Summary
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी इंडेंटेशन प्रोटोकॉल सामान्य या विवश विकास (यानी, पानी की कमी के तहत) के दौरान ऊतक या अंग के किसी विशेष सेल की कोशिका भित्ति के भौतिक गुणों की भूमिका को विच्छेदित करने की संभावना प्रदान करता है।
Abstract
एक ऑप्टिकल उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ युग्मित परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) के साथ नैनोइंडेंटेशन के माध्यम से जीवित एराबिडोप्सिस जड़ों की एपिडर्मल कोशिकाओं की कोशिका भित्ति के भौतिक गुणों को चिह्नित करने के लिए यहां एक विधि का वर्णन किया गया है। विधि में इसके विरूपण को मापते हुए नमूने पर नियंत्रित बलों को लागू करना शामिल है, जिससे उपकोशिकीय संकल्पों पर सेल की दीवारों के स्पष्ट यंग के मापांक जैसे मापदंडों को निर्धारित करने की अनुमति मिलती है। इसके लिए नमूने के सावधानीपूर्वक यांत्रिक स्थिरीकरण और इंडेंटर और इंडेंटेशन गहराई के सही चयन की आवश्यकता होती है। यद्यपि इसका उपयोग केवल बाहरी ऊतकों में किया जा सकता है, यह विधि विकास के दौरान पौधे की कोशिका की दीवारों में यांत्रिक परिवर्तनों को चिह्नित करने की अनुमति देती है और पूरे अंग के विकास के साथ इन सूक्ष्म परिवर्तनों के सहसंबंध को सक्षम बनाती है।
Introduction
पौधे की कोशिकाएं एक कोशिका भित्ति से घिरी होती हैं जो पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स और पानी के अंतःक्रियात्मक नेटवर्क से बनी एक जटिल संरचना है जो सेल प्रकार और विकास के चरण 1,2 के आधार पर मोटाई में0.1 से कई μm तक भिन्न होती है। सेल दीवार यांत्रिक गुण पौधों के विकास में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। सेल की दीवार के कम कठोरता मूल्यों को सेल विकास और सेल-दीवार विस्तार के लिए एक पूर्व शर्त के रूप में प्रस्तावित किया गया है, और इस बात के सबूत बढ़ रहे हैं कि सभी कोशिकाएं अपने कार्यों को करने के लिए यांत्रिक बलों को महसूस करती हैं। हालांकि, यह अभी भी बहस की जाती है कि क्या सेल की दीवार के भौतिक गुणों में परिवर्तन सेल भाग्य 2,3,4 को निर्धारित करता है। क्योंकि पौधे की कोशिकाएं विकास के दौरान आगे नहीं बढ़ती हैं, एक अंग का अंतिम आकार इस बात पर निर्भर करता है कि एक कोशिका कितनी दूर और किस दिशा में फैलती है। इस प्रकार, एराबिडोप्सिस रूट सेल विस्तार में सेल दीवार भौतिक गुणों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है क्योंकि जड़ के विभिन्न क्षेत्रों में विभिन्न प्रकार के विस्तार होते हैं। उदाहरण के लिए, अनिसोट्रोपिक विस्तार बढ़ाव क्षेत्र में और विशेष रूप से एपिडर्मल कोशिकाओंमें स्पष्ट रूप से स्पष्ट है।
यहां वर्णित विधि का उपयोग परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) का उपयोग करके जीवित एराबिडोप्सिस जड़ों के नैनोस्केल पर एपिडर्मल कोशिकाओं की कोशिका भित्ति के भौतिक गुणों को चिह्नित करने के लिएकिया गया था। एएफएम तकनीक के व्यापक संशोधन के लिए, 7,8,9 पढ़ें।
यह प्रोटोकॉल एक बुनियादी नमूना तैयारी विधि और प्लांट सेल की दीवारों के एएफएम-आधारित लोच माप के लिए एक सामान्य विधि को रेखांकित करता है।
