Summary
פרוטוקול הכניסה למיקרוסקופיה של הכוח האטומי מציע את האפשרות לנתח את תפקיד התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תא מסוים ברקמה או באיבר במהלך גדילה רגילה או מוגבלת (כלומר, תחת גירעון מים).
Abstract
כאן מתוארת שיטה לאפיון התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תאי האפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים באמצעות ננו-אינסטנציות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך אופטי. השיטה מורכבת מהפעלת כוחות מבוקרים על הדגימה תוך מדידת העיוות שלה, ומאפשרת לכמת פרמטרים כגון מודולוס דופן התא של יאנג לכאורה ברזולוציות תת-תאיות. זה דורש אימוביליזציה מכנית זהירה של המדגם ובחירה נכונה של כניסות ועומקי כניסה. למרות שניתן להשתמש בו רק ברקמות חיצוניות, שיטה זו מאפשרת לאפיין שינויים מכניים בדפנות תאי הצמח במהלך ההתפתחות ומאפשרת קורלציה של שינויים מיקרוסקופיים אלה עם גדילה של איבר שלם.
Introduction
תאי הצמח מוקפים בדופן תא שהיא מבנה מורכב המורכב מרשתות אינטראקציה של פוליסכרידים, חלבונים, מטבוליטים ומים שעוביים משתנה מ-0.1 למספר מיקרומטר בהתאם לסוג התא ולשלב הגדילה 1,2. תכונות מכניות של דופן התא ממלאות תפקיד חיוני בצמיחת צמחים. ערכי קשיחות נמוכים של דופן התא הוצעו כתנאי מקדים לצמיחת התא ולהרחבת דופן התא, ויש ראיות הולכות וגוברות לכך שכל התאים חשים כוחות מכניים כדי לבצע את תפקידיהם. עם זאת, עדיין מתלבטים אם שינויים בתכונות הפיזיקליות של דופן התא קובעים את גורל התא 2,3,4. מאחר שתאי צמחים אינם זזים במהלך ההתפתחות, צורתו הסופית של איבר תלויה במרחק ובאיזה כיוון תא מתרחב. לפיכך, שורש ערבידופסיס הוא מודל טוב לחקר ההשפעה של התכונות הפיזיקליות של דופן התא בהרחבת התא מכיוון שסוגים שונים של התפשטות מתרחשים באזורים שונים של השורש. לדוגמה, התפשטות אניזוטרופית ניכרת באזור ההתארכות ובולטת במיוחד בתאי האפידרמיס5.
השיטה המתוארת כאן שימשה לאפיון התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תאי האפידרמיס בקנה מידה ננומטרי של שורשי ערבידופסיס חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) בשילוב עם מיקרוסקופ פאזה פלואורסצנטית הפוכה6. לתיקון מקיף של טכניקת AFM, קרא 7,8,9.
פרוטוקול זה מתווה שיטה בסיסית להכנת דגימות ושיטה כללית למדידות גמישות מבוססות AFM של דפנות תאי צמחים.
איור 1: סקירה סכמטית של ניסוי כניסת כוח בשורשי ערבידופסיס באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). התוכנית נותנת סקירה של השלבים של ניסוי Force-Indentation מהכנת המצע כדי לשתק את דגימת השורש בחוזקה (1-2), אישור כדאיות השורש באמצעות צביעת פרופידיום יודיד (3), מיקום קנטילבר על פני השטח של תא אפידרמיס מוארך של השורש הראשוני (4-5), מדידת עקומות כוח (6), ועיבוד עקומת כוח לחישוב המודולוס של יאנג הנראה (7-8). EZ: אזור התארכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת החומר הצמחי ותנאי הגידול
- כדי ליצור את החומר הצמחי הדרוש, לעקר את הזרעים של Arabidopsis סוג בר וקווי עניין מוטנטיים.
הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו בדברים הבאים: ttl1: קווי החדרת T-DNA Salk_063943 (עבור TTL1; AT1G53300) - קולומביה-0 (Col-0) סוג פראי; מוטנט Procuste1 (prc1-1), המורכב ממוטציה נוק-אאוט (Q720stop) בגן CESA6 (AT5G64740), כפי שתואר קודם לכןב-10,11; ו-TTL1 x PRC1-1 מוטציה כפולה.- שים נפח משוער של 50 μL של זרעים microtube. הוסף 500 μL של 70% אתנול + 0.01% תמיסת טווין בטמפרטורת החדר. מערבבים ודוגרים במשך 7 דקות.
