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Genetics

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。

Abstract

次世代シーケンシングは、遺伝的バリアントの決定における臨床応用においてますます重要性を増しています。移植前の遺伝子検査では、この技術にはスケーラビリティ、スループット、およびコストの点で独自の利点があります。異数性解析のための移植前遺伝子検査では、ここで紹介する半導体ベースの次世代シーケンシング(NGS)システムは、8Mbの最小分解能で構造的遺伝的バリアントを決定するための包括的なアプローチを提供します。サンプルの取得から最終レポートまで、作業プロセスにはプロトコルに厳密に準拠した複数のステップが必要です。さまざまな重要なステップが増幅の結果、ライブラリの品質、読み取りのカバレッジ、およびデータの出力を決定することができるため、言葉以外の視覚的なデモンストレーションを伴う説明情報は、操作と操作の詳細を提供する可能性があり、すべての重要なステップの結果に大きな影響を与える可能性があります。本明細書に提示される方法は、生検されたTrophectoderm(TE)細胞の全ゲノム増幅(WGA)、ゲノムライブラリー構築、シークエンサー管理、そして最後にコピー数バリアントのレポートの生成に関与する手順を示す。

Introduction

異数性は、1つ以上の余分な染色体の存在または1つ以上の染色体の不在による染色体数の異常である。1つのX染色体の喪失(ターナー症候群)、常染色体21(ダウン症候群)、13(パタウ症候群)、および18(エドワーズ症候群)のトリソミーのような常染色体の余分なコピー、または47、XXX(クラインフェルター症候群)および47、XXX(トリプルX症候群)などの余分な性染色体のようなある種の異数性を有する胚は、先天性欠損症1の期間まで生き残ることができる。異数性は、第1期流産および 体外 受精(IVF)障害の主な原因である2。異数性率は、体外受精の実践3における自然サイクルおよび薬用対照群の異なる年齢層を通じて、25.4%〜84.5%の範囲であり得ることが報告されている。

次世代シーケンシング技術は、遺伝情報の決定に臨床的に広く応用されつつあります。それは効率および高いスループットでゲノム配列への実用的なアクセスを提供する。特に、次世代シーケンシングは、遺伝的要因による疾患の診断やゲノムの異常性の検査にも革命をもたらしました4。半導体シーケンシング技術を使用して、シーケンシングバイオ反応の化学信号をデジタルデータに直接転送する半導体ベースのシーケンスシステムは、3-7時間5,6でシーケンスデータに直接、リアルタイム検出を提供します。

体外受精手順では、着床前遺伝子検査(PGT)は、体外受精の結果を改善し、新生児の遺伝性疾患のリスクを軽減するために、子宮に移される前に胚の遺伝子プロファイルを調査します1,7。PGTとNGS技術を組み合わせることで、10細胞未満から抽出した遺伝物質を全ゲノム増幅キットまたは独自開発の全ゲノム増幅試薬で増幅します。これは、増幅段階で1つのステップのみを必要とし、全ゲノム増幅産物を得るために、事前増幅を必要としない。コピー数変異体および特別な遺伝子座配列決定のためのプライマーまたはパネルは、構築されたライブラリーにおいて設計および適用される。

NGSにおける着床前遺伝子検査異数性検査(PGT-A)の典型的なワークフローは、逐次的な手順を伴い、実験室職員の激しい作業負荷を必要とする8。一部の誤操作により、手順のロールバックが発生し、ラボの時間とリソースの両方が望ましくない損失につながる可能性があります。PGS-NGS ワークフローの簡潔で明確な標準操作手順 (SOP) が役立ちます。ただし、ワード形式のプロトコルでは、サンプル処理、デバイス操作、および計測器の設定に関するより詳細な情報を提示できず、ビデオプロトコルで視覚化できます。この記事では、検証済みのワークフローと動作の詳細の視覚化されたデモンストレーションを組み合わせることで、半導体シーケンシングプラットフォームでのPGTプラクティスにおいて、より直接的で直感的な参照プロトコルを提供できます。

ここでのプロトコルは、最大16回の胚生検を並行してバッチ処理することをサポートする方法を説明しています。より大きなバッチの場合は、Reproes-PGSなどの半導体シーケンシングに商用キットベースのプロトコルを使用することをお勧めします。

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Protocol

本試験に適用されたすべてのプロトコールおよび対流胚葉(TE)生検(1.1.1.1項)は、2017年9月18日に第924号病院のヒト研究倫理委員会によって審査および承認された(NO:PLA924-2017-59)。患者/参加者は、この研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. ヒト胚生検および全ゲノム増幅からのDNA単離

