الحجم) = 1: 1.5). ماصة أو دوامة بلطف لخلط الخرز جيدا ولفترة وجيزة جهاز طرد مركزي (5 ثوان) لتدوير كل التعليق وصولا إلى أسفل الأنبوب. اضبط الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT لعملية ربط الحمض النووي. اقلب الأنابيب بلطف للحفاظ على تشتت الخرز.
    6. أدخل أنابيب الطرد المركزي في رف المغناطيس ، وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي ويصبح السوبرنات شفافا. قم بإزالة السوبرناتانت ، وتجنب سحب الخرز ، مع الحفاظ على الأنابيب على الرف عند السحب.
    7. انقل 300 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ المحضر حديثا إلى الأنابيب ، وقم بتدوير الأنابيب بلطف مرتين بزاوية 180 درجة ، وحرك الخرز على طول جدار الأنبوب لغسل شامل. ماصة وتجاهل supernatant. تجنب سحب الخرز.
    8. كرر إجراء الغسيل مرة واحدة.
    9. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل من رف المغناطيس ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان). أدخل الأنابيب مرة أخرى في رف المغناطيس ، وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب.
    10. ماصة بعناية من السائل المتبقي في القاع. افتح غطاء أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل وجفف الخرز في RT لمدة 3-5 دقائق. حافظ على الرطوبة بعيدا عن الخرز.
      ملاحظة: أغلق الغطاء على الفور في حالة ظهور أي تشققات على حبيبات الخرز.
    11. ماصة 33 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخليص الحمض النووي في أنبوب ، وإغلاق الغطاء ، والدوامة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) للحصول على التعليق العكر في الجزء السفلي من الأنبوب وضبط الأنبوب على RT لمدة 5 دقائق.
    12. أدخل الأنابيب مرة أخرى في الرفوف المغناطيسية ، وانتظر حتى تنجذب جميع الخرز إلى الجدار الجانبي ويصبح المحلول شفافا. انقل محلول الحمض النووي بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة بسعة 1.5 مل مع العلامة المناسبة ، وتجنب سحب الخرز.
  2. ربط الباركود
    1. ضع كواشف ربط الباركود في الخطوة 3.2.2 على الجليد لإذابة جميع الكواشف المجمدة.
    2. قم بإعداد نظام الربط باستخدام 32 ميكرولتر من منتجات الحمض النووي التي تم إصلاحها في النهاية ، و 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز ، و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لليغاز ، و 1 ميكرولتر من الليغاز ، و 1 ميكرولتر من P1 تتكيف في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. قم بإخراج 1 ميكرولتر من كل كاشف باركود في مزيج المحلول في الأنبوب لعينة واحدة ، ودوامة لمدة 5 ثوان ، وأجهزة طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) للحصول على كل السائل في قاع الأنبوب.
      ملاحظة: عند إضافة الباركود ، تأكد من أن عدد الرموز الشريطية والعينات يتوافق ؛ فتح قارورة باركود واحدة فقط في كل مرة لتجنب التلوث المختلط للباركود ؛ تغيير القفازات لكل خمسة أو ستة رموز شريطية مضافة.
    3. احتضان الأنابيب عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. ماصة 75 ميكرولتر (العينة الأصلية: الخرز (الحجم) = 1:1.5) من الخرز المغناطيسي في أنبوب، وماصة أو دوامة بلطف لخلط الخرز جيدا. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) لتدوير كل التعليق إلى الأسفل ، وتجنب تجميع الخرز. اضبط الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT لعملية ربط الحمض النووي. اقلب الأنابيب برفق للحفاظ على توزيع الخرز.
    5. أدخل أنابيب أجهزة الطرد المركزي في رف المغناطيس ، وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي ويصبح السوبرنات شفافا. قم بإزالة supernatant وتجنب سحب الخرز ، مع الحفاظ على الأنابيب على الرف عند السحب.
    6. انقل 300 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ المحضر حديثا إلى أنابيب ، وقم بتدوير الأنابيب بلطف مرتين بزاوية 180 درجة ، وحرك الخرز على طول جدار الأنبوب لغسل شامل. ماصة وتجاهل supernatant. تجنب سحب الخرز.
    7. كرر إجراء الغسيل مرة واحدة.
    8. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل من رف المغناطيس وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان). أدخل الأنابيب مرة أخرى في رف المغناطيس وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب. ماصة بعناية من supernatant المتبقية في القاع.
    9. حافظ على غطاء الأنبوب مفتوحا لتجفيف الخرز في RT لمدة 3-5 دقائق. حافظ على الرطوبة بعيدا عن الخرز.
      ملاحظة: أغلق الغطاء على الفور في حالة ظهور أي تشققات على حبيبات الخرز.
    10. ماصة 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي في الأنبوب. شطف حبيبات الخرز وصولا إلى أسفل الأنبوب، وختم الغطاء، والدوامة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) للحصول على التعليق العكر في الجزء السفلي من الأنبوب والحفاظ على الأنبوب ثابتا عند RT لمدة 5 دقائق.
  3. تضخيم الشظايا
    1. ضع كواشف مبنى المكتبة على الجليد عندما يذوب الكاشف المجمد.
    2. انقل 47.5 ميكرولتر من مزيج الإنزيم و 2.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي والخرز ، والدوامة لمدة 5 ثوان ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) للحصول على كل السائل إلى قاع الأنبوب.
    3. اضبط الأنبوب على RT لمدة 5 دقائق. أدخل الأنابيب مرة أخرى في رفوف مغناطيسية ، وانتظر حتى تنجذب جميع الخرز إلى الجدار الجانبي ويتحول الخارق إلى شفاف. انقل محلول الحمض النووي بعناية إلى أنابيب PCR سعة 0.2 مل مع علامات مميزة بوضوح ، وتجنب سحب الخرز.
    4. احتضان العينة في مجموعة دورة حرارية مع البرنامج التالي: 72 درجة مئوية ، 20 دقيقة ؛ 98 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ 98 درجة مئوية ، 15 ثانية ؛ 62 درجة مئوية ، 15 ثانية ؛ 70 درجة مئوية ، 1 دقيقة (6 دورات) ؛ 70 درجة مئوية، 5 دقائق. لفترة وجيزة جهاز الطرد المركزي (5 ثانية) الأنبوب عند الانتهاء من التفاعل وتخزين المنتجات في 4 درجة مئوية.
    5. انقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل (مرفق منخفض). أضف 97.5 ميكرولتر (حجم العينة الأصلي: الخرز (الحجم) = 1:1.5) من الخرز المغناطيسي في الأنبوب عندما ينتهي التفاعل ، ماصة أو دوامة بلطف لخلط الخرز جيدا ، وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) لتدوير كل السائل إلى الأسفل. تجنب تجميع الخرز. اضبط الأنبوب على RT لمدة 5 دقائق. اقلب الأنابيب برفق للحفاظ على توزيع الخرز.
    6. أدخل أنابيب أجهزة الطرد المركزي في رف المغناطيس ، وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي ويصبح السوبرنات شفافا. قم بإزالة السوبرناتانت ، وتجنب سحب الخرز ، وحافظ على ثبات الأنابيب على الرف.
    7. انقل 300 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ المحضر حديثا إلى أنابيب ، وقم بتدوير الأنابيب بلطف مرتين بزاوية 180 درجة ، وحرك الخرز على طول جدار الأنبوب لغسل شامل. ماصة وتجاهل supernatant. تجنب سحب الخرز.
    8. كرر إجراء الغسيل مرة واحدة.
    9. قم بإزالة أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 1.5 مل من رف المغناطيس وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان). أدخل الأنبوب مرة أخرى في رف المغناطيس ، وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب. ماصة بعناية من السائل المتبقي في القاع.
    10. حافظ على غطاء الأنبوب مفتوحا لتجفيف الخرز في RT لمدة 3-5 دقائق. حافظ على الرطوبة بعيدا عن الخرز.
      ملاحظة: أغلق الغطاء على الفور في حالة ظهور أي تشققات على حبيبات الخرز.
    11. ماصة 22 ميكرولتر من مخزن الحمض النووي العازل في الأنبوب ، وشطف حبيبات الخرز لأسفل ، وأغلق الغطاء والدوامة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) للحصول على السائل العكر إلى أسفل الأنبوب وضبط الأنبوب على RT لمدة 5 دقائق.
    12. تحديد تركيز مكتبة الحمض النووي المبنية باستخدام مقياس الفلورومتر11 وتخزين مكتبة الحمض النووي المبنية عند -20 درجة مئوية ؛ يتراوح تركيز جزء الحمض النووي المختار من 0.6-10 نانوغرام / ميكرولتر.

