Summary
Het atoomkrachtmicroscopie-inkepingsprotocol biedt de mogelijkheid om de rol van de fysische eigenschappen van de celwand van een bepaalde cel van een weefsel of orgaan te ontleden tijdens normale of beperkte groei (d.w.z. onder watertekort).
Abstract
Hier wordt een methode beschreven om de fysische eigenschappen van de celwand van epidermale cellen van levende Arabidopsiswortels te karakteriseren door middel van nano-indentaties met een atoomkrachtmicroscoop (AFM) in combinatie met een optische omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De methode bestaat uit het toepassen van gecontroleerde krachten op het monster tijdens het meten van de vervorming, waardoor parameters zoals de schijnbare Young's modulus van celwanden bij subcellulaire resoluties kunnen worden gekwantificeerd. Het vereist een zorgvuldige mechanische immobilisatie van het monster en een juiste selectie van inspringers en inkepingsdiepten. Hoewel het alleen in externe weefsels kan worden gebruikt, maakt deze methode het mogelijk om mechanische veranderingen in de celwanden van planten tijdens de ontwikkeling te karakteriseren en maakt het de correlatie van deze microscopische veranderingen met de groei van een heel orgaan mogelijk.
Introduction
Plantencellen worden omgeven door een celwand die een complexe structuur is die bestaat uit op elkaar inwerkende netwerken van polysacchariden, eiwitten, metabolieten en water die in dikte varieert van 0,1 tot enkele μm, afhankelijk van het celtype en de groeifase 1,2. Celwand mechanische eigenschappen spelen een essentiële rol bij de groei van planten. Lage stijfheidswaarden van de celwand zijn voorgesteld als een voorwaarde voor celgroei en celwanduitbreiding, en er is steeds meer bewijs dat alle cellen mechanische krachten voelen om hun functies uit te voeren. Er wordt echter nog steeds gediscussieerd of veranderingen in de fysieke eigenschappen van de celwand het lot van de cel bepalen 2,3,4. Omdat plantencellen niet bewegen tijdens de ontwikkeling, hangt de uiteindelijke vorm van een orgaan af van hoe ver en in welke richting een cel uitzet. Arabidopsiswortel is dus een goed model om de impact van fysieke eigenschappen van celwand in celexpansie te bestuderen, omdat verschillende soorten expansie voorkomen in verschillende regio's van de wortel. Anisotrope expansie is bijvoorbeeld duidelijk in de rekzone en vooral merkbaar in de epidermale cellen5.
De hier beschreven methode werd gebruikt om de fysische eigenschappen van de celwand van epidermale cellen op nanoschaal van levende Arabidopsis-wortels te karakteriseren met behulp van een Atomic Force Microscope (AFM) in combinatie met een omgekeerde fluorescentiefasemicroscoop6. Voor een uitgebreide herziening van de AFM-techniek, lees 7,8,9.
Dit protocol schetst een basismethode voor monstervoorbereiding en een algemene methode voor afm-gebaseerde elasticiteitsmetingen van plantencelwanden.
Figuur 1: Schematisch overzicht van kracht-indentatie experiment in Arabidopsis wortels met behulp van atomic force microscopie (AFM). Het schema geeft een overzicht van de stappen van een Force-Indentation-experiment vanaf de voorbereiding van het substraat om het wortelmonster stevig te immobiliseren (1-2), bevestiging van de levensvatbaarheid van de wortel door propidiumjodidekleuring (3), cantileverpositionering op het oppervlak van een langwerpige epidermale cel van de primaire wortel (4-5), krachtcurvemeting (6) en krachtcurveverwerking om de schijnbare Young's modulus te berekenen (7-8). EZ: rekzone. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het plantmateriaal en groeiomstandigheden
- Om het benodigde plantmateriaal te genereren, steriliseert u de zaden van het wildtype Arabidopsis en de mutante lijnen van belang.