- יוצקים את תמיסת האתנול ומוסיפים 500 μL של 20% נתרן היפוכלוריט. מערבבים ודוגרים במשך 7 דקות.
- יוצקים את תמיסת hypochlorite נתרן ולשטוף את הזרעים שלוש עד ארבע פעמים עם מים סטריליים.
- ציפוי
- הכינו מראש מורשיגה בסיסית וסקוג (MS) בינונית12 + 1.5% סוכרוז + 1% אגר (pH 5.7) (ראו טבלת חומרים). אוטוקלאב את המדיום. הכינו קולט אדים למינרי שיעבוד בסביבה סטרילית ותייגו את צלחות הפטרי המרובעות הדרושות לניסוי. יוצקים את המדיום לתוך צלחות הפטרי ומאפשרים למדיום להתמצק.
- צלחת את הזרעים המעוקרים באמצעות קצוות פיפטה סטריליים על צלחות פטרי מרובעות המכילות את המדיום. מפזרים את הזרעים באופן שווה בשתי שורות. כאשר הזרעים יבשים, סגרו את המכסים ואטמו את הצלחות. ריבוד הזרעים ב 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 4 ימים.
הערה: יש צורך בריבוד כדי לסנכרן את הנביטה. - מניחים את הלוחות אנכית בתא הגידול במשטר של יום ארוך (16 שעות של אור / 8 שעות של חושך) עם 25 μmol m2 s−1 עוצמת אור ו 23 °C (יום / לילה). לגדל את השתילים במשך 7 ימים.
2. טיפול מתח אוסמוטי (אופציונלי)
הערה: סעיף זה מספק פרטים על הצמיחה של שורשי Arabidopsis בפוטנציאל אוסמוטי של -1.2 MPa כפי שהוערך על ידי אוסמומטר קריוסקופי (טבלת חומרים). חלק זה ניתן להשמיט או לשנות בהתאם לשאלה הניסויית העומדת על הפרק.
- הכינו MS בסיסי בינוני + 1.5% סוכרוז + 400 מ"מ מניטול + 1% אגר (pH 5.7). אוטוקלאב את המדיום. יוצקים את המדיום בצלחות פטרי מרובעות במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ומאפשרים למדיום להתמצק.
- בעזרת פינצטה (טבלת חומרים), הניחו שתילים בני 5 ימים שגודלו מראש ב-MS בסיסי + 1.5% סוכרוז בינוני בצלחות פטרי מרובעות המכילות את המדיום בתוספת מניטול של 400 מ"מ. מניחים את הלוחות אנכית בתא הגידול באותם תנאים כמו בשלב 1.2.3. לגדל את השתילים תחת תנאי מתח אוסמוטי זה במשך 7 ימים.
הערה: כדי להעריך את הסתגלות צמיחת השורש הראשוני במהלך עקה אוסמוטית חמורה, מומלץ להשתמש בשתילים 5 ימים לאחר הנביטה שגדלו בתנאים מבוקרים כדי להבטיח שגודל השורש כבר נקבע13. לחלופין, ניתן לבצע את הניתוח בכל שלב של הפיתוח כדי לקבוע את ההשפעה ההתפתחותית של פעולת מתח אוסמוטית.
3. ניסויי ננו-אינדנטנציה של מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM)
- הכנת הדגימה לניסויים בננו-אינדנטנציה
הערה: זהו צעד מכריע ליישום AFM בחקר דגימות ביולוגיות חיות. המדגם חייב להיות מחובר היטב למצע כדי להיות יציב מכנית במהלך מדידות הזחה. יחד עם זאת, יש לשמר את התכונות המבניות של המדגם. אסטרטגיה יעילה לייצוב מדגם גדול עבור AFM היא להשתמש בדבקים. הדבק חייב להתייבש במהירות ואסור שיהיה רעיל או תגובתי עם המדיום שמסביב. בפרוטוקול זה, צלחות פטרי פוליסטירן שימשו כמצע ודבק סיליקון לא חומצי (טבלת חומרים) שימש לקשירת שתילי הערבידופסיס.- מורחים שכבה דקה של דבק סיליקון לתוך צלחת פטרי עם כיסוי. השאירו את הדבק באוויר במשך 45 שניות.
