Summary
Протокол отступа атомно-силовой микроскопии дает возможность препарировать роль физических свойств клеточной стенки конкретной клетки ткани или органа во время нормального или ограниченного роста (т.е. при дефиците воды).
Abstract
Здесь описан способ охарактеризовать физические свойства клеточной стенки эпидермальных клеток живых корней арабидопсиса посредством наноиндентов с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) в сочетании с оптическим инвертированным флуоресцентным микроскопом. Метод заключается в приложении контролируемых сил к образцу при измерении его деформации, что позволяет количественно оценить такие параметры, как кажущийся модуль Юнга клеточных стенок при субклеточных разрешениях. Это требует тщательной механической иммобилизации образца и правильного подбора инденторов и глубин углублений. Хотя он может быть использован только во внешних тканях, этот метод позволяет охарактеризовать механические изменения клеточных стенок растений во время развития и позволяет соотнести эти микроскопические изменения с ростом целого органа.
Introduction
Растительные клетки окружены клеточной стенкой, которая представляет собой сложную структуру, состоящую из взаимодействующих сетей полисахаридов, белков, метаболитов и воды, толщина которой варьируется от 0,1 до нескольких мкм в зависимости от типа клетки и фазы роста 1,2. Механические свойства клеточной стенки играют существенную роль в росте растений. Низкие значения жесткости клеточной стенки были предложены в качестве предварительного условия для роста клеток и расширения клеточной стенки, и появляется все больше доказательств того, что все клетки ощущают механические силы для выполнения своих функций. Тем не менее, до сих пор обсуждается, определяет ли изменение физических свойств клеточной стенки судьбу клетки 2,3,4. Поскольку растительные клетки не движутся во время развития, окончательная форма органа зависит от того, как далеко и в каком направлении расширяется клетка. Таким образом, корень Arabidopsis является хорошей моделью для изучения влияния физических свойств клеточной стенки на расширение клеток, поскольку различные типы расширения происходят в разных областях корня. Например, анизотропное расширение проявляется в зоне удлинения и особенно заметно в клетках эпидермиса5.
Описанный здесь способ был использован для характеристики физических свойств клеточной стенки эпидермальных клеток на наноуровне живых корней арабидопсиса с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) в сочетании с инвертированным флуоресцентным фазовым микроскопом6. Вместо обширного пересмотра метода AFM читать 7,8,9.
Этот протокол описывает базовый метод подготовки образцов и общий метод измерения эластичности клеточных стенок растений на основе AFM.
Рисунок 1: Схематический обзор эксперимента по силовому отступу в корнях Arabidopsis с использованием атомно-силовой микроскопии (AFM). Схема дает обзор этапов эксперимента по силовому углублению от подготовки субстрата для прочной иммобилизации образца корня (1-2), подтверждения жизнеспособности корня через окрашивание йодида пропидия (3), консольного позиционирования на поверхности удлиненной эпидермальной клетки первичного корня (4-5), измерения кривых силы (6) и обработки кривой силы для расчета кажущегося модуля Юнга (7-8). EZ: зона удлинения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка растительного материала и условий роста
- Чтобы получить необходимый растительный материал, стерилизуйте семена арабидопсиса дикого типа и мутантные линии, представляющие интерес.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали следующее: ttl1: линии вставки T-ДНК Salk_063943 (для TTL1; AT1G53300) — Колумбия-0 (Col-0) дикого типа; мутант Procuste1 (prc1-1), который состоит из нокаутирующей мутации (Q720stop) в гене CESA6 (AT5G64740), как описано ранее в10,11; и ttl1 x prc1-1 двойной мутант.- Поместите приблизительный объем 50 мкл семян в микропробирку. Добавьте 500 мкл 70% этанола + 0,01% раствора Tween при комнатной температуре. Перемешать и инкубировать в течение 7 мин.
- Влить раствор этанола и добавить 500 мкл 20% гипохлорита натрия. Перемешать и инкубировать в течение 7 мин.
- Залить раствор гипохлорита натрия и промыть семена три-четыре раза стерильной водой.