OPMERKING: In dit protocol hebben we het volgende gebruikt: ttl1: T-DNA-invoeglijnen Salk_063943 (voor TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) wild-type; de Procuste1 (prc1-1) mutant, die bestaat uit een knock-out mutant (Q720stop) in het CESA6 gen (AT5G64740), zoals eerder beschreven in10,11; en ttl1 x prc1-1 dubbele mutant.- Doe een geschat volume van 50 μL zaden in een microbuisje. Voeg 500 μL 70% ethanol + 0,01% Tween-oplossing toe bij kamertemperatuur. Meng en incubeer gedurende 7 min.
- Giet de ethanoloplossing en voeg 500 μL 20% natriumhypochloriet toe. Meng en incubeer gedurende 7 min.
- Giet de natriumhypochlorietoplossing en was de zaden drie tot vier keer met steriel water.
- Plating
- Bereid van tevoren basale Murashige en Skoog (MS) medium12 + 1,5% sucrose + 1% agar (pH 5,7) (zie Materiaaltabel). Autoclaaf het medium. Bereid een laminaire stromingskap voor om in een steriele omgeving te werken en label de vierkante petrischalen die nodig zijn voor het experiment. Giet het medium in de petrischaaltjes en laat het medium stollen.
- Leg de gesteriliseerde zaden met steriele pipetpunten op vierkante petrischalen met het medium. Verdeel de zaden gelijkmatig in twee rijen. Als de zaden droog zijn, sluit je de deksels en sluit je de platen af. Stratificeer de zaden bij 4 °C in het donker gedurende 4 dagen.
OPMERKING: Stratificatie is nodig om de kieming te synchroniseren. - Plaats de platen verticaal in de groeikamer in een lange dagregime (16 uur licht/8 uur donker) met 25 μmol m2 s−1 lichtintensiteit en 23 °C (dag/nacht). Laat de zaailingen 7 dagen groeien.
2. Osmotische stressbehandeling (optioneel)
OPMERKING: Deze sectie geeft details over de groei van Arabidopsis-wortels in osmotisch potentieel van -1,2 MPa zoals geschat door cryoscopische osmometer (Tabel van materialen). Dit deel kan worden weggelaten of gewijzigd, afhankelijk van de experimentele vraag die voorhanden is.
- Bereid basaal MS-medium + 1,5% sucrose + 400 mM mannitol + 1% agar (pH 5,7). Autoclaaf het medium. Giet het medium in vierkante petrischaaltjes in de laminaire stromingskap en laat het medium stollen.
- Plaats met een pincet (Tabel met Materialen) 5 dagen oude zaailingen die zijn voorgekweekt in basaal MS + 1,5% sucrose-medium in vierkante petrischalen met het medium aangevuld met 400 mM mannitol. Plaats de platen verticaal in de groeikamer onder dezelfde omstandigheden als in stap 1.2.3. Laat de zaailingen groeien onder deze osmotische stressconditie gedurende 7 dagen.
OPMERKING: Om de wortelgroeiaanpassing van de primaire wortel tijdens ernstige osmotische stress te evalueren, wordt voorgesteld om zaailingen 5 dagen na ontkieming te gebruiken die in gecontroleerde omstandigheden zijn gekweekt om ervoor te zorgen dat de grootte van de wortelmeristem al is vastgesteld13. Als alternatief kan de analyse in elk stadium van ontwikkeling worden uitgevoerd om het ontwikkelingseffect van osmotische stressactie te bepalen.
3. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) nano-inductie-experimenten
- Voorbereiding van het monster voor nano-indentatie-experimenten
OPMERKING: Dit is een cruciale stap voor het toepassen van AFM op de studie van levende biologische monsters. Het monster moet stevig aan het substraat worden bevestigd om mechanisch stabiel te zijn tijdens inkepingsmetingen. Tegelijkertijd moeten de structurele eigenschappen van monsters behouden blijven. Een effectieve strategie om een grote steekproef voor AFM te stabiliseren, is het gebruik van lijmen. De lijm moet snel drogen en mag niet giftig of reactief zijn met het omringende medium. In dit protocol werden polystyreen petrischalen gebruikt als substraat en niet-zure siliconenlijm (Table of Materials) om de Arabidopsis-zaailingen te binden.- Verdeel een dun laagje siliconenlijm in de petrischaal met een hoeslip. Laat de lijm 45 s in de lucht.
