Summary
Atomkraftmikroskopi innrykksprotokollen gir mulighet til å dissekere rollen som de fysiske egenskapene til celleveggen til en bestemt celle i et vev eller organ under normal eller begrenset vekst (dvs. under vannunderskudd).
Abstract
En metode er beskrevet her for å karakterisere de fysiske egenskapene til celleveggen til epidermale celler av levende Arabidopsis-røtter gjennom nanoindentasjoner med et atomkraftmikroskop (AFM) kombinert med et optisk invertert fluorescensmikroskop. Metoden består i å påføre kontrollerte krefter på prøven mens den måles deformasjon, slik at man kan kvantifisere parametere som den tilsynelatende Youngs modul av cellevegger ved subcellulære oppløsninger. Det krever en nøye mekanisk immobilisering av prøven og riktig valg av indentere og innrykksdybder. Selv om den kun kan brukes i eksternt vev, tillater denne metoden karakterisering av mekaniske endringer i plantecellevegger under utvikling og muliggjør korrelasjon av disse mikroskopiske endringene med veksten av et helt organ.
Introduction
Planteceller er omgitt av en cellevegg som er en kompleks struktur sammensatt av samvirkende nettverk av polysakkarider, proteiner, metabolitter og vann som varierer i tykkelse fra 0,1 til flere μm avhengig av celletype og vekstfase 1,2. Cellevegg mekaniske egenskaper spiller en viktig rolle i veksten av planter. Lave stivhetsverdier i celleveggen har blitt foreslått som en forutsetning for cellevekst og celleveggutvidelse, og det er økende bevis på at alle celler føler mekaniske krefter for å utføre sine funksjoner. Det diskuteres imidlertid fortsatt om endringer i celleveggens fysiske egenskaper bestemmer celleskjebne 2,3,4. Fordi planteceller ikke beveger seg under utviklingen, avhenger den endelige formen på et organ av hvor langt og i hvilken retning en celle utvides. Dermed er Arabidopsis rot en god modell for å studere virkningen av cellevegg fysiske egenskaper i celleutvidelse fordi forskjellige typer ekspansjon forekommer i forskjellige regioner av roten. For eksempel er anisotropisk ekspansjon tydelig i forlengelsessonen og spesielt merkbart i epidermale celler5.
Metoden beskrevet her ble brukt til å karakterisere de fysiske egenskapene til celleveggen til epidermale celler på nanoskala av levende Arabidopsis-røtter ved hjelp av et atomkraftmikroskop (AFM) kombinert med et omvendt fluorescensfasemikroskop6. For en omfattende revisjon av AFM-teknikken, les 7,8,9.
Denne protokollen skisserer en grunnleggende prøveprepareringsmetode og en generell metode for AFM-baserte elastisitetsmålinger av plantecellevegger.
Figur 1: Skjematisk oversikt over kraftinnrykkseksperiment i Arabidopsis-røtter ved bruk av atomkraftmikroskopi (AFM). Skjemaet gir en oversikt over trinnene i et Force-Indentation-eksperiment fra fremstillingen av substratet for å immobilisere rotprøven fast (1-2), rotens levedyktighetsbekreftelse gjennom propidiumjodidfarging (3), utkragende posisjonering på overflaten av en langstrakt epidermal celle av primærroten (4-5), kraftkurvemåling (6) og kraftkurvebehandling for å beregne den tilsynelatende Youngs modul (7-8). EZ: forlengelsessone. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av plantemateriale og vekstforhold
- For å generere det nødvendige plantematerialet, steriliser frøene til Arabidopsis villtype og mutante linjer av interesse.
MERK: I denne protokollen brukte vi følgende: ttl1: T-DNA innsettingslinjer Salk_063943 (for TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) villtype; Procuste1 (prc1-1) mutanten, som består av en knock-out mutasjon (Q720stop) i CESA6-genet (AT5G64740), som tidligere beskrevet i10,11; og TTL1 x PRC1-1 dobbel mutant.- Sett et omtrentlig volum på 50 μL frø i et mikrorør. Tilsett 500 μL 70% etanol + 0,01% Tween-oppløsning ved romtemperatur. Bland og inkuber i 7 min.
- Hell etanoloppløsningen og tilsett 500 μL 20% natriumhypokloritt. Bland og inkuber i 7 min.
- Hell natriumhypoklorittoppløsningen og vask frøene tre til fire ganger med sterilt vann.