- Металлизация
- Заранее готовят базальный мурашиге и скуг (МС) в среде12 + 1,5% сахарозы + 1% агара (рН 5,7) (см. Таблицу материалов). Автоклав среды. Подготовьте ламинарную вытяжку для работы в стерильной среде и пометьте квадратные чашки Петри, необходимые для эксперимента. Налейте среду в чашку Петри и дайте среде затвердеть.
- Нанесите стерилизованные семена стерильными наконечниками пипеток на квадратные чашки Петри, содержащие среду. Распределите семена равномерно в два ряда. Когда семена высохнут, закройте крышки и запечатайте пластины. Стратифицировать семена при 4 °C в темноте в течение 4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратификация необходима для синхронизации прорастания. - Поместите пластины вертикально в камеру роста в режиме длинного дня (16 ч света/8 ч темноты) с интенсивностью света 25 мкмольм 2 с−1 и 23 °C (день/ночь). Выращивайте рассаду в течение 7 дней.
2. Лечение осмотическим стрессом (по желанию)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены подробности о росте корней Arabidopsis при осмотическом потенциале -1,2 МПа, оцененном криоскопическим осмометром (Таблица материалов). Эта часть может быть опущена или изменена в зависимости от рассматриваемого экспериментального вопроса.
- Готовят базальную МС среду + 1,5% сахарозы + 400 мМ маннит + 1% агара (рН 5,7). Автоклав среды. Вылейте среду в квадратные чашки Петри в ламинарную вытяжку и дайте среде затвердеть.
- Пинцетом (Таблица материалов) поместите 5-дневные саженцы, предварительно выращенные в базальной среде MS + 1,5% сахарозы, в квадратные чашки Петри, содержащие среду, дополненную маннитом 400 мМ. Поместите пластины вертикально в камеру роста в тех же условиях, что и на этапе 1.2.3. Выращивайте рассаду в этом осмотическом стрессовом состоянии в течение 7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки адаптации роста корней первичного корня во время сильного осмотического стресса рекомендуется использовать рассаду через 5 дней после прорастания, выращенную в контролируемых условиях, чтобы убедиться, что размер корневой меристемы уже установлен13. Альтернативно, анализ может быть выполнен на каждой стадии развития, чтобы определить эффект развития осмотического стрессового действия.
3. Эксперименты по наноиндентированию атомно-силовой микроскопии (AFM)
- Подготовка образца к экспериментам по наноиндентированию
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важнейший шаг для применения ОВМ к изучению живых биологических образцов. Образец должен быть прочно прикреплен к подложке, чтобы быть механически стабильным во время измерений отступа. При этом структурные качества образца должны быть сохранены. Эффективной стратегией стабилизации большого образца для AFM является использование клеев. Клей должен быстро высыхать и не должен быть токсичным или реакционноспособным с окружающей средой. В этом протоколе в качестве подложки использовались полистирольные чашки Петри, а для связывания саженцев арабидопсиса использовался некислотный силиконовый клей (Таблица материалов).- Нанесите тонкий слой силиконового клея в чашку Петри с помощью чехла. Оставьте клей на воздухе на 45 с.
- Пинцетом поместите саженец на клей, ориентируя его в направлении, избегающем контакта между выступающими частями саженца и консолью. Затем аккуратно прижмите корень к силиконовому клеевому слою, чтобы прочно связать его. Оставьте рассаду в контакте со клеем в течение 45 с, прежде чем приступить к следующим шагам протокола.
- Инкубировать присоединенные саженцы 2 мкг/мл йодида пропидия (PI; Таблица материалов) в течение 5 мин в темноте и трижды тщательно промыть их 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (Таблица материалов).
- Поместите рассаду, инкубированные PI, в перевернутый флуоресцентный микроскоп в сочетании с AFM. Для наблюдения флуоресценции установите длины волн возбуждения и излучения на уровне 572 нм и 617 нм соответственно. Отсутствие флуоресценции внутри клеток эпидермиса подтверждает жизнеспособность корней.
- Накройте рассаду 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
- Протокол отступа
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все измерения АСМ в течение 1 ч после иммобилизации образца на его опоре при комнатной температуре. Помещение, в котором находится AFM, должно поддерживаться при температуре 25 °C с кондиционером. Раствор PBS должен быть при одинаковой температуре.- Установите стандартный консольный нитрид кремния с пирамидальным наконечником (см. Таблицу материалов) в держатель зонда AFM для жидкости (Таблица материалов).
