Summary
Atomik kuvvet mikroskobu girinti protokolü, normal veya kısıtlı büyüme sırasında (yani su açığı altında) bir doku veya organın belirli bir hücresinin hücre duvarının fiziksel özelliklerinin rolünü inceleme imkanı sunar.
Abstract
Burada, canlı Arabidopsis köklerinin epidermal hücrelerinin hücre duvarının fiziksel özelliklerini, optik ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile birleştirilmiş bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile nanogirintiler yoluyla karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, deformasyonunu ölçerken numuneye kontrollü kuvvetler uygulamaktan oluşur ve hücre altı çözünürlüklerde görünür Young hücre duvarı modülü gibi parametrelerin nicelleştirilmesine izin verir. Numunenin dikkatli bir mekanik immobilizasyonunu ve girintilerin ve girinti derinliklerinin doğru seçimini gerektirir. Sadece dış dokularda kullanılabilmesine rağmen, bu yöntem gelişim sırasında bitki hücre duvarlarındaki mekanik değişikliklerin karakterize edilmesine izin verir ve bu mikroskobik değişikliklerin tüm organın büyümesiyle korelasyonunu sağlar.
Introduction
Bitki hücreleri, hücre tipine ve büyüme evresi 1,2'ye bağlı olarak kalınlığı 0.1 ila birkaç μm arasında değişen polisakkaritler, proteinler, metabolitler ve su ağlarından oluşan karmaşık bir yapı olan bir hücre duvarı ile çevrilidir. Hücre duvarı mekanik özellikleri bitkilerin büyümesinde önemli bir rol oynar. Hücre duvarının düşük sertlik değerleri, hücre büyümesi ve hücre duvarı genişlemesi için bir ön koşul olarak önerilmiştir ve tüm hücrelerin işlevlerini yerine getirmek için mekanik kuvvetler algıladığına dair kanıtlar artmaktadır. Bununla birlikte, hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklerin hücre kaderini belirleyip belirlemediği hala tartışılmaktadır 2,3,4. Bitki hücreleri gelişim sırasında hareket etmediğinden, bir organın son şekli, bir hücrenin ne kadar uzağa ve hangi yönde genişlediğine bağlıdır. Bu nedenle, Arabidopsis kökü, hücre duvarının fiziksel özelliklerinin hücre genişlemesindeki etkisini incelemek için iyi bir modeldir, çünkü kökün farklı bölgelerinde farklı genişleme türleri meydana gelir. Örneğin, anizotropik genişleme uzama bölgesinde ve özellikle epidermal hücrelerde belirgin şekilde belirgindir5.
Burada açıklanan yöntem, epidermal hücrelerin hücre duvarının fiziksel özelliklerini, ters çevrilmiş bir floresan faz mikroskobu6 ile birleştirilmiş bir Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak canlı Arabidopsis köklerinin nano ölçeğinde karakterize etmek için kullanılmıştır. AFM tekniğinin kapsamlı bir revizyonu için 7,8,9'u okuyun.
Bu protokol, temel bir numune hazırlama yöntemini ve bitki hücre duvarlarının AFM tabanlı elastikiyetini ölçmek için genel bir yöntemi özetlemektedir.
Şekil 1: Arabidopsis köklerinde atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak yapılan kuvvet-girinti deneyine şematik genel bakış. Şema, kök örneğini sıkıca hareketsiz hale getirmek için substratın hazırlanmasından (1-2), propidium iyodür boyama yoluyla kök canlılığının doğrulanmasından (3), birincil kökün uzatılmış bir epidermal hücresinin yüzeyinde konsol konumlandırmasından (4-5), kuvvet eğrileri ölçümünden (6) ve görünür Young modülünü hesaplamak için kuvvet eğrisi işlemesinden (7-8) bir Kuvvet-Girinti deneyinin adımlarına genel bir bakış sunar. EZ: uzama bölgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki materyalinin hazırlanması ve büyüme koşulları
- Gerekli bitki materyalini üretmek için, Arabidopsis vahşi tipi ve mutant ilgi alanlarının tohumlarını sterilize edin.