- Plating
- Forbered på forhånd basal Murashige og Skoog (MS) medium12 + 1,5% sukrose + 1% agar (pH 5,7) (se Materialtabell). Autoklav mediet. Forbered en laminær strømningshette for å fungere i et sterilt miljø og merk de firkantede petriskålene som trengs for eksperimentet. Hell mediet i petriskålene og la mediet stivne.
- Tallerken de steriliserte frøene ved hjelp av sterile pipettespisser på firkantede petriskåler som inneholder mediet. Fordel frøene jevnt i to rader. Når frøene er tørre, lukk lokkene og forsegl platene. Stratifiser frøene ved 4 °C i mørket i 4 dager.
MERK: Stratifisering er nødvendig for å synkronisere spiring. - Plasser platene vertikalt i vekstkammeret i et langdagsregime (16 timer lys / 8 timer mørkt) med 25 μmol m2 s−1 lysintensitet og 23 °C (dag/natt). Dyrk plantene i 7 dager.
2. Osmotisk stressbehandling (valgfritt)
MERK: Denne delen gir detaljer om veksten av Arabidopsis-røtter i osmotisk potensial på -1,2 MPa som estimert ved kryoskopisk osmometer (materialtabell). Denne delen kan utelates eller endres avhengig av det aktuelle eksperimentelle spørsmålet.
- Forbered basal MS medium + 1,5% sukrose + 400 mM mannitol + 1% agar (pH 5,7). Autoklav mediet. Hell mediet i firkantede petriskåler i den laminære strømningshetten og la mediet stivne.
- Med pinsett (materialbord), plasser 5 dager gamle frøplanter som er forvokst i basal MS + 1,5% sukrosemedium i firkantede petriskåler som inneholder mediet supplert med 400 mM mannitol. Plasser platene vertikalt i vekstkammeret under samme forhold som i trinn 1.2.3. Dyrk plantene under denne osmotiske stresstilstanden i 7 dager.
MERK: For å evaluere rotveksttilpasning av primærroten under alvorlig osmotisk stress, foreslås det å bruke frøplanter 5 dager etter spiring dyrket under kontrollerte forhold for å sikre at rotmeristemstørrelsen allerede er etablert13. Alternativt kan analysen utføres på alle stadier av utviklingen for å bestemme utviklingseffekten av osmotisk stressvirkning.
3. Atomkraftmikroskopi (AFM) nanoindentasjonseksperimenter
- Forberedelse av prøven for nanoindentasjonseksperimenter
MERK: Dette er et viktig skritt for å bruke AFM til studiet av levende biologiske prøver. Prøven må være godt festet til underlaget for å være mekanisk stabil under innrykksmålinger. Samtidig bør utvalgets strukturelle egenskaper bevares. En effektiv strategi for å stabilisere en stor prøve for AFM er å bruke lim. Limet må tørke raskt og må ikke være giftig eller reaktivt med det omkringliggende mediet. I denne protokollen ble polystyren petriskåler brukt som substrat og ikke-surt silikonlim (materialtabell) ble brukt til å binde Arabidopsis-plantene.- Spred et tynt lag silikon lim i petriskålen med en coverslip. La limet stå i luften i 45 s.
- Med pinsett, legg frøplanten på limet, orienter den i en retning som unngår kontakt mellom frøplantens fremspringende deler og utkraget. Trykk deretter roten forsiktig til silikonlimlaget for å binde det fast. La frøplanten være i kontakt med limet i 45 s før du fortsetter med de neste trinnene i protokollen.
- Inkuber de vedlagte plantene med 2 μg / ml propidiumjodid (PI; Tabell over materialer) i 5 minutter i mørket og vask dem forsiktig tre ganger med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) løsning (Table of Materials).
- Plasser de PI-inkuberte plantene i et omvendt fluorescensmikroskop kombinert med AFM. For å observere fluorescens, sett eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til henholdsvis 572 nm og 617 nm. Fraværet av fluorescens inne i epidermale celler bekrefter levedyktigheten til røttene.
- Dekk frøplanten med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) løsning.
- Innrykksprotokoll
MERK: Utfør alle AFM-målinger innen 1 time etter immobilisering av prøven på støtten ved romtemperatur. Rommet der AFM er plassert bør opprettholdes ved 25 °C med klimaanlegg. PBS-løsningen skal ha samme temperatur.- Monter en standard silisiumnitridutkragingsutkrager med en pyramidespiss (se Materialtabell) i AFM-sondeholderen for væske (Table of Materials).
