Summary
Il protocollo di indentazione della microscopia a forza atomica offre la possibilità di sezionare il ruolo delle proprietà fisiche della parete cellulare di una particolare cellula di un tessuto o organo durante la crescita normale o limitata (cioè in deficit idrico).
Abstract
Un metodo è descritto qui per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche delle radici viventi di Arabidopsis attraverso nanoindentazioni con un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio ottico a fluorescenza invertita. Il metodo consiste nell'applicare forze controllate al campione misurandone la deformazione, consentendo di quantificare parametri come l'apparente modulo di Young delle pareti cellulari a risoluzioni subcellulari. Richiede un'attenta immobilizzazione meccanica del campione e una corretta selezione dei penetratori e delle profondità di indentazione. Sebbene possa essere utilizzato solo nei tessuti esterni, questo metodo consente di caratterizzare i cambiamenti meccanici nelle pareti cellulari delle piante durante lo sviluppo e consente la correlazione di questi cambiamenti microscopici con la crescita di un intero organo.
Introduction
Le cellule vegetali sono circondate da una parete cellulare che è una struttura complessa composta da reti interagenti di polisaccaridi, proteine, metaboliti e acqua che varia in spessore da 0,1 a diversi μm a seconda del tipo di cellula e della fase di crescita 1,2. Le proprietà meccaniche della parete cellulare svolgono un ruolo essenziale nella crescita delle piante. Bassi valori di rigidità della parete cellulare sono stati proposti come precondizione per la crescita cellulare e l'espansione della parete cellulare, e vi è una crescente evidenza che tutte le cellule percepiscono le forze meccaniche per svolgere le loro funzioni. Tuttavia, è ancora dibattuto se i cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare determinino il destino cellulare 2,3,4. Poiché le cellule vegetali non si muovono durante lo sviluppo, la forma finale di un organo dipende da quanto lontano e in quale direzione una cellula si espande. Pertanto, la radice di Arabidopsis è un buon modello per studiare l'impatto delle proprietà fisiche della parete cellulare nell'espansione cellulare perché diversi tipi di espansione si verificano in diverse regioni della radice. Ad esempio, l'espansione anisotropa è evidente nella zona di allungamento e in particolare nelle cellule epidermiche5.
Il metodo qui descritto è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche su scala nanometrica delle radici viventi di Arabidopsis utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio a fase di fluorescenza invertita6. Per una revisione approfondita della tecnica AFM, leggere 7,8,9.
Questo protocollo delinea un metodo di preparazione del campione di base e un metodo generale per le misurazioni dell'elasticità basate su AFM delle pareti cellulari delle piante.
Figura 1: Panoramica schematica dell'esperimento di indentazione della forza nelle radici di Arabidopsis utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Lo schema fornisce una panoramica delle fasi di un esperimento di forza-indentazione dalla preparazione del substrato per immobilizzare saldamente il campione radicale (1-2), conferma della vitalità della radice attraverso colorazione con ioduro di propidio (3), posizionamento a sbalzo sulla superficie di una cellula epidermica allungata della radice primaria (4-5), misurazione delle curve di forza (6) e elaborazione della curva di forza per calcolare il modulo di Young apparente (7-8). EZ: zona di allungamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Protocol
1. Preparazione del materiale vegetale e condizioni di crescita
- Per generare il materiale vegetale necessario, sterilizzare i semi di Arabidopsis wild type e le linee mutanti di interesse.
NOTA: In questo protocollo, abbiamo usato quanto segue: ttl1: linee di inserzione del T-DNA Salk_063943 (per TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) wild-type; il mutante Procuste1 (prc1-1), che consiste in una mutazione knock-out (Q720stop) nel gene CESA6 (AT5G64740), come precedentemente descritto in10,11; e TTL1 x PRC1-1 doppio mutante.- Metti un volume approssimativo di 50 μL di semi in un microtubo. Aggiungere 500 μL di etanolo al 70% + soluzione Tween allo 0,01% a temperatura ambiente. Mescolare e incubare per 7 min.
- Versare la soluzione di etanolo e aggiungere 500 μL di ipoclorito di sodio al 20%. Mescolare e incubare per 7 min.
- Versare la soluzione di ipoclorito di sodio e lavare i semi tre o quattro volte con acqua sterile.
- Placcatura
- Preparare in anticipo Murashige basale e Skoog (MS) terreno12 + 1,5% saccarosio + 1% agar (pH 5,7) (vedi tabella dei materiali). Autoclave il mezzo. Preparare una cappa a flusso laminare per lavorare in un ambiente sterile ed etichettare le piastre di Petri quadrate necessarie per l'esperimento. Versare il mezzo nelle piastre di Petri e lasciare che il mezzo si solidifichi.