चित्र 1: परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके एराबिडोप्सिस जड़ों में बल-इंडेंटेशन प्रयोग का योजनाबद्ध अवलोकन। यह योजना सब्सट्रेट की तैयारी से लेकर रूट नमूने को मजबूती से स्थिर करने (1-2), प्रोपिडियम आयोडाइड स्टेनिंग (3) के माध्यम से रूट व्यवहार्यता की पुष्टि, प्राथमिक जड़ (4-5) के लम्बी एपिडर्मल सेल की सतह पर कैंटिलीवर पोजिशनिंग, बल वक्र माप (6), और स्पष्ट यंग के मापांक (7-8) की गणना करने के लिए बल वक्र प्रसंस्करण से फोर्स-इंडेंटेशन प्रयोग के चरणों का अवलोकन देती है। ईजेड: बढ़ाव क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
1. पौधे की सामग्री और विकास की स्थिति की तैयारी
- आवश्यक पौधे सामग्री उत्पन्न करने के लिए, एराबिडोप्सिस जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती लाइनों के बीजों को निष्फल करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, हमने निम्नलिखित का उपयोग किया: टीटीएल 1: टी-डीएनए सम्मिलन लाइनें Salk_063943 (टीटीएल 1 के लिए; एटी 1 जी 53300) - कोलंबिया -0 (कोल -0) जंगली प्रकार; प्रोकस्टे 1 (पीआरसी 1-1) उत्परिवर्ती, जिसमें सीईएसए 6 जीन (एटी 5 जी 64740) में एक नॉक-आउट म्यूटेशन (क्यू 720स्टॉप) होता है, जैसा कि पहले10,11 में वर्णित है; और ttl1 x prc1-1 डबल म्यूटेंट।- एक माइक्रोट्यूब में बीज की अनुमानित मात्रा 50 μL डालें। कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल + 0.01% ट्वीन घोल का 500 μL जोड़ें। 7 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
- इथेनॉल घोल डालें और 20% सोडियम हाइपोक्लोराइट के 500 μL जोड़ें। 7 मिनट के लिए मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
- सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल डालें और बीज को बाँझ पानी से तीन से चार बार धोएं।
- चढ़ाना
- बेसल मुराशिगे और स्कूग (एमएस) माध्यम12 + 1.5% सुक्रोज + 1% अगर (पीएच 5.7) ( सामग्री की तालिका देखें) में अग्रिम रूप से तैयार करें। माध्यम को स्वचालित करें। बाँझ वातावरण में काम करने के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड तैयार करें और प्रयोग के लिए आवश्यक चौकोर पेट्री व्यंजनों को लेबल करें। पेट्री व्यंजनों में माध्यम डालें और माध्यम को ठोस होने दें।
- माध्यम युक्त वर्ग पेट्री व्यंजनों पर बाँझ पिपेट युक्त युक्तियों का उपयोग करके निष्फल बीजों को प्लेट करें। बीज को दो पंक्तियों में समान रूप से वितरित करें। जब बीज सूख जाएं, तो ढक्कन बंद करें और प्लेटों को सील करें। बीज को 4 दिनों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्ट्रैटिफाई करें।
नोट: अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए स्तरीकरण की आवश्यकता होती है। - प्लेटों को विकास कक्ष में लंबवत रूप से 25 μmol m 2 s-1 प्रकाश तीव्रता और23 °C (दिन / रात) के साथ एक लंबे दिन के शासन (16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे) में रखें। रोपाई को 7 दिनों के लिए उगाएं।
2. आसमाटिक तनाव उपचार (वैकल्पिक)