- Juster laseren på utkrageren nær spissens posisjon. Deretter flytter du fotodioden for å plassere laserpunktet i midten av detektoren.
- For å kalibrere avbøyningsfølsomheten, plasser en polystyren petriskål med 1x PBS under AFM.
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å beregne innrykket. Når en kraftmåling gjøres på en hard overflate, er det ingen innrykk i overflaten, så enhver endring i z-skannerens forskyvning tilsvarer utkrageavbøyningen. Derfor er det svært viktig å kalibrere avbøyningsfølsomheten på en hard overflate. Bruk av en myk overflate vil overvurdere avbøyningsfølsomheten, noe som vil resultere i fjærkonstanter som er for lave. - Juster fotodetektoren slik at ikke-kontaktavbøyningen er nær 0 V. Kalibrer avbøyningsfølsomheten ved å utføre en innrykk (kraftkurve), med en rampestørrelse på 3 μm, en innrykks- og tilbaketrekningshastighet på 0,6 μm / s, og en utløsergrense på 0,5 V.
- For å kalibrere fjærkonstanten til utkrageren, bruk Thermal Tune-verktøyet til AFM-programvaren (Table of Materials) som anbefales for sonder med fjærkonstanter mindre enn ca. 5 N/m, eller bruk metoden beskrevet i referanse14. Før du aktiverer Thermal Tune i programvaren, må du forsikre deg om at sonden ikke samhandler med prøven.
- Angi utkragetemperaturen. Klikk på Calibrate > Thermal Tune eller på Thermal Tune-ikonet i NanoScope-verktøylinjen . Velg et frekvensområde (1-100 Hz).
- Klikk på Hent data i Thermal Tune-panelet . Vent til AFM henter data, og klikk deretter på Simple Harmonic Oscillator (Fluid) -knappen.
- Juster median filterbredde til 3. Juster PSD-papirkurvbredden for å redusere støyen i de innsamlede dataene med gjennomsnitt. Sett passformgrenser rundt den første resonanstoppen.
- Klikk på Beregn fjærkonstant k, og klikk deretter på Ja i popup-vinduet og spør om brukeren vil bruke denne verdien.
- Gjenta trinnene beskrevet ovenfor tre ganger og manuelt ta et gjennomsnitt av vårkonstantverdier. Skriv inn denne gjennomsnittsverdien i boksen Vårkonstant i listen Rampeparameter i PicoForce-visningen . Kalibreringen avsluttes på dette punktet.
- Ved hjelp av det inverterte optiske mikroskopet ved 10x, 20x og 40x okularforstørrelse, plasser AFM-sonden på overflaten av den fjerde langstrakte epidermale cellen til primærroten, og sørg for å plassere den i midten av cellen.
- Med den beregnede fjærkonstantverdien (trinn 3.2.5.5), oppnå kraftkurver med en rampestørrelse på 3 μm, en utløserterskel på 11 nN og en innrykks- og tilbaketrekningshastighet på 0,6 μm / s ved utvalgte punkter.
MERK: Tidligere arbeid15,16 fant at lavfrekvent innrykk og tilbaketrekning bidrar til å minimere hysterese og dragkraft. - Få kraftkurver fra tre celler per rot for hver behandling (bruk tre biologiske replikasjoner per behandling). Fang minst 150 kraftkurver for hver rot.
4. Mål den tilsynelatende Youngs modul
- Tilpass hver kraftkurve til følgende modell for pyramidale indenters17:
, der E er den tilsynelatende Youngs modul i prøven, er Poisson-modulen til prøven, 
og α er halvvinkelen til toppunktet. Kast passformene med en korrelasjonskoeffisient (r2) < 0,99. Tenk på Poissons forhold for helt inkompressibelt materiale: = 0,5 og geometrien til indenten gitt av produsentene.
MERK: Bruk de første 100 nm fra kontaktpunktet til lastekurven for at beslaget skal være så følsomt som mulig for celleveggmekanikk og for å redusere virkningen av turgortrykk på den tilsynelatende Youngs modulverdier8. Tilpasningen er gjort ved hjelp av et tilpasset MATLAB-program (tilgjengelig på personlig forespørsel ved å skrive til J. C. B) som gjør det mulig å sette en bestemt innrykksdybde fra kontaktpunktet til lastekurven. - Lag et normalisert histogram med den tilsynelatende Youngs moduldata og tilpass den med en Gauss-fordeling. Forkast datapunkter utenfor 95 % konfidensintervallet, og beregn både histogrammet og gaussisk tilpasning på nytt. Beregn og rapporter gjennomsnittet og standardavviket til den tilsynelatende Youngs modul.