- Выровняйте лазер на консольном суставе близко к положению наконечника. Затем переместите фотодиод, чтобы поместить лазерное пятно в центр детектора.
- Чтобы откалибровать чувствительность к отклонению, поместите полистирольную чашку Петри с 1x PBS под AFM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для вычисления отступа. Когда измерение силы производится на твердой поверхности, в поверхности нет углубления, поэтому любое изменение смещения z-сканера соответствует отклонению консольной части. Поэтому очень важно откалибровать чувствительность отклонения на твердой поверхности. Использование мягкой поверхности переоценит чувствительность к отклонению, что приведет к слишком низким пружинным константам. - Отрегулируйте фотоприемник таким образом, чтобы бесконтактное отклонение было около 0 В. Откалибруйте чувствительность отклонения, выполнив отступ (кривую силы) с размером рампы 3 мкм, скоростью отступа и втягивания 0,6 мкм/с и порогом срабатывания 0,5 В.
- Чтобы откалибровать константу пружины консольного аппарата, используйте утилиту Thermal Tune программного обеспечения AFM (Таблица материалов), рекомендуемую для зондов с постоянными пружины менее приблизительно 5 Н/м, или используйте метод, описанный в ссылке14. Перед активацией Thermal Tune в программном обеспечении убедитесь, что зонд не взаимодействует с образцом.
- Введите консольную температуру. Нажмите « Калибровка > «Тепловая настройка» или значок «Тепловая настройка» на панели инструментов NanoScope . Выберите частотный диапазон (1-100 Гц).
- Нажмите « Получить данные » на панели «Тепловая настройка ». Подождите, пока AFM получит данные, а затем нажмите кнопку Простой гармонический осциллятор (Fluid ).
- Отрегулируйте среднюю ширину фильтра на 3. Отрегулируйте ширину PSD Bin, чтобы уменьшить шум в полученных данных путем усреднения. Установите границы подгонки вокруг первого резонансного пика.
- Нажмите «Рассчитать константу пружины k», а затем нажмите « Да » во всплывающем окне с вопросом, хочет ли пользователь использовать это значение.
- Повторите описанные выше шаги три раза и вручную возьмите среднее значение постоянных пружин. Введите это среднее значение в поле Spring Constant в списке параметров Ramp в представлении PicoForce . На этом калибровка заканчивается.
- Используя перевернутый оптический микроскоп при увеличении окуляра 10x, 20x и 40x, расположите зонд AFM на поверхности четвертой удлиненной эпидермальной клетки первичного корня, обеспечив ее положение в центре клетки.
- С расчетным значением постоянной пружины (шаг 3.2.5.5) получите кривые силы с размером рампы 3 мкм, порогом срабатывания 11 нН и скоростью отступа и втягивания 0,6 мкм/с в выбранных точках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущая работа15,16 показала, что низкая частота отступов и втягиваний помогает минимизировать гистерезис и силу сопротивления. - Получите кривые силы из трех клеток на корень для каждого лечения (используйте три биологические реплики на лечение). Захватите не менее 150 кривых силы для каждого корня.
4. Измерьте кажущийся модуль Юнга
- Подогнать каждую кривую силы к следующей модели для пирамидальных инденторов17:
, где E — кажущийся модуль Юнга образца, 
— модуль Пуассона образца, а α — полуугл к вершине. Отбросьте припадки с коэффициентом корреляции (r2) < 0,99. Рассмотрим коэффициент Пуассона для полностью несжимаемого материала: = 0,5 и геометрию индентора, указанную производителями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте первые 100 нм от точки контакта кривой нагрузки, чтобы фитинг был как можно более чувствителен к механике клеточной стенки и уменьшал влияние тургорного давления на кажущиеся значения модуля Юнга8. Подгонка была выполнена с помощью пользовательской программы MATLAB (доступной по личному запросу путем записи в J. C. B), которая позволяет установить определенную глубину отступа от точки контакта кривой загрузки. - Создайте нормализованную гистограмму с кажущимися данными модуля Юнга и приведите ее в соответствие с распределением Гаусса. Отбрасывайте точки данных за пределами 95% доверительного интервала и пересчитывайте как гистограмму, так и гауссову подгонку. Рассчитайте и отчитайте среднее и стандартное отклонение кажущегося модуля Юнга.