NOT: Bu protokolde aşağıdakileri kullandık: ttl1: T-DNA ekleme çizgileri Salk_063943 (TTL1 için; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) vahşi tip; daha önce 10,11'de tanımlandığı gibi, CESA6 genindeki (AT5G64740) bir nakavt mutasyonundan (Q720stop) oluşan Procuste1 (prc1-1) mutant; ve ttl1 x prc1-1 çift mutant.- Bir mikrotüpe yaklaşık 50 μL tohum hacmini koyun. Oda sıcaklığında 500 μL% 70 etanol +% 0.01 Ara çözeltisi ekleyin. 7 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
- Etanol çözeltisini dökün ve 500 μL% 20 sodyum hipoklorit ekleyin. 7 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
- Sodyum hipoklorit çözeltisini dökün ve tohumları üç ila dört kez steril suyla yıkayın.
- Kaplama
- Önceden bazal Murashige ve Skoog (MS) ortamı12 +% 1.5 sakkaroz +% 1 agar (pH 5.7) hazırlayın (bkz. Ortamı otoklav edin. Steril bir ortamda çalışmak için laminer bir akış davlumbaz hazırlayın ve deney için gereken kare Petri kaplarını etiketleyin. Ortamı Petri kaplarına dökün ve ortamın katılaşmasına izin verin.
- Steril pipet uçları kullanarak sterilize edilmiş tohumları, ortamı içeren kare Petri kaplarına yerleştirin. Tohumları iki sıra halinde eşit olarak dağıtın. Tohumlar kuruduğunda, kapakları kapatın ve plakaları kapatın. Tohumları 4 gün boyunca karanlıkta 4 ° C'de tabakalaştırın.
NOT: Çimlenmeyi senkronize etmek için tabakalaşma gereklidir. - Plakaları büyüme odasına dikey olarak 25 μmolm2 s−1 ışık yoğunluğu ve 23 °C (gündüz/gece) ile uzun gün rejiminde (16 saat ışık / 8 saat karanlık) yerleştirin. Fideleri 7 gün boyunca büyütün.
2. Ozmotik stres tedavisi (isteğe bağlı)
NOT: Bu bölüm, krioskopik ozmometre (Malzeme Tablosu) tarafından tahmin edildiği gibi -1.2 MPa'lık ozmotik potansiyelde Arabidopsis köklerinin büyümesi hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir. Bu bölüm, eldeki deneysel soruya bağlı olarak çıkarılabilir veya değiştirilebilir.
- Bazal MS ortamı +% 1.5 sakkaroz + 400 mM mannitol +% 1 agar (pH 5.7) hazırlayın. Ortamı otoklav edin. Ortamı laminer akış davlumbazındaki kare Petri tabaklarına dökün ve ortamın katılaşmasını bekleyin.
- Cımbızla (Malzeme Tablosu), bazal MS +% 1.5 sakkaroz besisinde önceden yetiştirilmiş 5 günlük fideleri, 400 mM mannitol ile desteklenmiş ortamı içeren kare Petri kaplarına yerleştirin. Plakaları, büyüme odasına, adım 1.2.3'teki ile aynı koşullarda dikey olarak yerleştirin. Fideleri bu ozmotik stres koşulu altında 7 gün boyunca büyütün.
NOT: Şiddetli ozmotik stres sırasında birincil kökün kök büyüme adaptasyonunu değerlendirmek için, kök meristem boyutunun zaten kurulmuş olduğundan emin olmak için kontrollü koşullarda yetiştirilen çimlenmeden 5 gün sonra fidelerin kullanılması önerilir13. Alternatif olarak, analiz, ozmotik stres etkisinin gelişimsel etkisini belirlemek için gelişimin her aşamasında gerçekleştirilebilir.
3. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) nanogirinti deneyleri
- Nanogirinti deneyleri için numunenin hazırlanması
NOT: Bu, AFM'yi canlı biyolojik örneklerin çalışmasına uygulamak için çok önemli bir adımdır. Numune, girinti ölçümleri sırasında mekanik olarak kararlı olması için alt tabakaya sıkıca tutturulmalıdır. Aynı zamanda, örnek yapısal nitelikler korunmalıdır. AFM için büyük bir numuneyi stabilize etmek için etkili bir strateji, yapıştırıcılar kullanmaktır. Yapıştırıcı hızlı bir şekilde kurumalı ve çevredeki ortamla toksik veya reaktif olmamalıdır. Bu protokolde substrat olarak polistiren Petri tabakları, Arabidopsis fidelerinin bağlanması için asidik olmayan silikon yapıştırıcı (Table of Materials) kullanılmıştır.- Petri kabına ince bir silikon yapıştırıcı tabakasını, bir örtü parçası ile yayın. Tutkalı 45 s havada bırakın.
