Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Organisk opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning til robust proteomrensning forud for massespektrometri

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

Denne protokol beskriver opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning under kontrollerede forhold for robust og hurtig genvinding og oprensning af proteomprøver inden massespektrometri.

Abstract

Mens flere fremskridt inden for massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mere pålidelige front-end-tilgange til at isolere, berige og behandle proteiner foran MS afgørende for en vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingenvinding og resterende urenheder såsom overfladeaktive stoffer er skadelige for MS-analyse. Proteinudfældning betragtes ofte som upålidelig, tidskrævende og teknisk udfordrende at udføre sammenlignet med andre prøveforberedelsesstrategier. Disse bekymringer overvindes ved at anvende optimale proteinudfældningsprotokoller. For acetoneudfældning er kombinationen af specifikke salte, temperaturregulering, opløsningsmiddelsammensætning og udfældningstid kritisk, mens effektiviteten af chloroform / methanol / vandudfældning afhænger af korrekt pipettering og hætteglasmanipulation. Alternativt er disse nedbørsprotokoller strømlinede og halvautomatiske i en engangsspinpatron. De forventede resultater af opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning i det konventionelle format og ved hjælp af en engangsfiltrerings- og ekstraktionspatron i to trin er illustreret i dette arbejde. Dette omfatter den detaljerede karakterisering af proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS/MS-analyse. Den overlegne ydeevne af SDS-baserede arbejdsgange demonstreres også i forhold til ikke-forurenet protein.

Introduction

Proteomanalyse ved massespektrometri er blevet stadig strengere på grund af den forbedrede følsomhed, opløsning, scanningshastighed og alsidighed af moderne MS-instrumenter. Ms-fremskridt bidrager til større proteinidentifikationseffektivitet og mere præcis kvantificering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering kræver forskere en tilsvarende konsistent front-end-prøveforberedelsesstrategi, der er i stand til kvantitativ genopretning af proteiner med høj renhed på minimal tid på tværs af alle faser af arbejdsgangen 6,7,8,9,10,11 . For nøjagtigt at afspejle et biologisk systems proteomstatus skal proteiner isoleres fra den oprindelige prøvematrix på en effektiv og upartisk måde. Til dette formål sikrer herunder et denaturerende overfladeaktivt stof, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), effektiv proteinekstraktion og opløseliggørelse12. SDS forstyrrer imidlertid kraftigt elektrosprayionisering, hvilket forårsager alvorlig MS-signalundertrykkelse, hvis den ikke elimineres korrekt13.

Forskellige SDS-udtømningsstrategier er tilgængelige til efterfølgende proteomanalyse, såsom retention af proteiner over et molekylærvægtafskæringsfilter indeholdt i engangsspinpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveforberedelsesmetode (FASP) foretrækkes, da den effektivt udtømmer SDS under 10 ppm, hvilket letter optimal MS. Proteingenvinding med FASP er imidlertid variabel, hvilket førte til udforskning af andre teknikker. Kromatografiske tilgange, der selektivt fanger protein (eller overfladeaktivt stof), har udviklet sig til forskellige praktiske patroner eller perlebaserede formater 17,18,19,20,21. I betragtning af disse enkle og (ideelt set) konsistente strategier til proteinrensning overses den klassiske tilgang til proteinudfældning med organiske opløsningsmidler ofte som en lovende tilgang til proteinisolering. Mens udfældning af opløsningsmidler har vist sig at nedbryde SDS under kritiske niveauer med succes, har proteingenvinding længe været en bekymring for denne tilgang. Flere grupper har observeret en proteingendannelsesbias med uacceptabelt lave nedbørsudbytter som funktion af proteinkoncentration, molekylvægt og hydrofobicitet22,23. På grund af mangfoldigheden af nedbørsprotokoller, der er rapporteret i litteraturen, blev der udviklet standardiserede nedbørsforhold. I 2013 rapporterede Crowell et al. først afhængigheden af ionstyrke på udfældningseffektiviteten af proteiner i 80% acetone24. For alle undersøgte proteiner viste tilsætning af op til 30 mM natriumchlorid sig at være afgørende for at maksimere udbyttet (op til 100% genopretning). For nylig viste Nickerson et al., at kombinationen af endnu højere ionstyrke (op til 100 mM) med forhøjet temperatur (20 ° C) under acetoneudfældning gav næsten kvantitativ genopretning i 2-5 min25. Et lille fald i genopretningen af proteiner med lav molekylvægt (LMW) blev observeret. Derfor demonstrerede en efterfølgende rapport fra Baghalabadi et al. den vellykkede genopretning af LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved at kombinere specifikke salte, især zinksulfat, med et højere niveau af organisk opløsningsmiddel (97% acetone)26.

Mens raffinering af udfældningsprotokollen giver en mere pålidelig proteinrensningsstrategi for MS-baseret proteomics, afhænger succesen med konventionel nedbør stærkt af brugerteknik. Et primært mål med dette arbejde er at præsentere en robust nedbørsstrategi, der letter isoleringen af proteinpellet fra den forurenende supernatant. En engangsfiltreringspatron blev udviklet til at eliminere pipettering ved at isolere aggregeret protein over et porøst PTFE-membranfilter27. MS-interfererende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort centrifugeringstrin med lav hastighed. Engangsfilterpatronen tilbyder også en udskiftelig SPE-patron, som letter efterfølgende prøveoprydning efter resolubilisering og valgfri proteinfordøjelse forud for massespektrometri.