  1. 全ゲノム増幅のためのプロトコル 9,10
    注:ピコプレックスWGAキットは、全ゲノム増幅を実行するために使用されます。
    1. サンプルの収集と保管
      1. 対流胚葉生検:孵化支援後のD5/6胚のヘルニアTE から平均 6 ~ 9 個の細胞を採取し、次の増幅に適した量の DNA を取得します。
      2. サンプル細胞を 5 μL の PBS 中の PCR チューブに移します。
      3. プロトコルがDNA抽出に直接進まない場合は、直ちに-80°Cでサンプルを凍結します。
    2. 細胞溶解
      注:補足ファイル1は、細胞溶解および1、8、16、および32サンプルのバッチの全ゲノム増幅中にマスターミックスを調製する際に、各成分の推奨量をリストし、参照として役立ちます(ピペッティングエラーに対応するために超過分あり)。このプロトコルの他のマスターミックスを調合する場合、各成分の体積は、繰り返しピペッティングによって引き起こされる成分消費に対応するためにさらに増加する。すべての短時間の遠心分離は、卓上ミニ遠心分離機で室温(RT)で2〜10秒間、5,300 x gの遠心力で10,000の固定RPMで行われます。遠心力は 2,000 x g から 12,000 x g の間でなければなりません。
      1. サンプルあたり4.8 μLの抽出酵素希釈バッファーと0.2 μLの細胞抽出酵素で細胞溶解ミックスを調製します。
      2. 新しく調製した細胞溶解のピペット5 μLをPCRチューブ内の各5 μL細胞サンプルに混合し、チューブをRTで5秒間短時間遠心分離した。チューブを渦巻きにしないでください。
      3. 以下のようにサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートする:75°C、10分間;95°C、4分;25°C、14分。インキュベーション後のチューブを短時間遠心分離(5秒)する。
    3. 全ゲノムDNAの事前増幅
      1. サンプルあたり 4.8 μL のプリアンプバッファーと 0.2 μL のプリアンプ酵素を含むプレアンプミックスを調製します。
      2. 予備増幅ミックスのピペット5 μLをチューブの壁を通してサンプルチューブに入れ、3秒間短時間遠心分離した。先端がチューブの底に達するのを避け、チューブを渦巻き込まないでください。
      3. 表1に記載したサーマルサイクラープログラムに従ってサンプルをインキュベートする。
    4. 全ゲノムDNA増幅
      1. サンプルを5秒間短時間遠心分離し、プリアンプインキュベーション製品を氷の上に置きます。
      2. サンプルあたり25 μLの増幅バッファー、0.8 μLの増幅酵素、および34.2 μLのヌクレアーゼフリー水で全ゲノム増幅ミックスを調製します。
      3. 新たに調製した全ゲノム増幅ミックス60 μLを15 μLのプレアンプインキュベーション産物と混合する。総容量は75 μLにする必要があります。短時間遠心分離機で5秒間加熱します。先端がチューブの底に達するのを避け、チューブを渦巻き込まないでください。
      4. PCR チューブをサーマルサイクラーの上に置き、 表 2 に記載されているサーマルサイクラープログラムを実行します。
      5. チューブを5秒間短時間遠心分離し、製品を新しい1.5mL遠心分離チューブに移します。
      6. 蛍光光度計11でWGA生成物濃度を定量する。サンプルは、次の手順に進まない場合は、-20°Cで2ヶ月未満時間保存することができます。
  2. 独自に開発されたWGA試薬のプロトコール。
    1. サンプルの収集と保管
      1. 次の増幅のために孵化支援後のD5/6胚から細胞を引き出す。
      2. 1.5 μL の PBS を含むサンプル細胞を、2 μL の PBS を含む PCR チューブに移します。
        注:PBSはMg2+およびCa2+を含まない。
      3. 直接DNA抽出プロトコールに進まない場合は-80°Cで直ちにサンプルを凍結する。
    2. 細胞溶解
      1. 細胞溶解バッファー (40 mM トリス (pH 8)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM エチレングリコール四酢酸 (EGTA)、1% (v/v) Triton X-100、5 mM ピロリン酸ナトリウム、2 mM β-グリセロリン酸、0.1% SDS) を RT で溶かし、氷の上に置きます。各サンプルに2 μLの細胞溶解バッファーを加え、短時間(5秒)遠心分離した。
        メモ: チューブを渦巻きにせず、ピペットチップがチューブ内の液面に触れないようにして、細胞や DNA を反応系外に持ち出さないでください。
      2. 以下のようにサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートする:55°C、20分;95°C、10分;4°C、保持する。インキュベーション後10秒間、チューブをRTで短時間遠心分離する。
    3. 全ゲノムDNA増幅
      1. 細胞溶解生成物を5秒間短時間遠心分離し、氷の上に置く。
      2. 増幅前混合液16 μL、増幅酵素1 μL、ヌクレアーゼフリー水28 μLと混合して、各サンプルの全ゲノム増幅用混合液を調製した。穏やかに混合し、短時間(5秒)遠心分離機で遠心分離し、混合物を氷の上に置く。チューブを渦巻きにしないでください。
      3. ステップ1.2.2.2で調製した細胞溶解産物に新たに調製した全ゲノム増幅混合物のピペット45 μL;穏やかに混合し、5秒間短時間遠心分離する。
        メモ:チューブを渦巻きにせず、ピペットチップがチューブ内の液体に触れないようにしてください。
      4. PCR チューブをサーマルサイクラーに置き、 表 3 に詳述されているようにプログラムを実行します。
      5. チューブをすぐに5秒間遠心分離し、製品を新しい1.5mL遠心分離チューブに移します。
      6. 蛍光光度計11 でWGA製品濃度を定量し、その結果をQA(品質分析)シートに記録する。適格な濃度の製品は、次のステップに進まなければ、-20°Cで2ヶ月未満で一時的に保存することができます。

2. 増幅断片の選択

注: このセクションで使用される資料は、ライブラリ準備キット(資料表)で入手できます。

  1. 開始前の準備
    1. 磁気ビーズ(n x 100 μL)を平衡化し、RTで30分間精製します。
    2. 以前のWGA製品をRTに復元します。製品をRTで30秒間ボルテックスしてから、短時間遠心分離します。
    3. 新鮮な70%エタノールを用意する。
  2. フラグメント選択手順
    1. WGA製品の25 μLをピペットで切り取り、25 μLのヌクレアーゼフリー水をプリロードした1.5 mL遠沈管に移します。
    2. ボルテックスとDNA精製ビーズをよく混ぜる。それを各サンプルチューブに50 μLずつ入れ(元のサンプル:ビーズ(体積)= 1:1)、ボルテックス、および遠心分離機を短時間(5秒)する。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。
    3. 1.5 mL 遠心チューブをマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。上清を新しい1.5 mL遠沈管に慎重に移します。ビーズをピペッティングしないでください。
    4. 元のサンプル容量に従って、磁気ビーズのピペット30 μL(元のサンプル:ビーズ(容量)= 1:0.6)を、渦、遠心分離機で短時間(5秒)します。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。
    5. 1.5 mL 遠心分離チューブをマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで 5 分間待ちます。上清を慎重に取り除き、廃棄します。ビーズをピペッティングしないでください。
    6. 70%エタノール300 μLを1.5 mL遠沈管にピペットで入れ、180°の角度で管を2回静かに回転させ、ビーズを管壁に沿って移動させて徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    7. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    8. マグネットラックから 1.5 mL 遠心管を取り外し、すぐに (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。
    9. 底部に残っている液体を慎重にピペットで送り出します。チューブを開いたままにして、RTでビーズを3〜5分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    10. 磁気ラックからチューブを取り出し、25-30 μLのDNA溶出バッファーをチューブにピペットで入れ、キャップとボルテックスを閉じます。短時間遠心分離機(5秒)して濁った液体をチューブの底に取得し、チューブをRTで5分間セットした。
    11. チューブを磁気ラックに挿入し直し、すべてのビーズがチューブ側壁に引き寄せられ、上澄み液が透明になるまで待ちます。DNA溶液を新しい1.5 mL遠沈管に慎重に移します。ビーズをピペッティングしないでください。
    12. 断片選択後のDNA濃度を蛍光光度計11で定量し、-20°Cで保存する。 典型的には、選択されたDNA断片の濃度は、1.5〜2.4ng/μLの範囲である。