- Cımbızla, fideyi tutkalın üzerine yerleştirin ve fidenin çıkıntılı kısımları ile konsol arasındaki teması önleyecek bir yöne yönlendirin. Ardından, sıkıca bağlamak için kökü silikon yapıştırıcı tabakasına hafifçe bastırın. Protokolün sonraki adımlarına devam etmeden önce fideyi tutkalla 45 s temas halinde bırakın.
- Ekli fideleri 2 μg/mL propidium iyodür (PI; Malzeme Tablosu) karanlıkta 5 dakika boyunca ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi (Malzeme Tablosu) ile üç kez dikkatlice yıkayın.
- PI ile inkübe edilmiş fideleri, AFM ile birleştirilmiş ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna yerleştirin. Floresanı gözlemlemek için, uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 572 nm ve 617 nm olarak ayarlayın. Epidermal hücrelerin içinde floresan bulunmaması, köklerin yaşayabilirliğini doğrular.
- Fideyi 1x fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile örtün.
- Girinti protokolü
NOT: Tüm AFM ölçümlerini, numunenin oda sıcaklığında desteğinde hareketsiz hale getirilmesinden sonra 1 saat içinde gerçekleştirin. AFM'nin bulunduğu oda klima ile 25 °C'de muhafaza edilmelidir. PBS çözeltisi aynı sıcaklıkta olmalıdır.- Piramidal uçlu standart bir silikon nitrür konsolunu (bakınız Malzeme Tablosu) sıvı için AFM prob tutucusuna (Malzeme Tablosu) monte edin.
- Konsol üzerindeki lazeri ucun konumuna yakın bir yerde hizalayın. Ardından, lazer noktasını dedektörün merkezine yerleştirmek için fotodiyotu hareket ettirin.
- Sapma hassasiyetini kalibre etmek için, AFM'nin altına 1x PBS'li bir polistiren Petri kabı yerleştirin.
NOT: Bu adım, girintiyi hesaplamak için gereklidir. Sert bir yüzeyde bir kuvvet ölçümü yapıldığında, yüzeye girinti girmez, bu nedenle z tarayıcı yer değiştirmesindeki herhangi bir değişiklik, konsol sapmasına karşılık gelir. Bu nedenle, sert bir yüzeyde sapma hassasiyetini kalibre etmek çok önemlidir. Yumuşak bir yüzey kullanmak, sapma hassasiyetini abartacak ve bu da çok düşük yay sabitlerine neden olacaktır. - Fotodetektörü, temassız sapma 0 V'a yakın olacak şekilde ayarlayın. 3 μm rampa boyutu, 0,6 μm / s girinti ve geri çekme hızı ve 0,5 V tetik eşiği ile bir girinti (kuvvet eğrisi) gerçekleştirerek sapma hassasiyetini kalibre edin.
- Konsol yay sabitini kalibre etmek için, yay sabitleri yaklaşık 5 N/m'den düşük olan problar için önerilen AFM yazılımının (Malzeme Tablosu) Termal Ayar yardımcı programını kullanın veya referans14'te açıklanan yöntemi kullanın. Yazılımda Thermal Tune'u etkinleştirmeden önce, probun numuneyle etkileşime girmediğinden emin olun.
- Konsol sıcaklığını girin. Termal Ayar > Kalibre Et'e veya NanoScope araç çubuğundaki Termal Ayar simgesine tıklayın. Bir frekans aralığı seçin (1-100 Hz).
- Termal Ayar panelinde Veri Al'a tıklayın. AFM'nin veri almasını bekleyin ve ardından Basit Harmonik Osilatör (Akışkan) düğmesine tıklayın.
- Medyan Filtre Genişliği'ni 3 olarak ayarlayın. Ortalama alarak elde edilen verilerdeki gürültüyü azaltmak için PSD Kutu Genişliği'ni ayarlayın. İlk rezonans zirvesinin etrafına uyum sınırları belirleyin.
- Bahar Sabit K'yı Hesapla'ya tıklayın ve ardından kullanıcının bu değeri kullanmak isteyip istemediğini soran açılır pencerede Evet'e tıklayın.