नोट: यह खंड क्रायोस्कोपिक ऑस्मोमीटर (सामग्री की तालिका) द्वारा अनुमानित -1.2 एमपीए की आसमाटिक क्षमता में एराबिडोप्सिस जड़ों के विकास पर विवरण प्रदान करता है। इस भाग को हाथ में प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर छोड़ा या बदला जा सकता है।
- बेसल एमएस माध्यम + 1.5% सुक्रोज + 400 एमएम मैनिटोल + 1% अगर (पीएच 5.7) तैयार करें। माध्यम को स्वचालित करें। लैमिनार प्रवाह हुड में चौकोर पेट्री व्यंजनों में माध्यम डालें और माध्यम को ठोस होने दें।
- चिमटी (सामग्री की तालिका) के साथ, बेसल एमएस + 1.5% सुक्रोज माध्यम में पहले से उगाए गए 5 दिन पुराने पौधों को स्क्वायर पेट्री व्यंजनों में रखें, जिसमें माध्यम 400 एमएम मैनिटोल के साथ पूरक होता है। चरण 1.2.3 में समान परिस्थितियों में विकास कक्ष में प्लेटों को लंबवत रूप से रखें। 7 दिनों के लिए इस आसमाटिक तनाव की स्थिति के तहत रोपाई उगाएं।
नोट: गंभीर आसमाटिक तनाव के दौरान प्राथमिक जड़ के जड़ विकास अनुकूलन का मूल्यांकन करने के लिए, नियंत्रित परिस्थितियों में उगाए गए अंकुरण के 5 दिन बाद रोपाई का उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है ताकि यह सुनिश्चितकिया जा सके कि रूट मेरिस्टेम आकार पहले से ही स्थापित है। वैकल्पिक रूप से, आसमाटिक तनाव कार्रवाई के विकास ता्मक प्रभाव को निर्धारित करने के लिए विकास के हर चरण में विश्लेषण किया जा सकता है।
3. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) नैनोइंडेंटेशन प्रयोग
- नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए नमूने की तैयारी
नोट: यह जीवित जैविक नमूनों के अध्ययन के लिए एएफएम को लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इंडेंटेशन माप के दौरान यांत्रिक रूप से स्थिर होने के लिए नमूना को सब्सट्रेट से मजबूती से जोड़ा जाना चाहिए। इसी समय, नमूना संरचनात्मक गुणों को संरक्षित किया जाना चाहिए। एएफएम के लिए एक बड़े नमूने को स्थिर करने के लिए एक प्रभावी रणनीति चिपकने वाले का उपयोग करना है। चिपकने वाला जल्दी से सूखना चाहिए और आसपास के माध्यम के साथ विषाक्त या प्रतिक्रियाशील नहीं होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, पॉलीस्टाइनिन पेट्री व्यंजनों का उपयोग सब्सट्रेट के रूप में किया गया था और गैर-अम्लीय सिलिकॉन गोंद (सामग्री की तालिका) का उपयोग एराबिडोप्सिस रोपाई को बांधने के लिए किया गया था।- एक कवरस्लिप के साथ पेट्री डिश में सिलिकॉन गोंद की एक पतली परत फैलाएं। गोंद को 45 सेकंड के लिए हवा में छोड़ दें।
- चिमटी के साथ, अंकुर को गोंद पर रखें, इसे एक ऐसी दिशा में उन्मुख करें जो अंकुर के उभरे हुए भागों और कैंटिलीवर के बीच संपर्क से बचता है। फिर, जड़ को सिलिकॉन गोंद परत पर धीरे से दबाएं ताकि इसे मजबूती से बांधा जा सके। प्रोटोकॉल के अगले चरणों को जारी रखने से पहले अंकुर को गोंद के संपर्क में 45 सेकंड के लिए छोड़ दें।
- संलग्न रोपाई को 2 μg / mL प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) के साथ इनक्यूबेट करें; सामग्री की तालिका) अंधेरे में 5 मिनट के लिए और सावधानीपूर्वक उन्हें 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) समाधान (सामग्री की तालिका) के साथ तीन बार धोएं।