- Bestem betydningen av sammenligningene mellom grupper ved hjelp av flere sammenligningstester som ANOVA.
, der E er den tilsynelatende Youngs modul i prøven, er Poisson-modulen til prøven, 
og α er halvvinkelen til toppunktet. Kast passformene med en korrelasjonskoeffisient (r2) < 0,99. Tenk på Poissons forhold for helt inkompressibelt materiale: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimenter med innrykk av kraft
Følgende tekst presenterer noen resultater som forventes når et kraftinnrykkseksperiment utføres for å vise den typiske utgangen som kan forventes når protokollen er godt utført.
Kraftforskyvningskurver
Representative kraftinnrykkplott som ble oppnådd innrykk av levende prøver i en posisjon plassert i midten av cellen i rotforlengelsessonen, er presentert i figur 2. Når AFM-spissen begynner å rykke inn overflaten av celleveggen, begynner kraften å øke (indikert med 1 i figur 2A) på grunn av celleveggens motstand mot deformasjonen. Økningen av kraft (lasting) fortsetter til den maksimale kraftverdien er nådd (angitt med 2 i figur 2A); Etter dette punktet begynner lossedelen av innrykket.
Figur 2: Kraftforskyvningskurver oppnådd i innrykkseksperimenter gjort i cellevegger av levende rotforlengelsessoneceller . (A) En typisk kraftforskyvningskurve. Ved stillingen merket med 1 begynner kraften å øke; AFM-spissen begynner å rykke inn celleveggen. Økningen av kraft (lasting) fortsetter til maksimal kraftverdi er nådd, som angitt med 2; Etter dette punktet begynner lossedelen av innrykket. (B) Eksempel på en kraftforskyvningskurve der det er umulig å oppdage posisjonen til celleoverflaten før innrykket (indikert med a), og både laste- og lossekurvene er støyende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De forventede kraftforskyvningskurvene vil vise i innrykksdelen at kraften vokser etter en parabel, som forutsagt av modellen (forklart i trinn 4.1) (figur 2A). En annen passende parameter er kontaktpunktposisjonen; det skal svare til celleveggoverflaten før innrykk og regnes som opprinnelsen til AFM-spissforskyvningen. Kraftkurver der det ikke er mulig å oppdage kontaktpunktet før innrykket skal kastes (figur 2B). Belastnings- og lossekurven for kraftinnrykkseksperimentet må være blottet for støy. Støyende kurver som den som er representert i figur 2B må kastes.
Normalisert histogram av den tilsynelatende Youngs modul
Histogrammene som viser fordelingen av frekvensen av de oppnådde verdiene til den tilsynelatende Youngs modul for et sett med 201 vellykkede innrykk på ni forskjellige celler av tre forskjellige planter av Col-0 dyrket under kontrollforhold, er presentert i figur 3. Figuren viser et eksempel der gjennomsnittet og standardavviket til den tilsynelatende Youngs modul (88,12 ± 2,79 KPa) ble beregnet ut fra histogrammene utstyrt med en gaussisk kurve6.
Figur 3: Eksempel på et histogram av tilsynelatende Youngs modul som tillot en skikkelig statistisk analyse av resultatene. Data ble hentet fra kraftkurver på ni forskjellige celler av tre forskjellige planter av Col-0 dyrket i kontrollforhold. Dataene fra 201 Force-kurver ble tilpasset en Gauss-fordeling. Den relative frekvensen indikerer antall monterte kraftkurver som tilsvarer hver beregnet tilsynelatende Youngs modul. Gjennomsnitts- og standardavviksverdiene for denne tilstanden ble oppnådd fra Gauss-tilpasningene. RF: Relativ frekvens; AEM: tilsynelatende Youngs modul. Dette tallet ble endret fra referanse6Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Noen genotyper kan være svært vanskelig å rykke inn på grunn av rotens morfologi. Dette var tilfellet for prc1-1 mutant og ttl1 prc1-1 dobbel mutant dyrket i alvorlig osmotisk stress. I denne tilstanden hadde disse mutantene få langstrakte celler i rotforlengelsessonen og utviklet svært lange rothår, noe som forstyrrer utkrageren som produserer prøvebevegelsen. Figur 4 viser histogrammer som viser sannsynlighetsfordelingen for de oppnådde verdiene av den tilsynelatende Youngs modul på ni forskjellige celler i ttl1 prc1-1 dobbeltmutanten. Figuren viser et eksempel der de oppnådde kraftkurvene ikke tillot riktig analyse. Bare histogram H som tilsvarer en celle kunne tilpasses en gaussisk fordeling6.