4. إعداد قالب التسلسل13,14

ملاحظة: تتوفر المواد المستخدمة في هذا القسم في مجموعة أدوات إعداد القوالب (الكواشف/الحلول/المواد) الخاصة بالمجموعة العالمية لتفاعلات التسلسل (جدول المواد).

  1. مزيج المكتبة
    1. املأ نموذج ورقة سجلات ما قبل التشغيل في نظام الخادم وقم بوضع علامة على أنبوب العينة بتركيز المكتبة ورقم الباركود. تجنب استخدام نفس الباركود على عينات مختلفة في تشغيل واحد.
    2. دوامة وخلط عينة المكتبة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثانية). قم بتخفيف جميع العينات إلى 100 جزء في المليون بالماء الخالي من النوكليز ، والدوامة لمدة 30 ثانية ، وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة للعينة.
      ملاحظة: بالنظر إلى أن متوسط طول الحمض النووي يبلغ 260 نقطة أساس، وأن 1 نقطة أساس يساوي 660 جم/مول، احسب تحويل ng/μL إلى pM باستخدام المعادلة التالية: 1 ng/μL = 5,827.5 pM/L.
    3. ماصة 10 ميكرولتر من 100 جزء في المليون مكتبة مخففة في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل ، دوامة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة طرد مركزي لفترة وجيزة لمدة 2 ثانية. احتفظ بالمكتبة المختلطة على الجليد.
  2. إعداد القالب
    1. ابدأ تشغيل نظام تضخيم القالب واختر البرنامج النظيف. أضف زيت التفاعل إلى 1/2 من الأنبوب ، وأضف محلول كسر المستحلب إلى 1/3 من الأنبوب.
    2. تأكد من ضبط لوحة التضخيم ومحول الغسيل في وضع التشغيل . نظف زجاجة النفايات ، وضع إبرة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل لجمع النفايات. قم بتأكيد الخطوات التي تمت معالجتها على شاشة نظام تضخيم القالب. اضغط على NEXT لبدء برنامج نظيف ، والذي سيستغرق حوالي 15 دقيقة.
    3. استبدل لوحة التضخيم بأخرى جديدة بعد البرنامج النظيف ، وأدخل أنابيب التجميع التي تحتوي على محلول كسر 150 ميكرولتر II في الدوار ، وضع الجسر على أنابيب التجميع. أضف زيت التفاعل إلى 1/2 من الأنبوب ومحلول كسر المستحلب إلى 1/3 من الأنبوب.
    4. استحلاب تحضير كاشف PCR: قم بموازنة المخزن المؤقت PCR المستحلب في RT حتى يذوب ، وقم بطرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) لجميع الكواشف ، وضعها على الجليد قبل الاستخدام.
    5. ماصة 120 ميكرولتر من مزيج إنزيم PCR المستحلب ، و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لجسيمات المجال الأيوني (ISP) ، و 170.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز ، و 9.5 ميكرولتر من المكتبة المختلطة (100 pM) في أنبوب يحتوي على 2000 ميكرولتر من مخزن PCR المستحلب. امزج المحلول جيدا مع السحب المتكرر.
      ملاحظة: يجب تحميل المحلول المختلط على نظام تضخيم القالب في غضون 15 دقيقة؛ تنفيذ جميع الإجراءات في RT.
    6. ضع مرشحا جديدا لإعداد القالب ثابتا على حامل الأنبوب مع مدخل العينة لأعلى. دوامة الحل لمدة 5 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثانية) ، ونقل الحل إلى بوابة عينة المرشح بعد سحب 800 ميكرولتر مرارا وتكرارا ثلاث مرات. جهاز طرد مركزي للأنبوب لتقليل الفقاعات قبل الحقن الأخير. تجنب حقن الهواء في الفلتر. حقن 200 ميكرولتر من زيت التفاعل II بعد المحلول المختلط.
    7. اقلب بوابة العينة الخاصة بالمرشح لأسفل، واستبدل تكيف الغسيل بالفلتر. أدخل إبرة العينة في الفتحة المركزية لغطاء الدوار ثم اضغط على الإبرة في الأسفل.
    8. اضغط على الزر RUN (تشغيل) على الشاشة ، واختر البرنامج وفقا للمجموعة المقابلة ، واضغط على ASSISTED للتحقق من جميع الخطوات. اضغط على NEXT حتى يتم بدء تشغيل التشغيل ؛ يستغرق حوالي 4.5 ساعة للإنهاء.
    9. اضغط على NEXT عند الانتهاء من البرنامج; سيبدأ النظام في الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. عندما يتوقف جهاز الطرد المركزي، اضغط على زر فتح الغطاء وانقل أنابيب التجميع إلى الرفوف. إذا لم ينتقل الإجراء إلى الخطوة التالية في غضون 15 دقيقة ، فاضغط على Final Spin لإعادة الطرد المركزي.
    10. قم بإزالة supernatant في أنبوب التجميع ، مع ترك 100 ميكرولتر من المحلول في الأنبوب. امزج العينة المتبقية عن طريق السحب وانقل العينة إلى أنابيب الطرد المركزي الجديدة سعة 1.5 مل التي تحمل علامة OT (نظام اللمسة الواحدة 2).
      ملاحظة: عند سحب السوبرناتانت، تجنب لمس قاع الأنبوب على طول الجانب.
    11. ماصة 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز في كل من أنابيب التجميع ، ونقل المحلول إلى أنبوب OT المغسول بالسحب المتكرر. أضف 600 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز إلى أنبوب OT لجعل الحجم الإجمالي 1 مل ، دوامة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة طرد مركزي عند 15500 × جم لمدة 8 دقائق.
    12. قم بإزالة المادة الفائقة بلطف في أنبوب OT مع بقاء 100 ميكرولتر واستخدم الطرف للتخلص من طبقة الزيت جيدا. أضف 900 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز ، ودوامة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة طرد مركزي عند 15500 × جم لمدة 8 دقائق.
    13. قم بإزالة supernatant حتى يتم ترك 20 ميكرولتر ، وأضف حل تعليق القالب لجعل الحجم 100 ميكرولتر ، والدوامة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 2 ثانية.
      ملاحظة: يجب أن ينتقل الحل الذي تم الحصول عليه في هذه الخطوة إلى الخطوة التالية في أقل من 12 ساعة.
    14. قم بتشغيل البرنامج النظيف على نظام تضخيم القالب قبل إيقاف تشغيل الطاقة.
  3. إثراء القالب
    1. تحضير مزيج ذوبان مع 280 ميكرولتر من tween-80 و 40 ميكرولتر من 1 M NaOH.
    2. اغسل حبات C1. دوامة حل الخرز C1 لمدة 30 ثانية. انقل 100 ميكرولتر من الخرز إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وأدخل الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين وتخلص من السوبرناتانت.
    3. انقل 1 مل من محلول غسيل الخرز C1 إلى الأنبوب والدوامة لمدة 30 ثانية. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (5 ثوان) ، أدخل الأنبوب في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة ، وتخلص من supernatant. ماصة 130 ميكرولتر من محلول إعادة تعليق حبة C1 في الأنبوب ، وخلط الخرز عن طريق السحب المتكرر. تجنب خلق فقاعات.
    4. قم بتحميل 100 ميكرولتر من المكتبة المخففة ، و 130 ميكرولتر من حبات C1 ، و 300 ميكرولتر × 3 محلول غسيل القوالب ، و 300 ميكرولتر من محلول الذوبان إلى شرائط البئر الثمانية ، كما هو موضح في الشكل 1.
    5. قم بتثبيت شرائط البئر الثمانية على وحدة التخصيب ، وقم بتحميل طرف السحب ، واضبط أنبوب جهاز الطرد المركزي 200 ميكرولتر في موضع التجميع. اضغط على START لتشغيل البرنامج ؛ يستغرق حوالي 35 دقيقة.
    6. سيتم جمع العينة تلقائيا في أنبوب جهاز طرد مركزي 200 ميكرولتر. أغلق الغطاء وقم بطرده مركزيا عند 15500 × جم لمدة 5 دقائق. تحقق من قاع الأنبوب للتحقق مما إذا كانت هناك أي حبات C1 متبقية.
    7. إذا كانت حبات C1 متبقية ، فقم بماصة محلول القالب بشكل متكرر 10x وأدخل الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 4 دقائق. انقل جميع المواد الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 0.2 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 15,500 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. إذا لم تكن هناك حبات C1 مرئية متبقية ، فتخلص من supernatant حتى يتم ترك 10 ميكرولتر ، وأضف 200 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز ، واخلطه عن طريق سحب 10x. جهاز طرد مركزي عند 15,500 × g لمدة 5 دقائق.
    9. تخلص من المادة الفائقة مع بقاء 10 ميكرولتر ، وأضف 90 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز للوصول إلى حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر. يمكن تخزين المحلول في 2-8 درجة مئوية لمدة تقل عن 3 أيام.

5. تسلسل الجيل التالي 9,15

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات الواردة في هذا القسم على النظام الأساسي لتسلسل DA8600. تتوفر المواد المستخدمة في هذا القسم في مجموعة أدوات التسلسل (الكواشف/الحلول/المواد) الخاصة بالمجموعة العالمية لتفاعلات التسلسل (جدول المواد).