DNAライブラリーの作製

注: このセクションで使用される資料は、ライブラリ準備キット(資料表)で入手できます。

  1. 修復の終了
    1. 磁気ビーズをRTで30分間平衡化します。
    2. ステップ 2.2.12 でのフラグメント選択の DNA 産物を RT に平衡化します。DNA を含む各バイアルのタグを確認して記録します。
    3. 1.5 mL 遠沈管に 30 μL の DNA 産物、10 μL の末端修復バッファー、0.5 μL の末端修復酵素、および 9.5 μL のヌクレアーゼフリー水を使用して、DNA 末端修復システムを調製します。チューブを30秒間ボルテックスし、RTで短時間(5秒間)遠心分離して、すべての液体をチューブ底部に取得します。
    4. 25°Cで30分間インキュベートし、インキュベーション後のチューブを短時間遠心分離(5s)した。
    5. 磁気ビーズを渦巻きまたはリバースミックスし、75 μLの磁気ビーズを末端修復DNAサンプルを含むチューブに移します(元のサンプル:ビーズ(体積)= 1:1.5)。ピペットまたは穏やかにボルテックスでビーズをよく混合し、短時間遠心分離機(5秒)ですべての懸濁液をチューブの底まで回転させます。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。ビーズを分散させるためにチューブを静かにひっくり返します。
    6. 遠沈管をマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズが側壁に引き寄せられ、上清が透明になるまで5分間待ちます。上清を取り除き、ビーズをピペッティングしないようにして、ピペッティング時にチューブをラックに保持してください。
    7. 新しく調製した70%エタノール300μLをチューブに移し、チューブを180°の角度で2回静かに回転させ、ビーズをチューブ壁に沿って動かして徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    8. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    9. マグネットラックから 1.5 mL 遠沈管を取り外し、短時間 (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで5分間待ちます。
    10. 底部に残っている液体を慎重にピペットで送り出します。1.5 mL 遠沈管のキャップを開け、ビーズを RT で 3 ~ 5 分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    11. 33 μLのDNA溶出バッファーをチューブにピペットで入れ、キャップを閉め、ボルテックスした。短時間遠心分離機(5秒)して濁った懸濁液をチューブの底部に取得し、チューブをRTで5分間セットした。
    12. チューブを磁気ラックに挿入し直し、すべてのビーズが側壁に引き寄せられ、溶液が透明になるまで待ちます。DNA溶液を適切なタグを付けた新しい1.5 mL遠心分離チューブに慎重に移し、ビーズをピペッティングしないようにします。
  2. バーコードライゲーション
    1. ステップ3.2.2のバーコードライゲーション試薬を氷の上に置き、凍結試薬をすべて溶かします。
    2. 1.5 mL の遠沈管に、32 μL の末端修復 DNA 産物、10 μL のヌクレアーゼフリー水、5 μL のリガーゼバッファー、1 μL のリガーゼ、および 1 μL の P1 を適応させてライゲーションシステムを調製します。各バーコード試薬 1 μL を溶液ミックスにピペットで取り出し、チューブ内の溶液ミックスを 1 サンプル、ボルテックスを 5 秒間、短時間 (5 s) 遠心分離してチューブ底部内のすべての液体を取得します。
      メモ: バーコードを追加するときは、バーコードとサンプルの数が対応していることを確認してください。バーコードの混合汚染を避けるために、毎回1つのバーコードバイアルのみを開きます。5 つまたは 6 つのバーコードを追加するごとに手袋を交換します。
    3. チューブを25°Cで30分間インキュベートする。
    4. チューブに磁気ビーズ75 μLのピペット(原試料:ビーズ(容量)=1:1.5)を入れ、ピペットまたは穏やかにボルテックスしてビーズをよく混合した。遠心分離機を短時間(5秒)して、ビーズ凝集を避けて、すべての懸濁液を底まで回転させます。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。ビーズを分散させるためにチューブを静かにひっくり返します。
    5. 遠沈管をマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズが側壁に引き寄せられ、上清が透明になるまで5分間待ちます。上澄み液を取り除き、ビーズをピペッティングしないようにして、ピペッティング時にはチューブをラックに保管してください。
    6. 新しく調製した70%エタノール300μLをチューブに移し、チューブを180°の角度で2回静かに回転させ、ビーズをチューブ壁に沿って移動させて徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    7. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    8. マグネットラックから 1.5 mL 遠沈管を取り外し、短時間 (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで5分間待ちます。底部に残っている上清を慎重にピペットで取り除きます。
    9. チューブキャップを開けたままにして、RTでビーズを3〜5分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    10. チューブ内にDNA溶出バッファーを15 μLのピペットで入れます。ビーズのペレットをチューブの底まですすぎ、キャップを密封し、渦巻きます。短時間(5秒)遠心分離機で濁った懸濁液をチューブの底に着き、チューブをRTで5分間安定させます。
  3. フラグメント増幅
    1. 凍結試薬が溶解したら、図書館の建築試薬を氷の上に置きます。
    2. 溶出したDNAとビーズを含むチューブに酵素ミックス47.5 μLとプライマーミックス2.5 μLを移し、5秒間ボルテックスし、短時間(5 s)遠心分離して、すべての液体をチューブ底部に取得します。
    3. チューブをRTで5分間セットします。チューブを磁気ラックに挿入し直し、すべてのビーズが側壁に引き寄せられ、上澄み液が透明になるまで待ちます。DNA溶液をタグがはっきりとマークされた0.2 mL PCRチューブに慎重に移し、ビーズをピペッティングしないでください。
    4. 次のプログラムで設定されたサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートする:72°C、20分;98°C、2分;98 °C, 15 秒;62 °C, 15 秒;70°C、1分(6サイクル);70°C、5分間反応が終了したらチューブを短時間遠心分離機(5s)し、生成物を4°Cで保存した。
    5. PCR 産物を 1.5 mL 遠沈管に移します (低アタッチメント)。反応終了時に97.5 μL(元のサンプル容量:ビーズ(容量)= 1:1.5)の磁気ビーズをチューブに加え、ピペットまたは穏やかにボルテックスでビーズをよく混合し、短時間遠心分離機(5 s)してすべての液体を底部まで回転させます。ビーズの凝集は避けてください。チューブをRTで5分間セットします。ビーズを分散させるためにチューブを静かにひっくり返します。
    6. 遠沈管をマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズが側壁に引き寄せられ、上清が透明になるまで5分間待ちます。上澄み液を取り除き、ビーズをピペッティングしないようにして、チューブをラックに固定してください。
    7. 新しく調製した70%エタノール300μLをチューブに移し、チューブを180°の角度で2回静かに回転させ、ビーズをチューブ壁に沿って移動させて徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    8. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    9. マグネットラックから 1.5 mL 遠沈管を取り外し、短時間 (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで5分間待ちます。底部に残っている液体を慎重にピペットで送り出します。
    10. チューブキャップを開けたままにして、RTでビーズを3〜5分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    11. 22 μLのDNA溶出バッファーをチューブにピペットで入れ、ビーズのペレットをすすぎ、キャップとボルテックスを閉じます。短時間遠心分離機(5秒)して濁った液体をチューブの底に取得し、チューブをRTで5分間セットした。
    12. 構築したDNAライブラリーの濃度を蛍光光度計11 で定量し、構築したDNAライブラリーを-20°Cで保存する。選択されたDNA断片の濃度は0.6~10 ng/μLの範囲であり、ライブラリ情報をライブラリデータベースに再コードし、それに応じてサンプルを保存します。

シークエンシングテンプレートの作製13,14

注:このセクションで使用される材料は、シーケンシング反応ユニバーサルキット(材料表)のテンプレート調製キットセット(試薬/溶液/材料)で入手できます。

  1. ライブラリミックス
    1. サーバーシステムの事前実行記録シートのフォームに記入し、サンプルチューブにライブラリ濃度とバーコード番号をタグ付けします。1 回の実行で異なるサンプルに同じバーコードを使用することは避けてください。
    2. ボルテックスとライブラリー試料を混合し、短時間遠心分離機(5秒)した。すべてのサンプルをヌクレアーゼフリーの水で100pMに希釈し、30秒間ボルテックスし、サンプルを短時間遠心分離します。
      注: DNA の平均長が 260 bp で、1 bp が 660 g/mol である場合、1 ng/μL = 5,827.5 pM/L の式を使用して、ng/μL から pM への変換を計算します。
    3. 100 pM希釈ライブラリーのピペット10 μLを1.5 mL遠沈管に入れ、30秒間ボルテックスし、2秒間短時間遠心分離した。混合ライブラリを氷の上に保管してください。
  2. テンプレートの準備
    1. テンプレート増幅システムを起動し、クリーンプログラムを選択します。反応油をチューブの1/2に加え、乳化剤破砕液をチューブの1/3に加える。
    2. 増幅プレートと洗浄アダプターが ON の位置に設定されていることを確認します。廃液瓶をきれいにし、新しい50mL遠沈管に針を入れて廃液を回収します。テンプレート増幅システムの画面で処理手順を確認します。 NEXT を押してクリーンプログラムを開始しますが、これには約15分かかります。
    3. クリーンプログラム後に増幅プレートを新しいプレートに交換し、150 μLの破砕液IIを含む収集チューブをローターに挿入し、収集チューブにブリッジを置きます。反応油をチューブの1/2に、乳化剤破砕液をチューブの1/3に加える。
    4. PCR 試薬調製物を乳化する: 乳化 PCR バッファーが溶解するまで RT で平衡化し、すべての試薬を短時間遠心分離 (5 秒) し、使用前に氷の上に置きます。
    5. 乳化 PCR 酵素ミックスのピペット 120 μL、鋳型イオンスフェア粒子 (ISP) バッファー 100 μL、ヌクレアーゼフリー水 170.5 μL、および混合ライブラリー 9.5 μL (100 pM) を、2,000 μL の乳化 PCR バッファーを含むチューブに入れます。繰り返しピペッティングで溶液をよく混合する。
      注:混合溶液は、15分以内にテンプレート増幅システムにロードする必要があります。RTですべての手順を実行します。
    6. テンプレート調製用の新しいフィルターを、サンプルポータルを上向きにしてチューブラックにしっかりと置きます。溶液を5秒間ボルテックスし、短時間遠心分離機(5s)し、800μLを3回繰り返しピペッティングした後に溶液をフィルターのサンプルポータルに移した。チューブを遠心分離して、最後の注入前に気泡を減らします。フィルターに空気を注入しないでください。以下の混合溶液に反応油IIを200μL注入する。
    7. フィルターのサンプルポータルを下向きに回し、洗浄適応をフィルターと交換します。サンプル針をローター蓋の中央の穴に挿入し、針を底に押します。
    8. 画面の RUN ボタンを押し、対応するキットに従ってプログラムを選択し、 ASSISTED を押してすべての手順を確認します。実行が開始されるまで NEXT を押します。完了するまでに約4.5時間かかります。
    9. プログラムが終了したら NEXT を押します。システムは10分間の遠心分離を開始します。遠心分離が止まったら、 蓋を開け るボタンを押して、回収チューブをラックに移動します。手順が15分以内に次のステップに進まない場合は、 Final Spin を押して再遠心分離機にします。
    10. 収集チューブ内の上清を除去し、チューブ内に100μLの溶液を残す。残りのサンプルをピペッティングで混合し、OT(ワンタッチ2システム)と表示された新しい1.5mL遠心チューブにサンプルを移します。
      メモ: 上澄み液をピペッティングするときは、チューブ底面の側面に触れないでください。
    11. それぞれの回収管にヌクレアーゼフリー水100 μLをピペットで入れ、溶液をOT管に移し、ピペッティングを繰り返して洗浄した。OTチューブにヌクレアーゼフリーの水600μLを加えて、全容量を1mLにし、30秒間ボルテックスし、15,500 x g で8分間遠心分離します。
    12. 100 μL残ったOTチューブの上清をやさしく取り除き、先端を使って油層を徹底的に廃棄します。ヌクレアーゼを含まない水 900 μL を加え、ボルテックスを 30 秒間、遠心分離機を 15,500 x g で 8 分間遠心分離します。
    13. 20 μLが残るまで上清を取り除き、テンプレート再懸濁溶液を加えて容量を100 μLにし、30秒間ボルテックスし、2秒間短時間遠心分離します。
      メモ: この手順で得られたソリューションは、12 時間以内に次の手順に進む必要があります。
    14. 電源をシャットダウンする前に、テンプレート増幅システムでクリーンプログラムを実行します。
  3. テンプレートの強化
    1. 280 μL の tween-80 および 40 μL の 1 M NaOH を含むメルトオフミックスを調製します。
    2. C1ビーズを洗う。C1ビーズ溶液を30秒間ボルテックスする。100 μL のビーズを 1.5 mL 遠沈管に移し、チューブを磁気ラックに 2 分間挿入して上清を捨てます。
    3. 1mLのC1ビーズ洗浄液をチューブに移し、30秒間ボルテックスする。短時間(5秒)遠心分離機で、チューブを磁気ラックに2分間挿入し、上清を捨てた。チューブ内にC1ビーズ再懸濁溶液130 μLをピペットで入れ、ピペッティングを繰り返してビーズを混合した。バブルの作成は避けてください。
    4. 図1に示すように、希釈ライブラリーの100 μL、C1ビーズ130 μL、300 μL x 3テンプレート洗浄溶液、および300 μLのメルトオフ溶液を8ウェルストリップに負荷します。
    5. 濃縮モジュールに 8 ウェル ストリップを取り付け、ピペッティングチップをロードし、200 μL 遠沈管を収集位置にセットします。 START を押してプログラムを実行します。所要時間は約35分です。
    6. サンプルは自動的に200μLの遠沈管に集められます。蓋を閉め、15,500 x g で5分間遠心分離します。チューブの底面をチェックして、C1ビーズが残っているかどうかを確認します。
    7. C1ビーズが残っている場合は、テンプレート溶液10xを繰り返しピペットし、チューブを磁気ラックに4分間挿入する。すべての上清を新しい0.2 mL遠沈管に移し、15,500 x g で5分間遠心分離します。
    8. 目に見えるC1ビーズが残っていない場合は、10 μLが残るまで上清を捨て、200 μLのヌクレアーゼフリー水を加え、ピペッティング10xで混合します。15,500 x g で 5 分間遠心分離します。
    9. 10 μL 残った上清を捨て、ヌクレアーゼを含まない水 90 μL を加えて全量 100 μL に達します。ピペットを 10 倍上下にして溶液を混合し、5 秒間ボルテックスし、短時間遠心分離機 (5 s) します。溶液は、2〜8°Cで3日間未満保存することができる。

次世代シーケンシング 9,15

メモ:このセクションのすべての手順は、DA8600シーケンスプラットフォーム上で実行されます。このセクションで使用される材料は、シーケンシング反応ユニバーサルキット(材料表)のシーケンシングキットセット(試薬/溶液/材料)で入手できます。

  1. ランオンシーケンシングプラットフォームに必要なすべての試薬と材料を確認してください。
    1. シーケンシング試薬:-30-10 °Cで保存したシーケンシング酵素溶液(6 μL)、シーケンシングプライマー(20 μL)、品質管理テンプレート(5 μL)、およびdGTP/dCTP/dATP/dTTP(70 μL)の可用性を確認します。
    2. シーケンシング溶液:シークエンシング溶液II(100 mL)、シークエンシングソリューションIII(50 mL)、アニーリングバッファー(1,015 μL)、ローディングバッファー(10 μL)、発泡剤(2 μL)、塩素錠剤(1錠)、およびストレプトアビジンビーズ(100 μL)の利用可能性を確認し、4°Cで保存します。
    3. 材料:RTで保存された250 mL試薬チューブ(8)、250試薬チューブキャップ(8)、シッパーII(8)、シッパー(1)、2 L試薬ボトル(1)、シーケンシングチップ(1)の入手可能性を確認します。
  2. 使用前にチップを洗ってください。
    1. 1 つのチップを作業プレートに安定してセットし、ヌクレアーゼフリーの水 100 μL をサンプル穴に注入し、アウトポータルで溶液を取り出し、手順を繰り返します。
    2. チップに100 μLの0.1 M NaOH溶液を注入し、RTで1分間インキュベートします。
    3. 100 μLのイソプロパノールをサンプルホールに注入し、アウトポータルの余分な溶液を除去して、手順をもう一度繰り返します。
    4. アウトポータルをろ紙で覆い、窒素を流してチップのフローセル内の残りのイソプロパノールを乾燥させ、すぐに使用できるチップをRTに保ちます。
  3. シーケンサーの開始
    1. 窒素バルブのスイッチを入れ、圧力を30psiに調整します。シーケンサーを起動し、メイン画面で CLEAN を押し、水または塩化物を選択してそれに応じて機械を洗浄します。
      注:毎回実行する前に水で洗うか、毎週塩化物で洗うか、機械が48時間以上の試薬で待機している時間。
    2. 塩化物洗浄:塩化物洗浄用に指定された試薬ボトルを1本選択し、18MΩの水でボトルを2回洗浄し、ボトルを1Lの18MΩ水で満たします。塩化物錠剤1錠をボトルに入れ、錠剤を10分間溶解し、1mLの1M NaOHを加え、次いでボトルを逆にして溶液を混合する。調製後3時間以内に塩化物溶液を使用してください。
    3. 塩化物溶液100 mLを0.45 μmフィルターでろ過し、2本のチューブで収集します。2 本の塩化物チューブを位置 C1 および C2 に取り付けます。メイン画面の CLEAN を押し、塩化物洗浄用のチップを装備します。
    4. NEXTを押し、画面上のすべての手順をチェックして、洗浄プログラムを開始します。プログラムは30分で終了します。塩化物洗浄後に水洗を開始する。
    5. 水洗い:水専用のチューブ2本にC1とC2のマークを付け、18MΩの水でチューブを2回洗います。各水洗浄管に18MΩの水100mLを加え、それぞれC1位とC2位にセットします。
    6. CLEANプログラムを選択し、水洗浄用に準備されたチップをインストールし、NEXTを押してから、画面上のすべての手順を確認して洗浄プログラムを開始します。
  4. 初期化
    1. 洗浄液IIで洗浄ボトルを洗浄し、W2としてマークし、18MΩの水で3回洗浄します。
    2. 窒素チューブをエアレイドペーパーで清掃し、チューブ底部に挿入し、エアフローを0.5 L/minに調整します。ボトル内の酸素を排出し、ボトルに1,920mLの18MΩ水を満たします。シーケンス溶液IIおよび10 μLの1 M NaOHをボトルに加え、キャップを閉め、ボトルを数回裏返して溶液を混合する。
    3. 2 つの新しいチューブを W1 と W3 としてマークします。W1 に 32 μL の 1 M NaOH を加え、40 ~ 50 mL の 1x シーケンス溶液 III を W3 に加え、キャップを閉じます。
      注: 1x シーケンス溶液 III は、最初に使用したときに 37 °C のウォーターバスに 30 分間入れる必要があります。シーケンスソリューションIIは、光から保護し、RTで保存する必要があります。洗浄ボトルは、20回使用した後に新しいボトルと交換する必要があります。
    4. メイン画面で INITIALIZE を押し、W1、W2、および W3 の位置のシッパーを変更し、それに応じてチューブをその位置に設定し、回転によってしっかりとシールします。初期化用のチップをインストールし、マシンの状態パラメータを確認します。
    5. NEXT を押して初期化プログラムを開始します。最初のセクションでは40分かかります。
      メモ:シッパーの本体を汚染しないように、新しいシッパーを交換する前に手袋を交換する必要があります。水洗浄と初期化に使用されると、チップは初期化に適用できますが、初期化に塩化物洗浄チップに使用されるチップは使用しないでください。
    6. 氷上でdGTP、dCTP、dATP、dTTPを溶解し、渦を混ぜ合わせます。4つの新しいチューブをG、C、A、およびTとしてマークし、チューブのタグに従って溶液のピペット70μLをピペットで留めます。
  5. 実行するためのライブラリを準備します。
    1. 品質管理テンプレート、プライマー、酵素溶液を氷の上に置きます。
    2. 初期化プログラムの残り時間が約 20 分になったら、DNA ライブラリを準備します。品質管理テンプレートを30秒間ボルテックスして混合し、2秒間短時間遠心分離します。5 μL の品質管理テンプレートをテンプレート溶液に移し、5 秒間ボルテックスし、チューブを 15,500 x g で 5 分間遠心分離します。慎重にピペッティングして上清を取り除き、ペレットに触れないようにし、チューブ内に10μLの容量を残します。
    3. 15 μLのアニーリングバッファーをチューブに加えます。溶液の全容量は25μLである。
    4. 配列プライマーが氷上で完全に溶解したらボルテックスし、2秒間短時間遠心分離する。配列プライマーの20 μLを前のステップからチューブに移し、ボルテックスを5秒間、まもなく遠心分離機で2秒間、使用前にRTで保存した。
  6. サンプルのロードとシーケンシング
    1. 前工程で調製した試料溶液55 μLをピペットで切り込み、チップの試料孔に注入する。
    2. チップを遠心分離機にセットします。切り込みを外側に、サンプルポータルを内側に保ち、別の使用済みチップとのバランスを取り、10分間遠心分離します。
    3. ローディング溶液を準備します。
      1. 1.5 mL の遠沈管で 0.5 mL のアニーリングバッファーと 0.5 mL のヌクレアーゼフリー水を混合します。50%アニーリングバッファーとしてマークし、7日以内に使用してください。
      2. 0.5 mLのイソプロパノール溶液と0.5 mLのアニーリングバッファーを混合する。50%洗浄バッファーとしてマークし、24時間以内に使用してください。
      3. 配列酵素6 μLと50%アニーリングバッファー60 μLを混合する。それを酵素反応緩衝液としてマークし、調製後に溶液を氷上に置く。
      4. 49 μL の 50% アニーリングバッファーと 1 μL の発泡剤を混合し、発泡溶液としてマークします。
    4. 発泡溶液に空気100μLを吹き込み、泡が緻密な発泡状態になるまで溶液をピペットで繰り返し、泡の体積を250μL前後に保つ。
    5. 遠心分離機後のベンチにチップを置き、サンプル穴に100μLの泡を注入し、アウトポータルの押し出された溶液を除去する。チップを遠心分離機に戻して、30秒間短時間遠心分離します。
    6. 手順 5.6.4 ~ 5.6.5 を繰り返します。
    7. 100 μL の 50% 洗浄バッファーを 2 回注入し、注入のたびにアウトポータルの押し出し溶液を除去します。
    8. 100 μL の 50% アニーリングバッファーを 3 回注入し、各注入後にアウトポータルの押し出し溶液を除去します。
    9. 65 μL の 50% 酵素反応バッファーを注入し、気泡を避け、押し出された溶液をアウトポータルから取り出します。
    10. ロードされたチップをRTで5分間安定させ、シーケンサーチップポータルにチップを取り付けます。ステップ 6 でプログラムされた計画を選択し、情報をチェックして、実行を開始します。完了するまでに約1.5時間かかります。
    11. 実行終了後 72 時間以内に水洗浄プログラムを実行します。水洗前に塩化物洗浄を行い、時間が72時間を超えた場合は水洗を行う。シーケンサーをシャットダウンし、窒素のバルブを閉じます。

6. レポーターサーバシステム16における指示されたシーケンシング実行を計画する

メモ: このセクションのすべての手順は、レポーターサーバーシステムを搭載した Ion プロトンシーケンサーで実行されます。

  1. サーバー・システムにサインインし、「プラン 」 タブを選択して、「 プラン・テンプレートの実行」をクリックします。実行タイプとして 全ゲノム を選択し、計画実行テンプレートのリストから適切なテンプレートを選択します。
  2. 「 計画」 タブで、以下の項目を入力または選択します。
    1. サンプルのバッチに従って新しい実行計画名を入力し、「参照ライブラリー」ドロップダウン・リストから「hg19 (ホモ・サピエンス)」を選択し、「ターゲット領域」ドロップダウン・リストから「なし」および「ホットスポット領域」ドロップダウン・リストから「なし」を選択します。
    2. サンプルセットで使用するバーコードの数を入力し、各サンプルのドロップダウンリストからバーコードを選択し、サンプルのグループ化と追跡に役立つ一意のわかりやすい名前を入力します。デフォルトの サンプル 1 などは使用しないでください。
    3. 「イオンレポーター」タブで「なし」を選択し、「次へ」をクリックして、アプリケーション内の「DNA」および「全ゲノム」をターゲット手法として選択します。
    4. [ キット ] タブで、選択内容を確認するか、実行に適した変更を行います。
      1. 「ライブラリキットタイプ」ドロップダウンリストから「イオンプラスフラグメントライブラリキット」を選択します。[テンプレート キット] ドロップダウン リストで [Ion PI HI-Q OT2 200 キット] を選択し、デフォルトとして [OneTouch] を選択します。「シーケンシングキット」ドロップダウンリストから「イオン PI HI-Q シーケンシング 200 キット」を選択します。
      2. 300 フローを入力し、[チップ タイプ] ドロップダウン リストから [イオン PITM チップ] を選択し、[バーコード セット] ドロップダウン リストから [IonXpress] を選択します。
      3. 「重複読み取りとして マーク 」の選択と「 再配置の有効化」の選択を取り消します。
    5. 「プラグイン」タブで適切なプラグインを選択して、ステップ 7 でデータ分析を実行します。プロジェクトステップで選択を完了し、「次へ」をクリックし、右下隅の「実行の計画」をクリックして、計画実行をリストします。
    6. [計画実行] タブで、新しく作成した実行を選択し、レビューウィンドウですべての設定を確認します。

7. データ解析

  1. バイオインフォマティクスワークフローを使用してコピー数バリアント(CNV)を分析します。
    注:CNVは、隠れマルコフモデル(HMM)に基づくアルゴリズムの実装により、バイオインフォマティクスワークフローで分析されました17。このモデルは、ゲノム全体の読み取りカバレッジを使用して、コピー数または整数の倍数性状態(すなわち、0、1、2、3など)を予測する。バイオインフォマティクスのパイプライン全体は、シーケンスサーバーシステムのプラグインで構築されました( 図2を参照)。バイオインフォマティクス分析ステップは、完了までに平均4時間かかります。

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Representative Results

マシンで実行中のプロセスが終了した後にシーケンス計画が終了すると、シーケンス・サーバー・システムは、 図 2 に示すように、生成されたデータ、チップ状況、ISP ロード・レート、およびライブラリー品質の説明情報とともに要約を報告します。この結果実証では、全ベースで17.6Gのデータが得られ、ISPの全体的な負荷率はチップの全ウェルで88%でした。ヒートマップは、サンプルがチップの全面積に均等にロードされていることを示しました(図2A)。代表的な実行では、99,761,079の合計読み取りが得られ、77%が使用可能でした。ISPがロードされたすべての井戸では、100%がテンプレートが強化されており、78%がクローンでした。すべてのクローンテンプレートのうち、97%が最終ライブラリとして認定されました(図2B)。読み取りの平均長さは、それぞれ平均、中央値、およびモードを含む117 bp、176 bp、および174 bpでした(図2C)。テンプレートの適応におけるT、C、およびAのピークカウントは〜76であり、これは適格なカットオフラインの50を超えている(図2D)。ライブISPでアドレス指定可能なすべての井戸で、99.5%が構築されたライブラリとして認定され、20%のポリクローナルで低品質のライブラリが除外されました。ISPの76.6%がさらなる分析の資格を得ています(図2E)。

単一サンプルS19030109-3からのコピー数バリアントの結果を 図3に示します。黒い破線は22個の常染色体と性染色体にまたがる倍数性セグメントとして正規化され、赤い線は4番染色体上のp16.3-q35.2の182.16 Mbモザイクトリソミー、および染色体22上のq11.1-q13.33の33.13 Mbモノソミーセグメントを表す異数性染色体領域として正規化される。

WGAキットを用いた12サンプルと、独自開発のWGA試薬を用いたワンステップ法による13サンプルの代表的な報告を、バーコードID、サンプル名、ユニークリードカウント、アライメントリード平均長、平均深さ、GC含量の割合、染色体バリアントマークの要約情報を含む 表4 および 表5にそれぞれ示す。染色体変異体マークは、性染色体、重複の位置およびサイズ、ならびに染色体上の欠失を実証した。

Figure 1
図1:8ウェルストリップ上のサンプルローディング位置の図。各ウェルには、装填内容物がそれぞれ示されている。Uは濃縮されていないサンプル、Bはビーズ、Wは洗浄溶液を表します。空の井戸も図に記されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 実行中のサマリー: データ サイズ、ISP の読み込み量、ライブラリ品質のメトリック 。(A) ヒート マップを使用した合計ベース数、キー信号、ISP の読み込み率など、全体的な状態。(B) 各反応ステップにおける読み取りの合計、使用可能な読み取り速度、および ISP 情報の概要。(C) 読み上げの長さのヒストグラム。(D) TCAのコンセンサス・キー1-Mer(E) アドレス指定可能な井戸およびIPSクローン状態。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:可視化されたコピー数バリアントプロットの例:S19030109-3。コピー数(CN)シグナルは、染色体の青色と緑色の間隔が隣り合ったプロットで視覚化されます。与えられた例は、赤色で記された平均CNV線が2からずれているため、第4染色体におけるCNの増加観察および第22染色体におけるCNの減少観察を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

いいえ。サイクル数 温度 時間
1サイクル 95 °C 2分
12サイクル 95 °C 15秒
15 °C 50秒
25 °C 40秒
35 °C 30秒
65 °C 40秒
75 °C 40秒
1サイクル 4°C 持つ

表1:事前増幅のための熱サイクルプログラム。 温度、時間、サイクルなどの熱反応条件を示します。

歩 温度 時間 いいえ。サイクル数
1 95 °C 2分 1
2 95 °C 15秒 14
65 °C 1分
75 °C 1分
3 4°C 持つ 1

表2:全ゲノム増幅キットを用いた全ゲノム増幅のための熱サイクルプログラム。 温度、時間、サイクルなどの熱反応条件を示します。

歩 温度(°C) 時間 いいえ。サイクル数
1 95 °C 2分30秒 1
2 95 °C 30秒 6
25°C 2分
0.3 °C/秒~72 °C ——
72 °C 1分30秒
3 95 °C 30秒 20
62 °C 30秒
72 °C 1分
4 72 °C 2分 1
5 4°C 持つ 1

表3:独自に開発した試薬による全ゲノム増幅のための熱サイクルプログラム。 温度、時間、サイクルなどの熱反応条件を示します。

サンプル名 一意の読み取り数 整列読み取り 平均長さ 平均深さ CG% ティッカー 印
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 ティッカー
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 ティッカー
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 ティッカー
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 ティッカー
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 ティッカー
S19030401-10 · 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 ティッカー
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 ティッカー

表4:サーバーシステムレポートの全ゲノム増幅キットを使用したコピー数変動の出力例。 典型的な出力シートには、サンプル名、一意の読み取り回数、整列された読み取り、平均長さ、平均深さ、CGパーセンテージ、長さの標準偏差、およびほとんどの場合、XYでタグ付けされた性染色体と結論CNVの詳細を持つ染色体状態のマークなどのパラメータが含まれます。検出されたCNVは、染色体位置および断片サイズでマークされる。

サンプル名 一意の読み取り数 整列読み取り 平均長さ 平均深さ ティッカー ティッカー 印
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 ティッカー
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 ティッカー
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 ティッカー
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 ティッカー
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 ティッカー
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 ティッカー
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 ティッカー
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 ティッカー

表5:独自に開発した全ゲノム増幅試薬を用いたワンステップ法によるコピー数変動のサーバーシステムレポートの出力例 典型的な出力シートには、サンプル名、一意の読み取り回数、整列された読み取り、平均長さ、平均深さ、CGパーセンテージ、長さの標準偏差、およびほとんどの場合、XYでタグ付けされた性染色体と結論CNVの詳細を持つ染色体状態のマークなどのパラメータが含まれます。検出されたCNVは、染色体位置および断片サイズでマークされる。

補足ファイル 1: 異なるバッチサイズのマスターミックスを準備する際の各コンポーネントの推奨ボリューム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

胚の染色体異数性は、自然に妊娠したか体外受精(IVF)かにかかわらず、妊娠喪失の大部分の原因である。体外受精の臨床現場では、異数性の胚をスクリーニングし、倍数性胚を移入することが体外受精の結果を改善することができることが提案されている。蛍光in situハイブリダイゼーションは、性選択およびPGT-Aに採用された最も初期の技術である。しかし、この技術は実験室の職員からより多くの技術的専門知識を必要とし、比較的労働集約的である。蛍光in situハイブリダイゼーションを用いたPGT-Aの研究の増加は、出生率の改善を示さない17,18。

しかし、着床前遺伝子検査におけるコピー数解析を評価する技術の急速な進歩が行われている。さまざまな方法には長所と短所があります。定量的蛍光PCR、一塩基多型(SNP)アレイ、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)、次世代シーケンシングなどの新しく開発された包括的な分子技術は、IVFアウトカムの改善に有望であることを示しました7。これらの中で、NGSは、そのスケーラビリティ、より高いスループット、より容易な自動化、およびコストを削減する可能性がより高いにもかかわらず、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションと高い一貫性を有する19,20,21。

WGA技術と組み合わせることで、胚生検のNGS分析はより正確な配列情報を提供することができ、また、一塩基レベルのより多くの標的に対して実行可能な拡張を有する。遺伝子異常の検出における次世代シーケンシングの適用が進むにつれて、実験室と臨床現場の両方でサンプル/データ処理の標準を構築することが急務である22,23,24。

PGT-Aプロセスの分離から異数性同定までの道のりにおいて、重要なステップには、分離、全ゲノム増幅法の選択、次世代シーケンシングプラットフォームの選択、およびシーケンシングデータの分析が含まれる。全ゲノム増幅プロセスはPGT-Aの最も重要なステップであり、シーケンシングデータの完全性と均一性を決定します。以前の研究で3つの全ゲノム増幅戦略を比較し、picoPLEX準ランダムプライマー法がシーケンシングデータの完全性と均一性の点で多重変位増幅(MDA)法とほぼ同様に機能することが証明されています25。臨床現場では、PGT-Aの一塩基変動ではなく、~10Mbpの分解能でのコピー数変動(CNV)に焦点を当てているため、picoPLEX WGAキットと独自に開発されたWGA試薬は、経済的な懸念から選択されました。増幅段階では、後者は、事前増幅を必要とせずに、全ゲノムの増幅を完了するために1つのステップしか必要としない。

現在、PGTに使用されている市場には、イルミナ26 のMiSeqとサーモフィッシャーサイエンティフィック27のイオンプロトンの2つの主要な商用プラットフォームがあります。MiseqとProtonはどちらも染色体全体の異数性を識別することができますが、Miseqは染色体全体の異数性を識別するためにのみ設計されていますが、陽子は臨床的に有意なdelsまたはdupを含む大きな欠失(dels)または重複(dups)を約800 kbから1 Mb28の分解能まで識別することもできます。Protonプラットフォームは、コスト面での優位性と強力な現地技術サポートを備えています。これらの理由から、Protonプラットフォームは後の臨床診療のために選択されました。

次世代シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、臨床応用の臨床医にとって複雑で困難です。Clinvar29、1000 genome 30、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)31 などのヒト遺伝子変異の公開アーカイブ内のデータの増加に伴い、より多くのCNV注釈ソフトウェアアプリケーションが開発され、公的および私的使用のために利用可能になりました32,33。ここでは、PGT-A34の臨床現場でワンクリックでCNVデータ分析を完了するために、ラボスタッフと臨床医を支援するために、ローカルに設計された情報システムDarui-LIMSが適用されました。

当社の方法はPGT-A専用に設計されており、分解能、精度、コストのバランスがとれています。遺伝物質処理とバイオインフォマティクスパイプラインの標準的な手順は、臨床分析のための一貫したデータを生成することができます。NGSシステムに基づく技術の新たな進歩により、転座などのさらなる染色体構造異常をPGTサイクルにおける臨床的増幅について試験および診断することができる35,36。これらのテストでは、より特殊な方法を開発し、適用する必要があります。それでも、PGT-Aの臨床実践を導くための仕様として、これらの方法は、DA8600次世代シーケンシングプラットフォーム上のPGT-Aの実験室診療における実験室スタッフおよび臨床医にとって有用であろう。

ただし、この方法には一定の制限があります。このプロトコルでは、磁気ラックがサポートできるサンプルの最大数は 16 です。もちろん、実際の臨床サンプル数に応じて、一度により多くのサンプルをサポートする磁気ラックを選択するか、磁気ラックの数を増やしてより多くのサンプル操作を実行することもできます。ただし、これにより、操作エラーのリスクが高まる可能性があります。したがって、サーモフィッシャーサイエンティフィックの Ion ReproSeq PGS キットなど、32 サンプル以上のバッチで作業する場合は、半導体シーケンシングに基づく市販キットをお勧めします。

中国食品医薬品管理研究機構が公布した着床前染色体異数性検出試薬の品質管理技術に関する技術評価ガイドライン(ハイスループットシーケンシング)によると、1サンプルの有効なデータ量の要件は1M以上です。Ion PI 製品の概要によると、チップあたり 6,000 ~ 80 M の読み取りがあり、実験経験に基づくと、有効な一意の読み取り数は元のデータの 50% 以上です。計算後、各実験サンプルの有効データ量は2M以上です。したがって、実験結果の精度を確保するために、最大容量は16サンプルを推奨します。

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Disclosures

著者らには開示するものは何もありません。

Acknowledgments

LIMS拡張アプリケーションに関するアドバイスをしてくれたZhangyong Ming 博士と Rongji Hou 氏に感謝します。本研究は、人民解放軍家族計画特別研究プロジェクト(17JS008, 20JSZ08)、広西チワン族自治区代謝性疾患研究基幹研究所基金(No.20-065-76)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034)の支援を受けています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

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References

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遺伝学 問題 186
半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査
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Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

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