Figur 4: Eksempel på histogrammer av tilsynelatende Youngs modul som ikke tillot en skikkelig analyse. Data ble hentet fra kraftkurver på ni forskjellige celler av tre forskjellige planter av ttl1prc1-1 dobbeltmutanten. Den relative frekvensen indikerer antall monterte kraftkurver som tilsvarer hver beregnet tilsynelatende Youngs modul. Bare histogram H kunne tilpasses en gaussisk fordeling. RF: Relativ frekvens; AEM: den tilsynelatende Youngs modul. Dette tallet er endret fra referanse6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celle- og celleveggmekanikk blir stadig mer relevant for å få innsikt i hvordan mekanikk påvirker vekstprosesser. Etter hvert som fysiske krefter forplanter seg over store avstander i fast vev, blir studiet av endringer i celleveggens fysiske egenskaper og hvordan de sanses, kontrolleres, justeres og påvirker plantens vekst et viktig fagområde 2,3,8.
En metode presenteres her for å studere celleveggens fysiske egenskaper av celler i forlengelsessonen til Arabidopsis-roten. AFM-teknikken kan lett kombineres med andre teknikker, for eksempel veksthastighetsstudier, for å forstå effekten av celleveggens fysiske egenskaper i rotvekst.
En av de mest kritiske eksperimentelle trinnene er mekanisk immobilisering av prøven; Prøven må være godt festet for å unngå prøvebevegelsen mens den er innrykket. Laget av silikonlimet må være tynt nok til at det tørker raskt. Manipuleringen av silikonlimet og prøven bør være forsiktig for å sikre at silikonet ikke dekker områdene av prøven som skal måles. Videre bør preparatet fullføres raskt (innen et minutt) for å opprettholde silikonlimets klebende egenskaper og forhindre dehydrering av røtter. Det er avgjørende å forhindre vevskader; Dehydrering og skade på epidermalvevet vil gi irreversible forandringer i celleveggens mekaniske egenskaper. Andre metoder brukte immobilisering i 1% agarose på et glassglass; Denne metoden har imidlertid også utfordringen med å trenge rask manipulering og et ekstra trinn for klargjøring av glassglassene for å forhindre at prøvene beveger seg i X- og Y-aksene under analysen. For mer informasjon, se referanser 8,18. Et annet relevant punkt i denne protokollen er å telle med et optisk mikroskop med epifluorescens koblet til AFM som har forskjellige mål (10x, 20x og 40x). Dette gjør det mulig å velge innrykksområdet nøyaktig.
Et utfordrende aspekt ved protokollen er valget av AFM-innrykksinnstillinger. Ulike indenters og innrykksdybder gir forskjellige oppløsninger og kan brukes til å svare på forskjellige forskningsspørsmål8. Flere studier har vist at spissens størrelse og geometri er viktige hensyn for å skjelne de ønskede resultatene. Ulike opplysninger innhentes med ulike spissformer7. For eksempel kan den koniske spissen diskriminere mekaniske egenskaper på subcellulært nivå, den sfæriske spissen kan bedre representere de mekaniske egenskapene til hele cellen19, og pyramidespisser tillater å oppnå høyoppløselige bilder og mekaniske egenskaper samtidig 7,20. Valget av pyramidespissradius (20-60 nm) er viktig for å forhindre at spissen synker, noe som muliggjør en riktig innrykksprosess. For hver applikasjon må forskeren velge hvilken type utkrager (og spiss) som passer bedre for prøven og hvilken type målinger som skal utføres8.
Metoden har noen begrensninger: De mekaniske egenskapene til bare celler på overflaten av organer kan måles, og vev med variable topografier er vanskelige å jobbe med. For eksempel kan rothår gjøre det vanskelig å få tilgang til epidermale celler med AFM-spissen 8,18. Til slutt, mens metoden som presenteres måler elastisitet, har nanoindentasjon også blitt brukt til å rapportere viskositet og turgortrykk i planter og dyr 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter. MATLAB-skriptet som brukes til å tilpasse dataene, er tilgjengelig på personlig forespørsel ved å skrive til JCB.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av CSIC I + D 2018, stipend nr. 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) og PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
