Login processing...

JoVE Journal
Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Chemistry

Organisk opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning til robust proteomrensning forud for massespektrometri

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Journal (Chemistry)

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO₂ Source

Stable Aqueous Suspensions of Manganese Ferrite Clusters with Tunable Nanoscale Dimension and Composition

Journal (Chemistry)

Stable Aqueous Suspensions of Manganese Ferrite Clusters with Tunable Nanoscale Dimension and Composition

Click here for the English version

Organisk opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning til robust proteomrensning forud for massespektrometri

Article DOI: 10.3791/63503-v

February 7th, 2022 •

Jessica L. Nickerson¹, Venus Baghalabadi¹, Ziheng Dang¹, Victoria A. Miller², Sara L. Little², Alan A. Doucette¹

¹Department of Chemistry, Dalhousie University, ²Proteoform Scientific Inc.

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 7th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokol beskriver opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning under kontrollerede forhold for robust og hurtig genvinding og oprensning af proteomprøver inden massespektrometri.

Transcript

Disse protokoller er designet til at maksimere genopretningen såvel som renheden af proteiner gennem opløsningsmiddelbaseret nedbør. Vi vil vise dig et par tricks til at udføre nedbør i hætteglas samt en halvautomatisk tilgang i et centrifugeringspatronformat. Vi har også optimeret nedbørsprotokollen til at være ensartet og hurtig.

Hele protokollen tager kun et par minutter. Disse protokoller viser, at opløsningsmiddeludfældning af proteiner er ideel til prøveforberedelse forud for massespektrometri. Protokollerne passer problemfrit ind i bottom up såvel som top down pro arbejdsgange.

Ziheng Dang og Victoria Miller, seniorforsker ved Proteoform Scientific i Halifax, Nova Scotia Pipette 90 mikroliter partikelfri proteinopløsning i et polypropylenmikrocentrifugerør, demonstrerer for os i dag. Tilsæt derefter 10 mikroliter vandigt natriumchlorid og 400 mikroliter acetone i prøveopløsningen, hætten og tryk forsigtigt på hætteglasset for at kombinere opløsningsmidlerne. Lad hætteglasset inkubere det.

Rumtemperatur uforstyrret i mindst to minutter efter inkubation, centrifugerer prøverne med angivelse af hætteglassets orientering og centrifugerer i mindst to minutter ved 10.000 RCF eller højere ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen observeres en synlig hvid pellet i bunden af røret. På dette tidspunkt skal du løsne røret og dekantere supernaten i en affaldsbeholder ved at vende røret om.

Brug et papirhåndklæde til at trække eventuelt resterende opløsningsmiddel ud af hætteglasset. Til SDS, der indeholder prøver. Dispenser forsigtigt 400 mikroliter frisk acetone uden at forstyrre pelleten.

Straks centrafuse prøven i et minut ved 10.000 gange G eller højere ved stuetemperatur ved at placere hætteglasset i rotoren i samme retning som det indledende spin. Tæl vaskeopløsningsmidlet som beskrevet tidligere. Tør prøven med hætten åben i ca. et minut.

I en røghætte, før en pelletopløsning. Dispenser 100 mikroliter af proteinopløsningen i et polypropylenhætteglas. I røghætten tilsættes 400 mikroliter methanol efterfulgt af 100 mikroliter chloroform.

Hætteglasset og hvirvelen kort for at blande. Dispenser hurtigt 300 mikroliter vand direkte ind i midten af hætteglasset. Hætteglasset skal dækkes, og lad det sidde uforstyrret på bordpladen i et minut, efter at hætteglasset med polypropylen er anbragt i en centrifuge, og centrifugeret drejes i fem minutter ved 10.000 gange G eller højere ved stuetemperatur.

Hætteglasset observeres at have to opløsningslaglag og en synlig hvid pellet til hætteglasset ved ca. 45 grader. Fjern ca. 700 mikroliter af opløsningsmidlet fra det øverste lag med ensartet hastighed ved hjælp af en stor en milliliter mikropipettespids først og senere med en 200 mikroliter pipettespids, indtil den danner en perle i hætteglasset. Der tilsættes 400 mikroliter frisk methanol til hætteglasset med prøven uden at forstyrre pelleten ved at dispensere solvensen ned langs siden af hætteglasset.

Hætteglasset lukkes, og kombiner opløsningslagene ved forsigtigt at vippe hætteglasset for at hvirvle opløsningsmidlerne sammen. At observere den hvide proteinpille, der noterer orienteringen af hætteglasset i rotorcentrifugen i mindst 10 minutter ved 10.000 gange G eller højere ved stuetemperatur. Vinkel hætteglasset med pelleten nedad.

Placer en pipettespids langs hætteglassets øverste kant, og fjern supernatanten med en mikropipettespids på en milliliter med en langsom, men ensartet hastighed. Beholder ca. 20 mikroliter opløsningsmiddel. Lad det resterende opløsningsmiddel tørre i røghætten.

At udfælde proteinet. Brug en engangsfiltreringspatron til at fastgøre stikket til den øverste filtreringspatron. Kombiner 90 mikroliter proteinopløsning 10 mikroliter en mol aquas, natriumchlorid og 400 mikroliter acetone.

Inkuberes i mindst to minutter på bordpladen, centrifugeres den tilberedte proteinprøve med stikket stadig fastgjort til filtreringspatronen i to minutter ved 2.500 gange G.At stuetemperatur, vend patronen og skru af og fjern stikket fra patronbasen. Filtreringspatronen anbringes i et rent hætteglas og centrifugerer proteinprøven i tre minutter ved 500 gange G ved stuetemperatur. Kassér strømmen gennem opløsningsmiddel fra det nederste hætteglas.

Proteinpelleten vaskes ved at tilsætte 400 mikroliter acetone til filtreringspatronen, centrifuge i tre minutter ved 500 gange G ved stuetemperatur, eller indtil der ikke er noget opløsningsmiddel tilbage i den øverste patron. Efter de tidligere demonstrerede proteinudfældningsprotokoller. Opløselig proteinet ved at fugte membranen i bunden af filtreringspatronen ved at dispensere to til fem mikroliter ISO-propanol direkte til membranen umiddelbart før fortsættelse til genopløselighedsprotokollen for genopløselighed af proteinpelleten forberede 80% volumenprocent opløsning af myresyre i vand.

Forkøl denne syreopløsning ved minus 20 grader Celsius og filtreringspatronen indeholdende udfældet protein. Dispenser 50 mikroliter kold fortyndet myresyre i den kølede patronhætte og hvirvel i 30 sekunder. Filtreringspatronen returneres til fryseren ved minus 20 grader Celsius i 10 minutter.

Gentag de tidligere hvirvel- og inkubationstrin. Tilsæt 450 mikroliter vand til et slutvolumen på 500 mikroliter. Fortynding af myresyren til 8%Vend patronen af, og tag stikket ud af patronbasen, og fastgør SPE-patronen til hætteglasset.

Drej proteinet gennem SPE-patronen i en centrifuge ved stuetemperatur i fem minutter ved 800 gange G.Hvis opløsningsmidlet forbliver i den øverste patron, skal du returnere patronen til centrifugen og gentage centrifugen. Skyl ved at tilsætte 300 mikroliter 5% acetonitril med 0,1% TFA i vand til SPE-patronen, flow gennem SPE-patronen i to minutter ved 2000 gange G.For proteiner med lav molekylvægt eller fordøjede peptider elueres prøven ved at strømme 300 mikroliter. En 50% acetonitril med 0,1% TFA i fem minutter ved 2.500 gange G.For intakte proteiner.

Følg op med et ekstra undvigelsestrin ved hjælp af 300 mikroliter 75% acetonitril med 0,1% Trifluor asketisk syre. Kombiner de to resulterende ekstrakter. Figuren sammenligner SDS-udtømningen efter hætteglasbaseret eller udfældning af proteiner i en engangsfilterpatron.

Brug af acetone med de konventionelle hurtige og CMW-protokoller. Alle tilgange reducerer SDS for at muliggøre optimal massespektrometrianalyse. Denne figur viser kvantitativ proteingenvinding ved at følge hurtig acetoneudfældning og CMW-udfældning gennem SDS-sideanalyse af et forarbejdet gærtotal cellelysat.

Konsekvent genopretning blev opnået med alle nedbørsprotokoller. Nedbør i en engangsfiltreringspatron eliminerer behovet for omhyggeligt at pipettere SDS indeholdende supernatant, samtidig med at de aggregerede proteiner over et membranfilter bevares. Der blev således ikke påvist synlige bånd i supernatantfraktionerne på tværs af tre uafhængige replikater.

Den patronbaserede proteinudfældning viser overlegen genvinding af en Pepsinfordøjet prøve af kvægplasma i forhold til hætteglasbaseret udfældning. Mere signifikante forskelle i udbytte bemærkes i patronen, når anvendelse af natriumchlorid, mens anvendelse af zinkopløsningsmiddel resulterede i det højeste udbytte. Dette tal kvantificerer peptidtopintensiteten fra hver peptidprøve med et forhold over et, der afspejler en højere peptidmængde for prøver, der behandles i engangsfilterpatronerne.

Figuren sammenligner antallet af identificerede peptider pr. protein på tværs af de tre replikatprøvepræparater. Korrelationskoefficienterne på 0,94 til 0,95 i disse grafer viser den høje konsistens af prøveforberedelsesmetoden til bund-op massespektrometrianalyse. Så når den pille er dannet, vil du virkelig undgå at forstyrre den.

Hvis du holder det som en intakt pille, får du et højere udbytte. Så sørg for ikke at glemme at vaske den pille med ekstra acetone. Dette sikrer, at vi slipper af med SDS, der holder vores prøve så ren som muligt, og det giver os den bedste massespektrometrianalyse.

Så vi fandt ud af, at fjernelse af det overskydende opløsningsmiddel ved at invertere det er meget enklere end at forsøge at pipette prøven. Du får mere ensartede udbytter på denne måde. Udførelse af acetoneudfældning ved stuetemperatur resulterede i mere konsekvent og hurtigere genopretning end traditionel nedbør i fryseren.

X

Simple Hit Counter