- पीआई-इनक्यूबेटेड रोपाई को एएफएम के साथ युग्मित एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में रखें। प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, क्रमशः 572 एनएम और 617 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट करें। एपिडर्मल कोशिकाओं के अंदर प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति जड़ों की व्यवहार्यता की पुष्टि करती है।
- अंकुर को 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) घोल के साथ कवर करें।
- इंडेंटेशन प्रोटोकॉल
नोट: कमरे के तापमान पर इसके समर्थन पर नमूने के स्थिरीकरण के बाद 1 घंटे के भीतर सभी एएफएम माप करें। जिस कमरे में एएफएम स्थित है, उसे एयर कंडीशनर के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए। पीबीएस समाधान एक ही तापमान पर होना चाहिए।- द्रव (सामग्री की तालिका) के लिए एएफएम जांच धारक में पिरामिड टिप (सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक मानक सिलिकॉन नाइट्राइड कैंटिलीवर माउंट करें।
- टिप की स्थिति के करीब कैंटिलीवर पर लेजर संरेखित करें। इसके बाद, डिटेक्टर के केंद्र में लेजर स्पॉट रखने के लिए फोटोडायोड को स्थानांतरित करें।
- विक्षेपण संवेदनशीलता को कैलिब्रेट करने के लिए, एएफएम के तहत 1x PBS के साथ एक पॉलीस्टाइनिन पेट्री डिश रखें।
नोट: इंडेंटेशन की गणना करने के लिए इस चरण की आवश्यकता है। जब एक कठोर सतह पर बल माप किया जाता है, तो सतह में कोई इंडेंटेशन नहीं होता है, इसलिए जेड स्कैनर विस्थापन में कोई भी परिवर्तन कैंटिलीवर विक्षेपण से मेल खाता है। इसलिए, एक कठोर सतह पर विक्षेपण संवेदनशीलता को कैलिब्रेट करना बहुत महत्वपूर्ण है। एक नरम सतह का उपयोग करने से विक्षेपण संवेदनशीलता को अधिक महत्व दिया जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप वसंत स्थिरांक होंगे जो बहुत कम हैं। - फोटोडिटेक्टर को इस तरह समायोजित करें कि गैर-संपर्क विक्षेपण 0 V के पास है। 3 μm के रैंप आकार, 0.6 μm/ s की इंडेंटेशन-एंड-रिट्रेक्शन दर और 0.5 V की ट्रिगर सीमा के साथ एक इंडेंटेशन (बल वक्र) करके विक्षेपण संवेदनशीलता को कैलिब्रेट करें।
- कैंटिलीवर के स्प्रिंग स्थिरांक को कैलिब्रेट करने के लिए, लगभग 5 एन / एम से कम स्प्रिंग स्थिरांक के साथ जांच के लिए अनुशंसित एएफएम सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) की थर्मल ट्यून उपयोगिता का उपयोग करें या संदर्भ14 में वर्णित विधि का उपयोग करें। सॉफ्टवेयर में थर्मल ट्यून को सक्रिय करने से पहले, सुनिश्चित करें कि जांच नमूने के साथ बातचीत नहीं करती है।
- कैंटिलीवर तापमान दर्ज करें। कैलिब्रेट > थर्मल ट्यून पर या नैनोस्कोप टूलबार में थर्मल ट्यून आइकन पर क्लिक करें। किसी आवृत्ति श्रेणी (1-100 Hz) का चयन करें।
- थर्मल ट्यून पैनल में डेटा प्राप्त करें पर क्लिक करें। डेटा प्राप्त करने के लिए एएफएम की प्रतीक्षा करें, और फिर सरल हार्मोनिक ऑसिलेटर (द्रव) बटन पर क्लिक करें।
- औसत फ़िल्टर चौड़ाई को 3 पर समायोजित करें। औसत द्वारा अधिग्रहित डेटा में शोर को कम करने के लिए PSD बिन चौड़ाई समायोजित करें। पहले अनुनाद शिखर के चारों ओर फिट सीमाएं निर्धारित करें।
- स्प्रिंग कॉन्स्टेंट के की गणना करें पर क्लिक करें, और फिर, पॉप-अप विंडो में हां पर क्लिक करें और पूछें कि क्या उपयोगकर्ता इस मान का उपयोग करना चाहता है।
- ऊपर वर्णित चरणों को तीन बार दोहराएं और मैन्युअल रूप से वसंत स्थिर मूल्यों का औसत लें। पिकोफोर्स दृश्य में रैंप पैरामीटर सूची में स्प्रिंग कॉन्स्टेंट बॉक्स में यह औसत मान दर्ज करें। अंशांकन इस बिंदु पर समाप्त होता है।
- 10x, 20x और 40x आईपीस आवर्धन पर उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, एएफएम जांच को प्राथमिक जड़ के चौथे लम्बी एपिडर्मल सेल की सतह पर रखें, इसे सेल के केंद्र में रखना सुनिश्चित करें।
- गणना किए गए स्प्रिंग स्थिर मान (चरण 3.2.5.5) के साथ, चयनित बिंदुओं पर 3 μm के रैंप आकार, 11 nN की ट्रिगर सीमा और 0.6 μm/ s की इंडेंटेशन-एंड-रिट्रेक्शन दर के साथ बल वक्र प्राप्त करें।
नोट: पिछले काम15,16 में पाया गया कि इंडेंटेशन-एंड-रिट्रेक्शन की कम आवृत्ति हिस्टैरिसीस और ड्रैग फोर्स को कम करने में मदद करती है। - प्रत्येक उपचार के लिए प्रति जड़ तीन कोशिकाओं से बल वक्र प्राप्त करें (प्रति उपचार तीन जैविक प्रतिकृतियों का उपयोग करें)। प्रत्येक जड़ के लिए कम से कम 150 बल वक्रों को कैप्चर करें।
4. स्पष्ट यंग के मापांक को मापें
- पिरामिड इंडेंटर्स के लिए प्रत्येक बल वक्र को निम्नलिखित मॉडल में फिट करें17:
जहां ई नमूने का स्पष्ट यंग का मापांक है, 
नमूने का पॉइसन मापांक है, और α शीर्ष का अर्ध-कोण है। सहसंबंध गुणांक (आर2) < 0.99 के साथ फिट को छोड़ दें। पूरी तरह से असंगत सामग्री के लिए पॉइसन के अनुपात पर विचार करें: = 0.5 और निर्माताओं द्वारा दिए गए इंडेंटर की ज्यामिति।
नोट: फिटिंग के लिए लोडिंग वक्र के संपर्क बिंदु से पहले 100 एनएम का उपयोग करें ताकि सेल दीवार यांत्रिकी के प्रति जितना संभव हो उतना संवेदनशील हो सके और स्पष्ट यंग के मापांक मान8 पर टर्गर दबाव के प्रभाव को कम किया जा सके। फिटिंग एक कस्टम MATLAB प्रोग्राम (J. C. B को लिखकर व्यक्तिगत अनुरोध पर उपलब्ध) का उपयोग करके की गई है जो लोडिंग वक्र के संपर्क बिंदु से एक विशिष्ट इंडेंटेशन गहराई सेट करने की अनुमति देता है। - स्पष्ट यंग के मापांक डेटा के साथ एक सामान्यीकृत हिस्टोग्राम बनाएं और इसे गॉसियन वितरण के साथ फिट करें। 95% आत्मविश्वास अंतराल के बाहर डेटा बिंदुओं को छोड़ दें और हिस्टोग्राम और गॉसियन फिट दोनों की फिर से गणना करें। स्पष्ट यंग के मापांक के माध्य और मानक विचलन की गणना और रिपोर्ट करें।
- एनोवा जैसे कई तुलना परीक्षणों द्वारा समूहों के बीच तुलना के महत्व को निर्धारित करें।
जहां ई नमूने का स्पष्ट यंग का मापांक है, 
नमूने का पॉइसन मापांक है, और α शीर्ष का अर्ध-कोण है। सहसंबंध गुणांक (आर2) < 0.99 के साथ फिट को छोड़ दें। पूरी तरह से असंगत सामग्री के लिए पॉइसन के अनुपात पर विचार करें: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
बल-इंडेंटेशन प्रयोग
निम्नलिखित पाठ कुछ परिणामों को प्रस्तुत करता है जब प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से निष्पादित होने पर विशिष्ट आउटपुट दिखाने के लिए एक बल-इंडेंटेशन प्रयोग आयोजित किया जाता है।