- בפינצטה, מניחים את השתיל על הדבק, מכוונים אותו לכיוון שנמנע ממגע בין החלקים הבולטים של השתיל לבין הקנטילבר. לאחר מכן, לחץ את השורש בעדינות לשכבת דבק הסיליקון כדי לקשור אותו בחוזקה. השאירו את השתיל במגע עם הדבק במשך 45 שניות לפני שתמשיכו בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
- דגירה של השתילים המחוברים עם 2 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד (PI; טבלת חומרים) במשך 5 דקות בחושך ולשטוף אותם בזהירות שלוש פעמים עם 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) (טבלת חומרים).
- מקם את השתילים הדוגרים ב- PI במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך יחד עם ה- AFM. כדי לצפות בפלואורסצנציה, קבעו את אורכי הגל של העירור והפליטה על 572 ננומטר ו-617 ננומטר, בהתאמה. היעדר פלואורסצנציה בתוך תאי האפידרמיס מאשר את הכדאיות של השורשים.
- מכסים את השתיל בתמיסת מלח (PBS) אחת עם אגירת פוספטים.
- פרוטוקול כניסה
הערה: בצע את כל מדידות ה-AFM תוך שעה אחת לאחר אימוביליזציה של הדגימה על תמיכתה בטמפרטורת החדר. החדר שבו AFM ממוקם צריך להיות מתוחזק ב 25 מעלות צלזיוס עם מזגן. תמיסת PBS צריכה להיות באותה טמפרטורה.- הרכיבו תעלת סיליקון ניטריד סטנדרטית עם קצה פירמידלי (ראו טבלת חומרים) לתוך מחזיק הבדיקה AFM לנוזל (טבלת חומרים).
- יישר את הלייזר על המכל קרוב למיקום הקצה. לאחר מכן, הזז את הפוטודיודה כדי למקם את נקודת הלייזר במרכז הגלאי.
- כדי לכייל את רגישות הסטייה, מקם צלחת פטרי פוליסטירן עם PBS אחד מתחת ל-AFM.
הערה: שלב זה נחוץ כדי לחשב את הכניסה. כאשר מדידת כוח מתבצעת על משטח קשה, אין כניסה למשטח, ולכן כל שינוי בתזוזה של סורק z מתאים לסטייה הקנטילית. לכן, חשוב מאוד לכייל את רגישות הסטייה על משטח קשה. שימוש במשטח רך יעריך יתר על המידה את רגישות הסטייה, מה שיגרום לקבועי קפיץ נמוכים מדי. - התאם את הפוטודקטור כך שהסטייה ללא מגע תהיה קרובה ל- 0 V. כייל את רגישות הסטייה על ידי ביצוע כניסה (עקומת כוח), עם גודל רמפה של 3 מיקרומטר, קצב כניסה ונסיגה של 0.6 מיקרומטר לשנייה, וסף טריגר של 0.5 V.
- כדי לכייל את קבוע הקפיץ של הקנטילבר, השתמש בכלי השירות Thermal Tune של תוכנת AFM (טבלת חומרים) המומלצת עבור בדיקות עם קבועי קפיץ הנמוכים מכ-5 N/m או השתמש בשיטה המתוארת בהתייחסות14. לפני הפעלת Thermal Tune בתוכנה, ודא שהבדיקה אינה מקיימת אינטראקציה עם הדגימה.
- הזן את הטמפרטורה cantilever. לחץ על כיול > כוונון תרמי או על סמל המנגינה התרמית בסרגל הכלים NanoScope . בחר טווח תדרים (1-100 הרץ).
- לחץ על רכישת נתונים בחלונית כוונון תרמי. המתן עד שה- AFM ישיג נתונים ולאחר מכן לחץ על לחצן מתנד הרמוני פשוט (Fluid).
- התאם את רוחב המסנן החציוני ל- 3. התאם את רוחב סל PSD כדי להפחית את הרעש בנתונים הנרכשים בממוצע. הציבו גבולות התאמה סביב פסגת התהודה הראשונה.
- לחץ על חשב קבוע אביב k ולאחר מכן, לחץ על כן בחלון המוקפץ ושאל אם המשתמש רוצה להשתמש בערך זה.