En række anbefalede proteomudfældningsarbejdsgange præsenteres her, herunder modificeret acetone og chloroform / methanol / vand28 protokoller, i et konventionelt (hætteglasbaseret) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraktionspatron. De resulterende proteingenvindinger og SDS-udtømningseffektivitet fremhæves sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdækning for at demonstrere det forventede resultat fra hver protokol. De praktiske fordele og ulemper forbundet med hver tilgang diskuteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Materielle overvejelser og prøveforberedelse

  1. Brug kun opløsningsmidler med høj renhed (acetone, chloroform, methanol) (>99,5%) og kemikalier, fri for overskydende fugt.
  2. Forbered natriumchlorid- og zinksulfatopløsninger (1 M) i vand.
    BEMÆRK: Saltopløsninger kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur, så længe de er fri for forurenende eller mikrobiel vækst.
  3. Brug det mindste hætteglas med polypropylen (PP) mikrocentrifuge, der er tilstrækkeligt til at bevare det krævede volumen prøve og opløsningsmidler til at inducere udfældning.
  4. Det skal sikres, at SDS-koncentrationen i den prøve, der skal udfældes, ikke er større end 2 % (w/v). Hvis SDS er højere, fortyndes prøven med vand.
  5. Sørg for en proteinkoncentration mellem 0,01 og 10 g / l for optimal udfældningseffektivitet.
    BEMÆRK: Den optimale masse til udfældning varierer mellem 1-100 μg protein.
  6. Sørg for, at alle opløsningsmidler og opløsninger er fri for partikler før brug. Udfør enten et filtreringstrin (<0,5 μm) eller centrifugeringstrin (10.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur) for at fjerne uopløste partikler.
  7. Hvis der kræves reduktion af disulfidbinding og alkylering, skal du udføre disse trin inden proteinudfældning. Overskydende reducerende og alkylerende reagenser fjernes gennem udfældningsprocessen.
  8. Udfælde proteinerne ved at vælge og udføre en af protokollerne (trin 2, 3, 4 eller 5).

2. Hurtig (hætteglasbaseret) proteinudfældning med acetone

  1. Pipettere 90 μL (partikelfrit) protein eller proteomopløsning i et PP mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes 10 μL 1 M vandig NaCl.
    BEMÆRK: Hvis proteomekstraktets ionstyrke allerede overstiger 100 mM, er der ikke behov for yderligere salt.
  2. Der føres 400 μL acetone ind i prøven. Sæt hætteglasset på, og bank forsigtigt på hætteglasset for at kombinere opløsningsmidlerne. Kraftig blanding er ikke påkrævet.
    BEMÆRK: Mængden af protein, salt og acetone kan øges, så længe det relative forhold mellem hver opretholdes.
  3. Lad hætteglasset inkubere uforstyrret ved stuetemperatur i mindst 2 min.
    BEMÆRK: Længere inkubationer, herunder dem ved reduceret temperatur (f.eks. Konventionel acetoneudfældning anvender nedbør natten over i fryseren), kan resultere i dannelse af større (synlige) aggregerede proteinpartikler (figur 1A), som generelt ikke forbedrer total proteingenvinding.
  4. Efter inkubation anbringes prøver i en centrifuge, idet hætteglassets orientering noteres. Centrifuger i mindst 2 min, ved 10.000 x g eller højere ved stuetemperatur.
  5. Tag hætteglasset ud, og dekanter forsigtigt supernatanten ved langsomt at vende hætteglasset til en affaldsbeholder. Rør det omvendte hætteglas til et papirhåndklæde for at trække resterende solvens fra hætteglasset.
    FORSIGTIG: Affaldsopløsningsmidler skal opbevares og kasseres i henhold til passende protokoller.
  6. For SDS-holdige prøver skal der dispenseres 400 μL frisk acetone, idet du skal være forsigtig med ikke at forstyrre pelleten.
    BEMÆRK: Trin 2.6 er valgfrit.
    1. Prøven centrifugeres straks (10.000 x g eller derover i 1 min. ved stuetemperatur), og hætteglasset anbringes i rotoren i samme retning som det indledende centrifugeringspunkt. Vaskemidlet dekanteres som beskrevet i trin 2.5.
  7. Lad prøven tørre helt med hætten åben (~1 min). Opsummer hætteglasset igen, og fortsæt med pelletsopløselighed (trin 6).

3. Udfældning af peptider med lav molekylvægt (LMW) (ZnSO4 + acetone)

  1. Der dispenseres 54 μL proteomekstrakt til et hætteglas med 2 ml PP, og der tilsættes derefter 6 μL 1 M ZnSO4.
    BEMÆRK: Optimal genopretning af LMW peptider (≤5 kDa) opnås ved tilsætning af acetone til en endelig 97 volumenprocent. Hvis man antager et hætteglas med 2 ml PP, er det maksimale indledende prøvevolumen 54 μL.
  2. Der tilsættes 1940 μL acetone til en endelig volumenprocent på 97%. Hvirvl forsigtigt for at blande, og lad stå uforstyrret på bordpladen i minimum 2 min.
  3. Centrifuger (10.000 x g i 1 min ved stuetemperatur), og fjern supernatanten ved at vende hætteglasset om og derefter røre hætteglasset til et køkkenrulle.
  4. For SDS-holdige prøver skal der dispenseres 400 μL frisk acetone, idet du skal være forsigtig med ikke at forstyrre pelleten.
    BEMÆRK: Trin 3.4 er valgfrit.
    1. Prøven centrifugeres straks i henhold til trin 3.3, og hætteglasset anbringes i rotoren i samme retning som det indledende centrifugeringspunkt. Vaskemidlet dekanteres som beskrevet i trin 3.3.
  5. Re-opløse den resulterende tørre pellet i et vandigt opløsningsmiddel med kort hvirveldannelse eller sonikering (~ 5 min).