  1. تحقق من جميع الكواشف والمواد المطلوبة في منصة تسلسل تشغيلية.
    1. كاشف التسلسل: تحقق من توفر محلول إنزيم التسلسل (6 ميكرولتر) ، والاشعال المتسلسل (20 ميكرولتر) ، وقالب مراقبة الجودة (5 ميكرولتر) ، و dGTP / dCTP / dATP / dTTP (70 ميكرولتر) ، المخزنة بين -30-10 درجة مئوية.
    2. حل التسلسل: تحقق من توفر حل التسلسل II (100 مل) ، وحل التسلسل III (50 مل) ، والمخزن المؤقت للتلدين (1015 ميكرولتر) ، ومخزن التخزين المؤقت للتحميل (10 ميكرولتر) ، وعامل الرغوة (2 ميكرولتر) ، وقرص الكلور (1 قرص) ، وخرز Streptavidin (100 ميكرولتر) ، المخزن في 4 درجات مئوية.
    3. المواد: تحقق من توفر أنبوب كواشف 250 مل (8) ، و 250 غطاء أنبوب كواشف (8) ، ورشفة II (8) ، ورشفة (1) ، وزجاجة كاشف سعة 2 لتر (1) ، وشريحة تسلسل (1) ، مخزنة في RT.
  2. اغسل الشريحة قبل الاستخدام.
    1. اضبط شريحة واحدة ثابتة على لوحة عمل ، وحقن 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز في ثقب العينة ، وقم بإزالة المحلول في البوابة الخارجية ، وكرر الإجراء.
    2. حقن 100 ميكرولتر من محلول 0.1 M NaOH في الشريحة واحتضنها لمدة دقيقة واحدة في RT.
    3. حقن 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول في ثقب العينة، وإزالة محلول إضافي في البوابة الخارجية، وتكرار الإجراء مرة أخرى.
    4. قم بتغطية البوابة الخارجية بورق ترشيح ، واتدفق في النيتروجين لتجفيف الأيزوبروبانول المتبقي في خلية تدفق الشريحة ، واحتفظ بالشريحة الجاهزة للاستخدام في RT.
  3. بدء التسلسل
    1. قم بتشغيل صمام النيتروجين واضبط الضغط على 30 رطل لكل بوصة مربعة. ابدأ تشغيل جهاز التسلسل ، واضغط على CLEAN على الشاشة الرئيسية ، واختر الماء أو الكلوريد لغسل الماكينة وفقا لذلك.
      ملاحظة: اغسل بالماء قبل كل جري، واغسله بالكلوريد كل أسبوع أو في الوقت الذي تقف فيه الماكينة بالكواشف على مدار 48 ساعة.
    2. غسل الكلوريد: اختر زجاجة كاشف واحدة محددة لغسل الكلوريد ، واغسل الزجاجة مرتين بماء 18 MΩ واملأ الزجاجة ب 1 لتر من ماء 18 MΩ. ضع قرص كلوريد واحد في الزجاجة ، وقم بإذابة القرص لمدة 10 دقائق ، وأضف 1 مل من 1 M NaOH ، ثم عكس الزجاجة لخلط المحلول. استخدم محلول الكلوريد في غضون 3 ساعات بعد التحضير.
    3. تصفية 100 مل من محلول الكلوريد مع مرشح 0.45 ميكرومتر وجمع مع أنبوبين. قم بتثبيت أنبوبي الكلوريد في المواضع C1 و C2. اضغط على CLEAN على الشاشة الرئيسية ، وقم بتجهيز شريحة لغسل الكلوريد.
    4. اضغط على NEXT وتحقق من جميع الخطوات على الشاشة لبدء برنامج الغسيل ؛ سينتهي البرنامج في 30 دقيقة. ابدأ الغسيل بالماء بعد غسل الكلوريد.
    5. غسل المياه: ضع علامة على أنبوبين محددين للمياه باستخدام C1 و C2 ، واغسل الأنابيب بماء 18 MΩ مرتين. أضف 100 مل من الماء 18 MΩ إلى كل أنبوب من أنابيب غسيل المياه ، واضبطها في مواضع C1 و C2 ، على التوالي.
    6. اختر برنامج CLEAN ، وقم بتثبيت الشريحة المعدة للغسيل بالماء ، واضغط على NEXT ، ثم تحقق من جميع الخطوات التي تظهر على الشاشة لبدء برنامج الغسيل.
  4. التهيئه
    1. نظف زجاجة الغسيل بمحلول الغسيل II ، وقم بوضع علامة W2 عليها ، واغسلها ثلاث مرات بماء 18 MΩ.
    2. نظف أنبوب النيتروجين بورق وضع في الهواء ، وأدخله في قاع الأنبوب ، واضبط تدفق الهواء إلى 0.5 لتر / دقيقة. تفريغ الأكسجين في الزجاجة وملء الزجاجة مع 1920 مل من الماء 18 MΩ. أضف محلول التسلسل II و 10 ميكرولتر من 1 M NaOH إلى الزجاجة ، وأغلق الغطاء ، وعكس الزجاجة عدة مرات لخلط المحلول.
    3. ضع علامة على أنبوبين جديدين ك W1 و W3. أضف 32 ميكرولتر من 1 M NaOH إلى W1 ، وأضف 40-50 مل من حل تسلسل 1x III إلى W3 ، وأغلق القبعات.
      ملاحظة: يجب أن يكون محلول تسلسل 1x III في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند استخدامه لأول مرة. يجب حماية حل التسلسل II من الضوء وتخزينه في RT. يجب استبدال زجاجة الغسيل بأخرى جديدة بعد استخدامها 20 مرة.
    4. اضغط على تهيئة على الشاشة الرئيسية ، وقم بتغيير الرشفة على مواضع W1 و W2 و W3 ، واضبط الأنابيب على موضعها وفقا لذلك ، وأغلقها بإحكام عن طريق الدوران. قم بتثبيت شريحة للتهيئة وتحقق من معلمات حالة الجهاز.