- Yukarıda açıklanan adımları üç kez tekrarlayın ve manuel olarak yay sabiti değerlerinin ortalamasını alın. Bu ortalama değeri, PicoForce görünümündeki Rampa parametre listesindeki Yay Sabiti kutusuna girin. Kalibrasyon bu noktada sona erer.
- Ters çevrilmiş optik mikroskobu 10x, 20x ve 40x göz merceği büyütmede kullanarak, AFM probunu birincil kökün dördüncü uzatılmış epidermal hücresinin yüzeyine yerleştirin ve hücrenin merkezine yerleştirilmesini sağlayın.
- Hesaplanan yay sabiti değeri (adım 3.2.5.5) ile, 3 μm rampa boyutuna, 11 nN tetikleme eşiğine ve seçilen noktalarda 0,6 μm/sn girinti ve geri çekme hızına sahip kuvvet eğrileri elde edin.
NOT: Önceki çalışma15,16, düşük girinti ve geri çekilme sıklığının histerezis ve sürükleme kuvvetini en aza indirmeye yardımcı olduğunu bulmuştur. - Her tedavi için kök başına üç hücreden kuvvet eğrileri elde edin (tedavi başına üç biyolojik replikasyon kullanın). Her kök için en az 150 kuvvet eğrisi yakalayın.
4. Görünür Young modülünü ölçün
- Piramidal girintiler için her kuvvet eğrisini aşağıdaki modele uydurun17:
E, numunenin görünür Young modülüdür, 
numunenin Poisson modülüdür ve α tepe noktasına yarı açıdır. Uyumları 0,99'< bir korelasyon katsayısı (r2) ile atın. Poisson'un tamamen sıkıştırılamaz malzeme için oranını göz önünde bulundurun: = 0.5 ve üreticiler tarafından verilen girintinin geometrisi.
NOT: Bağlantı elemanının hücre duvarı mekaniğine mümkün olduğunca duyarlı olması ve turgor basıncının görünür Young modül değerleri8 üzerindeki etkisini azaltmak için yükleme eğrisinin temas noktasından ilk 100 nm'yi kullanın. Montaj, yükleme eğrisinin temas noktasından belirli bir girinti derinliğinin ayarlanmasına izin veren özel bir MATLAB programı (kişisel istek üzerine JC B'ye yazılarak kullanılabilir) kullanılarak yapılmıştır. - Görünen Young modül verileriyle normalleştirilmiş bir histogram oluşturun ve bunu bir Gauss dağılımına uydurun. Veri noktalarını %95 güven aralığının dışına atın ve hem histogramı hem de Gauss uyumunu yeniden hesaplayın. Görünen Young modülünün ortalama ve standart sapmasını hesaplayın ve raporlayın.
- ANOVA gibi çoklu karşılaştırma testleri ile gruplar arasındaki karşılaştırmaların önemini belirleyin.
E, numunenin görünür Young modülüdür, 
numunenin Poisson modülüdür ve α tepe noktasına yarı açıdır. Uyumları 0,99'< bir korelasyon katsayısı (r2) ile atın. Poisson'un tamamen sıkıştırılamaz malzeme için oranını göz önünde bulundurun: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kuvvet-Girinti deneyleri
Aşağıdaki metinde, protokol iyi yürütüldüğünde beklenen tipik çıktıyı göstermek için bir kuvvet girinti deneyi yapıldığında beklenen bazı sonuçlar sunulmaktadır.
Kuvvet-yer değiştirme eğrileri
Canlı örneklerin kök uzama bölgesinin hücresinin merkezine yerleştirilen bir konumda girintili girinti elde edilen temsili kuvvet girinti grafikleri Şekil 2'de sunulmuştur. AFM ucu hücre duvarının yüzeyini girintilemeye başladığında, hücre duvarının deformasyona karşıtlığı nedeniyle kuvvet artmaya başlar ( Şekil 2A'da 1 ile gösterilir). Kuvvet artışı (yükleme), maksimum kuvvet değerine ulaşılana kadar devam eder ( Şekil 2A'da 2 ile gösterilir); Bu noktadan sonra, girintinin boşaltma kısmı başlar.