4. Proteinudfældning med chloroform/methanol/vand (CMW)

  1. 100 μL af protein- eller proteomopløsningen hældes i et PP-hætteglas. Der tilsættes 400 μL methanol efterfulgt af 100 μL chloroform. Sæt hætteglasset og hvirvelen kort på hylden for at blande.
    BEMÆRK: Til CMW-nedbør foretrækkes 1,5 ml hætteglas med smalle bunde (figur 2A).
    FORSIGTIG: Chloroformopløsningsmiddel skal håndteres i en passende ventilationshætte. Alle opløsningsmidler, der kommer i kontakt med chloroform, skal behandles som halogenaffald, når de bortskaffes.
  2. Dispenser hurtigt 300 μL vand direkte ind i midten af hætteglasset. Sæt hætteglasset på låg. Lad prøven sidde uforstyrret på bordpladen i 1 min.
    BEMÆRK: Løsningen vises straks overskyet hvid. Undgå at blande hætteglasset efter tilsætning af vand.
  3. Pp-hætteglasset anbringes i en centrifuge, og centrifugering i mindst 5 minutter (10.000 x g eller højere ved stuetemperatur).
    BEMÆRK: Når de er centrifugeret, dannes to synlige opløsningsmiddellag (øverste lag = methanol / vand; bund = chloroform). En fast proteinpellet dannes ved opløsningsmiddelgrænsefladen (figur 2A).
  4. Brug en stor (1 ml) mikropipetspids og hold hætteglasset ved ~ 45 °, fjern ~ 700 μL af opløsningsmidlet fra det øverste lag med en ensartet hastighed.
  5. Brug en mindre (200 μL) mikropipetspids til at fortsætte med at fjerne det øverste opløsningsmiddellag fra hætteglasset med ~45° hældning. Pipette i en kontinuerlig bevægelse, indtil det øverste opløsningsmiddellag danner en perle i hætteglasset.
  6. Der tilsættes 400 μL frisk methanol til hætteglasset med prøven uden at forstyrre pelleten ved at hælde solvensen ned på siden af hætteglasset.
  7. Sæt hætteglasset på låg. Kombiner opløsningsmiddellagene ved forsigtigt at vippe hætteglasset for at hvirvle opløsningsmidlerne sammen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at forstyrre pelleten. Hvirvl ikke hætteglasset.
  8. Bemærk orienteringen af hætteglasset i rotoren, centrifuger i mindst 10 minutter (10.000 x g ved stuetemperatur). Proteinpellet klæber til bunden af hætteglasset (figur 2B).
  9. Hætteglasset tippes ved 45°, med pelleten nedad. Anbring pipettespidsen langs hætteglassets øverste kant, og fjern supernatanten med en 1 ml mikropipetspids med en langsom, men kontinuerlig hastighed. Opbevar ~ 20 μL opløsningsmiddel i hætteglasset.
  10. Proteinpillen vaskes til SDS-holdige prøver ved langsomt at dosere 400 μL frisk methanol. Hvirvl ikke hætteglasset.
    1. Fortsæt direkte med centrifugering (10.000 x g i 2 min ved temperatur), og placer hætteglasset i rotoren med samme retning som det indledende spin.
  11. Opløsningsmidlet fjernes i henhold til trin 4.9. Lad prøven lufttørre i en røg, indtil det resterende opløsningsmiddel fordamper.
  12. Se de anbefalede resolubiliseringsprocedurer i trin 6.

5. Proteinudfældning ved hjælp af en engangsfiltreringspatron

BEMÆRK: Hver opløsningsmiddelbaseret udfældningsprotokol, der er beskrevet i trin 2-5, kan udføres i en totrins filtrerings- og ekstraktionspatron (se materialetabel).

  1. Med stikket fastgjort til den øverste filtreringspatron (figur 3A) skal du dispensere det ønskede volumen af det ekstraherede proteom, salt og opløsningsmiddel som beskrevet i en af de tre muligheder nedenfor.
    1. (Mulighed 1) Til proteinudfældning med acetone kombineres 90 μL protein- eller proteomopløsning, 10 μL 1 M vandig NaCl og 400 μL acetone. Inkuber i minimum 2 min på bordpladen.
      BEMÆRK: Der vil udvikle sig et synligt bundfald til koncentrerede proteinprøver (1 g/l) (figur 3B).
    2. (Mulighed 2) Til LMW-peptidudfældning kombineres 15 μL af prøven, 1,5 μL 1 M ZnSO4 og 485 μL acetone. Inkuber i minimum 2 min på bordpladen.
      BEMÆRK: En saltkoncentration på 90 mM i den vandige prøve vil ikke påvirke restitutionen i forhold til de 100 mM, der anbefales i trin 3.
    3. (Mulighed 3) Til CMW-udfældning tilsættes 50 μL proteomekstrakt, 200 μL methanol og 50 μL chloroform. Sæt hætteglasset på, og hvirvlen kort for at kombinere.
      1. Dispenser hurtigt 150 μL vand direkte ind i midten af hætteglasset. Inkuber i 1 minut på bordpladen.
  2. Centrifuger i 2 minutter ved 2.500 x g ved stuetemperatur med stikket stadig fastgjort til filtreringspatronen.
  3. Vend patronen, og skru derefter stikket ud af patronbasen.
  4. Anbring filtreringspatronen i et rent hætteglas, og vend tilbage til centrifugen. Centrifuger i 3 min ved 500 x g ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømningsopløsningsmiddelet fra det nederste hætteglas.
    BEMÆRK: Hvis der er noget opløsningsmiddel tilbage i den øverste filtreringspatron, skal du vende tilbage til centrifugen og udføre en ekstra centrifugering.
  5. Proteinpillen vaskes ved tilsætning af 400 μL acetone til filtreringspatronen (ved CMW-udfældning, trin 5.1.3 tilsættes 400 μL methanol).
  6. Centrifuger i 3 minutter ved 500 x g ved stuetemperatur, eller indtil der ikke er noget opløsningsmiddel tilbage i den øverste cylinderampul.
  7. Opsuge udfældningspilleren igen som beskrevet i trin 6.