बल-विस्थापन मोड़
प्रतिनिधि बल इंडेंटेशन प्लॉट जो रूट बढ़ाव क्षेत्र के सेल के केंद्र में रखी गई स्थिति में जीवित नमूने में प्राप्त किए गए थे, चित्र 2 में प्रस्तुत किए गए हैं। जब एएफएम टिप सेल की दीवार की सतह को चिह्नित करना शुरू कर देता है, तो विरूपण के लिए सेल दीवार के विरोध के कारण बल बढ़ने लगता है (चित्रा 2 ए में 1 द्वारा इंगित)। बल (लोडिंग) की वृद्धि तब तक जारी रहती है जब तक कि अधिकतम बल मूल्य तक नहीं पहुंच जाता है ( चित्रा 2 ए में 2 द्वारा इंगित); इस बिंदु के बाद, इंडेंटेशन का अनलोडिंग हिस्सा शुरू होता है।
चित्र 2: जीवित जड़ बढ़ाव क्षेत्र कोशिकाओं की कोशिका भित्ति में किए गए इंडेंटेशन प्रयोगों में प्राप्त बल-विस्थापन वक्र। (A) एक विशिष्ट बल-विस्थापन वक्र। 1 द्वारा चिह्नित स्थिति पर, बल बढ़ना शुरू हो जाता है; एएफएम टिप सेल की दीवार को चिह्नित करना शुरू कर देती है। बल (लोडिंग) की वृद्धि तब तक जारी रहती है जब तक कि अधिकतम बल मूल्य तक नहीं पहुंच जाता है, जैसा कि 2 के साथ इंगित किया गया है; इस बिंदु के बाद, इंडेंटेशन का अनलोडिंग हिस्सा शुरू होता है। (बी) बल-विस्थापन वक्र का उदाहरण जिसमें इंडेंटेशन (ए द्वारा इंगित) से पहले सेल की सतह की स्थिति का पता लगाना असंभव है, और लोडिंग और अनलोडिंग वक्र दोनों शोर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
अपेक्षित बल-विस्थापन वक्र इंडेंटेशन भाग में दिखाएंगे कि बल एक पैराबोला के बाद बढ़ता है, जैसा कि मॉडल द्वारा भविष्यवाणी की गई है (चरण 4.1 में समझाया गया है) (चित्रा 2 ए)। एक और फिटिंग पैरामीटर संपर्क बिंदु की स्थिति है; यह इंडेंटेशन से पहले सेल की दीवार की सतह के अनुरूप होना चाहिए और इसे एएफएम टिप विस्थापन की उत्पत्ति माना जाता है। बल वक्र जिसमें इंडेंटेशन को त्यागने से पहले संपर्क के बिंदु का पता लगाना असंभव है (चित्रा 2 बी)। बल-इंडेंटेशन प्रयोग के लोडिंग और अनलोडिंग वक्र शोर से रहित होना चाहिए। शोर-शराबे वाले वक्रों जैसे कि चित्र 2B में दर्शाए गए वक्रों को छोड़ दिया जाना चाहिए।
स्पष्ट यंग के मापांक का सामान्यीकृत हिस्टोग्राम
नियंत्रण स्थितियों में उगाए गए कोल -0 के तीन अलग-अलग पौधों की नौ अलग-अलग कोशिकाओं पर 201 सफल इंडेंटेशन के एक सेट के लिए स्पष्ट यंग के मापांक के प्राप्त मूल्यों की आवृत्ति के वितरण को दिखाने वाले हिस्टोग्राम चित्र 3 में प्रस्तुत किए गए हैं। आंकड़ा एक उदाहरण दिखाता है जिसमें गॉसियन वक्र6 के साथ फिट हिस्टोग्राम से स्पष्ट यंग के मापांक (88.12 ± 2.79 केपीए) के औसत और मानक विचलन की गणना की गई थी।
चित्रा 3: स्पष्ट यंग के मापांक के हिस्टोग्राम का उदाहरण जिसने परिणामों के उचित सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति दी। नियंत्रण स्थितियों में उगाए गए कोल -0 के तीन अलग-अलग पौधों की नौ अलग-अलग कोशिकाओं पर बल वक्रों से डेटा प्राप्त किया गया था। 201 फोर्स कर्व्स से प्राप्त डेटा को गॉसियन वितरण के लिए फिट किया गया था। सापेक्ष आवृत्ति फिट किए गए बल वक्रों की संख्या को इंगित करती है जो प्रत्येक गणना किए गए स्पष्ट यंग के मापांक के अनुरूप हैं। इस स्थिति के औसत और मानक विचलन मान गॉसियन फिट्स से प्राप्त किए गए थे। आरएफ: सापेक्ष आवृत्ति; एईएम: स्पष्ट यंग का मापांक। यह आंकड़ा संदर्भ6 से संशोधित किया गया था कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
जड़ की आकृति विज्ञान के कारण कुछ जीनोटाइप की पहचान करना बहुत मुश्किल हो सकता है। यह पीआरसी 1-1 उत्परिवर्ती और टीटीएल 1 पीआरसी 1-1 डबल म्यूटेंट के लिए मामला था जो गंभीर आसमाटिक तनाव में उगाया गया था। इस स्थिति में, इन उत्परिवर्ती में जड़ बढ़ाव क्षेत्र में कुछ लम्बी कोशिकाएं थीं और बहुत लंबे जड़ बाल विकसित हुए, जो नमूना आंदोलन का उत्पादन करने वाले कैंटिलीवर में हस्तक्षेप करते हैं। चित्रा 4 हिस्टोग्राम प्रस्तुत करता है जो टीटीएल 1 पीआरसी 1-1 डबल म्यूटेंट की नौ अलग-अलग कोशिकाओं पर स्पष्ट यंग के मापांक के प्राप्त मूल्यों के संभाव्यता वितरण को दर्शाता है। आंकड़ा एक उदाहरण दिखाता है जिसमें प्राप्त बल वक्रों ने उचित विश्लेषण की अनुमति नहीं दी। केवल हिस्टोग्राम एच जो एक सेल से मेल खाता है, उसे गॉसियन वितरण 6 में फिट किया जा सकताहै।
चित्रा 4: स्पष्ट यंग के मापांक के हिस्टोग्राम का उदाहरण जो उचित विश्लेषण की अनुमति नहीं देता था। टीटीएल 1 पीआरसी 1-1 डबल म्यूटेंट के तीन अलग-अलग पौधों की नौ अलग-अलग कोशिकाओं पर बल वक्रों से डेटा प्राप्त किया गया था। सापेक्ष आवृत्ति फिट किए गए बल वक्रों की संख्या को इंगित करती है जो प्रत्येक गणना किए गए स्पष्ट यंग के मापांक के अनुरूप हैं। गॉसियन वितरण के लिए केवल हिस्टोग्राम एच फिट किया जा सकता है। आरएफ: सापेक्ष आवृत्ति; एईएम: स्पष्ट यंग का मापांक। इस आंकड़े को संदर्भ6 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सेल और सेल-वॉल मैकेनिक्स तेजी से प्रासंगिक हो रहे हैं ताकि यह पता चल सके कि यांत्रिकी विकास प्रक्रियाओं को कैसे प्रभावित करती है। चूंकि ठोस ऊतकों में भौतिक बल काफी दूरी पर फैलते हैं, सेल की दीवार के भौतिक गुणों में परिवर्तन का अध्ययन और उन्हें कैसे महसूस किया जाता है, नियंत्रित किया जाता है, ट्यून किया जाता है, और पौधे के विकास को प्रभावित किया जाता है, अध्ययन 2,3,8 का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन रहा है।
एराबिडोप्सिस जड़ के बढ़ाव क्षेत्र में कोशिकाओं की कोशिका भित्ति भौतिक गुणों का अध्ययन करने के लिए यहां एक विधि प्रस्तुत की गई है। जड़ विकास में सेल की दीवार भौतिक गुणों के प्रभाव को समझने के लिए, एएफएम तकनीक को अन्य तकनीकों के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है, जैसे कि विकास दर अध्ययन।
सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चरणों में से एक नमूने का यांत्रिक स्थिरीकरण है; नमूना आंदोलन से बचने के लिए नमूना दृढ़ता से जुड़ा होना चाहिए, जबकि यह इंडेंटेड है। सिलिकॉन गोंद की परत इतनी पतली होनी चाहिए कि इसे जल्दी से सूखने की अनुमति मिल सके। सिलिकॉन गोंद और नमूने के हेरफेर को यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहना चाहिए कि सिलिकॉन नमूने के उन क्षेत्रों को कवर नहीं करता है जिन्हें मापा जाएगा। इसके अलावा, सिलिकॉन गोंद के चिपकने वाले गुणों को बनाए रखने और जड़ों के निर्जलीकरण को रोकने के लिए तैयारी जल्दी (एक मिनट के भीतर) पूरी की जानी चाहिए। ऊतक क्षति को रोकने के लिए यह महत्वपूर्ण है; एपिडर्मल ऊतक का निर्जलीकरण और क्षति कोशिका भित्ति के यांत्रिक गुणों में अपरिवर्तनीय परिवर्तन पैदा करेगी। अन्य तरीकों ने ग्लास स्लाइड पर 1% अगारोस में स्थिरीकरण का उपयोग किया; हालांकि, इस विधि में विश्लेषण के दौरान नमूनों को एक्स और वाई अक्षों में स्थानांतरित होने से रोकने के लिए त्वरित हेरफेर और ग्लास स्लाइड की तैयारी के एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता की चुनौती भी है। अधिक जानकारी के लिए, संदर्भ 8,18 देखें। इस प्रोटोकॉल का एक और प्रासंगिक बिंदु एएफएम के साथ युग्मित एपिफ्लोरेसेंस के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ गणना करना है जिसके विभिन्न उद्देश्य हैं (10x, 20x, और 40x)। यह इंडेंटेशन क्षेत्र को सटीक रूप से चुनने की अनुमति देता है।
प्रोटोकॉल का एक चुनौतीपूर्ण पहलू एएफएम इंडेंटेशन सेटिंग्स का चयन है। विभिन्न इंडेंटर और इंडेंटेशन गहराई अलग-अलग संकल्प प्रस्तुत करते हैं और विभिन्न शोध प्रश्नों के उत्तर देने के लिए उपयोग किया जा सकताहै। कई अध्ययनों से पता चला है कि वांछित परिणामों को समझने के लिए टिप का आकार और ज्यामिति महत्वपूर्ण विचार हैं। विभिन्न टिप आकृतियों के साथ अलग-अलग जानकारी प्राप्त की जाती है। उदाहरण के लिए, शंक्वाकार टिप उप-सेलुलर स्तर पर यांत्रिक गुणों को भेदभाव कर सकती है, गोलाकार टिप पूरे सेल19 के यांत्रिक गुणों का बेहतर प्रतिनिधित्व कर सकती है, और पिरामिड युक्तियां एकही समय में उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों और यांत्रिक गुणों को प्राप्त करने की अनुमति देती हैं। पिरामिड टिप त्रिज्या (20-60 एनएम) का चयन टिप को डूबने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे एक उचित इंडेंटेशन प्रक्रिया की अनुमति मिलती है। प्रत्येक आवेदन के लिए, शोधकर्ता को नमूने के लिए बेहतर उपयुक्त कैंटिलीवर (और टिप) का प्रकार और8 करने के लिए माप के प्रकार का चयन करना होगा।
विधि की कुछ सीमाएं हैं: अंगों की सतह पर केवल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को मापा जा सकता है, और चर टोपोग्राफी वाले ऊतकों के साथ काम करना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, जड़ बाल एएफएम टिप8,18 के साथ एपिडर्मल कोशिकाओं तक पहुंचना मुश्किल बना सकते हैं। अंत में, जबकि प्रस्तुत विधि लोच को मापती है, नैनोइंडेंटेशन का उपयोग पौधों और जानवरों में चिपचिपाहट और टर्गर दबावकी रिपोर्ट करने के लिए भी किया गया है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है। डेटा फिट करने के लिए उपयोग की जाने वाली MATLAB स्क्रिप्ट J. C. B. को लिखकर व्यक्तिगत अनुरोध पर उपलब्ध है।
Acknowledgments
इस शोध को सीएसआईसी आई + डी 2018, अनुदान संख्या 95 (मारियाना सोटेलो सिल्वेरा) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; सीएसआईसी ग्रूपोस (उमर बोरसानी) और पेडीसीबा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
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