- Plaats met een pincet de zaailing op de lijm en richt deze in een richting die contact tussen de uitstekende delen van de zaailing en de uitkraging vermijdt. Druk vervolgens de wortel zachtjes op de siliconenlijmlaag om deze stevig te binden. Laat de zaailing 45 s in contact met de lijm voordat u doorgaat met de volgende stappen van het protocol.
- Incubeer de aangehechte zaailingen met 2 μg / ml propidiumjodide (PI; Materiaaltabel) gedurende 5 minuten in het donker en was ze driemaal zorgvuldig met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (Materiaaltabel).
- Plaats de PI-geïncubeerde zaailingen in een omgekeerde fluorescentiemicroscoop in combinatie met de AFM. Om fluorescentie te observeren, stelt u de excitatie- en emissiegolflengten in op respectievelijk 572 nm en 617 nm. De afwezigheid van fluorescentie in de epidermale cellen bevestigt de levensvatbaarheid van de wortels.
- Bedek de zaailing met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Inspringingsprotocol
OPMERKING: Voer alle AFM-metingen uit binnen 1 uur na immobilisatie van het monster op de steun bij kamertemperatuur. De ruimte waar de AFM zich bevindt, moet met een airconditioner op 25 °C worden gehouden. De PBS-oplossing moet op dezelfde temperatuur zijn.- Monteer een standaard siliciumnitride cantilever met een piramidale punt (zie Materiaaltabel) in de AFM-sondehouder voor vloeistof (Materiaaltabel).
- Lijn de laser uit op de cantilever dicht bij de positie van de punt. Verplaats vervolgens de fotodiode om de laserspot in het midden van de detector te plaatsen.
- Om de doorbuigingsgevoeligheid te kalibreren, plaatst u een polystyreen petrischaal met 1x PBS onder de AFM.
OPMERKING: Deze stap is nodig om de inspringing te berekenen. Wanneer een krachtmeting wordt uitgevoerd op een hard oppervlak, is er geen inkeping in het oppervlak, dus elke verandering in de verplaatsing van de z-scanner komt overeen met de uitbuiging van de cantilever. Daarom is het erg belangrijk om de doorbuigingsgevoeligheid op een hard oppervlak te kalibreren. Het gebruik van een zacht oppervlak zal de doorbuigingsgevoeligheid overschatten, wat zal resulteren in te lage veerconstanten. - Pas de fotodetector zodanig aan dat de contactloze doorbuiging in de buurt van 0 V ligt. Kalibreer de doorbuigingsgevoeligheid door een inkeping (krachtcurve) uit te voeren, met een hellingsgrootte van 3 μm, een inkepings- en retractiesnelheid van 0,6 μm/s en een triggerdrempel van 0,5 V.
- Om de veerconstante van de cantilever te kalibreren, gebruikt u het thermal tune-hulpprogramma van de AFM-software (Table of Materials) dat wordt aanbevolen voor sondes met veerconstanten van minder dan ongeveer 5 N/m of gebruikt u de methode beschreven in referentie14. Voordat u Thermal Tune in de software activeert, moet u ervoor zorgen dat de sonde geen interactie heeft met het monster.
- Voer de uitkragingstemperatuur in. Klik op Calibrate > Thermal Tune of op het Thermal Tune icoon in de NanoScope werkbalk. Selecteer een frequentiebereik (1-100 Hz).
- Klik op Gegevens verkrijgen in het deelvenster Thermal Tune. Wacht tot de AFM gegevens heeft verzameld en klik vervolgens op de knop Simple Harmonic Oscillator (Fluid).
- Pas de mediane filterbreedte aan op 3. Pas de PSD-bakbreedte aan om de ruis in de verkregen gegevens te verminderen door middeling. Stel fitgrenzen in rond de eerste resonantiepiek.
- Klik op Bereken veerconstante k en klik vervolgens op Ja in het pop-upvenster met de vraag of de gebruiker deze waarde wil gebruiken.