6. Resolubilisering af proteinpellet

  1. Våd membranen i bunden af filtreringspatronen ved at dispensere 2-5 μL isopropanol direkte til membranen umiddelbart før de nedenfor beskrevne resolubiliseringsprotokoller.
  2. Følg en af følgende resolubiliseringsmetoder.
    1. (Mulighed 1) Tilsæt mindst 20 μL vandig buffer indeholdende ≥2% SDS til filtreringspatronen. Cap og hvirvel kraftigt (~ 1 min). Alternativt sonikeres (>10 min) for at sprede proteinpellet.
      1. Prøven opvarmes ved 95 °C i 5 min. Gentag blandingstrinnet efter opvarmning.
        BEMÆRK: Laemmli gel loading buffer kan re-opløse protein pellet. SDS-holdige prøver er imidlertid uforenelige med trypsinfordøjelse og omvendt fase LC og MS.
    2. (Mulighed 2) Forbered en opløsning af 80% (v / v) myresyre i vand. Præchill syreopløsningen (-20 °C) samt filtreringspatronen indeholdende udfældet protein.
      1. Hæld 50 μL kold myresyre i patronen; hætte og hvirvel i 30 s. Vend tilbage til fryseren (-20 °C) i 10 min.
      2. Vortex patronen igen i 30 s. Gentag derefter køle- og blandingscyklussen en gang til (10 min, -20 °C, 30 s hvirvel).
      3. Tilsæt vand til en endelig 500 μL, fortynding af myresyren til 8%.
        BEMÆRK: Den kolde myresyreprotokol er uforenelig med efterfølgende trypsinfordøjelse, men er kompatibel med LC-MS.
    3. (Mulighed 3) Der tilsættes 50 μL frisklavet 8 M urinstof i vand til filtreringspatronen. Soniker i 30 min.
      1. Lad patronen inkubere på bordpladen i 1 time (op til natten).
      2. Fortynd 8 M urinstof mindst 5 gange med vand eller passende buffer.
        BEMÆRK: Når den er fortyndet, er urinstofopløselighedsprotokollen kompatibel med efterfølgende trypsinfordøjelse såvel som LC-MS.

7. Protein fordøjelse

  1. Til bottom-up MS-analyse skal du udsætte de re-opløselige proteiner for enzymatisk fordøjelse ved hjælp af en af de to metoder, der er nævnt nedenfor.
    1. (Mulighed 1) Til resolubilisering af myresyre reduceres det oprindelige volumen på 80% myresyre i trin 6.2.2.1 til 25 μL. I trin 6.2.2.3 anvendes 375 μL vand til at fortynde myresyren til 5 % (v/v).
    2. Hæld pepsin i cylinderampullen i et omtrentligt protein/enzymforhold på 50:1. Med et stik fastgjort til filtreringspatronen inkuberes prøven natten over ved stuetemperatur.
  2. (Mulighed 2) Til resolubilisering i urinstof sikres en pH-værdi på mellem 8 og 8,3 med inklusion af 100 mM Tris eller ammoniumbicarbonat i trin 6.2.3.2.
    1. Der tilsættes trypsin i et omtrentligt protein til enzymmasseforhold på 50:1. Med et stik fastgjort til patronen inkuberes prøven natten over i et varmtvandsbad ved 37 °C.
    2. Afslut fordøjelsen ved at forsure opløsningen med 10% TFA til en endelig 1%.
  3. Det pepsin- eller trypsinfordøjede protein genvindes ved at fjerne proppen fra bunden af filteret og centrifugere cylinderampullen i et rent hætteglas (2 min, 5000 x g, stuetemperatur).

8. SPE-oprydning

BEMÆRK: Ved yderligere prøveafsaltning efter fordøjelse eller udskiftning af opløsningsmidler kan prøven underkastes omvendt faseoprydning som beskrevet.