    5. اضغط NEXT لبدء تشغيل برنامج التهيئة; يستغرق 40 دقيقة في القسم الأول.
      ملاحظة: يجب تغيير القفازات قبل تغيير الرشفة الجديدة لتجنب تلويث جسم الرشفة. بمجرد استخدامها لغسل المياه والتهيئة ، يمكن تطبيق الرقائق على التهيئة ، ولكن لا تستخدم الرقائق المستخدمة في رقائق غسيل الكلوريد للتهيئة.
    6. قم بإذابة dGTP و dCTP و dATP و dTTP على الجليد ، ودوامة للخلط. ضع علامة على أربعة أنابيب جديدة ك G و C و A و T ، وماصة 70 ميكرولتر من المحلول وفقا لعلامة الأنبوب.
  5. إعداد مكتبة للتشغيل.
    1. ضع قالب مراقبة الجودة والاشعال ومحلول الإنزيم على الجليد.
    2. قم بإعداد مكتبة الحمض النووي عندما يكون برنامج التهيئة على بعد حوالي 20 دقيقة. دوامة قالب مراقبة الجودة لمدة 30 ثانية لمزج، ولفترة وجيزة الطرد المركزي لمدة 2 ثانية. انقل 5 ميكرولتر من قالب مراقبة الجودة إلى حل القالب ، دوامة لمدة 5 ثوان ، وطرد مركزي للأنبوب لمدة 15500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة supernatant عن طريق السحب بعناية ، وتجنب لمس الكريات ، واترك حجم 10 ميكرولتر في الأنبوب.
    3. أضف 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت التلدين في الأنبوب ؛ الحجم الكلي للمحلول هو 25 ميكرولتر.
    4. دوامة تسلسل الاشعال عندما يذوب تماما على الجليد وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 2 ثانية. انقل 20 ميكرولتر من الاشعال المتتابعة إلى الأنبوب من الخطوة السابقة ، دوامة لمدة 5 ثوان ، جهاز طرد مركزي قصير لمدة 2 ثانية ، ثم تخزينها في RT قبل الاستخدام.
  6. تحميل العينة وتسلسلها
    1. ماصة 55 ميكرولتر من محلول العينة المحضر في الخطوة السابقة وحقنها في ثقب العينة للرقاقة.
    2. تعيين الشريحة على جهاز الطرد المركزي. حافظ على الشق نحو الخارج وبوابة العينة في الداخل ، وقم بموازنته مع شريحة أخرى مستعملة ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق.
    3. إعداد حل التحميل.
      1. امزج 0.5 مل من المخزن المؤقت الملدن و 0.5 مل من الماء الخالي من النوكليز في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. ضع علامة عليه كمخزن مؤقت للتلدين بنسبة 50٪ واستخدمه في غضون 7 أيام.
      2. امزج 0.5 مل من محلول الأيزوبروبانول و 0.5 مل من المخزن المؤقت للتلدين. ضع علامة عليه كمخزن مؤقت للغسيل بنسبة 50٪ واستخدمه في غضون 24 ساعة.
      3. امزج 6 ميكرولتر من إنزيم التسلسل و 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت التلدين بنسبة 50٪. ضع علامة عليه كمخزن مؤقت لتفاعل الإنزيم ، وضع المحلول على الجليد بعد التحضير.
      4. امزج 49 ميكرولتر من 50٪ من المخزن المؤقت للتلدين و 1 ميكرولتر من عامل الرغوة ، ووضع علامة عليه كمحلول رغوي.
    4. نفخ 100 ميكرولتر من الهواء في محلول الرغوة ، وقم بماصة المحلول بشكل متكرر حتى تصبح الفقاعات في حالة رغوة كثيفة ، وحافظ على حجم الرغوة حوالي 250 ميكرولتر.
    5. ضع الشريحة على المقعد بعد جهاز الطرد المركزي ، وحقن 100 ميكرولتر من الرغوة في ثقب العينة ، وقم بإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية. اضبط الشريحة مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية.
    6. كرر الخطوات 5.6.4-5.6.5.
    7. حقن 100 ميكرولتر من 50٪ غسل المخزن المؤقت مرتين، وإزالة المحلول المبثوق في بوابة الخروج بعد كل حقن.
    8. حقن 100 ميكرولتر من 50٪ من المخزن المؤقت التلدين ثلاث مرات ، وإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية بعد كل حقنة.
    9. حقن 65 ميكرولتر من 50٪ من المخزن المؤقت لتفاعل الإنزيم ، وتجنب الفقاعات ، وإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية.
    10. قم بتثبيت الشريحة المحملة في RT لمدة 5 دقائق، وقم بتثبيت الشريحة على بوابة رقاقة التسلسل. اختر الخطة المبرمجة في الخطوة 6 ، وتحقق من المعلومات ، وابدأ التشغيل ؛ يستغرق حوالي 1.5 ساعة للإنهاء.
    11. قم بتنفيذ برنامج غسل المياه في غضون 72 ساعة بعد انتهاء التشغيل. قم بإجراء غسل الكلوريد قبل غسل الماء عندما يتجاوز الوقت 72 ساعة. أغلق جهاز التسلسل ، وأغلق صمام النيتروجين.