- חזור על השלבים שתוארו לעיל שלוש פעמים וקח באופן ידני ממוצע של ערכי קפיץ קבועים. הזן ערך ממוצע זה בתיבה קבוע קפיץ ברשימת הפרמטרים רמפה בתצוגת PicoForce . הכיול מסתיים בנקודה זו.
- באמצעות המיקרוסקופ האופטי ההפוך בהגדלה של 10x, 20x ו-40x עיניות, מקם את גשושית ה-AFM על פני השטח של התא האפידרמלי המוארך הרביעי של השורש הראשוני, תוך הקפדה למקם אותו במרכז התא.
- עם ערך קבוע הקפיץ המחושב (שלב 3.2.5.5), השג עקומות כוח בגודל רמפה של 3 מיקרומטר, סף טריגר של 11 nN וקצב כניסה ונסיגה של 0.6 מיקרומטר לשנייה בנקודות נבחרות.
הערה: בעבודה קודמת15,16 נמצא כי תדירות נמוכה של כניסה ונסיגה מסייעת למזער היסטרזיס וכוח גרירה. - קבל עקומות כוח משלושה תאים לכל שורש עבור כל טיפול (השתמש בשלושה שכפולים ביולוגיים לכל טיפול). צלם לפחות 150 עקומות כוח עבור כל שורש.
4. מדוד את המודולוס של יאנג לכאורה
- התאימו כל עקומת כוח למודל הבא עבור כניסות פירמידליות17:
, כאשר E הוא המודולוס הנראה של יאנג של המדגם, הוא מודולוס פואסון של הדגימה, 
ו- α הוא הזווית למחצה לקודקוד. השליכו את ההתאמות עם מקדם מתאם (r2) < 0.99. שקול את היחס של פואסון עבור חומר בלתי דחוס לחלוטין: = 0.5 ואת הגיאומטריה של indenter נתון על ידי היצרנים.
הערה: השתמש ב-100 ננומטר הראשונים מנקודת המגע של עקומת ההעמסה כדי שההתאמה תהיה רגישה ככל האפשר למכניקה של דופן התא וכדי להפחית את ההשפעה של לחץ הטורגור על ערכי המודולוס של יאנג הנראה8. ההתאמה נעשתה באמצעות תוכנית MATLAB מותאמת אישית (זמינה על פי בקשה אישית בכתב ל- J. C. B) המאפשרת קביעת עומק כניסה ספציפי מנקודת המגע של עקומת ההעמסה. - צור היסטוגרמה מנורמלת עם נתוני המודולוס של יאנג לכאורה והתאם אותה להתפלגות גאוסית. השליכו נקודות נתונים מחוץ לרווח בר-סמך של 95% וחשבו מחדש הן את ההיסטוגרמה והן את ההתאמה של גאוס. חשב ודווח על הממוצע וסטיית התקן של המודולוס של יאנג לכאורה.
- קבע את משמעות ההשוואות בין קבוצות על ידי מבחני השוואה מרובים כמו ANOVA.
, כאשר E הוא המודולוס הנראה של יאנג של המדגם, הוא מודולוס פואסון של הדגימה, 
ו- α הוא הזווית למחצה לקודקוד. השליכו את ההתאמות עם מקדם מתאם (r2) < 0.99. שקול את היחס של פואסון עבור חומר בלתי דחוס לחלוטין: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסויי כניסת כוח
הטקסט הבא מציג כמה תוצאות הצפויות כאשר נערך ניסוי כניסת כוח כדי להראות את הפלט האופייני לצפות כאשר הפרוטוקול מבוצע היטב.
עקומות תזוזת כוח
חלקות כניסת כוח מייצגות שהתקבלו בהסטת דגימות חיות במיקום הממוקם במרכז התא של אזור התא של התא של התא של אזור התא של השורש מוצגות באיור 2. כאשר קצה ה-AFM מתחיל להסיט פנימה את פני השטח של דופן התא, הכוח מתחיל לגדול (מסומן על-ידי 1 באיור 2A) בגלל התנגדות דופן התא לעיוות. עליית הכוח (העמסה) נמשכת עד להגעה לערך הכוח המרבי (מסומן על ידי 2 באיור 2A); לאחר נקודה זו, חלק הפריקה של הכניסה מתחיל.