  1. En SPE-patron (se materialetabel) primer ved at overføre 300 μL methanol (2 min, 400 x g) efterfulgt af 300 μL 5 % acetonitril/0,1 % TFA (2 min, 400 x g).
  2. Den grundede SPE-patron sluttes til bunden af filtreringspatronen, der indeholder re-opløseligt eller fordøjet protein.
  3. Centrifuger proteinet gennem SPE-cylinderampullen (5 min, 800 x g ved stuetemperatur). Hvis der forbliver opløsningsmiddel i den øverste patron, skal du sætte cylinderampullen tilbage i centrifugen og gentage centrifugeringen.
    BEMÆRK: Hvis prøven føres gennem SPE-cylinderampullen en ekstra gang, kan det forbedre restitutionen.
  4. Der tilsættes 300 μL 5 % acetonitril/0,1 % TFA i vand til cylinderampullen. For at vaske, flow gennem SPE patronen (2 min, 2000 x g). Kassér gennemstrømningen.
  5. For LMW-proteiner eller fordøjede peptider elueres prøven ved at strømme 300 μL 50% acetonitril / 0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
  6. For intakte proteiner skal du følge trin 8.5 med et yderligere elueringstrin ved hjælp af 300 μL 75% acetonitril / 0,1% TFA. Kombiner de to resulterende ekstrakter.
    BEMÆRK: Trin 8.6 er valgfrit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 opsummerer den forventede SDS-udtømning efter hætteglasbaseret eller patron-faciliteret udfældning af proteiner i en engangsfilterpatron ved anvendelse af acetone. Konventionel inkubation natten over (-20 °C) i acetone sammenlignes med den hurtige acetoneudfældningsprotokol ved stuetemperatur (trin 2) samt CMW-udfældning (trin 4). Resterende SDS blev kvantificeret ved methylenblåt aktive stof (MBAS) assay29. Kort fortalt blev 100 μL prøve kombineret med 100 μL MBAS reagens (250 mg methylenblåt, 50 g natriumsulfat, 10 ml svovlsyre, fortyndet i vand til 1,0 L), efterfulgt af tilsætning af 400 μL chloroform og absorbansmåling af det organiske lag ved 651 nm på et UV/Vis-spektrofotometer. Alle tilgange reducerer SDS for at muliggøre optimal MS-analyse.

Kvantitativ og reproducerbar proteingenvinding opnås efter hurtig acetoneudfældning og CMW-udfældning, som det ses i figur 5 gennem SDS PAGE-analyse af et forarbejdet gær totalcellelysat. Udfældning i en engangsfiltreringspatron eliminerer behovet for omhyggeligt at pipettere den SDS-holdige supernatant, mens de aggregerede proteiner bevares over et membranfilter. Konsekvent genopretning opnås med alle udfældningsprotokoller, uden synlige bånd detekteret i supernatantfraktionerne på tværs af tre uafhængige replikater.

Figur 6 kvantificerer de forventede udbytter, herunder resolubilisering af udfældede proteinpiller ved hjælp af kold myresyre (trin 6). CMW-udfældning giver kvantitativ genvinding ved omhyggeligt at bevare pelleten i en hætteglasbaseret tilgang (trin 5), hvilket svarer til den, der opnås ved anvendelse af patronen (henholdsvis 100 ± 4% vs. 101 ± 3%). Genvinding af acetoneudfældede proteinpellets drager fordel af en filtreringspatron med en 15-20% forbedring i udbyttet observeret. I hætteglas er isolering af acetonesupernatanten fra det aggregerede protein i det væsentlige afhængig af pelletens vedhæftning til PP-røroverfladen; filtreringspatronen eliminerer denne bekymring, da filteret sikrer høj genvinding af udfældet protein uden pipettering.

For effektivt at genvinde LMW-proteiner og peptider modificeres acetoneudfældningsprotokollen ved at erstatte NaCl med ZnSO4 og hæve opløsningsmiddelprocenten til 97%. Kombination af dette specifikke salt og højere niveauer af organisk opløsningsmiddel er nødvendige for høj genvinding af LMW-proteiner og peptider26. Som det ses i figur 7, viser patronbaseret proteinudfældning overlegen genvinding af en pepsinfordøjet prøve af kvægplasma i forhold til hætteglasbaseret udfældning. Engangsspinpatronen kan genvinde over 90% af LMW peptider. Mere signifikante forskelle i udbytte bemærkes i patronen ved anvendelse af NaCl, hvilket bekræfter vigtigheden af salttype for at maksimere udbyttet. Inkludering af ZnSO4 i modsætning til NaCl resulterer i en aggregeret proteinpellet, der lettere fanges af spinpatronfilteret.

For at vurdere effekten af udfældende proteiner over et bredt dynamisk område blev en blanding af tre standardproteiner behandlet: β-galactosidase (β-gal) fra E. coli, cytokrom c (Cyt c) fra kvæg og enolase (Eno) fra S. cerevisiae. Masseforholdet mellem β-gal:Cyt c:Eno var 10.000:10:1. Prøverne indeholdt oprindeligt 2% SDS før patronbaseret udfældning (trin 5) og blev genopløseliggjort og fordøjet med trypsin (trin 6 og 7). Prøver fremstillet i hætteglas fungerede som en kontrol, der ikke havde nogen SDS og udelod nedbøren. Alle prøver blev underkastet tilsvarende SPE-oprydning (trin 8). Bottom-up MS blev udført, hvor MS/MS-spektre blev søgt mod en kombineret database, der indeholdt alle proteiner fra de tre involverede arter (se Materialetabel for instrument- og softwareplatforme). En peptid falsk opdagelsesrate på 1% blev anvendt. Alle tre proteiner blev identificeret af MS med henholdsvis 666, 28 og 35 unikke peptider til β-gal, Cyt c og Eno. Figur 8 kvantificerer det relative forhold (peptidtopintensitet) fra hver prøve, med et forhold over 1, der afspejler en højere peptidmængde for prøver behandlet i engangsfilterpatronerne. Resultaterne viser fordelene ved at inkorporere SDS i en proteomics-arbejdsgang, minimere proteintab (f.eks. fra potentiel adsorption til prøvehætteglasset) og maksimere peptidudbyttet.