6. خطط لتشغيل تسلسل التعليمات في نظام خادم المراسل16

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات الواردة في هذا القسم على Ion Proton Sequencer باستخدام نظام خادم المراسل.

  1. قم بتسجيل الدخول إلى نظام الخادم ، وحدد علامة التبويب خطة ، وانقر فوق خطة تشغيل القالب. اختر الجينوم الكامل كنوع تشغيل، وحدد القالب المناسب من قائمة قوالب التشغيل المخططة.
  2. في علامة التبويب خطة ، أدخل التحديدات التالية أو قم بها:
    1. أدخل اسم خطة تشغيل جديد وفقا لمجموعة العينات، وحدد hg19 (Homo sapiens) من القائمة المنسدلة المكتبة المرجعية، وحدد لا شيء من القوائم المنسدلة المناطق المستهدفة ومناطق النقاط الساخنة.
    2. أدخل عدد الرموز الشريطية المستخدمة في مجموعة النماذج، وحدد رمزا شريطيا من القائمة المنسدلة لكل عينة، وأدخل اسما وصفيا فريدا، والذي يمكن أن يكون مفيدا في تجميع العينة وتعقبها. تجنب استخدام النموذج 1 الافتراضي وما إلى ذلك.
    3. حدد لا شيء في علامة التبويب Ion Reporter ، وانقر فوق التالي ، وحدد الحمض النووي في التطبيق والجينوم الكامل كتقنية مستهدفة.
    4. في علامة التبويب مجموعات، تحقق من التحديدات، أو قم بإجراء تغييرات عندما يكون مناسبا للتشغيل.
      1. حدد مجموعة مكتبة Ion Plus Fragment من القائمة المنسدلة نوع مجموعة أدوات المكتبة. حدد مجموعة Ion PI HI-Q OT2 200 في القائمة المنسدلة مجموعة القوالب ، واختر OneTouch كإعداد افتراضي. حدد مجموعة تسلسل Ion PI HI-Q 200 من القائمة المنسدلة مجموعة أدوات التسلسل .
      2. أدخل 300 تدفق، وحدد شريحة Ion PITM من القائمة المنسدلة نوع الشريحة ، وحدد IonXpress من القائمة المنسدلة مجموعة الباركود .
      3. قم بإلغاء تحديد وضع علامة كقراءات مكررة وتحديد تمكين إعادة المحاذاة.
    5. اختر المكون الإضافي المناسب في علامة التبويب المكونات الإضافية لإجراء تحليل البيانات في الخطوة 7. أكمل التحديدات في خطوة المشاريع ، وانقر فوق التالي ، وانقر فوق تشغيل الخطة في الزاوية اليمنى السفلى لإدراج عمليات التشغيل المخططة.
    6. في علامة التبويب عمليات التشغيل المخططة ، حدد التشغيل الذي تم إنشاؤه حديثا وتحقق من جميع الإعدادات في نافذة المراجعة.

7. تحليل البيانات

  1. تحليل متغيرات رقم النسخ (CNVs) باستخدام سير عمل المعلوماتية الحيوية.
    ملاحظة: تم تحليل CNVs في سير عمل المعلوماتية الحيوية مع تنفيذ خوارزمية تستند إلى نموذج ماركوف المخفي (HMM)17 ؛ يستخدم النموذج تغطية القراءة عبر الجينوم للتنبؤ برقم النسخة أو حالة ploidy بالعدد الكامل (أي 0 و 1 و 2 و 3 وما إلى ذلك). تم بناء خط أنابيب المعلوماتية الحيوية الشامل في المكون الإضافي لنظام خادم التسلسل ، والذي هو موضح في الشكل 2. تستغرق خطوة تحليل المعلوماتية الحيوية ما معدله 4 ساعات لإكمالها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مع انتهاء خطة التسلسلات بعد عملية التشغيل في الجهاز، يقوم نظام خادم التسلسل بالإبلاغ عن الملخص مع المعلومات الوصفية للبيانات التي تم إنشاؤها، وحالة الشريحة، ومعدل تحميل مزود خدمة الإنترنت، وجودة المكتبة، كما هو موضح في الشكل 2. في هذا العرض التوضيحي للنتائج ، تم الحصول على بيانات 17.6 G في القاعدة الإجمالية ، وكان معدل التحميل الإجمالي لمزود خدمة الإنترنت 88٪ في إجمالي آبار الرقاقة ؛ أظهرت الخريطة الحرارية أن العينة تم تحميلها بالتساوي على المساحة الإجمالية للشريحة (الشكل 2A). وفي الجولة التمثيلية، تم الحصول على 99,761,079 قراءة إجمالية، 77٪ منها قابلة للاستخدام؛ في جميع الآبار المحملة بمزود خدمة الإنترنت ، كان لدى 100٪ قوالب غنية ، حيث كانت 78٪ نسلية. من بين جميع القوالب النسيلة ، تم تأهيل 97٪ كمكتبة نهائية (الشكل 2B). وكان متوسط طول القراءة 117 نقطة أساس و176 نقطة أساس و174 نقطة أساس مع المتوسط والوسيط والوضع على التوالي (الشكل 2C). كانت أعداد الذروة من T و C و A في تكييف القوالب ~ 76 ، وهو ما يزيد عن خط القطع المؤهل البالغ 50 (الشكل 2D). في جميع الآبار القابلة للعنونة مع مزودي خدمات الإنترنت المباشرين ، تم تأهيل 99.5٪ كمكتبة تم بناؤها ، وتم تصفية مكتبة متعددة النسيلة ومنخفضة الجودة بنسبة 20٪. وكان 76.6٪ من مقدمي خدمات الإنترنت مؤهلين لمزيد من التحليل (الشكل 2 هاء).

يوضح الشكل 3 نتيجة متغيرات عدد النسخ من عينة واحدة S19030109-3 ؛ يتم تطبيع خط الشرطة الأسود كمقطع euploidy عبر 22 autosomes والكروموسومات الجنسية ، ويتم تطبيع الخط الأحمر كمنطقة كروموسوم اختلال الصيغة الصبغية التي تمثل 182.16 Mb الفسيفساء التثلث الصبغي من p16.3-q35.2 على الكروموسوم 4 ، و 33.13 Mb أحادي الصبغي من q11.1-q13.33 على الكروموسوم 22.

وترد في الجدول 4 والجدول 5 على التوالي تقارير تمثيلية ل 12 عينة باستخدام مجموعات WGA و 13 عينة بطريقة خطوة واحدة باستخدام كواشف WGA المطورة بشكل مستقل ، والتي تتضمن معلومات موجزة عن معرف الباركود ، واسم العينة ، وعدد القراءات الفريدة ، ومحاذاة القراءات متوسط الطول ، ومتوسط العمق ، والنسبة المئوية لمحتوى GC ، وعلامة المتغيرات الكروموسومية. أظهرت متغيرات الكروموسوم الكروموسوم الكروموسوم ، وموقع وحجم الازدواجية ، والحذف على الكروموسومات.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لموضع تحميل العينة على شريط 8 آبار. يشار إلى كل بئر مع محتويات التحميل على التوالي. U لتقف علي عينة غير مخصب ، B لتقف على الخرز ، و W لتقف على حل الغسيل. ويلاحظ أيضا الآبار الفارغة في الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ملخص التشغيل: حجم البيانات وتحميل مزود خدمة الإنترنت ومقاييس جودة المكتبة. (أ) الحالة العامة ، بما في ذلك القواعد الإجمالية وإشارة المفتاح ومعدل تحميل مزود خدمة الإنترنت مع خريطة حرارية. (ب) إجمالي القراءات ومعدل القراءات القابل للاستخدام وملخص معلومات مزود خدمة الإنترنت في كل خطوة من خطوات التفاعل. (ج) الرسم البياني لطول القراءة. (د) مفتاح توافق الآراء 1-Mer من TCA. (ه) الآبار القابلة للعنونة والحالة النسيلية ل IPS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على مخطط متغيرات عدد النسخ المرئية: S19030109-3. يتم تصور إشارات رقم النسخ (CN) في مؤامرة ذات فواصل زمنية زرقاء وخضراء للكروموسومات بجانب بعضها البعض. يوضح المثال المعطى زيادة ملاحظة CN في الكروموسوم 4 وانخفاض ملاحظة CN في الكروموسوم 22 ، حيث أن متوسط خط CNV الملحوظ في السقوط الأحمر يعوض عن 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لا. عدد الدورات درجة الحرارة الوقت
1 دورة 95 درجة مئوية 2 دقيقة
12 دورة 95 درجة مئوية 15 ثانية
15 درجة مئوية 50 ثانية
25 درجة مئوية 40 ثانية
35 درجة مئوية 30 ثانية
65 درجة مئوية 40 ثانية
75 درجة مئوية 40 ثانية
1 دورة 4 درجات مئوية مسك

الجدول 1: برنامج الدورة الحرارية للتضخيم المسبق. يتم عرض ظروف التفاعل الحراري مثل درجة الحرارة والوقت والدورات.