איור 2: עקומות תזוזת כוח המתקבלות בניסויי הזחה שנעשו בדפנות תאים של תאי אזור התארכות שורשים חיים. (A) עקומת תזוזת כוח טיפוסית. בעמדה המסומנת על ידי 1, הכוח מתחיל להגדיל; קצה ה-AFM מתחיל להסיט פנימה את דופן התא. עליית הכוח (העמסה) נמשכת עד להגעה לערך הכוח המרבי, כפי שצוין עם 2; לאחר נקודה זו, חלק הפריקה של הכניסה מתחיל. (B) דוגמה לעקומת תזוזת כוח שבה לא ניתן לזהות את מיקום פני התא לפני הכניסה (מסומן על ידי a), וגם עקומות הטעינה והפריקה רועשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
עקומות תזוזת הכוח הצפויות יראו בחלק ההזחה שהכוח גדל בעקבות פרבולה, כפי שחזה המודל (מוסבר בשלב 4.1) (איור 2A). פרמטר מתאים נוסף הוא מיקום נקודת המגע; זה צריך להתאים את פני השטח של דופן התא לפני הכניסה והוא נחשב המקור של עקירה קצה AFM. עקומות כוח שבהן אי אפשר לזהות את נקודת המגע לפני הכניסה צריכות להיות מושלכות (איור 2B). עקומת הטעינה והפריקה של ניסוי כניסת הכוח חייבת להיות נטולת רעש. יש להשליך עקומות רועשות כמו זו המיוצגת באיור 2B .
היסטוגרמה מנורמלת של המודולוס של יאנג לכאורה
ההיסטוגרמות המציגות את התפלגות התדירות של הערכים המתקבלים של המודולוס של יאנג לכאורה עבור קבוצה של 201 כניסות מוצלחות על תשעה תאים שונים של שלושה צמחים שונים של Col-0 שגדלו בתנאי בקרה מוצגות באיור 3. האיור מציג דוגמה שבה הממוצע וסטיית התקן של המודולוס של יאנג לכאורה (88.12 ± 2.79 KPa) חושבו מההיסטוגרמות המצוידות בעקומת גאוס6.
איור 3: דוגמה להיסטוגרמה של מודולוס יאנג לכאורה שאפשרה ניתוח סטטיסטי נכון של התוצאות. הנתונים התקבלו מעקומות כוח על תשעה תאים שונים של שלושה צמחים שונים של Col-0 שגודלו בתנאי בקרה. הנתונים שהתקבלו מ-201 עקומות כוח הותאמו להתפלגות גאוס. התדירות היחסית מציינת את מספר עקומות הכוח המותאמות לכל מודולוס מחושב של יאנג. ערכי הממוצע וסטיית התקן של מצב זה התקבלו מההתאמות של גאוס. RF: תדירות יחסית; AEM: לכאורה המודולוס של יאנג. נתון זה שונה מהפניה6אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
גנוטיפים מסוימים עשויים להיות קשים מאוד לכניסה בשל המורפולוגיה של השורש. זה היה המקרה עבור מוטנט prc1-1 ו ttl1 prc1-1 מוטציה כפולה שגדלה בסטרס אוסמוטי חמור. במצב זה, למוטנטים אלה היו מעט תאים מוארכים באזור התארכות השורשים ופיתחו שערות שורש ארוכות מאוד, המפריעות לתנועת הדגימה לייצר את הדגימה. איור 4 מציג היסטוגרמות המציגות את התפלגות ההסתברות של הערכים המתקבלים של המודולוס של יאנג לכאורה על תשעה תאים שונים של המוטציה הכפולה ttl1 prc1-1. האיור מציג דוגמה שבה עקומות הכוח המתקבלות לא אפשרו את הניתוח הנכון. רק היסטוגרמה H המתאימה לתא אחד יכולה להיות מותאמת להתפלגות גאוס6.
איור 4: דוגמה להיסטוגרמות של מודולוס של יאנג לכאורה שלא אפשרו ניתוח נכון. הנתונים התקבלו מעקומות כוח על תשעה תאים שונים של שלושה צמחים שונים של המוטציה הכפולה ttl1prc1-1 . התדירות היחסית מציינת את מספר עקומות הכוח המותאמות לכל מודולוס מחושב של יאנג. רק היסטוגרמה H יכולה להיות מותאמת להתפלגות גאוס. RF: תדירות יחסית; AEM: המודולוס של יאנג לכאורה. נתון זה שונה מהפניה6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מכניקת התאים ודפנות התאים הופכת רלוונטית יותר ויותר כדי לקבל תובנה לגבי האופן שבו מכניקה משפיעה על תהליכי גדילה. כאשר כוחות פיזיקליים מתפשטים על פני מרחקים ניכרים ברקמות מוצקות, חקר השינויים בתכונות הפיזיקליות של דופן התא וכיצד הם חשים, מבוקרים, מכוונים ומשפיעים על צמיחת הצמח הופכים לתחום מחקר חשוב 2,3,8.