- Placcare i semi sterilizzati utilizzando punte sterili per pipette su piastre di Petri quadrate contenenti il mezzo. Distribuire uniformemente i semi su due file. Quando i semi sono asciutti, chiudere i coperchi e sigillare i piatti. Stratificare i semi a 4 °C al buio per 4 giorni.
NOTA: La stratificazione è necessaria per sincronizzare la germinazione. - Posizionare le piastre verticalmente nella camera di crescita in un regime di lunga giornata (16 ore di luce/8 ore di buio) con 25 μmol m2 s−1 di intensità luminosa e 23 °C (giorno/notte). Coltiva le piantine per 7 giorni.
2. Trattamento dello stress osmotico (opzionale)
NOTA: Questa sezione fornisce dettagli sulla crescita delle radici di Arabidopsis in potenziale osmotico di -1,2 MPa come stimato dall'osmometro crioscopico (Tabella dei materiali). Questa parte può essere omessa o modificata a seconda della domanda sperimentale in questione.
- Preparare il terreno di SM basale + 1,5% di saccarosio + 400 mM di mannitolo + 1% di agar (pH 5,7). Autoclave il mezzo. Versare il mezzo in piastre di Petri quadrate nella cappa a flusso laminare e lasciare che il mezzo si solidifichi.
- Con una pinzetta (Table of Materials), posizionare piantine di 5 giorni pre-coltivate in MS basale + 1,5% di saccarosio in piastre di Petri quadrate contenenti il mezzo integrato con 400 mM di mannitolo. Collocare verticalmente le piastre nella camera di crescita nelle stesse condizioni del punto 1.2.3. Coltiva le piantine in questa condizione di stress osmotico per 7 giorni.
NOTA: Per valutare l'adattamento alla crescita radicale della radice primaria durante un grave stress osmotico, si consiglia di utilizzare piantine 5 giorni dopo la germinazione cresciute in condizioni controllate per garantire che la dimensione del meristema della radice sia già stabilita13. In alternativa, l'analisi può essere eseguita in ogni fase dello sviluppo per determinare l'effetto sullo sviluppo dell'azione dello stress osmotico.
3. Esperimenti di nanoindentazione di microscopia a forza atomica (AFM)
- Preparazione del campione per esperimenti di nanoindentazione
NOTA: Questo è un passo cruciale per applicare l'AFM allo studio di campioni biologici vivi. Il campione deve essere saldamente fissato al substrato per essere meccanicamente stabile durante le misurazioni di indentazione. Allo stesso tempo, le qualità strutturali del campione dovrebbero essere preservate. Una strategia efficace per stabilizzare un grande campione per AFM è quella di utilizzare adesivi. L'adesivo deve asciugarsi rapidamente e non deve essere tossico o reattivo con il mezzo circostante. In questo protocollo, le piastre di Petri in polistirene sono state utilizzate come substrato e la colla siliconica non acida (Table of Materials) è stata utilizzata per legare le piantine di Arabidopsis.- Stendere un sottile strato di colla siliconica nella capsula di Petri con un coprivetrino. Lasciare la colla in aria per 45 s.
- Con una pinzetta, posizionare la piantina sulla colla, orientandola in una direzione che eviti il contatto tra le parti sporgenti della piantina e il cantilever. Quindi, premere delicatamente la radice sullo strato di colla siliconica per legarlo saldamente. Lasciare la piantina a contatto con la colla per 45 secondi prima di continuare con i passaggi successivi del protocollo.
- Incubare le piantine attaccate con 2 μg/ml di ioduro di propidio (PI; Tabella dei materiali) per 5 minuti al buio e lavarli accuratamente tre volte con 1x soluzione salina tamponata fosfaticamente (PBS) (Table of Materials).
- Posizionare le piantine incubate da PI in un microscopio a fluorescenza invertita accoppiato con l'AFM. Per osservare la fluorescenza, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 572 nm e 617 nm. L'assenza di fluorescenza all'interno delle cellule epidermiche conferma la vitalità delle radici.
- Coprire la piantina con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
- Protocollo di indentazione
NOTA: Eseguire tutte le misurazioni AFM entro 1 h dopo l'immobilizzazione del campione sul suo supporto a temperatura ambiente. La stanza in cui si trova l'AFM deve essere mantenuta a 25 °C con un condizionatore d'aria. La soluzione PBS deve essere alla stessa temperatura.- Montare un cantilever standard in nitruro di silicio con una punta piramidale (vedi Tabella dei materiali) nel supporto della sonda AFM per fluido (Tabella dei materiali).
- Allineare il laser sul cantilever vicino alla posizione della punta. Quindi, spostare il fotodiodo per posizionare il punto laser al centro del rilevatore.
- Per calibrare la sensibilità di deflessione, posizionare una capsula di Petri in polistirene con 1x PBS sotto l'AFM.
NOTA: questo passaggio è necessario per calcolare il rientro. Quando viene effettuata una misurazione della forza su una superficie dura, non vi è alcuna rientranza nella superficie, quindi qualsiasi modifica nello spostamento dello scanner z corrisponde alla deflessione a sbalzo. Pertanto, è molto importante calibrare la sensibilità alla deflessione su una superficie dura. L'utilizzo di una superficie morbida sovrasvaluterà la sensibilità di deflessione, il che si tradurrà in costanti di molla troppo basse. - Regolare il fotorilevatore in modo che la deflessione senza contatto sia vicina a 0 V. Calibrare la sensibilità di deflessione eseguendo un'indentazione (curva di forza), con una dimensione della rampa di 3 μm, una velocità di indentazione e retrazione di 0,6 μm/s e una soglia di attivazione di 0,5 V.
- Per calibrare la costante della molla del cantilever, utilizzare l'utilità Thermal Tune del software AFM (Table of Materials) consigliato per sonde con costanti di molla inferiori a circa 5 N/m o utilizzare il metodo descritto nel riferimento14. Prima di attivare Thermal Tune nel software, assicurarsi che la sonda non interagisca con il campione.
- Immettere la temperatura a sbalzo. Fare clic su Calibra > Thermal Tune o sull'icona Thermal Tune nella barra degli strumenti NanoScope . Selezionare un intervallo di frequenza (1-100 Hz).
- Fare clic su Acquisisci dati nel pannello Thermal Tune. Attendere che l'AFM acquisisca i dati, quindi fare clic sul pulsante Simple Harmonic Oscillator (Fluid).
- Regolare la larghezza mediana del filtro su 3. Regola la larghezza del contenitore PSD per ridurre il rumore nei dati acquisiti mediante la media. Imposta i limiti di adattamento attorno al primo picco di risonanza.
- Fare clic su Calcola costante di primavera k, quindi fare clic su Sì nella finestra pop-up chiedendo se l'utente desidera utilizzare questo valore.
- Ripetere i passaggi descritti sopra tre volte e prendere manualmente una media dei valori costanti della molla. Immettete questo valore medio nella casella Costante molla (Spring Constant ) nell'elenco dei parametri Rampa (Ramp parameter) nella vista PicoForce . La calibrazione termina a questo punto.
- Utilizzando il microscopio ottico invertito con ingrandimento dell'oculare 10x, 20x e 40x, posizionare la sonda AFM sulla superficie della quarta cellula epidermica allungata della radice primaria, assicurandosi di posizionarla al centro della cellula.
- Con il valore calcolato della costante della molla (passo 3.2.5.5), ottenere curve di forza con una dimensione della rampa di 3 μm, una soglia di innesco di 11 nN e una velocità di indentazione e retrazione di 0,6 μm/s in punti selezionati.
NOTA: Il lavoro precedente15,16 ha scoperto che la bassa frequenza di indentazione e retrazione aiuta a ridurre al minimo l'isteresi e la forza di trascinamento. - Ottenere curve di forza da tre cellule per radice per ogni trattamento (utilizzare tre repliche biologiche per trattamento). Cattura almeno 150 curve di forza per ogni radice.
4. Misurare il modulo di Young apparente
- Adattare ogni curva di forza al seguente modello per i penetratori piramidali17:
, dove E è il modulo di Young apparente del campione, 
è il modulo di Poisson del campione e α è il semiangolo al vertice. Scartare gli attacchi con un coefficiente di correlazione (r2) < 0,99. Si consideri il rapporto di Poisson per materiale totalmente incomprimibile: = 0,5 e la geometria del penetratore data dai produttori.
NOTA: Utilizzare i primi 100 nm dal punto di contatto della curva di carico affinché il raccordo sia il più sensibile possibile alla meccanica della parete cellulare e per ridurre l'impatto della pressione del turgore sui valori apparenti del modulo di Young8. Il fitting è stato realizzato utilizzando un programma MATLAB personalizzato (disponibile su richiesta personale scrivendo a J. C. B) che consente di impostare una profondità di indentazione specifica dal punto di contatto della curva di carico. - Creare un istogramma normalizzato con i dati apparenti del modulo di Young e adattarlo a una distribuzione gaussiana. Scartare i punti dati al di fuori dell'intervallo di confidenza del 95% e ricalcolare sia l'istogramma che l'adattamento gaussiano . Calcolare e riportare la media e la deviazione standard del modulo di Young apparente.
- Determinare il significato dei confronti tra gruppi mediante più test di confronto come ANOVA.
, dove E è il modulo di Young apparente del campione, 
è il modulo di Poisson del campione e α è il semiangolo al vertice. Scartare gli attacchi con un coefficiente di correlazione (r2) < 0,99. Si consideri il rapporto di Poisson per materiale totalmente incomprimibile: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esperimenti di forza-indentazione
Il testo seguente presenta alcuni risultati attesi quando viene condotto un esperimento di indentazione forzata per mostrare l'output tipico da aspettarsi quando il protocollo è ben eseguito.
Curve forza-spostamento
I grafici di indentazione della forza rappresentativa ottenuti indentando campioni vivi in una posizione posta al centro della cella della zona di allungamento della radice sono presentati nella Figura 2. Quando la punta AFM inizia a indentare la superficie della parete cellulare, la forza inizia ad aumentare (indicata da 1 nella Figura 2A) a causa dell'opposizione della parete cellulare alla deformazione. L'aumento della forza (carico) continua fino al raggiungimento del valore massimo di forza (indicato da 2 nella figura 2A); Dopo questo punto, inizia la parte di scarico dell'indentazione.
Figura 2: Curve forza-spostamento ottenute in esperimenti di indentazione effettuati in pareti cellulari di cellule vive della zona di allungamento delle radici . (A) Una tipica curva forza-spostamento. Nella posizione contrassegnata da 1, la forza inizia ad aumentare; la punta AFM inizia a rientrare la parete cellulare. L'aumento della forza (carico) continua fino al raggiungimento del valore massimo di forza, come indicato con 2; Dopo questo punto, inizia la parte di scarico dell'indentazione. (B) Esempio di una curva forza-spostamento in cui è impossibile rilevare la posizione della superficie della cella prima dell'indentazione (indicata da a) ed entrambe le curve di carico e scarico sono rumorose. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le curve forza-spostamento previste mostreranno nella parte di indentazione che la forza cresce seguendo una parabola, come previsto dal modello (spiegato nel passo 4.1) (Figura 2A). Un altro parametro di adattamento è la posizione del punto di contatto; dovrebbe corrispondere alla superficie della parete cellulare prima dell'indentazione ed è considerata l'origine dello spostamento della punta AFM. Curve di forza in cui è impossibile rilevare il punto di contatto prima che l'indentazione venga scartata (Figura 2B). La curva di carico e scarico dell'esperimento di indentazione della forza deve essere priva di rumore. Le curve rumorose come quella rappresentata nella Figura 2B devono essere eliminate.
Istogramma normalizzato dell'apparente modulo di Young
Gli istogrammi che mostrano la distribuzione della frequenza dei valori ottenuti del modulo di Young apparente per una serie di 201 rientranze riuscite su nove diverse cellule di tre diverse piante di Col-0 cresciute in condizioni di controllo sono presentati in Figura 3. La figura mostra un esempio in cui la media e la deviazione standard del modulo apparente di Young (88,12 ± 2,79 KPa) sono state calcolate dagli istogrammi dotati di una curva gaussiana6.
Figura 3: Esempio di istogramma del modulo di Young apparente che ha permesso una corretta analisi statistica dei risultati. I dati sono stati ottenuti da curve di forza su nove diverse cellule di tre diverse piante di Col-0 coltivate in condizioni di controllo. I dati ottenuti da 201 curve di forza sono stati adattati ad una distribuzione gaussiana. La frequenza relativa indica il numero di curve di forza adattate che corrispondono a ciascun modulo di Young apparente calcolato. I valori di deviazione media e standard di questa condizione sono stati ottenuti dagli attacchi gaussiani. RF: Frequenza relativa; AEM: apparente modulo di Young. Questa figura è stata modificata dal riferimento6Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Alcuni genotipi potrebbero essere molto difficili da indentare a causa della morfologia della radice. Questo è stato il caso del mutante prc1-1 e del mutante doppio ttl1 prc1-1 cresciuti in grave stress osmotico. In questa condizione, questi mutanti avevano poche cellule allungate nella zona di allungamento della radice e sviluppavano peli radicali molto lunghi, che interferiscono con il cantilever che produce il movimento del campione. La Figura 4 presenta istogrammi che mostrano la distribuzione di probabilità dei valori ottenuti del modulo di Young apparente su nove diverse cellule del doppio mutante ttl1 prc1-1. La figura mostra un esempio in cui le curve di forza ottenute non hanno permesso l'analisi corretta. Solo l'istogramma H che corrisponde a una cella potrebbe essere adattato a una distribuzione gaussiana6.
Figura 4: Esempio di istogrammi del modulo di Young apparente che non permettevano una corretta analisi. I dati sono stati ottenuti da curve di forza su nove diverse cellule di tre diverse piante del doppio mutante ttl1prc1-1 . La frequenza relativa indica il numero di curve di forza adattate che corrispondono a ciascun modulo di Young apparente calcolato. Solo l'istogramma H poteva essere adattato ad una distribuzione gaussiana. RF: Frequenza relativa; AEM: l'apparente modulo di Young. Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La meccanica delle cellule e della parete cellulare sta diventando sempre più rilevante per ottenere informazioni su come la meccanica influisce sui processi di crescita. Poiché le forze fisiche si propagano su distanze considerevoli nei tessuti solidi, lo studio dei cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare e di come vengono rilevati, controllati, sintonizzati e influenzano la crescita della pianta stanno diventando un importante campo di studio 2,3,8.
Un metodo è presentato qui per studiare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule nella zona di allungamento della radice di Arabidopsis. La tecnica AFM può essere facilmente combinata con altre tecniche, come gli studi sul tasso di crescita, per comprendere l'effetto delle proprietà fisiche della parete cellulare nella crescita delle radici.
Una delle fasi sperimentali più critiche è l'immobilizzazione meccanica del campione; Il campione deve essere fissato saldamente per evitare il movimento del campione mentre è rientrato. Lo strato della colla siliconica deve essere abbastanza sottile da consentirgli di asciugarsi rapidamente. La manipolazione della colla siliconica e del campione deve fare attenzione a garantire che il silicone non copra le aree del campione che verranno misurate. Inoltre, la preparazione deve essere completata rapidamente (entro un minuto) per mantenere le proprietà adesive della colla siliconica e prevenire la disidratazione delle radici. È fondamentale prevenire danni ai tessuti; La disidratazione e il danno del tessuto epidermico produrranno cambiamenti irreversibili nelle proprietà meccaniche della parete cellulare. Altri metodi utilizzati immobilizzazione in agarosio all'1% su un vetrino; tuttavia, questo metodo ha anche la sfida di richiedere una rapida manipolazione e un'ulteriore fase di preparazione dei vetrini per impedire ai campioni di muoversi negli assi X e Y durante l'analisi. Per ulteriori informazioni, vedere riferimenti 8,18. Un altro punto rilevante di questo protocollo è contare con un microscopio ottico con epifluorescenza accoppiato all'AFM che ha obiettivi diversi (10x, 20x e 40x). Ciò consente di selezionare accuratamente l'area di rientro.
Un aspetto impegnativo del protocollo è la selezione delle impostazioni di rientro AFM. Diversi penetratori e profondità di indentazione rendono risoluzioni diverse e possono essere utilizzati per rispondere a diverse domande di ricerca8. Diversi studi hanno dimostrato che le dimensioni e la geometria della punta sono considerazioni importanti per discernere i risultati desiderati. Si ottengono informazioni diverse con diverse forme di punta7. Ad esempio, la punta conica può discriminare le proprietà meccaniche a livello subcellulare, la punta sferica può rappresentare meglio le proprietà meccaniche dell'intera cella19 e le punte piramidali consentono di ottenere immagini ad alta risoluzione e proprietà meccaniche allo stesso tempo 7,20. La selezione del raggio della punta piramidale (20-60 nm) è importante per evitare che la punta affondi, consentendo un corretto processo di indentazione. Per ogni applicazione, il ricercatore deve scegliere il tipo di cantilever (e punta) più adatto al campione e il tipo di misure da eseguire8.
Il metodo ha alcune limitazioni: le proprietà meccaniche delle sole cellule sulla superficie degli organi possono essere misurate e i tessuti con topografie variabili sono difficili da lavorare. Ad esempio, i peli radicali potrebbero rendere difficile l'accesso alle cellule epidermiche con la punta AFM 8,18. Infine, mentre il metodo presentato misura l'elasticità, la nanoindentazione è stata utilizzata anche per segnalare la viscosità e la pressione del turgore nelle piante e negli animali 8,18.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse. Lo script MATLAB utilizzato per l'adattamento dei dati è disponibile su richiesta personale scrivendo a J. C. B.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da CSIC I + D 2018, sovvenzione n. 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) e PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