درج درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات
1 95 درجة مئوية 2 دقيقة 1
2 95 درجة مئوية 15 ثانية 14
65 درجة مئوية 1 دقيقة
75 درجة مئوية 1 دقيقة
3 4 درجات مئوية مسك 1

الجدول 2: برنامج الدورة الحرارية لتضخيم الجينوم الكامل باستخدام مجموعات تضخيم الجينوم الكاملة. يتم عرض ظروف التفاعل الحراري مثل درجة الحرارة والوقت والدورات.

درج درجة الحرارة (°C) الوقت لا. عدد الدورات
1 95 درجة مئوية 2 دقيقة 30 ثانية 1
2 95 درجة مئوية 30 ثانية 6
25 درجة مئوية 2 دقيقة
0.3 درجة مئوية / ثانية إلى 72 درجة مئوية ——
72 درجة مئوية 1 دقيقة 30 ثانية
3 95 درجة مئوية 30 ثانية 20
62 درجة مئوية 30 ثانية
72 درجة مئوية 1 دقيقة
4 72 درجة مئوية 2 دقيقة 1
5 4 درجات مئوية مسك 1

الجدول 3: برنامج الدورة الحرارية لتضخيم الجينوم الكامل باستخدام الكواشف المطورة بشكل مستقل. يتم عرض ظروف التفاعل الحراري مثل درجة الحرارة والوقت والدورات.

اسم العينة عدد القراءات الفريدة قراءات محاذاة متوسط الطول متوسط العمق CG٪ اس دي مارك
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 إكس واي
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 إكس واي
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 إكس واي
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 إكس واي
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 عشرون
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 عشرون
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 إكس واي

الجدول 4: مثال على مخرجات تباين عدد النسخ باستخدام مجموعات تضخيم الجينوم الكاملة في تقرير نظام الخادم. تتضمن ورقة الإخراج النموذجية معلمات مثل اسم العينة ، وعدد القراءات الفريدة ، والقراءات المحاذاة ، ومتوسط الطول ، ومتوسط العمق ، والنسبة المئوية CG ، والانحراف المعياري للطول ، وبالنسبة لمعظم الناس ، علامة حالة الكروموسوم مع الكروموسوم الجنسي الموسومة ب XY وتفاصيل CNV المبرمة. يتم تمييز CNV المكتشف بموقع الكروموسوم وحجم الشظية.

اسم العينة عدد القراءات الفريدة قراءات محاذاة متوسط الطول متوسط العمق GC٪ اس دي مارك
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 إكس واي
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 عشرون
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 عشرون
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 إكس واي
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 عشرون
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 إكس واي
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 عشرون
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 إكس واي

الجدول 5: مثال على مخرجات تباين عدد النسخ بطريقة خطوة واحدة باستخدام كواشف تضخيم الجينوم الكاملة المطورة بشكل مستقل في تقرير نظام الخادم. تتضمن ورقة الإخراج النموذجية معلمات مثل اسم العينة ، وعدد القراءات الفريدة ، والقراءات المحاذاة ، ومتوسط الطول ، ومتوسط العمق ، والنسبة المئوية CG ، والانحراف المعياري للطول ، وبالنسبة لمعظم الناس ، علامة حالة الكروموسوم مع الكروموسوم الجنسي الموسومة ب XY وتفاصيل CNV المبرمة. يتم تمييز CNV المكتشف بموقع الكروموسوم وحجم الشظية.

الملف التكميلي 1: الحجم الموصى به لكل مكون عند إعداد مزيج رئيسي من أحجام الدفعات المختلفة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اختلال الصيغة الصبغية للكروموسومات للأجنة هو سبب نسبة كبيرة من فقدان الحمل ، سواء تم تصوره بشكل طبيعي أو في المختبر الإخصاب (IVF). في الممارسة السريرية للتلقيح الاصطناعي ، يقترح أن فحص اختلال الصيغة الصبغية للجنين ونقل جنين euploidy يمكن أن يحسن نتائج التلقيح الاصطناعي. التهجين الفلوري في الموقع هو أول تقنية معتمدة لاختيار الجنس و PGT-A. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية المزيد من الخبرة التقنية من موظفي المختبر وهي كثيفة العمالة نسبيا. الدراسات المتزايدة ل PGT-A باستخدام التهجين الفلوري في الموقع لا تظهر أي تحسن في معدلات المواليد الأحياء17,18.

ومع ذلك، فقد أحرز تقدم سريع في التكنولوجيات لتقييم تحليل عدد النسخ في الاختبارات الجينية السابقة للزرع؛ طرق مختلفة لها إيجابيات وسلبيات. أظهرت التقنيات الجزيئية الشاملة التي تم تطويرها حديثا مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري الكمي ، وصفيف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) ، والتهجين الجينومي المقارن للمصفوفة (aCGH) ، وتسلسل الجيل التالي ، وعدا في تحسين نتائج التلقيح الاصطناعي7. من بين هذه ، تتمتع NGS باتساق عال مع التهجين الجينومي المقارن بالصفائف على الرغم من قابليتها للتوسع ، وإنتاجية أعلى ، وأتمتة أسهل ، والمزيد من الإمكانات لخفض التكلفة19،20،21.

بالاقتران مع تقنيات WGA ، يمكن أن يوفر تحليل NGS لخزعة الجنين معلومات تسلسل أكثر دقة ، ولديه أيضا امتداد قابل للتطبيق لمزيد من الأهداف من مستوى النيوكليوتيدات المفردة. مع التطبيق المتزايد لتسلسل الجيل التالي في الكشف عن الشذوذ الجيني ، هناك حاجة ملحة لبناء معايير لعملية العينات / البيانات في كل من المختبر والممارسة السريرية 22،23،24.