Kvæglever blev indkøbt i en lokal købmand. Proteinerne blev isoleret ved at ekstrahere vævet med en opløsning af 1% SDS. Derefter blev det genvundne proteom udfældet, re-opløseligt (urinstof) og fordøjet med trypsin, alt sammen i en engangspatron. Bottom-up LC-MS / MS blev udført, hvilket resulterede i identifikation af et gennemsnit på ~ 8.000 proteiner (~ 30.000 peptider). Falske opdagelsesrater på 0,5% og 1,0% for peptidspektre og proteingrupper blev anvendt ved søgning i kvægdatabasen. Den tekniske reproducerbarhed af denne patronbaserede arbejdsgang vurderes gennem overlappende proteinidentifikationer. De replikerede MS-injektioner af en fælles fordøjet prøve opnår i gennemsnit 78 ± 0,5% overlapning med de identificerede proteiner. Til sammenligning opnåede prøver uafhængigt fremstillet i diskrete patroner 76 ± 0,5% overlapning. Disse data tyder på, at prøveforberedelsens bidrag til analysens samlede variabilitet er mindre i forhold til det, der allerede er bidraget af LC-MS instrumentelle tilgang. De kvægproteiner, der blev identificeret fra tre tekniske replikater (behandlet uafhængigt i tre engangspatroner), blev yderligere karakteriseret med hensyn til deres molekylvægt, hydrofobicitet og isoelektriske punkt, vist i figur 9. En tovejs ANOVA kunne ikke bestemme statistiske forskelle i de identificerede proteomer på tværs af de tekniske replikater. Endelig sammenligner figur 10 antallet af identificerede peptider pr. protein på tværs af de tre replikatprøvepræparater. Korrelationskoefficienterne i disse grafer (0,94-0,95) viser den høje konsistens af prøveforberedelsesmetoden til bottom-up MS-analyse.

Figure 1
Figur 1: Acetoneudfældede proteiner. Prøver indeholdende 100 og 1.000 μg protein kombineret med 100 mM NaCl og udfældet med 80 % acetone (A) efter 5 minutters udfældningstid og (B) efter udfældning og efterfølgende centrifugering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Proteinudfældning med chloroform/methanol/vand. En prøve indeholdende 50 μg protein udfældet i henhold til trin 4. (A) Umiddelbart efter trin 4.4. (B) Umiddelbart efter trin 4.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Billeder af en engangs to-trins filtrerings- og ekstraktionspatron til proteinudfældning. En prøve indeholdende 100 μg protein blev kombineret med 100 mM NaCl og 80% acetone i (A) den samlede filtrering og SPE-patron og (B) udfældet i 5 minutter, indtil proteinaggregater blev synlige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SDS-udtømningseffektivitet efter proteinudfældning. Procentdelen af SDS, der fjernes, vises fra acetoneudfældning med den konventionelle protokol (natten over ved -20 °C), den hurtige protokol (2 minutters inkubation ved stuetemperatur) eller ved chloroform / methanol / vand (CMW) udfældning af et S. cerevisiae-lysat , både i konventionelt (hætteglas) og patronformat. Disse prøver indeholdt oprindeligt 0,5% SDS (5.000 ppm), hvilket udleder, >99,8% SDS-fjernelse er nødvendig for optimal MS-analyse. Resterende SDS kvantificeres ved methylenblåt aktive stoffer (MBAS) assay. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen fra tekniske replikater (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Samlet proteomgenvinding gennem nedbør. SDS PAGE viser genopretningen af S. cerevisiae total proteinlysat, udfældet ved (A) konventionel acetoneudfældning, (B) chloroform / methanol / vandudfældning og (C) hurtig acetoneudfældning. Proteinbånd observeres udelukkende i pelletfraktionen uden synlige bånd i supernatanten (Super.). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Overlegen proteingenvinding i en filtreringspatron. Til udfældning af S. cerevisiae totalproteinlysat letter engangsspinpatronen kvantitativ genvinding med acetone og CMW-udfældning. Høj genopretning er også mulig med hætteglasbaseret nedbør, selvom omhyggelig prøvemanipulation og pipettering er påkrævet. LC-UV vurderet proteingenvinding efter resolubilisering af pelleten med kold myresyre er vist her. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen fra tekniske replikater (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Høje nedbørsudbytter for peptider med lav molekylvægt. En modificeret acetoneudfældningsprotokol for peptider og proteiner ≤5 kDa involverer kobling af 100 mM ZnSO4 med 97% acetone for at opnå de højeste udbytter. Udfældning lettet af en engangsfiltreringspatron viser forbedret genvinding sammenlignet med konventionel hætteglasbaseret nedbør på tværs af alle tre nedbørsforhold. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen fra tekniske replikater (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Højere genvinding af standardproteiner i SDS-baseret arbejdsgang. Tukey Box-and-Whisker plotter30 af relativ MS-signalintensitet for peptider genvundet fra SDS-holdige proteiner behandlet i en engangsfiltreringspatron i forhold til en kontrolprøve (ingen SDS, ingen udfældning). De anvendte proteiner spænder over et bredt koncentrationsdynamisk område-β-galactosidase: cytokrom c: enolase = 10,000: 10: 1. Hver kvartil i kasserne indeholder 25% af fordelingen, mens fejlstænger omfatter 95% af fordelingen. Middelværdi er angivet med "+" og medianen med en vandret linje. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Identificerede proteinfordelinger fra tekniske replikater. Tukey Box-and-Whisker-plot karakteriserer (A) molekylvægten, (B) hydrofobiciteten og (C) isoelektrisk punkt af proteiner identificeret ved bottom-up LC-MS / MS efter tredobbelte præparater af et bovint leverlysat i en to-trins filtrerings- og ekstraktionspatron. Der var ingen statistisk forskel i disse karakteristika ved tovejs ANOVA (s < 0,05). Hver kvartil i kasserne indeholder 25% af fordelingen, mens fejlstænger omfatter 95% af fordelingen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Korrelation af peptid-id'er pr. protein gennem den SDS-baserede forberedelsesarbejdsgang på tværs af præparative replikater. Analyse af bottom-up proteom reproducerbarhed på tværs af (A) prøve 1 og 2, (B) prøve 2 og 3 og (C) prøve 1 og 3 baseret på antallet af peptid MS-identifikationer pr. protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optimal MS-karakterisering opnås, når resterende SDS er udtømt under 10 ppm. Mens alternative tilgange, såsom FASP og fordøjelse på perler, tilbyder kvantitativ SDS-udtømning med variabel genopretning 31,32,33, er det primære mål med nedbør at maksimere renhed og udbytte samtidigt. Dette afhænger af effektiv isolering af supernatanten (indeholdende SDS) uden at forstyrre proteinpillen. Med hætteglasbaseret nedbør, når hovedparten af supernatanten er fjernet ved pipettering, er det mere og mere sandsynligt, at nogle af de aggregerede pellets ved et uheld går tabt. Af denne grund er det vigtigt at efterlade en mere signifikant brøkdel af det resterende opløsningsmiddel (~ 20 μL) og tilføje et vasketrin34. Vasketrinnet fortynder og fjerner det resterende opløsningsmiddel fra hætteglasset. Især med CMW er det unødvendigt at vortex prøve hætteglasset, når pelleten er dannet. Afbrydelse af pelleten gennem kraftig omrøring har den uønskede virkning at øge sandsynligheden for tab ved utilsigtet pipettering. Hvis hvirveldannelse er inkluderet (som anbefalet i tidligere protokoller)35, er der potentiale for, at dele af CMW-pelleten klæber til undersiden af hætteglashætten; når pelleten er centrifugeret, forbliver den fastgjort på hætteglashætten og kan resultere i ~ 50% tab.