Şekil 2: Canlı kök uzama bölgesi hücrelerinin hücre duvarlarında yapılan girinti deneylerinde elde edilen kuvvet-yer değiştirme eğrileri. (A) Tipik bir kuvvet-yer değiştirme eğrisi. 1 ile işaretlenmiş konumda, kuvvet artmaya başlar; AFM ucu hücre duvarına girinti eklemeye başlar. Kuvvet artışı (yükleme), 2 ile belirtildiği gibi maksimum kuvvet değerine ulaşılana kadar devam eder; Bu noktadan sonra, girintinin boşaltma kısmı başlar. (B) Girintiden önce hücre yüzeyinin konumunu tespit etmenin imkansız olduğu (a ile gösterilir) ve hem yükleme hem de boşaltma eğrilerinin gürültülü olduğu bir kuvvet yer değiştirme eğrisi örneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Beklenen kuvvet-yer değiştirme eğrileri, girinti kısmında, modelin öngördüğü gibi (adım 4.1'de açıklandığı gibi) kuvvetin bir parabolden sonra büyüdüğünü gösterecektir (Şekil 2A). Başka bir montaj parametresi temas noktası konumudur; girintiden önce hücre duvarı yüzeyine karşılık gelmelidir ve AFM uç yer değiştirmesinin kaynağı olarak kabul edilir. Girinti atılmadan önce temas noktasının tespit edilmesinin imkansız olduğu kuvvet eğrileri atılmalıdır (Şekil 2B). Kuvvet girintileme deneyinin yükleme ve boşaltma eğrisi gürültüden yoksun olmalıdır. Şekil 2B'de gösterildiği gibi gürültülü eğriler atılmalıdır.
Görünür Young modülünün normalleştirilmiş histogramı
Kontrol koşullarında yetiştirilen üç farklı Col-0 bitkisinin dokuz farklı hücresi üzerinde 201 başarılı girinti seti için görünür Young modülünün elde edilen değerlerinin frekansının dağılımını gösteren histogramlar Şekil 3'te sunulmuştur. Şekil, görünür Young modülünün (88.12 ± 2.79 KPa) ortalama ve standart sapmasının, Gauss eğrisi6 ile donatılmış histogramlardan hesaplandığı bir örneği göstermektedir.
Şekil 3: Sonuçların uygun bir istatistiksel analizine izin veren görünür Young modülünün histogramı örneği. Veriler, kontrol koşullarında yetiştirilen üç farklı Col-0 bitkisinin dokuz farklı hücresi üzerindeki kuvvet eğrilerinden elde edildi. 201 Kuvvet eğrisinden elde edilen veriler bir Gauss dağılımına takıldı. Göreceli frekans, hesaplanan her görünür Young modülüne karşılık gelen takılı kuvvet eğrilerinin sayısını gösterir. Bu durumun ortalama ve standart sapma değerleri Gauss uyumlarından elde edilmiştir. RF: Bağıl frekans; AEM: Görünür Young modülü. Bu şekil referans6'dan değiştirilmiştir Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bazı genotiplerin kökün morfolojisi nedeniyle girintilenmesi çok zor olabilir. Bu, şiddetli ozmotik streste yetiştirilen prc1-1 mutant ve ttl1 prc1-1 çift mutant için geçerliydi. Bu durumda, bu mutantların kök uzama bölgesinde az sayıda uzamış hücresi vardı ve numune hareketini üreten konsola müdahale eden çok uzun kök kılları geliştirdiler. Şekil 4, görünür Young modülünün elde edilen değerlerinin ttl1 prc1-1 çift mutantının dokuz farklı hücresi üzerindeki olasılık dağılımını gösteren histogramları sunmaktadır. Şekil, elde edilen kuvvet eğrilerinin uygun analize izin vermediği bir örneği göstermektedir. Sadece bir hücreye karşılık gelen Histogram H, Gauss dağılımı6'ya takılabilir.
Şekil 4: Uygun bir analize izin vermeyen görünür Young modülünün histogramlarına örnek. Veriler, ttl1prc1-1 çift mutantının üç farklı bitkisinin dokuz farklı hücresi üzerindeki kuvvet eğrilerinden elde edildi. Göreceli frekans, hesaplanan her görünür Young modülüne karşılık gelen takılı kuvvet eğrilerinin sayısını gösterir. Gauss dağılımına sadece histogram H takılabilir. RF: Bağıl frekans; AEM: Görünen Young modülü. Bu şekil referans6'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre ve hücre duvarı mekaniği, mekaniğin büyüme süreçlerini nasıl etkilediğine dair fikir edinmek için giderek daha alakalı hale geliyor. Fiziksel kuvvetler katı dokularda önemli mesafelere yayıldıkça, hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklerin ve bunların bitkinin büyümesini nasıl algıladıkları, kontrol edildikleri, ayarlandıkları ve etkiledikleri üzerine yapılan çalışmalar önemli bir çalışma alanı haline gelmektedir 2,3,8.
Arabidopsis kökünün uzama bölgesindeki hücrelerin hücre duvarı fiziksel özelliklerini incelemek için burada bir yöntem sunulmuştur. AFM tekniği, hücre duvarının fiziksel özelliklerinin kök büyümesindeki etkisini anlamak için büyüme hızı çalışmaları gibi diğer tekniklerle kolayca birleştirilebilir.
En kritik deneysel adımlardan biri, numunenin mekanik olarak hareketsiz hale getirilmesidir; girintiliyken numune hareketini önlemek için numune sıkıca tutturulmalıdır. Silikon yapıştırıcının tabakası, hızlı bir şekilde kurumasını sağlayacak kadar ince olmalıdır. Silikon yapıştırıcının ve numunenin manipülasyonu, silikonun ölçülecek numunenin alanlarını örtmemesini sağlamak için dikkatli olmalıdır. Ayrıca, silikon yapıştırıcının yapışkan özelliklerini korumak ve kök dehidrasyonunu önlemek için preparat hızlı bir şekilde (bir dakika içinde) tamamlanmalıdır. Doku hasarını önlemek çok önemlidir; epidermal dokunun dehidrasyonu ve hasarı, hücre duvarının mekanik özelliklerinde geri dönüşü olmayan değişiklikler üretecektir. Diğer yöntemler, bir cam slayt üzerinde% 1 agarozda immobilizasyon kullandı; Bununla birlikte, bu yöntem aynı zamanda hızlı manipülasyona ve numunelerin analiz sırasında X ve Y eksenlerinde hareket etmesini önlemek için cam slaytların hazırlanmasında ek bir adıma ihtiyaç duyma zorluğuna da sahiptir. Daha fazla bilgi için bkz: Başvurular 8,18. Bu protokolün bir diğer ilgili noktası, farklı hedeflere (10x, 20x ve 40x) sahip AFM'ye bağlı epifloresanlı bir optik mikroskopla saymaktır. Bu, girinti alanının doğru bir şekilde seçilmesini sağlar.
Protokolün zorlu bir yönü, AFM girinti ayarlarının seçimidir. Farklı girintiler ve girinti derinlikleri farklı çözünürlükler oluşturur ve farklı araştırma sorularını cevaplamak için kullanılabilir8. Birçok çalışma, ucun boyutunun ve geometrisinin, istenen sonuçları ayırt etmek için önemli hususlar olduğunu göstermiştir. Farklı uç şekilleri ile farklı bilgiler elde edilir7. Örneğin, konik uç, hücre altı seviyedeki mekanik özellikleri ayırt edebilir, küresel uç tüm hücrenin mekanik özelliklerini daha iyi temsil edebilir19 ve piramidal uçlar aynı anda yüksek çözünürlüklü görüntüler ve mekanik özellikler elde etmeyi sağlar 7,20. Piramidal uç yarıçapının (20-60 nm) seçimi, ucun batmasını önlemek için önemlidir ve uygun bir girinti işlemine izin verir. Her uygulama için, araştırmacı numune için daha uygun konsol tipini (ve ucunu) ve8'i gerçekleştirecek ölçüm türünü seçmelidir.
Yöntemin bazı sınırlamaları vardır: sadece organların yüzeyindeki hücrelerin mekanik özellikleri ölçülebilir ve değişken topografyalara sahip dokularla çalışmak zordur. Örneğin, kök kılları AFM ucu8,18 ile epidermal hücrelere erişmeyi zorlaştırabilir. Son olarak, sunulan yöntem elastikiyeti ölçerken, nanogirinti de bitki ve hayvanlarda viskozite ve turgor basıncını bildirmek için kullanılmıştır 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur. Verileri sığdırmak için kullanılan MATLAB betiği, kişisel talep üzerine J. C. B'ye yazılarak kullanılabilir.
Acknowledgments
Bu araştırma CSIC I + D 2018, hibe No. 95 (Mariana Sotelo Silveira) tarafından finanse edilmiştir.; CSIC Grupos (Omar Borsani) ve PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