في المسار من الفصل إلى تحديد اختلال الصيغة الصبغية لعملية PGT-A ، تشمل الخطوات الرئيسية الفصل ، واختيار طريقة تضخيم الجينوم بالكامل ، واختيار منصة تسلسل الجيل التالي ، وتحليل بيانات التسلسل. عملية تضخيم الجينوم بأكملها هي الخطوة الأكثر أهمية في PGT-A ، والتي تحدد سلامة وتوحيد بيانات التسلسل. تمت مقارنة ثلاث استراتيجيات كاملة لتضخيم الجينوم في دراسة سابقة ، وثبت أن طريقة التمهيدي شبه العشوائية picoPLEX تؤدي تقريبا وكذلك طرق تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA) من حيث سلامة وتوحيد بيانات التسلسل25. نظرا لأن الممارسة السريرية تركز على اختلافات عدد النسخ (CNVs) بدقة ~ 10 ميجابت في الثانية بدلا من اختلاف النيوكليوتيدات المفردة في PGT-A ، فقد تم اختيار مجموعة picoPLEX WGA وكواشف WGA المطورة بشكل مستقل بسبب المخاوف الاقتصادية. في مرحلة التضخيم ، يتطلب الأخير خطوة واحدة فقط لإكمال تضخيم الجينوم بأكمله ، دون الحاجة إلى التضخيم المسبق.

هناك منصتان تجاريتان رئيسيتان في السوق يتم استخدامهما حاليا ل PGT: MiSeq من Illumina26 و Ion Proton من Thermo-Fisher Scientific27. يمكن لكل من Miseq و Proton تحديد اختلال الصيغة الصبغية للكروموسوم بالكامل ، ولكن Miseq مصمم فقط لتحديد اختلال الصيغة الصبغية للكروموسوم بأكمله ، في حين يمكن للبروتون أيضا تحديد عمليات الحذف الكبيرة (dels) أو الازدواجية (dups) ، بما في ذلك dels أو dups ذات الأهمية السريرية وصولا إلى دقة تبلغ حوالي 800 كيلو بايت إلى 1 ميجا بايت28. تتمتع منصة بروتون بمزايا التكلفة والدعم الفني المحلي القوي. لهذه الأسباب ، تم اختيار منصة بروتون للممارسة السريرية اللاحقة.

تحليل المعلوماتية الحيوية لبيانات تسلسل الجيل التالي معقد وصعب للأطباء في التطبيقات السريرية. مع زيادة البيانات في الأرشيف العام للمتغيرات الجينية البشرية والتفسيرات مثل Clinvar29 و 1000 genome 30 و Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) 31 ، تم تطوير المزيد من تطبيقات برامج التعليقات التوضيحية CNV وهي متاحة للاستخدام العام والخاص32,33. هنا ، تم تطبيق نظام معلومات مصمم محليا ، Darui-LIMS ، لمساعدة موظفي المختبر والأطباء السريريين على إكمال تحليل بيانات CNV بنقرة واحدة في الممارسة السريرية ل PGT-A34.

تم تصميم أساليبنا خصيصا ل PGT-A ولديها توازن جيد بين الدقة والدقة والتكلفة. ويمكن للإجراءات الموحدة في تجهيز المواد الجينية والمعلوماتية الحيوية أن تنتج بيانات متسقة للتحليل السريري. مع التقدم الجديد في التقنيات القائمة على نظام NGS ، يمكن اختبار تشوهات هيكلية كروموسومية إضافية مثل النقل وتشخيصها للتضخيم السريري في دورة PGT35,36. بالنسبة لهذه الاختبارات ، يجب تطوير طرق أكثر تخصصا وتطبيقها. ومع ذلك، وكمواصفات لتوجيه الممارسة السريرية ل PGT-A، ستكون هذه الأساليب مفيدة لموظفي المختبر والأطباء السريريين في الممارسة المختبرية ل PGT-A على منصة تسلسل الجيل التالي من DA8600.

ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود معينة. في البروتوكول ، الحد الأقصى لعدد العينات التي يمكن أن يدعمها الرف المغناطيسي هو 16 ؛ بالطبع ، اعتمادا على العدد الفعلي للعينات السريرية ، يمكن للمرء أيضا اختيار رف مغناطيسي لدعم المزيد من العينات في وقت واحد أو زيادة عدد الرف المغناطيسي لإجراء المزيد من عمليات العينات. ومع ذلك ، قد يزيد هذا من خطر حدوث أخطاء تشغيلية. لذلك ، يوصى باستخدام مجموعات تجارية تعتمد على تسلسل أشباه الموصلات عند العمل على دفعات من 32 عينة أو أكبر ، مثل مجموعات Ion ReproSeq PGS من Thermo-Fisher Scientific.

وفقا للمبادئ التوجيهية للتقييم الفني لتكنولوجيا مراقبة الجودة لكواشف الكشف عن الكروموسومات قبل الزرع (تسلسل الإنتاجية العالية) الصادرة عن المعاهد الوطنية الصينية لمراقبة الأغذية والأدوية ، فإن متطلبات حجم البيانات الصحيحة لعينة واحدة لا تقل عن 1 متر. هناك 60-80 مليون قراءة لكل شريحة وفقا لنظرة عامة على منتج Ion PI ، واستنادا إلى التجربة التجريبية ، فإن أرقام القراءات الفريدة الصالحة لا تقل عن 50٪ من البيانات الأصلية. بعد الحساب ، لا يقل حجم البيانات الفعال لكل عينة تجريبية عن 2 M. لذلك ، لضمان دقة النتائج التجريبية ، نوصي بسعة قصوى تبلغ 16 عينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتور تشانغيونغ مينغ والسيد رونغجي هو على مشورتهما بشأن تطبيق LIMS الموسع. يتم دعم هذه الدراسة من قبل مشاريع البحوث الخاصة PLA لتنظيم الأسرة (17JS008 ، 20JSZ08) ، وصندوق مختبر قوانغشي الرئيسي لأبحاث أمراض التمثيل الغذائي (رقم 20-065-76) ، ومشروع أبحاث العلوم والتكنولوجيا الصحية المواطن في قوانغتشو (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Tags

علم الوراثة ، العدد 186 ،
الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter