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Chemistry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले मजबूत प्रोटिओम शुद्धिकरण के लिए कार्बनिक विलायक-आधारित प्रोटीन वर्षा

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल मजबूत और तेजी से वसूली और मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले प्रोटिओम नमूनों की शुद्धि के लिए नियंत्रित परिस्थितियों में विलायक आधारित प्रोटीन वर्षा का वर्णन करता है।

Abstract

जबकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) उपकरणों में कई प्रगति ने गुणात्मक और मात्रात्मक प्रोटिओम विश्लेषण में सुधार किया है, एमएस से पहले प्रोटीन को अलग करने, समृद्ध करने और संसाधित करने के लिए अधिक विश्वसनीय फ्रंट-एंड दृष्टिकोण सफल प्रोटिओम लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण हैं। कम, असंगत प्रोटीन वसूली और अवशिष्ट अशुद्धियां जैसे सर्फेक्टेंट एमएस विश्लेषण के लिए हानिकारक हैं। प्रोटीन वर्षा को अक्सर अन्य नमूना तैयारी रणनीतियों की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए अविश्वसनीय, समय लेने वाली और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण माना जाता है। इष्टतम प्रोटीन वर्षा प्रोटोकॉल को नियोजित करके इन चिंताओं को दूर किया जाता है। एसीटोन वर्षा के लिए, विशिष्ट लवण, तापमान नियंत्रण, विलायक संरचना और वर्षा समय का संयोजन महत्वपूर्ण है, जबकि क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / पानी की वर्षा की दक्षता उचित पाइपिंग और शीशी हेरफेर पर निर्भर करती है। वैकल्पिक रूप से, इन वर्षा प्रोटोकॉल एक डिस्पोजेबल स्पिन कारतूस के भीतर सुव्यवस्थित और अर्ध-स्वचालित हैं। पारंपरिक प्रारूप में विलायक-आधारित प्रोटीन वर्षा के अपेक्षित परिणाम और एक डिस्पोजेबल, दो-चरण निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस का उपयोग करना इस काम में सचित्र हैं। इसमें बॉटम-अप एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण द्वारा प्रोटिओमिक मिश्रण का विस्तृत लक्षण वर्णन शामिल है। एसडीएस-आधारित वर्कफ़्लो का बेहतर प्रदर्शन गैर-दूषित प्रोटीन के सापेक्ष भी प्रदर्शित किया जाता है।

Introduction

आधुनिक एमएस उपकरणों की बढ़ी हुई संवेदनशीलता, संकल्प, स्कैन गति और बहुमुखी प्रतिभा के कारण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटिओम विश्लेषण तेजी से कठोर हो गया है। एमएस अग्रिम अधिक प्रोटीन पहचान दक्षता और अधिक सटीक मात्रा 1,2,3,4,5 में योगदान करते हैं। बेहतर एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ, शोधकर्ता वर्कफ़्लो 6,7,8,9,10,11 के सभी चरणों में न्यूनतम समय में उच्च शुद्धता वाले प्रोटीन की मात्रात्मक वसूली में सक्षम एक सुसंगत फ्रंट-एंड नमूना तैयारी रणनीति की मांग करते हैं . एक जैविक प्रणाली की प्रोटिओम स्थिति को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने के लिए, प्रोटीन को एक कुशल और निष्पक्ष फैशन में देशी नमूना मैट्रिक्स से अलग किया जाना चाहिए। यह अंत करने के लिए, एक विकृत सर्फेक्टेंट सहित, जैसे कि सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), कुशल प्रोटीन निष्कर्षण और घुलनशीलता12 सुनिश्चित करता है। हालांकि, एसडीएस इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण के साथ दृढ़ता से हस्तक्षेप करता है, जिससे गंभीर एमएस सिग्नल दमन होता है यदि ठीक से समाप्त नहीं होताहै 13.

बाद के प्रोटिओम विश्लेषण के लिए विभिन्न एसडीएस कमी रणनीतियां उपलब्ध हैं, जैसे डिस्पोजेबल स्पिन कारतूस14,15,16 के भीतर निहित आणविक भार कटऑफ फिल्टर के ऊपर प्रोटीन का प्रतिधारण। फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी विधि (एफएएसपी) इष्ट है क्योंकि यह प्रभावी रूप से 10 पीपीएम से नीचे एसडीएस को कम करता है, इष्टतम एमएस की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, एफएएसपी के साथ प्रोटीन रिकवरी परिवर्तनशील है, जिसने अन्य तकनीकों की खोज को प्रेरित किया। क्रोमैटोग्राफिक दृष्टिकोण जो चुनिंदा रूप से प्रोटीन (या सर्फैक्टेंट) को कैप्चर करते हैं, विभिन्न सुविधाजनक कारतूस या मनका-आधारित प्रारूपों 17,18,19,20,21 में विकसित हुए हैं। प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए इन सरल और (आदर्श रूप से) सुसंगत रणनीतियों को देखते हुए, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ प्रोटीन वर्षा के शास्त्रीय दृष्टिकोण को अक्सर प्रोटीन अलगाव के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में अनदेखा किया जाता है। जबकि विलायक वर्षा को महत्वपूर्ण स्तरों से नीचे एसडीएस को सफलतापूर्वक समाप्त करने के लिए दिखाया गया है, प्रोटीन वसूली इस दृष्टिकोण की लंबे समय से चिंता का विषय रही है। कई समूहों ने प्रोटीन एकाग्रता, आणविक भार और हाइड्रोफोबिसिटी22,23 के एक समारोह के रूप में अस्वीकार्य रूप से कम वर्षा पैदावार के साथ एक प्रोटीन रिकवरी पूर्वाग्रह देखा है। साहित्य में रिपोर्ट किए गए वर्षा प्रोटोकॉल की विविधता के कारण, मानकीकृत वर्षा की स्थिति विकसित की गई थी। 2013 में, क्रॉवेल एट अल ने पहली बार 80% एसीटोन24 में प्रोटीन की वर्षा दक्षता पर आयनिक ताकत की निर्भरता की सूचना दी। जांच किए गए सभी प्रोटीनों के लिए, पैदावार को अधिकतम करने के लिए 30 एमएम सोडियम क्लोराइड के अलावा आवश्यक दिखाया गया था (100% वसूली तक)। हाल ही में, निकर्सन एट अल ने दिखाया कि एसीटोन वर्षा के दौरान ऊंचा तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) के साथ और भी उच्च आयनिक ताकत (100 एमएम तक) का संयोजन 2-5 मिनट25 में मात्रात्मक वसूली के पास दिया गया। कम आणविक भार (एलएमडब्ल्यू) प्रोटीन की वसूली में मामूली गिरावट देखी गई। इसलिए, बाघलाबादी एट अल की एक बाद की रिपोर्ट ने कार्बनिक विलायक (97% एसीटोन) 26 के उच्च स्तर के साथ विशिष्ट लवण, विशेष रूप से जस्ता सल्फेट के संयोजन से एलएमडब्ल्यू प्रोटीन और पेप्टाइड्स (≤5 केडीए) की सफल वसूली का प्रदर्शन किया।

वर्षा प्रोटोकॉल को परिष्कृत करते समय एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए एक अधिक विश्वसनीय प्रोटीन शोधन रणनीति उधार देता है, पारंपरिक वर्षा की सफलता उपयोगकर्ता तकनीक पर बहुत अधिक निर्भर करती है। इस काम का एक प्राथमिक लक्ष्य एक मजबूत वर्षा रणनीति पेश करना है जो दूषित सतह पर तैरनेवाला से प्रोटीन गोली के अलगाव की सुविधा प्रदान करता है। एक छिद्रपूर्ण पीटीएफई झिल्ली फिल्टर27 के ऊपर एकत्रित प्रोटीन को अलग करके पाइपिंग को खत्म करने के लिए एक डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस विकसित किया गया था। सतह पर तैरनेवाला में एमएस-हस्तक्षेप घटकों को एक छोटे, कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण में प्रभावी ढंग से हटा दिया जाता है। डिस्पोजेबल फिल्टर कारतूस भी एक विनिमेय एसपीई कारतूस प्रदान करता है, जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले, पुनरुत्थान और वैकल्पिक प्रोटीन पाचन के बाद बाद के नमूने की सफाई की सुविधा प्रदान करता है।

अनुशंसित प्रोटिओम वर्षा वर्कफ़्लो की एक श्रृंखला यहां प्रस्तुत की गई है, जिसमें संशोधित एसीटोन और क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / पानी28 प्रोटोकॉल शामिल हैं, एक पारंपरिक (शीशी-आधारित) और डिस्पोजेबल दो-राज्य निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस में एक अर्ध-स्वचालित प्रारूप में। परिणामी प्रोटीन रिकवरी और एसडीएस की कमी क्षमता को हाइलाइट किया जाता है, साथ ही प्रत्येक प्रोटोकॉल से अपेक्षित परिणाम प्रदर्शित करने के लिए नीचे-ऊपर एलसी-एमएस / प्रत्येक दृष्टिकोण से जुड़े व्यावहारिक लाभों और कमियों पर चर्चा की जाती है।

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Protocol

1. सामग्री विचार और नमूना पूर्व तैयारी

  1. अतिरिक्त नमी से मुक्त केवल उच्च शुद्धता सॉल्वैंट्स (एसीटोन, क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल) (>99.5%) और रसायनों का उपयोग करें।
  2. पानी में सोडियम क्लोराइड और जिंक सल्फेट समाधान (1 एम) तैयार करें।
    नोट: नमक समाधान कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है, जब तक कि वे दूषित या माइक्रोबियल विकास से मुक्त न हों।
  3. वर्षा को प्रेरित करने के लिए नमूना और सॉल्वैंट्स की आवश्यक मात्रा को बनाए रखने के लिए पर्याप्त सबसे छोटी पॉलीप्रोपाइलीन (पीपी) माइक्रोसेंट्रिफ्यूज शीशी का उपयोग करें।
  4. सुनिश्चित करें कि अवक्षेपित किए जाने वाले नमूने में एसडीएस एकाग्रता 2% (डब्ल्यू / यदि एसडीएस अधिक है, तो पानी के साथ नमूने को पतला करें।
  5. इष्टतम वर्षा दक्षता के लिए 0.01 और 10 ग्राम / एल के बीच प्रोटीन एकाग्रता सुनिश्चित करें।
    नोट: वर्षा के लिए इष्टतम द्रव्यमान प्रोटीन के 1-100 μg के बीच होता है।
  6. सुनिश्चित करें कि उपयोग से पहले सभी सॉल्वैंट्स और समाधान पार्टिकुलेट मैटर से मुक्त हैं। अविघटित कणों को हटाने के लिए या तो निस्पंदन (<0.5 μm) या सेंट्रीफ्यूजेशन चरण (कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 x g ) करें।
  7. यदि डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड में कमी और अल्काइलेशन की आवश्यकता होती है, तो प्रोटीन वर्षा से पहले इन चरणों का संचालन करें। अतिरिक्त कम करने और क्षारीय अभिकर्मकों को वर्षा प्रक्रिया के माध्यम से हटा दिया जाएगा।
  8. प्रोटोकॉल (चरण 2, 3, 4, या 5) में से एक का चयन और प्रदर्शन करके प्रोटीन को अवक्षेपित करें।

2. एसीटोन के साथ तेजी से (शीशी आधारित) प्रोटीन वर्षा

  1. पीपी माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 90 μL (पार्टिकुलेट-फ्री) प्रोटीन या प्रोटिओम समाधान। फिर, 1 एम जलीय एनएसीएल के 10 μL जोड़ें।
    नोट: यदि प्रोटिओम निकालने की आयनिक ताकत पहले से ही 100 एमएम से अधिक है, तो कोई अतिरिक्त नमक आवश्यक नहीं है।
  2. नमूने में एसीटोन के पिपेट 400 μL। शीशी को कैप करें और सॉल्वैंट्स को संयोजित करने के लिए शीशी को धीरे से टैप करें। जोरदार मिश्रण की आवश्यकता नहीं है।
    नोट: प्रोटीन, नमक और एसीटोन की मात्रा तब तक बढ़ाई जा सकती है जब तक कि प्रत्येक के सापेक्ष अनुपात को बनाए रखा जाता है।
  3. शीशी को कमरे के तापमान पर सेते हैं, निर्बाध, न्यूनतम 2 मिनट के लिए।
    नोट: कम तापमान पर उन लोगों सहित लंबे समय तक ऊष्मायन (उदाहरण के लिए, पारंपरिक एसीटोन वर्षा फ्रीजर में रात भर वर्षा को नियोजित करता है), बड़े (दृश्यमान) एकत्रित प्रोटीन कणों (चित्रा 1 ए) के गठन में परिणाम हो सकता है, जो आम तौर पर कुल प्रोटीन वसूली में सुधार नहीं करते हैं।
  4. इनक्यूबेशन बाद, शीशी के अभिविन्यास को ध्यान में रखते हुए, एक अपकेंद्रित्र में नमूने रखें। कमरे के तापमान पर 10,000 एक्स जी या उससे अधिक पर न्यूनतम 2 मिनट के लिए स्पिन करें।
  5. शीशी को अनकैप करें और धीरे-धीरे शीशी को अपशिष्ट कंटेनर में उलटकर सतह पर तैरनेवाला को धीरे-धीरे डिकेंट करें। शीशी से अवशिष्ट विलायक आकर्षित करने के लिए उल्टे शीशी को एक पेपर तौलिया में स्पर्श करें।
    सावधानी: अपशिष्ट सॉल्वैंट्स को उचित प्रोटोकॉल के अनुसार बनाए रखा जाना चाहिए और त्याग दिया जाना चाहिए।
  6. एसडीएस युक्त नमूनों के लिए, ताजा एसीटोन के 400 μL वितरण, गोली परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहना।
    नोट: चरण 2.6 वैकल्पिक है।
    1. तुरंत नमूना अपकेंद्रित्र (कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी या उच्चतर), प्रारंभिक स्पिन के रूप में एक ही अभिविन्यास में रोटर में शीशी रखना। चरण 2.5 में वर्णित के रूप में धोने विलायक डिकेंट।
  7. नमूना पूरी तरह से टोपी खुला (~ 1 मिनट) के साथ सूखने की अनुमति दें। शीशी को पुनः प्राप्त करें और गोली घुलनशीलता (चरण 6) के साथ आगे बढ़ें।

3. कम आणविक भार (एलएमडब्ल्यू) पेप्टाइड्स की वर्षा (जेडएनएसओ4 + एसीटोन)

  1. 2 एमएल पीपी शीशी के लिए प्रोटिओम निकालने के 54 μL वितरित करें, और फिर 1 एम ZnSO4 के 6 μL जोड़ें।
    नोट: एलएमडब्ल्यू पेप्टाइड्स (≤5 केडीए) की इष्टतम वसूली मात्रा द्वारा अंतिम 97% में एसीटोन जोड़कर प्राप्त की जाती है। एक 2 एमएल पीपी शीशी मानते हुए, अधिकतम प्रारंभिक नमूना मात्रा 54 μL है।
  2. मात्रा से अंतिम 97% के लिए एसीटोन के 1940 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे घुमाएं, और कम से कम 2 मिनट के लिए बेंचटॉप पर निर्बाध खड़े होने दें।
  3. अपकेंद्रित्र (कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी ) और शीशी को उलटकर सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और फिर शीशी को एक पेपर तौलिया में स्पर्श करें।
  4. एसडीएस युक्त नमूनों के लिए, ताजा एसीटोन के 400 μL वितरण, गोली परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहना।
    नोट: चरण 3.4 वैकल्पिक है।
    1. चरण 3.3 के अनुसार नमूना तुरंत अपकेंद्रित्र, प्रारंभिक स्पिन के रूप में एक ही अभिविन्यास में रोटर में शीशी रखकर। चरण 3.3 में वर्णित के रूप में धोने विलायक डिकेंट।
  5. संक्षिप्त भंवर या सोनिकेशन (~ 5 मिनट) के साथ एक जलीय विलायक में परिणामस्वरूप सूखी गोली को फिर से घुलनशील करें।

4. क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी (सीएमडब्ल्यू) द्वारा प्रोटीन वर्षा

  1. एक पीपी शीशी में प्रोटीन या प्रोटिओम समाधान के 100 μL वितरित करें। मेथनॉल के 400 μL जोड़ें, इसके बाद क्लोरोफॉर्म के 100 μL। मिश्रण करने के लिए शीशी और भंवर को संक्षेप में कैप करें।
    नोट: सीएमडब्ल्यू वर्षा के लिए, संकीर्ण बोतलों के साथ 1.5 मिलीलीटर शीशियों को प्राथमिकता दी जाती है (चित्रा 2 ए)।
    सावधानी: क्लोरोफॉर्म विलायक को एक उपयुक्त वेंटिलेशन हुड में संभाला जाना चाहिए। क्लोरोफॉर्म से संपर्क करने वाले सभी सॉल्वैंट्स को निपटाने पर हलोजनयुक्त अपशिष्ट के रूप में माना जाना चाहिए।
  2. जल्दी से शीशी के केंद्र में सीधे 300 μL पानी वितरित करें। शीशी को कैप करें। नमूना 1 मिनट के लिए निर्विवाद बेंचटॉप पर बैठने के लिए अनुमति दें।
    नोट: समाधान तुरंत बादल सफेद दिखाई देगा। पानी के अतिरिक्त के बाद शीशी को मिलाने से बचें।
  3. पीपी शीशी को एक अपकेंद्रित्र में रखें और न्यूनतम 5 मिनट (कमरे के तापमान पर 10,000 एक्स जी या उससे अधिक) के लिए स्पिन करें।
    नोट: एक बार सेंट्रीफ्यूज होने के बाद, दो दृश्यमान विलायक परतें बनेंगी (शीर्ष परत = मेथनॉल / विलायक इंटरफ़ेस (चित्रा 2 ए) पर एक ठोस प्रोटीन गोली रूपों।
  4. एक बड़े (1 एमएल) माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करना, और शीशी को ~ 45 ° पर पकड़ना, एक समान दर पर ऊपरी परत से विलायक के ~ 700 μL को हटा दें।
  5. ~ 45 ° झुका हुआ शीशी से ऊपरी विलायक परत को हटाने के लिए जारी रखने के लिए एक छोटे (200 μL) माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करें। एक निरंतर गति में पिपेट जब तक ऊपरी विलायक परत शीशी में एक मनका नहीं बनाती है।
  6. नमूना शीशी के लिए ताजा मेथनॉल के 400 μL जोड़ें, गोली परेशान किए बिना, शीशी के किनारे नीचे विलायक वितरण द्वारा।
  7. शीशी को कैप करें। सॉल्वैंट्स को एक साथ घुमाने के लिए शीशी को धीरे-धीरे रॉक करके विलायक परतों को मिलाएं।
    नोट: गोली को बाधित करने से बचना आवश्यक है। शीशी को भंवर न करें।
  8. रोटर में शीशी के अभिविन्यास को ध्यान में रखते हुए, न्यूनतम 10 मिनट (कमरे के तापमान पर 10,000 एक्स जी ) के लिए अपकेंद्रित्र। प्रोटीन गोली शीशी (चित्रा 2 बी) के नीचे का पालन करता है।
  9. 45 ° पर शीशी टिप, गोली के साथ नीचे का सामना करना पड़ रहा है। शीशी के ऊपरी किनारे के साथ पिपेट टिप रखें और धीमी लेकिन निरंतर दर पर 1 एमएल माइक्रोपिपेट टिप के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। शीशी में विलायक के ~ 20 μL बनाए रखें।
  10. धीरे-धीरे ताजा मेथनॉल के 400 μL वितरण द्वारा एसडीएस युक्त नमूनों के लिए प्रोटीन गोली धो लें। शीशी को भंवर न करें।
    1. सेंट्रीफ्यूजेशन (तापमान पर 2 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी ) के साथ सीधे आगे बढ़ें, प्रारंभिक स्पिन के समान अभिविन्यास के साथ रोटर में शीशी रखें।
  11. चरण 4.9 के अनुसार, विलायक निकालें। अवशिष्ट विलायक वाष्पित होने तक नमूने को धुएं में सूखने दें।
  12. चरण 6 में अनुशंसित पुनरुत्थान प्रक्रियाओं से परामर्श करें।

5. एक डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस का उपयोग कर प्रोटीन वर्षा

नोट: चरण 2-5 में वर्णित प्रत्येक विलायक-आधारित वर्षा प्रोटोकॉल को दो-चरण निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस में किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।

  1. ऊपरी निस्पंदन कारतूस (चित्रा 3 ए) से जुड़े प्लग के साथ, नीचे दिए गए तीन विकल्पों में से एक में उल्लिखित निकाले गए प्रोटिओम, नमक और विलायक की वांछित मात्रा को वितरित करें।
    1. (विकल्प 1) एसीटोन के साथ प्रोटीन वर्षा के लिए, प्रोटीन या प्रोटिओम समाधान के 90 μL, 1 M जलीय NaCl के 10 μL, और एसीटोन के 400 μL गठबंधन। बेंचटॉप पर कम से कम 2 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: एक दृश्य अवक्षेप केंद्रित प्रोटीन नमूने (1 ग्राम / एल) (चित्रा 3 बी) के लिए विकसित होगा।
    2. (विकल्प 2) एलएमडब्ल्यू पेप्टाइड वर्षा के लिए, नमूने के 15 μL, 1 एम ZnSO4 के 1.5 μL, और एसीटोन के 485 μL गठबंधन। बेंचटॉप पर कम से कम 2 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: जलीय नमूने में 90 एमएम की नमक एकाग्रता चरण 3 में अनुशंसित 100 एमएम के सापेक्ष वसूली को प्रभावित नहीं करेगी।
    3. (विकल्प 3) सीएमडब्ल्यू वर्षा के लिए, प्रोटिओम निकालने के 50 μL, मेथनॉल के 200 μL, और क्लोरोफॉर्म के 50 μL जोड़ें। गठबंधन करने के लिए शीशी और संक्षेप में भंवर कैप करें।
      1. जल्दी से शीशी के केंद्र में सीधे 150 μL पानी वितरित करें। बेंचटॉप पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. प्लग अभी भी निस्पंदन कारतूस से जुड़ा के साथ कमरे के तापमान पर 2,500 x g पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. कारतूस को पलटें, और फिर कारतूस के आधार से प्लग को अनस्क्रू और हटा दें।
  4. निस्पंदन कारतूस को एक साफ शीशी में रखें और अपकेंद्रित्र पर लौटें। कमरे के तापमान पर 500 x g पर 3 मिनट के लिए स्पिन। निचली शीशी से प्रवाह-थ्रू विलायक को त्यागें।
    नोट: यदि कोई विलायक ऊपरी निस्पंदन कारतूस में रहता है, तो अपकेंद्रित्र पर लौटें और एक अतिरिक्त स्पिन करें।
  5. निस्पंदन कारतूस में एसीटोन के 400 μL जोड़कर प्रोटीन गोली धो लें (सीएमडब्ल्यू वर्षा के लिए, चरण 5.1.3, मेथनॉल के 400 μL जोड़ें)।
  6. कमरे के तापमान पर 500 x g पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र या जब तक कोई विलायक ऊपरी कारतूस में रहता है।
  7. चरण 6 में वर्णित वर्षा गोली को फिर से घुलनशील करें।

6. प्रोटीन गोली का पुनरुत्थान

  1. निस्पंदन कारतूस के आधार पर झिल्ली को गीला करें आइसोप्रोपेनॉल के 2-5 μL को सीधे झिल्ली में वितरित करके तुरंत नीचे वर्णित पुनरुत्थान प्रोटोकॉल से पहले।
  2. निम्न में से किसी एक रीसोल्यूबिलाइज़ेशन विधियों का पालन करें।
    1. (विकल्प 1) निस्पंदन कारतूस के लिए ≥2% एसडीएस युक्त जलीय बफर के 20 μL की एक न्यूनतम जोड़ें। टोपी और भंवर सख्ती से (~ 1 मिनट)। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन गोली फैलाने के लिए सोनीकेट (>10 मिनट)।
      1. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी)। हीटिंग के बाद मिश्रण चरण दोहराएं।
        नोट: लेमली जेल लोड हो रहा है बफर प्रोटीन गोली को फिर से घुलनशील कर सकता है। हालांकि, एसडीएस युक्त नमूने ट्रिप्सिन पाचन और उलट-चरण एलसी और एमएस के साथ असंगत हैं।
    2. (विकल्प 2) पानी में 80% (वी /वी) फॉर्मिक एसिड का घोल तैयार करें। एसिड समाधान (-20 डिग्री सेल्सियस), साथ ही निस्पंदन कारतूस जिसमें अवक्षेपित प्रोटीन होता है।
      1. कारतूस में ठंड फॉर्मिक एसिड के 50 μL वितरण; 30 एस के लिए टोपी और भंवर। 10 मिनट के लिए फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) पर लौटें।
      2. 30 एस के लिए कारतूस फिर से भंवर। फिर, द्रुतशीतन और मिश्रण चक्र को एक और बार दोहराएं (10 मिनट, -20 डिग्री सेल्सियस, 30 एस भंवर)।
      3. फॉर्मिक एसिड को 8% तक पतला करते हुए, अंतिम 500 μL में पानी जोड़ें।
        नोट: कोल्ड फॉर्मिक एसिड प्रोटोकॉल बाद के ट्रिप्सिन पाचन के साथ असंगत है लेकिन एलसी-एमएस के साथ संगत है।
    3. (विकल्प 3) निस्पंदन कारतूस के लिए पानी में ताजा तैयार 8 एम यूरिया के 50 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
      1. कारतूस को 1 घंटे (रात भर तक) के लिए बेंचटॉप पर सेते हैं।
      2. 8 एम यूरिया को पानी या उचित बफर के साथ न्यूनतम 5 गुना पतला करें।
        नोट: एक बार पतला होने के बाद, यूरिया घुलनशीलता प्रोटोकॉल बाद के ट्रिप्सिन पाचन, साथ ही एलसी-एमएस के साथ संगत है।

7. प्रोटीन पाचन

  1. बॉटम-अप एमएस विश्लेषण के लिए, नीचे उल्लिखित दो तरीकों में से एक का उपयोग करके एंजाइमी पाचन के लिए फिर से घुलनशील प्रोटीन के अधीन करें।
    1. (विकल्प 1) फॉर्मिक एसिड रिसोल्यूबिलाइजेशन के लिए, चरण 6.2.2.1 से 25 μL में 80% फॉर्मिक एसिड की प्रारंभिक मात्रा को कम करें। चरण 6.2.2.3 में, फॉर्मिक एसिड को 5% (वी / वी) तक पतला करने के लिए 375 μL पानी का उपयोग करें।
    2. 50: 1 के एंजाइम अनुपात के लिए अनुमानित प्रोटीन पर कारतूस में पेप्सिन वितरित करें। निस्पंदन कारतूस से जुड़े प्लग के साथ, कमरे के तापमान पर रात भर नमूना सेते हैं।
  2. (विकल्प 2) यूरिया में पुनर्सुलभीकरण के लिए, चरण 6.2.3.2 में ट्रिस या अमोनियम बाइकार्बोनेट के 100 एमएम को शामिल करने के साथ 8 और 8.3 के बीच पीएच सुनिश्चित करें।
    1. 50: 1 के एंजाइम द्रव्यमान अनुपात के लिए अनुमानित प्रोटीन पर ट्रिप्सिन जोड़ें। कारतूस से जुड़े प्लग के साथ, 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी के स्नान में रात भर नमूना सेते हैं।
    2. अंतिम 1% के लिए 10% टीएफए के साथ समाधान को अम्लीय करके पाचन समाप्त करें।
  3. फिल्टर के आधार से प्लग को हटाकर और एक साफ शीशी (2 मिनट, 5000 एक्स जी, कमरे के तापमान) के भीतर निहित कारतूस को सेंट्रीफ्यूज करके पेप्सिन- या ट्रिप्सिन-पचने वाले प्रोटीन को पुनर्प्राप्त करें।

8. एसपीई सफाई

नोट: पाचन या विलायक विनिमय के बाद अतिरिक्त नमूना डीसाल्टिंग के लिए, नमूना वर्णित के रूप में उलट-चरण सफाई के अधीन हो सकता है।

  1. मेथनॉल के 300 μL (2 मिनट, 400 x g) पारित करके एक एसपीई कारतूस (सामग्री की तालिका देखें) प्राइम 5% एसिटोनिट्राइल / टीएफए के 0.1% के 300 μL (2 मिनट, 400 x g) के बाद।
  2. प्राइमेड एसपीई कारतूस को निस्पंदन कारतूस के आधार से कनेक्ट करें जिसमें फिर से घुलनशील या पचने वाले प्रोटीन होते हैं।
  3. एसपीई कारतूस (5 मिनट, कमरे के तापमान पर 800 एक्स जी) के माध्यम से प्रोटीन स्पिन करें। यदि विलायक ऊपरी कारतूस में रहता है, तो कारतूस को अपकेंद्रित्र में वापस करें और स्पिन दोहराएं।
    नोट: दूसरी बार एसपीई कारतूस के माध्यम से नमूना पास करने से वसूली में सुधार हो सकता है।
  4. कारतूस में पानी में 5% एसिटोनिट्राइल / 0.1% टीएफए के 300 μL जोड़ें। धोने के लिए, एसपीई कारतूस (2 मिनट, 2000 एक्स जी) के माध्यम से प्रवाह। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
  5. एलएमडब्ल्यू प्रोटीन या पचने वाले पेप्टाइड्स के लिए, 50% एसिटोनाइट्राइल / 0.1% टीएफए (5 मिनट, 2500 एक्स जी) के 300 μL बहकर नमूना निकालें।
  6. बरकरार प्रोटीन के लिए, 75% एसिटोनिट्राइल / 0.1% टीएफए के 300 μL का उपयोग करके एक अतिरिक्त क्षालन चरण के साथ चरण 8.5 का पालन करें। दो परिणामी अर्क को मिलाएं।
    नोट: चरण 8.6 वैकल्पिक है।

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Representative Results

चित्रा 4 एसीटोन का उपयोग करके डिस्पोजेबल फिल्टर कारतूस में प्रोटीन की शीशी-आधारित या कारतूस-सुविधाजनक वर्षा के बाद अपेक्षित एसडीएस कमी को सारांशित करता है। एसीटोन में पारंपरिक रातोंरात इनक्यूबेशन (-20 डिग्री सेल्सियस) की तुलना कमरे के तापमान (चरण 2), साथ ही सीएमडब्ल्यू वर्षा (चरण 4) पर तेजी से एसीटोन वर्षा प्रोटोकॉल से की जाती है। अवशिष्ट एसडीएस मिथाइलीन ब्लू सक्रिय पदार्थों (एमबीएएस) परख29 द्वारा मात्रा निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, 100 μL नमूना 100 μL MBAS अभिकर्मक (250 मिलीग्राम मेथिलीन नीला, 50 ग्राम सोडियम सल्फेट, 10 एमएल सल्फ्यूरिक एसिड, 1.0 एल के लिए पानी में पतला) के साथ संयुक्त किया गया था, इसके बाद 400 μL क्लोरोफॉर्म और यूवी / सभी दृष्टिकोण इष्टतम एमएस विश्लेषण की अनुमति देने के लिए एसडीएस को कम करते हैं।

मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटीन वसूली तेजी से एसीटोन वर्षा और सीएमडब्ल्यू वर्षा के बाद प्राप्त की जाती है, जैसा कि एक संसाधित खमीर कुल सेल लाइसेट के एसडीएस पेज विश्लेषण के माध्यम से चित्रा 5 में देखा गया है। एक डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस में वर्षा झिल्ली फिल्टर के ऊपर एकत्रित प्रोटीन को बनाए रखते हुए एसडीएस युक्त सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक पाइप करने की आवश्यकता को समाप्त करती है। लगातार वसूली तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों में सतह पर तैरनेवाला अंशों में पता चला कोई दृश्य बैंड के साथ, सभी वर्षा प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया जाता है।

चित्रा 6 अपेक्षित पैदावार की मात्रा निर्धारित करता है, जिसमें कोल्ड फॉर्मिक एसिड (चरण 6) का उपयोग करके अवक्षेपित प्रोटीन छर्रों का पुनरुत्थान शामिल है। सीएमडब्ल्यू वर्षा एक शीशी-आधारित दृष्टिकोण (चरण 5) में गोली को सावधानीपूर्वक संरक्षित करके मात्रात्मक वसूली प्रदान करती है, जो कारतूस (क्रमशः 100 ± 4% बनाम 101 ± 3%) का उपयोग करके प्राप्त की जाती है। एसीटोन-अवक्षेपित प्रोटीन छर्रों की वसूली एक निस्पंदन कारतूस से लाभान्वित होती है, जिसमें उपज में 15-20% सुधार देखा जाता है। शीशियों में, एकत्रित प्रोटीन से एसीटोन सतह पर तैरनेवाला का अलगाव अनिवार्य रूप से पीपी ट्यूब सतह पर गोली के पालन पर निर्भर करता है; निस्पंदन कारतूस इस चिंता को समाप्त करता है क्योंकि फिल्टर पाइपिंग के बिना अवक्षेपित प्रोटीन की उच्च वसूली सुनिश्चित करता है।

एलएमडब्ल्यू प्रोटीन और पेप्टाइड्स को कुशलतापूर्वक पुनर्प्राप्त करने के लिए, एसीटोन वर्षा प्रोटोकॉल को जेडएनएसओ4 के लिए एनएसीएल को प्रतिस्थापित करके और विलायक प्रतिशत को 97% तक बढ़ाकर संशोधित किया जाता है। एलएमडब्ल्यू प्रोटीन और पेप्टाइड्स26 की उच्च वसूली के लिए इस विशिष्ट नमक और कार्बनिक विलायक के उच्च स्तर के संयोजन की आवश्यकता होती है। जैसा कि चित्रा 7 में देखा गया है, कारतूस-आधारित प्रोटीन वर्षा शीशी-आधारित वर्षा के सापेक्ष गोजातीय प्लाज्मा के पेप्सिन-पचने वाले नमूने की बेहतर वसूली को दर्शाती है। डिस्पोजेबल स्पिन कारतूस एलएमडब्ल्यू पेप्टाइड्स के 90% से अधिक पुनर्प्राप्त कर सकते हैं। एनएसीएल को नियोजित करते समय कारतूस में उपज में अधिक महत्वपूर्ण अंतर नोट किए जाते हैं, उपज को अधिकतम करने के लिए नमक प्रकार के महत्व की पुष्टि करते हैं। एनएसीएल के विपरीत जेडएनएसओ4 को शामिल करने से एक एकत्रित प्रोटीन गोली होती है जो स्पिन कारतूस फिल्टर द्वारा अधिक आसानी से फंस जाती है।

एक विस्तृत गतिशील रेंज पर अवक्षेपण प्रोटीन की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, तीन मानक प्रोटीनों का मिश्रण संसाधित किया गया था: ई कोलाई से β-गैलेक्टोसिडेस (β-गैल), गोजातीय से साइटोक्रोम सी (साइट सी), और एस सेरेविसिया से एनोलेज (ईएनओ)। β-गैल: साइट सी: एनो का द्रव्यमान अनुपात 10,000: 10: 1 था। नमूनों में शुरू में कारतूस-आधारित वर्षा (चरण 5) से पहले एसडीएस का 2% था और ट्रिप्सिन (चरण 6 और 7) के साथ फिर से घुलनशील और पचाया गया था। शीशियों में तैयार किए गए नमूनों ने एक नियंत्रण के रूप में कार्य किया, जिसमें कोई एसडीएस नहीं था और वर्षा को छोड़ दिया गया था। सभी नमूने समकक्ष एसपीई सफाई (चरण 8) के अधीन थे। एमएस स्पेक्ट्रा के साथ एक संयुक्त डेटाबेस के खिलाफ खोज की गई थी जिसमें शामिल तीन प्रजातियों के सभी प्रोटीन शामिल थे (उपकरण और सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। 1% की पेप्टाइड झूठी खोज दर नियोजित की गई थी। एमएस द्वारा सभी तीन प्रोटीनों की पहचान की गई थी, क्रमशः β-गैल, साइट सी और ईनो के लिए 666, 28 और 35 अद्वितीय पेप्टाइड्स के साथ। चित्रा 8 प्रत्येक नमूने से सापेक्ष अनुपात (पेप्टाइड चोटी तीव्रता) की मात्रा निर्धारित करता है, 1 से ऊपर के अनुपात के साथ डिस्पोजेबल फिल्टर कारतूस में संसाधित नमूनों के लिए एक उच्च पेप्टाइड बहुतायत को दर्शाता है। परिणाम एसडीएस को प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो में शामिल करने, प्रोटीन हानि को कम करने (उदाहरण के लिए, संभावित सोखना से नमूना शीशी तक), और पेप्टाइड पैदावार को अधिकतम करने के लाभों को प्रदर्शित करते हैं।

गोजातीय यकृत एक स्थानीय किराने की दुकान पर खरीदा गया था। प्रोटीन को 1% एसडीएस के समाधान के साथ ऊतक निकालकर अलग किया गया था। इसके बाद, बरामद प्रोटिओम को अवक्षेपित किया गया, फिर से घुलनशील (यूरिया), और ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया, सभी एक डिस्पोजेबल कारतूस के भीतर। एमएस आयोजित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप ~ 8,000 प्रोटीन (~ 30,000 पेप्टाइड्स) की औसत की पहचान हुई। पेप्टाइड स्पेक्ट्रा और प्रोटीन समूहों के लिए 0.5% और 1.0% की झूठी खोज दर, गोजातीय डेटाबेस की खोज करते हुए नियोजित की गई थी। इस कारतूस-आधारित वर्कफ़्लो की तकनीकी प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन अतिव्यापी प्रोटीन पहचान के माध्यम से किया जाता है। एक आम पचने वाले नमूने के प्रतिकृति एमएस इंजेक्शन पहचाने गए प्रोटीन के साथ औसतन 78 ± 0.5% ओवरलैप प्राप्त करते हैं। तुलनात्मक रूप से, असतत कारतूस में स्वतंत्र रूप से तैयार किए गए नमूनों ने 76 ± 0.5% ओवरलैप प्राप्त किया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि विश्लेषण की कुल परिवर्तनशीलता की ओर नमूना तैयारी का योगदान मामूली है, जो पहले से ही एलसी-एमएस वाद्य दृष्टिकोण द्वारा योगदान दिया गया है। तीन तकनीकी प्रतिकृतियों (तीन डिस्पोजेबल कारतूस में स्वतंत्र रूप से संसाधित) से पहचाने गए गोजातीय प्रोटीन को उनके आणविक भार, हाइड्रोफोबिसिटी और आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु से संबंधित विशेषता थी, जो चित्रा 9 में दिखाया गया है। एक दो-तरफ़ा एनोवा तकनीकी प्रतिकृतियों में पहचाने गए प्रोटिओम में सांख्यिकीय अंतर निर्धारित नहीं कर सका। अंत में, चित्रा 10 तीन प्रतिकृति नमूना तैयारी भर में प्रोटीन प्रति पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या की तुलना करता है। इन रेखांकन (0.94-0.95) में सहसंबंध गुणांक नीचे-ऊपर एमएस विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी दृष्टिकोण की उच्च स्थिरता प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एसीटोन-अवक्षेपित प्रोटीन। 100 एमएम एनएसीएल के साथ संयुक्त प्रोटीन के 100 और 1,000 μg युक्त नमूने और 5 मिनट वर्षा समय के बाद 80% एसीटोन (ए) के साथ अवक्षेपित होते हैं और (बी) वर्षा और बाद में सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी द्वारा प्रोटीन वर्षा। चरण 4 के अनुसार प्रोटीन के 50 μg युक्त एक नमूना। (ए) चरण 4.4 के तुरंत बाद। (बी) चरण 4.8 के तुरंत बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन वर्षा के लिए एक डिस्पोजेबल दो चरण निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस की तस्वीरें। 100 μg प्रोटीन युक्त एक नमूना एनएसीएल के 100 एमएम और (ए) इकट्ठे निस्पंदन और एसपीई कारतूस में 80% एसीटोन के साथ संयुक्त किया गया था और (बी) प्रोटीन समुच्चय दिखाई देने तक 5 मिनट के लिए अवक्षेपित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटीन वर्षा के बाद एसडीएस कमी दक्षता। हटाए गए एसडीएस का प्रतिशत पारंपरिक प्रोटोकॉल (-20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर), तेजी से प्रोटोकॉल (कमरे के तापमान पर 2 मिनट इनक्यूबेशन), या क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / पानी (सीएमडब्ल्यू) वर्षा के साथ एसीटोन वर्षा से दिखाया गया है । इन नमूनों में शुरू में 0.5% एसडीएस (5,000 पीपीएम) शामिल थे, यह अनुमान लगाते हुए > इष्टतम एमएस विश्लेषण के लिए 99.8% एसडीएस हटाने की आवश्यकता है। अवशिष्ट एसडीएस मिथाइलीन ब्लू सक्रिय पदार्थों (एमबीएएस) परख द्वारा मात्रा निर्धारित की जाती है। त्रुटि पट्टियाँ तकनीकी प्रतिकृतियों (एन = 3) से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: वर्षा के माध्यम से कुल प्रोटिओम वसूली। एसडीएस पेज एस सेरेविसिया कुल प्रोटीन लाइसेट की वसूली को दर्शाता है, जो (ए) पारंपरिक एसीटोन वर्षा, (बी) क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / पानी की वर्षा, और (सी) तेजी से एसीटोन वर्षा द्वारा अवक्षेपित होता है। प्रोटीन बैंड विशेष रूप से गोली अंश में देखे जाते हैं, सतह पर तैरनेवाला (सुपर) में कोई दृश्यमान बैंड नहीं होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एक निस्पंदन कारतूस के भीतर सुपीरियर प्रोटीन वसूली। सेरेविसिया कुल प्रोटीन लाइसेट की वर्षा के लिए, डिस्पोजेबल स्पिन कारतूस एसीटोन और सीएमडब्ल्यू वर्षा के साथ मात्रात्मक वसूली की सुविधा प्रदान करता है। शीशी आधारित वर्षा के साथ उच्च वसूली भी संभव है, हालांकि सावधानीपूर्वक नमूना हेरफेर और पाइपिंग की आवश्यकता होती है। ठंड फॉर्मिक एसिड के साथ गोली के पुनरुत्थान के बाद एलसी-यूवी मूल्यांकन प्रोटीन वसूली यहां दिखाई गई है। त्रुटि पट्टियाँ तकनीकी प्रतिकृतियों (एन = 3) से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: कम आणविक भार पेप्टाइड्स के लिए उच्च वर्षा पैदावार। पेप्टाइड्स और प्रोटीन ≤5 केडीए के लिए एक संशोधित एसीटोन वर्षा प्रोटोकॉल में उच्चतम पैदावार प्राप्त करने के लिए 97% एसीटोन के साथ जेडएनएसओ4 के 100 एमएम युग्मन शामिल है। डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस द्वारा सुगम वर्षा सभी तीन वर्षा स्थितियों में पारंपरिक शीशी-आधारित वर्षा की तुलना में बेहतर वसूली को दर्शाती है। त्रुटि पट्टियाँ तकनीकी प्रतिकृतियों (एन = 3) से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: एसडीएस-आधारित वर्कफ़्लो में मानक प्रोटीन की उच्च वसूली। टुकी बॉक्स-एंड-व्हिस्कर एक नियंत्रण नमूने (कोई एसडीएस, कोई वर्षा नहीं) के सापेक्ष डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस में संसाधित एसडीएस युक्त प्रोटीन से बरामद पेप्टाइड्स के लिए सापेक्ष एमएस सिग्नल तीव्रता के30 भूखंड। नियोजित प्रोटीन एक विस्तृत एकाग्रता गतिशील रेंज-β-गैलेक्टोसिडेस: साइटोक्रोम सी: एनोलेज़ = 10,000: 10: 1 तक फैलाते हैं। बक्से के भीतर प्रत्येक चतुर्थक में वितरण का 25% होता है, जबकि त्रुटि सलाखों में वितरण का 95% शामिल होता है। माध्य को "+" और माध्यिका को क्षैतिज रेखा द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: तकनीकी प्रतिकृतियों से प्रोटीन वितरण की पहचान की। टुकी बॉक्स-एंड-व्हिस्कर भूखंड (ए) आणविक भार, (बी) हाइड्रोफोबिसिटी, और (सी) दो-चरण निस्पंदन और निष्कर्षण कारतूस में गोजातीय यकृत लाइसेट की ट्रिप्लिकेट तैयारी के बाद नीचे-ऊपर एलसी-एमएस / एमएस द्वारा पहचाने जाने वाले प्रोटीन के आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु की विशेषता है। दो-तरफ़ा एनोवा (पी < 0.05) द्वारा इन विशेषताओं में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था। बक्से के भीतर प्रत्येक चतुर्थक में वितरण का 25% होता है, जबकि त्रुटि सलाखों में वितरण का 95% शामिल होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: प्रारंभिक प्रतिकृतियों में एसडीएस-आधारित तैयारी वर्कफ़्लो के माध्यम से प्रति प्रोटीन पेप्टाइड आईडी का सहसंबंध। (ए) नमूने 1 और 2, (बी) नमूने 2 और 3, और (सी) नमूने 1 और 3 में नीचे-ऊपर प्रोटिओम प्रजनन क्षमता का विश्लेषण प्रति प्रोटीन पेप्टाइड एमएस पहचान की संख्या के आधार पर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इष्टतम एमएस लक्षण वर्णन तब प्राप्त किया जाता है जब अवशिष्ट एसडीएस 10 पीपीएम से नीचे समाप्त हो जाता है। जबकि वैकल्पिक दृष्टिकोण, जैसे कि एफएएसपी और ऑन-बीड पाचन, चर वसूली31,32,33 के साथ मात्रात्मक एसडीएस कमी प्रदान करते हैं, वर्षा का प्राथमिक उद्देश्य शुद्धता और उपज को एक साथ अधिकतम करना है। यह प्रोटीन गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला (एसडीएस युक्त) को प्रभावी ढंग से अलग करने पर निर्भर करता है। शीशी-आधारित वर्षा के साथ, एक बार सतह पर तैरनेवाला के थोक को पाइपिंग द्वारा हटा दिया जाता है, तो यह तेजी से संभावना है कि कुछ एकत्रित छर्रों गलती से खो जाते हैं। इस कारण से, अवशिष्ट विलायक (~ 20 μL) के अधिक महत्वपूर्ण अंश को पीछे छोड़ना और धोने का चरण34 जोड़ना आवश्यक है। धोने का कदम शीशी से अवशिष्ट विलायक को पतला और हटा देता है। विशेष रूप से सीएमडब्ल्यू के साथ, गोली बनने के बाद नमूना शीशी को भंवर करना अनावश्यक है। जोरदार आंदोलन के माध्यम से गोली को बाधित करने से आकस्मिक पाइपिंग से नुकसान की संभावना बढ़ने का अवांछित प्रभाव पड़ता है। यदि भंवर शामिल है (जैसा कि पिछले प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित है)35, शीशी टोपी के नीचे का पालन करने के लिए सीएमडब्ल्यू गोली के कुछ हिस्सों के लिए संभावित मौजूद है; एक बार सेंट्रीफ्यूज होने के बाद, गोली शीशी टोपी पर तय रहती है और इसके परिणामस्वरूप ~ 50% नुकसान हो सकता है।

तेजी से वर्षा पतला प्रोटिओम नमूनों की उच्च वसूली के साथ किया जा सकता है, आदर्श रूप से 0.01-2 मिलीग्राम / एमएल के बीच, या 1-200 μg के बीच एक इसी प्रोटीन द्रव्यमान के बीच। हालांकि, 0.01 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन से शुरू होने वाली मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वसूली 10 मिनट से 1 घंटे तक लंबे वर्षा समय से लाभान्वित हो सकती है, जो वर्षा वर्कफ़्लो की थ्रूपुट सीमाओं का प्रदर्शन करती है। आश्चर्यजनक रूप से, अधिक केंद्रित नमूने (10 मिलीग्राम / एमएल) उपज में सांख्यिकीय कमी दिखाते हैं, संभवतः आकस्मिक पाइपिंग नुकसान से। >10 μg प्रोटीन मानते हुए, शीशी (चित्रा 1 बी) के किनारे पर एक दृश्यमान गोली देखी जानी चाहिए। छोटी मात्रा, 1 μg तक, देखने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। यह प्रोटीन गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला पिपेट करने की क्षमता को चुनौती देता है। गोली से विलायक को अलग करने के लिए शीशी को एसीटोन के साथ उलटा (धीरे-धीरे) किया जा सकता है। सीएमडब्ल्यू के लिए, गोली मज़बूती से शीशी का पर्याप्त रूप से पालन नहीं करती है, जिससे सतह पर तैरनेवाला के डिकैंटिंग पर पाइपिंग का पक्ष लिया जाता है। शीशी-आधारित वर्षा के लिए, इच्छित नमूना और विलायक मात्रा को सुविधाजनक बनाने के लिए सबसे छोटी संभव माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के साथ काम करने की सिफारिश की जाती है। इस काम में नियोजित डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस में वर्षा 500 μL की अधिकतम मात्रा क्षमता प्रदान करती है, जिससे 100 μL तक नमूना मात्रा पर 80% एसीटोन के साथ प्रोटीन वर्षा को सक्षम किया जा सकता है। नमूना, नमक और विलायक की मात्रा तदनुसार समायोजित की जा सकती है यदि अनुशंसित सांद्रता बनाए रखी जाती है।

कार्बनिक विलायक-आधारित वर्षा से बरामद प्रोटीन गोली की शुद्धता नमूना मैट्रिक्स, बफर घटकों और वर्षा की स्थिति की जटिलता से सीमित है। उदाहरण के लिए, ग्लाइसिन (एसडीएस पेज पृथक्करण के लिए उपयोग किया जाता है) जैसे विशिष्ट बफर घटकों को 80% एसीटोन का उपयोग करके प्रोटीन के साथ सह-अवक्षेपित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, सीएमडब्ल्यू वर्षा के माध्यम से ग्लाइसिन घुलनशील रहता है। एसीटोन को डीएनए टुकड़े36,37 अवक्षेपित करने की सूचना दी गई है, संभावित रूप से बरामद गोली में अवांछित पृष्ठभूमि अशुद्धियों को जोड़ना। कम आणविक भार प्रोटीन और पेप्टाइड्स की वर्षा के लिए उपज को अधिकतम करने के लिए कार्बनिक विलायक के ऊंचे स्तर और एक विशिष्ट नमक प्रकार की आवश्यकता होती है। जबकि कई लवणों का पता लगाया गया है, जेडएनएसओ4 लगातार उच्च उत्पाद प्रदान करता है। यह नमक प्रोटीन की अनुपस्थिति में 97% एसीटोन में अवक्षेपित होगा। इस प्रकार, परिणामी प्रोटीन गोली में नमक की उच्च सांद्रता होती है। यह ध्यान दिया जाता है कि मात्रा द्वारा 90% एसीटोन को नियोजित करने से उच्च पेप्टाइड पैदावार भी प्राप्त होगी, हालांकि वसूली में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण गिरावट (~ 5%) की उम्मीद है। हालांकि, यह प्रत्येक 2 एमएल शीशी में अधिक महत्वपूर्ण नमूना मात्रा (180 μL तक, 1 M ZnSO4 के 20 μL के साथ) को संसाधित करने की अनुमति देता है। प्रोटीन गोली के साथ सह-अवक्षेपण मैट्रिक्स अशुद्धियों से परे, यह कहा जाना चाहिए कि विलायक वर्षा स्वाभाविक रूप से नमूना38,39 के विकृतीकरण का कारण बनती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक प्रोटीन या देशी एमएस वर्कफ़्लो की तैयारी के लिए लागू नहीं है। एसीटोन को ग्लाइसिन अवशेष40 पर सहसंयोजक प्रोटीन संशोधनों का कारण बनने और +98 यू द्रव्यमान शिफ्ट को प्रेरित करने की भी सूचना दी गई है, जो एल्डोल संक्षेपण एसीटोन41 का उपोत्पाद होने का अनुमान है।

प्रोटीन वर्षा के लिए एक निस्पंदन कारतूस को नियोजित करते समय, प्रोटीन गोली का अलगाव पीटीएफई झिल्ली फिल्टर के ऊपर समुच्चय के प्रतिधारण पर निर्भर करता है। इस झिल्ली की सरंध्रता एक आणविक भार कटऑफ फिल्टर (जैसा कि एफएएसपी में देखा गया है) से अधिक है, जो कम स्पिन समय के साथ प्रोटीन अलगाव की अनुमति देता है। कम स्पिन गति पर तेजी से समाधान हस्तांतरण पीटीएफई झिल्ली के उचित गीलेपन पर निर्भर करता है; कार्बनिक सॉल्वैंट्स आसानी से प्रवाहित होते हैं, हालांकि एक सूखा पीटीएफई फिल्टर जलीय सॉल्वैंट्स को बाधित करता है। यदि निस्पंदन कारतूस भरा हुआ प्रतीत होता है, तो झिल्ली को सीधे कार्बनिक विलायक (जैसे, आइसोप्रोपेनॉल) की एक छोटी मात्रा को फिल्टर में लागू करके फिर से गीला किया जाना चाहिए। प्रोटीन गोली के आकार और नियोजित नमूने की मात्रा के आधार पर, उच्च गति (3,000 एक्स जी तक) पर अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन या स्पिन की आवश्यकता हो सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी विलायक निस्पंदन कारतूस से गुजर चुके हैं।

इष्टतम परिस्थितियों के साथ वर्षा से प्रोटीन वसूली अंततः गोली पुन: घुलनशीलता की चुनौती से सीमित है, जिसमें कुछ विलायक विकल्प डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण और एलसी-एमएस के साथ संगत हैं। इसके अतिरिक्त, कई वर्षा की स्थिति जैसे कि कम तापमान के लिए लंबे समय तक एक्सपोजर और कसकर पैक गोली को अधिक सुखाने से फिर से घुलनशीलता चुनौतियोंमें योगदान होता है 40. यह ध्यान दिया जाता है कि सीएमडब्ल्यू प्रोटीन छर्रों आमतौर पर एसीटोन छर्रों की तुलना में कम घुलनशील होते हैं। 80% कोल्ड फॉर्मिक एसिड (चरण 6.2.2) द्वारा अवक्षेपित प्रोटीन की अधिकतम पुन: घुलनशीलता दक्षता पहले42 बताई गई है; ठंडा तापमान प्रोटीन संशोधन को रोकता है, जो अन्यथा केंद्रित फॉर्मिक एसिड43,44 में होता है। एसिड एकाग्रता को पतला करने से संशोधन प्रतिक्रिया भी धीमी हो जाती है। फॉर्मिक एसिड को टॉप-डाउन एमएस दृष्टिकोण के लिए या पेप्सिन के साथ एंजाइमी पाचन से पहले अनुशंसित किया जाता है। इस विलायक को नियोजित करने के लिए थोड़ा शारीरिक उपचार की आवश्यकता होती है; भंवर, संक्षिप्त सोनिकेशन, या दोहराने पाइपिंग के साथ संयुक्त होने पर केवल 5 μL (प्रोटीन गोली को कवर करने के लिए पर्याप्त) के अलावा पर्याप्त हो सकता है। इसी तरह, एसडीएस पेज द्वारा विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों के लिए, एसडीएस युक्त लैमली बफर में फिर से भंग करना अत्यधिक प्रभावी है, जब हीटिंग से पहले नमूने के मामूली मिश्रण के साथ संयुक्त किया जाता है। हालांकि, ये सॉल्वैंट्स ट्रिप्सिन के साथ असंगत हैं। ट्रिप्सिन पाचन से पहले 8 एम यूरिया के साथ पुनर्सुलभीकरण की सिफारिश की जाती है, यह सुनिश्चित करते हुए कि यूरिया ताजा तैयार किया गया है (उसी दिन)। निस्पंदन कारतूस के भीतर प्रोटीन पुन: घुलनशीलता के लिए 50 μL बफर की न्यूनतम मात्रा की सिफारिश की जाती है ताकि चाओट्रोपिक विलायक और गोली के बीच संपर्क को अधिकतम किया जा सके, साथ ही सोनिकेशन, रिपीट पाइपिंग और / वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रोटीन को फिर से घुलनशील बनाने के लिए ट्रिप्सिन का शोषण करते हैं, जिसका अर्थ है कि एंजाइम जोड़ से पहले प्रोटीन को पूरी तरह से फिर से भंग करने की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, यह दृष्टिकोण पूर्वाग्रह पाचन कर सकता है, अधिक घुलनशील प्रजातियों के पक्ष में है जबकि हाइड्रोफोबिक प्रोटीन कम पाचन समय45 का अनुभव करते हैं। ट्रिस या अमोनियम बाइकार्बोनेट जैसे बुनियादी बफर के साथ 8 एम यूरिया के अलावा, पाचन के बाद के नमूने की सफाई कदम की मांग करता है। इस तरह के नमूना योजक के लिए, उलट चरण कॉलम सफाई आदर्श है। इस अध्ययन में नियोजित डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस एक विनिमेय उलट चरण एसपीई कारतूस के साथ पूरक है। यह कारतूस भी आदर्श रूप से विलायक विनिमय के लिए अनुकूल है, फॉर्मिक एसिड रीसोल्यूबिलाइजेशन प्रोटोकॉल के मामले में। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोई भी ठोस चरण निष्कर्षण दृष्टिकोण नमूना वसूली में अंतर्निहित हानि से जुड़ा हुआ है। इसलिए, उपयोगकर्ता को वसूली के लाभों और उनके प्रयोग के लिए अतिरिक्त शुद्धिकरण का वजन करना चाहिए।

यह अनुमान लगाया गया है कि ये प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक्स शोधकर्ताओं को अपने डिटर्जेंट-आधारित वर्कफ़्लो को सुव्यवस्थित करने में सक्षम बनाएंगे, प्रोटिओम निष्कर्षण के लिए एसडीएस पर पूंजीकरण करेंगे। प्रारंभिक रणनीतियां जो पूर्ण प्रोटिओम की लगातार वसूली की सुविधा प्रदान करती हैं, महत्वपूर्ण हैं। एक दो-चरण स्पिन कारतूस तेजी से, मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटिओम नमूना अलगाव के अवसर को सरल बनाता है। इस तरह का दृष्टिकोण नैदानिक सेटिंग्स या बड़े पैमाने पर अनुसंधान पहलजैसे नमूना थ्रूपुट का त्याग किए बिना कठोर विश्लेषण की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी होगा। इन दृष्टिकोणों के भविष्य के अनुप्रयोगों में बायोमार्कर खोज, पता लगाना, सटीक मात्रा और दवा और दवा लक्ष्य खोज शामिल हो सकते हैं।

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Disclosures

डौसेट प्रयोगशाला ने इस अध्ययन में नियोजित प्रोट्रैप एक्सजी की कल्पना और पेटेंट कराया। एएडी प्रोटियोफॉर्म साइंटिफिक का एक संस्थापक भागीदार भी है, जिसने नमूना तैयारी कारतूस का व्यावसायीकरण किया।

Acknowledgments

इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक एमएस डेटा के अधिग्रहण में उनके योगदान के लिए बीमार बच्चों के अस्पताल (टोरंटो, कनाडा) में जैव सूचना विज्ञान समाधान इंक (वाटरलू, कनाडा) और एसपीएआरसी बायोसेंटर (आणविक विश्लेषण) का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

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References

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मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले मजबूत प्रोटिओम शुद्धिकरण के लिए कार्बनिक विलायक-आधारित प्रोटीन वर्षा
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Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

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