- Herhaal de hierboven beschreven stappen drie keer en neem handmatig een gemiddelde van de veerconstantewaarden. Voer deze gemiddelde waarde in het vak Veerconstante in de lijst rampparameter in de PicoForce-weergave in. De kalibratie eindigt op dit punt.
- Gebruik de omgekeerde optische microscoop bij 10x, 20x en 40x oculairvergroting en plaats de AFM-sonde op het oppervlak van de vierde langwerpige epidermale cel van de primaire wortel en zorg ervoor dat deze in het midden van de cel wordt geplaatst.
- Verkrijg met de berekende veerconstantewaarde (stap 3.2.5.5) krachtcurven met een hellinggrootte van 3 μm, een triggerdrempel van 11 nN en een inkepings- en retractiesnelheid van 0,6 μm/s op geselecteerde punten.
OPMERKING: Uiteerder werk 15,16 bleek dat een lage frequentie van inkeping en terugtrekking helpt om hysterese en sleepkracht te minimaliseren. - Verkrijg krachtcurves van drie cellen per wortel voor elke behandeling (gebruik drie biologische replicaties per behandeling). Leg ten minste 150 krachtcurven vast voor elke wortel.
4. Meet de schijnbare Young's modulus
- Pas elke krachtcurve aan op het volgende model voor piramidale indruklijnen17:
, waarbij E de schijnbare Young-modulus van het monster is, 
de Poisson-modulus van het monster is en α de halve hoek ten opzichte van het hoekpunt is. Gooi de passen weg met een correlatiecoëfficiënt (r2) < 0,99. Overweeg de Poisson-verhouding voor volledig niet-samendrukbaar materiaal: = 0,5 en de geometrie van het indruklichaam dat door de fabrikanten is gegeven.
OPMERKING: Gebruik de eerste 100 nm vanaf het contactpunt van de belastingscurve om de fitting zo gevoelig mogelijk te maken voor celwandmechanica en om de impact van turgordruk op de schijnbare Young-moduluswaarden8 te verminderen. De aanpassing is gedaan met behulp van een aangepast MATLAB-programma (beschikbaar op persoonlijk verzoek door te schrijven naar J. C. B) waarmee een specifieke inkepingsdiepte kan worden ingesteld vanaf het contactpunt van de laadcurve. - Maak een genormaliseerd histogram met de schijnbare Young's modulusgegevens en pas het aan met een Gaussische verdeling. Gooi gegevenspunten buiten het 95%-betrouwbaarheidsinterval weg en bereken zowel het histogram als de Gaussiaanse fit opnieuw. Bereken en rapporteer de gemiddelde en standaarddeviatie van de schijnbare Young's modulus.
- Bepaal de significantie van de vergelijkingen tussen groepen door meerdere vergelijkingstests zoals ANOVA.
, waarbij E de schijnbare Young-modulus van het monster is, 
de Poisson-modulus van het monster is en α de halve hoek ten opzichte van het hoekpunt is. Gooi de passen weg met een correlatiecoëfficiënt (r2) < 0,99. Overweeg de Poisson-verhouding voor volledig niet-samendrukbaar materiaal: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimenten met force-indentation
De volgende tekst bevat enkele resultaten die worden verwacht wanneer een force-indentation-experiment wordt uitgevoerd om de typische uitvoer weer te geven die u kunt verwachten wanneer het protocol goed is uitgevoerd.
Krachtverplaatsingscurven
Representatieve krachtinkepingsplots die zijn verkregen door levende monsters in te laten inspringen op een positie in het midden van de cel van de wortelrekzone, zijn weergegeven in figuur 2. Wanneer de AFM-tip het oppervlak van de celwand begint in te krimpen, begint de kracht toe te nemen (aangegeven met 1 in figuur 2A) vanwege de celwand die tegen de vervorming is. De toename van kracht (belasting) gaat door totdat de maximale krachtwaarde is bereikt (aangegeven met 2 in figuur 2A); na dit punt begint het lossen van het inspringingsgedeelte.
Figuur 2: Krachtverplaatsingscurven verkregen in inkepingsexperimenten in celwanden van levende wortelverlengingszonecellen. (A) Een typische krachtverplaatsingscurve. Op de positie gemarkeerd door 1 begint de kracht toe te nemen; de AFM-tip begint de celwand in te laten inspringen. De toename van kracht (belasting) gaat door totdat de maximale krachtwaarde is bereikt, zoals aangegeven met 2; na dit punt begint het lossen van het inspringingsgedeelte. (B) Voorbeeld van een krachtverplaatsingscurve waarbij het onmogelijk is om de positie van het celoppervlak vóór de inkeping te detecteren (aangegeven met a), en zowel de laad- als de loscurve luidruchtig zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verwachte krachtverplaatsingscurven laten in het inkepingsgedeelte zien dat de kracht groeit na een parabool, zoals voorspeld door het model (uitgelegd in stap 4.1) (figuur 2A). Een andere passende parameter is de positie van het contactpunt; het moet overeenkomen met het celwandoppervlak vóór inkeping en wordt beschouwd als de oorsprong van de AFM-tipverplaatsing. Krachtcurven waarin het contactpunt vóór de inkeping niet kan worden gedetecteerd, moeten worden weggegooid (figuur 2B). De laad- en loscurve van het kracht-inkepingsexperiment moet lawaaivrij zijn. Luidruchtige curven zoals die in figuur 2B moeten worden weggegooid.
Genormaliseerd histogram van de schijnbare Young's modulus
De histogrammen die de verdeling van de frequentie van de verkregen waarden van de schijnbare Young-modulus tonen voor een set van 201 succesvolle inkepingen op negen verschillende cellen van drie verschillende planten van Col-0 gekweekt in controleomstandigheden, zijn weergegeven in figuur 3. De figuur toont een voorbeeld waarin het gemiddelde en de standaarddeviatie van de schijnbare Young-modulus (88,12 ± 2,79 KPa) werden berekend op basis van de histogrammen uitgerust met een Gaussische curve6.
Figuur 3: Voorbeeld van een histogram van de modulus van schijnbare Young die een goede statistische analyse van de resultaten mogelijk maakte. Gegevens werden verkregen uit krachtcurves op negen verschillende cellen van drie verschillende planten van Col-0 gekweekt in controleomstandigheden. De gegevens verkregen uit 201 Force-curven werden gemonteerd op een Gauss-verdeling. De relatieve frequentie geeft het aantal aangepaste krachtcurven aan die overeenkomen met elke berekende schijnbare Young-modulus. De gemiddelde en standaarddeviatiewaarden van deze aandoening werden verkregen uit de Gaussische pasvormen. RF: Relatieve frequentie; AEM: blijkbaar Young's modulus. Deze figuur is aangepast van referentie6Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Sommige genotypen kunnen erg moeilijk inspringen vanwege de morfologie van de wortel. Dit was het geval voor prc1-1 mutant en ttl1 prc1-1 dubbele mutant gekweekt in ernstige osmotische stress. In deze toestand hadden deze mutanten weinig langwerpige cellen in de wortelverlengingszone en ontwikkelden ze zeer lange wortelharen, die interfereren met de cantilever die de monsterbeweging produceert. Figuur 4 toont histogrammen die de kansverdeling van de verkregen waarden van de schijnbare Young's modulus op negen verschillende cellen van de ttl1 prc1-1 dubbele mutant laten zien. De figuur toont een voorbeeld waarin de verkregen krachtcurves niet de juiste analyse mogelijk maakten. Alleen Histogram H dat overeenkomt met één cel kon worden gemonteerd op een Gaussische verdeling6.
Figuur 4: Voorbeeld van histogrammen van de modulus van schijnbare Young die geen goede analyse mogelijk maakten. Gegevens werden verkregen uit krachtcurves op negen verschillende cellen van drie verschillende planten van de ttl1prc1-1 dubbele mutant. De relatieve frequentie geeft het aantal aangepaste krachtcurven aan die overeenkomen met elke berekende schijnbare Young-modulus. Alleen histogram H kon op een Gaussische verdeling worden aangebracht. RF: Relatieve frequentie; AEM: de schijnbare Young's modulus. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cel- en celwandmechanica worden steeds relevanter om inzicht te krijgen in hoe mechanica groeiprocessen beïnvloedt. Naarmate fysieke krachten zich over aanzienlijke afstanden in vaste weefsels voortplanten, wordt de studie van veranderingen in de fysieke eigenschappen van de celwand en hoe ze worden waargenomen, gecontroleerd, afgestemd en de groei van de plant beïnvloeden, een belangrijk studiegebied 2,3,8.
Een methode wordt hier gepresenteerd voor het bestuderen van de celwand fysische eigenschappen van cellen in de rekzone van de Arabidopsis wortel. De AFM-techniek kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere technieken, zoals groeisnelheidsstudies, om het effect van de fysieke eigenschappen van de celwand op wortelgroei te begrijpen.
Een van de meest kritische experimentele stappen is de mechanische immobilisatie van het monster; het monster moet stevig worden bevestigd om te voorkomen dat het monster wordt verplaatst terwijl het is ingesprongen. De laag van de siliconenlijm moet dun genoeg zijn om snel te kunnen drogen. De manipulatie van de siliconenlijm en het monster moet voorzichtig zijn om ervoor te zorgen dat de siliconen niet de gebieden van het monster bedekken die zullen worden gemeten. Bovendien moet de voorbereiding snel (binnen een minuut) worden voltooid om de kleefeigenschappen van de siliconenlijm te behouden en uitdroging van wortels te voorkomen. Het is cruciaal om weefselschade te voorkomen; uitdroging en beschadiging van het epidermale weefsel zal onomkeerbare veranderingen in de mechanische eigenschappen van de celwand veroorzaken. Andere methoden gebruikten immobilisatie in 1% agarose op een glazen glijbaan; deze methode heeft echter ook de uitdaging om snelle manipulatie en een extra stap van voorbereiding van de glasglaasjes nodig te hebben om te voorkomen dat de monsters tijdens de analyse in de X- en Y-as bewegen. Zie voor meer informatie referenties 8,18. Een ander relevant punt van dit protocol is om te tellen met een optische microscoop met epifluorescentie gekoppeld aan de AFM die verschillende doelstellingen heeft (10x, 20x en 40x). Hierdoor kunt u het inspringingsgebied nauwkeurig selecteren.
Een uitdagend aspect van het protocol is de selectie van de AFM-inspringingsinstellingen. Verschillende inspringers en inspringingsdiepten geven verschillende resoluties weer en kunnen worden gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te beantwoorden8. Verschillende studies hebben aangetoond dat de grootte en geometrie van de tip belangrijke overwegingen zijn om de gewenste resultaten te onderscheiden. Verschillende informatie wordt verkregen met verschillende tipvormen7. De conische punt kan bijvoorbeeld mechanische eigenschappen op subcellulair niveau onderscheiden, de bolvormige punt kan de mechanische eigenschappen van de hele cel beter weergeven19, en piramidale uiteinden maken het mogelijk om tegelijkertijd beelden met een hoge resolutie en mechanische eigenschappen te verkrijgen 7,20. De selectie van de piramidale tipradius (20-60 nm) is belangrijk om te voorkomen dat de tip zinkt, waardoor een goed inkepingsproces mogelijk is. Voor elke toepassing moet de onderzoeker het type uitkraging (en tip) kiezen dat beter geschikt is voor het monster en het soort metingen dat moet worden uitgevoerd8.
De methode heeft enkele beperkingen: de mechanische eigenschappen van alleen cellen aan het oppervlak van organen kunnen worden gemeten en weefsels met variabele topografieën zijn moeilijk om mee te werken. Wortelharen kunnen het bijvoorbeeld moeilijk maken om toegang te krijgen tot de epidermale cellen met de AFM-tip 8,18. Ten slotte, terwijl de gepresenteerde methode elasticiteit meet, is nano-indentatie ook gebruikt om viscositeit en turgordruk in planten en dieren te rapporteren 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten. Het MATLAB-script dat wordt gebruikt voor het aanbrengen van de gegevens is beschikbaar op persoonlijk verzoek door te schrijven naar J. C. B.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door CSIC I+D 2018, subsidie nr. 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) en PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