Hurtig udfældning kan udføres med høj genopretning af fortyndede proteomprøver, ideelt mellem 0,01-2 mg / ml, eller en tilsvarende proteinmasse mellem 1-200 μg. Kvantitative og reproducerbare genfindinger, der starter fra under 0,01 mg /ml protein, kan dog drage fordel af længere udfældningstider fra 10 minutter til 1 time, hvilket viser gennemstrømningsbegrænsninger i nedbørsarbejdsgangen. Overraskende nok viser mere koncentrerede prøver (10 mg/ml) en statistisk reduktion i udbyttet, formodentlig fra utilsigtede pipetteringstab. Under forudsætning >10 μg protein skal der observeres en synlig pellet på siden af hætteglasset (figur 1B). Mindre mængder, ned til 1 μg, er udfordrende at se. Dette udfordrer kapaciteten til at pipettere supernatanten uden at forstyrre proteinpillen. Hætteglasset kan vendes (langsomt) med acetone for at adskille opløsningsmidlet fra pelleten. For CMW klæber pelleten ikke pålideligt tilstrækkeligt til hætteglasset, hvorved pipettering foretrækkes frem for dekantering af supernatanten. Til hætteglasbaseret udfældning anbefales det at arbejde med det mindst mulige mikrocentrifugerør for at lette de påtænkte prøve- og opløsningsmiddelvolumener. Udfældning i engangsfiltreringspatronen, der anvendes i dette arbejde, giver en maksimal volumenkapacitet på 500 μL, hvilket muliggør proteinudfældning med 80% acetone på prøvevolumener op til 100 μL. Prøve-, salt- og opløsningsmiddelvolumener kan justeres i overensstemmelse hermed, hvis de anbefalede koncentrationer opretholdes.

Renheden af proteinpillen, der genvindes fra organisk opløsningsmiddelbaseret udfældning, er begrænset af kompleksiteten af prøvematrixen, bufferkomponenterne og udfældningsbetingelserne. For eksempel har specifikke bufferkomponenter såsom glycin (anvendt til SDS PAGE-separationer) vist sig at udfældes med protein ved anvendelse af 80% acetone. Glycin forbliver imidlertid opløseligt gennem CMW-udfældning. Aceton er blevet rapporteret at udfælde DNA-fragmenter36,37, hvilket potentielt tilføjer uønskede baggrunds urenheder til den genvundne pellet. Udfældning af proteiner og peptider med lav molekylvægt kræver et forhøjet niveau af organisk opløsningsmiddel og en specifik salttype for at maksimere udbyttet. Mens flere salte er blevet udforsket, giver ZnSO4 konsekvent høje produkter. Dette salt udfældes i 97% acetone i fravær af protein. Således indeholder den resulterende proteinpellet en høj koncentration af salt. Det bemærkes, at anvendelse af 90% acetone i volumen også vil opnå høje peptidudbytter, selvom der forventes et statistisk signifikant fald (~ 5%) i genopretning. Dette muliggør imidlertid behandling af et mere signifikant prøvevolumen (op til 180 μL, med 20 μL 1 M ZnSO4) i hvert 2 ml hætteglas. Ud over matrix urenheder, der udfældes sammen med proteinpellet, må det anføres, at udfældning af opløsningsmidler i sagens natur forårsager denaturering af prøven38,39. Derfor er denne protokol ikke anvendelig til fremstilling af funktionelle proteiner eller native MS-arbejdsgange. Aceton er også blevet rapporteret at forårsage kovalente proteinmodifikationer ved glycinrester40 og inducere et +98 u masseskift, spekuleret i at være et biprodukt af aldolkondensationsaceton41.