מוצגת כאן שיטה לחקר התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תאים באזור ההתארכות של שורש הערבידופסיס. ניתן לשלב בקלות את טכניקת AFM עם טכניקות אחרות, כגון מחקרי קצב גדילה, כדי להבין את ההשפעה של התכונות הפיזיקליות של דופן התא על צמיחת השורש.
אחד הצעדים הניסיוניים הקריטיים ביותר הוא אימוביליזציה מכנית של המדגם; הדגימה חייבת להיות מחוברת היטב כדי למנוע את תנועת הדגימה בזמן שהיא מוסטת פנימה. שכבת דבק הסיליקון חייבת להיות דקה מספיק כדי לאפשר לו להתייבש במהירות. המניפולציה של דבק הסיליקון והדגימה צריכה להיות זהירה כדי להבטיח שהסיליקון לא יכסה את שטחי הדגימה שיימדדו. כמו כן, יש להשלים את התכשיר במהירות (תוך דקה) כדי לשמור על תכונות ההדבקה של דבק הסיליקון ולמנוע התייבשות שורשים. זה חיוני כדי למנוע נזק לרקמות; התייבשות ונזק של רקמת האפידרמיס ייצרו שינויים בלתי הפיכים בתכונות המכניות של דופן התא. שיטות אחרות השתמשו באימוביליזציה ב-1% אגרוז על מגלשת זכוכית; עם זאת, לשיטה זו יש גם את האתגר של הצורך במניפולציה מהירה ושלב נוסף של הכנת שקופיות הזכוכית כדי למנוע מהדגימות לנוע בצירי X ו- Y במהלך הניתוח. לקבלת מידע נוסף, ראה הפניות 8,18. נקודה רלוונטית נוספת של פרוטוקול זה היא לספור עם מיקרוסקופ אופטי עם epifluorescence מוצמד AFM שיש לו מטרות שונות (10x, 20x, ו 40x). זה מאפשר לבחור את אזור הכניסה במדויק.
היבט מאתגר אחד של הפרוטוקול הוא בחירת הגדרות כניסות AFM. שקעים שונים ועומקי כניסה שונים מספקים רזולוציות שונות וניתן להשתמש בהם כדי לענות על שאלות מחקר שונות8. מספר מחקרים הראו כי גודל הקצה והגיאומטריה שלו הם שיקולים חשובים להבחנה בתוצאות הרצויות. מידע שונה מתקבל עם צורות עצה שונות7. לדוגמה, הקצה החרוטי יכול להבחין בתכונות מכניות ברמה התת-תאית, הקצה הכדורי יכול לייצג טוב יותר את התכונות המכניות של התא כולו19, וקצוות פירמידליים מאפשרים לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה ותכונות מכניות בו זמנית 7,20. בחירת רדיוס הקצה הפירמידלי (20-60 ננומטר) חשובה כדי למנוע את שקיעת הקצה, ומאפשרת תהליך כניסה תקין. עבור כל יישום, על החוקר לבחור את סוג הקנטילבר (והטיפ) המתאים יותר לדגימה ואת סוג המדידות לביצוע8.
לשיטה יש כמה מגבלות: ניתן למדוד את התכונות המכניות של תאים בלבד על פני השטח של איברים, ורקמות עם טופוגרפיות משתנות קשה לעבוד איתן. לדוגמה, שערות שורש יכולות להקשות על הגישה לתאי האפידרמיס עם קצה AFM 8,18. לבסוף, בעוד שהשיטה המוצגת מודדת גמישות, ננו-אינדנטציה שימשה גם לדיווח על צמיגות ולחץ טורגור בצמחים ובבעלי חיים 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים. סקריפט MATLAB המשמש להתאמת הנתונים זמין על פי בקשה אישית על ידי כתיבה ל- J. C. B.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי CSIC I+D 2018, מענק מס '95 (מריאנה סוטלו סילביירה).; CSIC גרופוס (עומר בורסאני) ו-PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