- Определите значимость сравнений между группами с помощью нескольких сравнительных тестов, таких как ANOVA.
, где E — кажущийся модуль Юнга образца, 
— модуль Пуассона образца, а α — полуугл к вершине. Отбросьте припадки с коэффициентом корреляции (r2) < 0,99. Рассмотрим коэффициент Пуассона для полностью несжимаемого материала: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперименты по силовому отступу
В следующем тексте представлены некоторые результаты, ожидаемые при проведении эксперимента с принудительным отступом, чтобы показать типичный выход, ожидаемый при хорошем выполнении протокола.
Кривые силы-смещения
Репрезентативные силовые участки отступа, которые были получены с отступом живых образцов в положении, расположенном в центре ячейки зоны удлинения корня, представлены на рисунке 2. Когда наконечник AFM начинает отступать от поверхности клеточной стенки, сила начинает увеличиваться (обозначена 1 на рисунке 2A) из-за оппозиции клеточной стенки к деформации. Увеличение силы (нагрузки) продолжается до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное значение силы (обозначено 2 на рисунке 2А); после этого момента начинается разгрузочная часть отступа.
Рисунок 2: Кривые силы-смещения, полученные в экспериментах по отступу, выполненных в клеточных стенках живых корневых зон удлинения. (A) Типичная кривая силы-смещения. В положении, отмеченном 1, сила начинает увеличиваться; наконечник AFM начинает отступать от клеточной стенки. Увеличение силы (нагрузки) продолжается до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное значение силы, указанное 2; после этого момента начинается разгрузочная часть отступа. (B) Пример кривой силы-смещения, в которой невозможно определить положение поверхности ячейки до отступа (обозначенного a), а кривые нагрузки и разгрузки являются шумными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Ожидаемые кривые силы-смещения покажут в части отступа, что сила растет после параболы, как и предсказывается моделью (объясненной на шаге 4.1) (рисунок 2A). Другим параметром подгонки является положение контактной точки; он должен соответствовать поверхности клеточной стенки до вмятины и считается источником смещения наконечника АСМ. Силовые кривые, в которых невозможно обнаружить точку контакта до углубления, должны быть отброшены (рисунок 2B). Кривая загрузки и разгрузки эксперимента по силовому отступу должна быть лишена шума. Шумные кривые, подобные той, что показана на рисунке 2B, должны быть отброшены.
Нормализованная гистограмма кажущегося модуля Юнга
Гистограммы, показывающие распределение частоты полученных значений кажущегося модуля Юнга для набора из 201 успешного углубления на девяти различных клетках трех различных растений Col-0, выращенных в контрольных условиях, представлены на фиг.3. На рисунке показан пример, в котором среднее и стандартное отклонение кажущегося модуля Юнга (88,12 ± 2,79 кПа) были рассчитаны на основе гистограмм, оснащенных кривой Гаусса6.
Рисунок 3: Пример гистограммы кажущегося модуля Юнга, который позволил провести надлежащий статистический анализ результатов. Данные были получены из кривых силы на девяти различных клетках трех разных растений Col-0, выращенных в контрольных условиях. Данные, полученные из 201 кривой силы, были адаптированы к гауссовскому распределению. Относительная частота указывает на количество установленных кривых силы, которые соответствуют каждому вычисленному кажущемуся модулю Юнга. Средние значения и значения стандартного отклонения этого условия были получены из гауссовских припадков. RF: Относительная частота; AEM: кажущийся модуль Юнга. Этот рисунок был изменен по сравнению со ссылкой6Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Некоторые генотипы может быть очень трудно отступить из-за морфологии корня. Так обстояло дело с мутантом prc1-1 и двойным мутантом ttl1 prc1-1 , выращенным в сильном осмотическом стрессе. В этом состоянии у этих мутантов было мало удлиненных клеток в зоне удлинения корней и развились очень длинные корневые волоски, которые мешают консолью, производящей движение образца. На фиг.4 представлены гистограммы, показывающие распределение вероятности полученных значений кажущегося модуля Юнга на девять различных клеток двойного мутанта ttl1 prc1-1 . На рисунке показан пример, в котором полученные силовые кривые не позволили провести надлежащий анализ. Только гистограмма H, соответствующая одной клетке, может быть приспособлена к гауссовскому распределению6.
Рисунок 4: Пример гистограмм кажущегося модуля Юнга, которые не позволяли провести надлежащий анализ. Данные были получены из кривых силы на девяти различных клетках трех разных растений двойного мутанта ttl1prc1-1 . Относительная частота указывает на количество установленных кривых силы, которые соответствуют каждому вычисленному кажущемуся модулю Юнга. Только гистограмма H может быть приспособлена к гауссовскому распределению. RF: Относительная частота; AEM: кажущийся модуль Юнга. Этот показатель был изменен по сравнению со ссылкой6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Механика клеток и клеточных стенок становится все более актуальной, чтобы получить представление о том, как механика влияет на процессы роста. Поскольку физические силы распространяются на значительные расстояния в твердых тканях, изучение изменений физических свойств клеточной стенки и того, как они воспринимаются, контролируются, настраиваются и влияют на рост растения, становится важной областью исследований 2,3,8.
Здесь представлен метод изучения физических свойств клеточной стенки клеток в зоне удлинения корня Арабидопсиса. Метод AFM может быть легко объединен с другими методами, такими как исследования скорости роста, чтобы понять влияние физических свойств клеточной стенки на рост корней.
Одним из наиболее важных экспериментальных этапов является механическая иммобилизация образца; образец должен быть прочно прикреплен, чтобы избежать движения образца при его отступе. Слой силиконового клея должен быть достаточно тонким, чтобы он мог быстро высохнуть. Манипуляции с силиконовым клеем и образцом должны быть осторожны, чтобы гарантировать, что силикон не покрывает области образца, которые будут измерены. Кроме того, подготовка должна быть завершена быстро (в течение минуты), чтобы сохранить адгезионные свойства силиконового клея и предотвратить обезвоживание корней. Крайне важно предотвратить повреждение тканей; обезвоживание и повреждение эпидермальной ткани приведет к необратимым изменениям механических свойств клеточной стенки. Другими методами используется иммобилизация в 1% агарозы на стеклянной горке; однако этот метод также сталкивается с проблемой необходимости быстрой манипуляции и дополнительного этапа подготовки стеклянных слайдов для предотвращения перемещения образцов по осям X и Y во время анализа. Для получения дополнительной информации см. ссылки 8,18. Другим важным моментом этого протокола является подсчет с помощью оптического микроскопа с эпифлуоресценцией, связанной с AFM, который имеет разные цели (10x, 20x и 40x). Это позволяет точно выбрать область отступа.
Одним из сложных аспектов протокола является выбор параметров отступов AFM. Различные отступы и глубины отступов отображают различные разрешения и могут быть использованы для ответа на различные исследовательские вопросы8. Несколько исследований показали, что размер и геометрия наконечника являются важными соображениями для определения желаемых результатов. Различная информация получена с различными формами наконечников7. Например, конический наконечник может различать механические свойства на субклеточном уровне, сферический наконечник может лучше представлять механические свойства всей ячейки19, а пирамидальные наконечники позволяют получать изображения высокого разрешения и механические свойства одновременно 7,20. Выбор радиуса пирамидального наконечника (20-60 нм) важен для предотвращения опускания наконечника, что позволяет обеспечить надлежащий процесс углубления. Для каждого применения исследователь должен выбрать тип консольного (и наконечника), лучше подходящего для образца, и тип измерений для выполнения8.
Метод имеет некоторые ограничения: можно измерить механические свойства только клеток на поверхности органов, а с тканями с переменной топографией трудно работать. Например, корневые волоски могут затруднить доступ к клеткам эпидермиса с помощью наконечника AFM 8,18. Наконец, в то время как представленный метод измеряет эластичность, наноиндентирование также использовалось для сообщения о вязкости и тургорном давлении у растений и животных 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов. Скрипт MATLAB, используемый для подгонки данных, доступен по личному запросу, написав в J. C. B.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось CSIC I+D 2018, грант No 95 (Мариана Сотело Силвейра).; CSIC Grupos (Омар Борсани) и PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. Root development. The Arabidopsis Book. 1, 0101 (2002).
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