Ved anvendelse af en filtreringspatron til proteinudfældning er isolering af proteinpellet afhængig af tilbageholdelse af aggregater over et PTFE-membranfilter. Porøsiteten af denne membran overstiger porøsiteten af et molekylvægtafskæringsfilter (som set i FASP), hvilket tillader proteinisolering med reducerede spintider. Hurtig opløsningsoverførsel ved lave omdrejningshastigheder er afhængig af korrekt befugtning af PTFE-membranen; organiske opløsningsmidler strømmer let igennem, selvom et tørt PTFE-filter hindrer vandige opløsningsmidler. Hvis filtreringspatronen ser ud til at være tilstoppet, skal membranen fugtes igen ved direkte at påføre et lille volumen organisk opløsningsmiddel (f.eks. Isopropanol) på filteret. Afhængigt af proteinpellets størrelse og mængden af anvendt prøve kan yderligere centrifugering eller centrifugering ved højere hastigheder (op til 3.000 x g) være nødvendig for at sikre, at alt opløsningsmiddel har passeret gennem filtreringspatronen.

Proteingenvinding fra nedbør med optimale forhold er i sidste ende begrænset af udfordringen med pelletreopløseliggørelse, hvor få opløsningsmiddelmuligheder er kompatible med downstream-behandling og LC-MS. Derudover bidrager flere nedbørsforhold såsom lange udsættelser for lave temperaturer og overtørring af en tæt pakket pille til genopløselighedsudfordringer40. Det bemærkes, at CMW-proteinpellets generelt er mindre opløselige end acetonepellets. Maksimeret re-opløselighedseffektivitet af udfældet protein med 80% kold myresyre (trin 6.2.2) er tidligere blevet rapporteret42; den kolde temperatur forhindrer proteinmodifikation, som ellers forekommer i koncentreret myresyre43,44. Fortynding af syrekoncentrationen bremser også modifikationsreaktionen. Myresyre anbefales til top-down MS-tilgange eller før enzymatisk fordøjelse med pepsin. Anvendelse af dette opløsningsmiddel kræver lidt fysisk behandling; tilsætningen af kun 5 μL (nok til at dække proteinpillen) kan være tilstrækkelig, når den kombineres med hvirveldannelse, kort sonikering eller gentagen pipettering. Tilsvarende for prøver, der er beregnet til at blive analyseret af SDS PAGE, er genopløsning i SDS-holdig Laemmli-buffer yderst effektiv, når den kombineres med beskeden blanding af prøven inden opvarmning. Disse opløsningsmidler er imidlertid begge uforenelige med trypsin. Resolubilisering med 8 M urinstof anbefales inden trypsinfordøjelsen, hvilket sikrer, at urinstof er frisklavet (samme dag). Et minimumsvolumen på 50 μL buffer anbefales til proteinreopløselighed i filtreringspatronen for at maksimere kontakten mellem det chaotropiske opløsningsmiddel og pellet samt for at hjælpe opløsning under sonikering, gentag pipettering og / eller hvirveldannelse. Alternative tilgange udnytter trypsin til at re-opløse proteinet, hvilket betyder, at proteinet ikke behøver at blive helt opløst før enzymtilsætning. Denne tilgang kan imidlertid skævvride fordøjelsen og favorisere de mere opløselige arter, mens hydrofobe proteiner oplever kortere fordøjelsestid45. Tilsætning af 8 M urinstof sammen med basiske buffere såsom Tris eller ammoniumbicarbonat kræver et oprydningstrin efter fordøjelsen. For sådanne prøveadditiver er oprydning af omvendt fasekolonne ideel. Engangsfiltreringspatronen, der anvendes i denne undersøgelse, suppleres med en udskiftelig SPE-patron med omvendt fase. Denne patron er også ideel til udveksling af opløsningsmidler i tilfælde af myresolubiliseringsprotokollen. Det er vigtigt at bemærke, at enhver fastfaseekstraktionsmetode er forbundet med iboende tab ved prøvegenvinding. Derfor bør brugeren afveje fordelene ved genopretning og den ekstra rensning til deres eksperiment.

Det forventes, at disse protokoller vil gøre det muligt for proteomics-forskere at strømline deres vaskemiddelbaserede arbejdsgange og udnytte SDS til proteomekstraktion. Forberedende strategier, der letter konsekvent genopretning af det komplette proteom, er kritiske. En to-trins spinpatron forenkler muligheden for hurtig, robust og reproducerbar proteomprøveisolering. En sådan tilgang ville være egnet til applikationer, der kræver streng analyse uden at ofre prøvegennemstrømninger, såsom kliniske indstillinger eller store forskningsinitiativer46. Fremtidige anvendelser af disse tilgange kan omfatte biomarkøropdagelse, påvisning, nøjagtig kvantificering og opdagelse af lægemiddel- og lægemiddelmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Doucette-laboratoriet udtænkte og patenterede ProTrap XG, der blev anvendt i denne undersøgelse. AAD er også en stiftende partner af Proteoform Scientific, som kommercialiserede prøveforberedelsespatronen.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Forfatterne takker Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) og SPARC BioCentre (Molecular Analysis) på Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) for deres bidrag til erhvervelsen af MS-data.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Tags

Kemi udgave 180 massespektrometri proteomik prøveforberedelse natriumdodecylsulfat udfældning proteinfordøjelse acetone chloroform/methanol/vand
Organisk opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning til robust proteomrensning forud for massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter