Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tredimensionelt, serumfrit kultursystem til stamceller fra lacrimalkirtlen

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

Den tredimensionelle, serumfri dyrkningsmetode til voksne lacrimal kirtel (LG) stamceller er veletableret til induktion af LG organoiddannelse og differentiering i acinar eller duktallignende celler.

Abstract

Lacrimal kirtel (LG) stamcellebaseret terapi er en lovende strategi for lacrimal kirtel sygdomme. Manglen på en pålidelig, serumfri dyrkningsmetode til opnåelse af et tilstrækkeligt antal LG-stamceller (LGSC'er) er imidlertid en hindring for yderligere forskning og anvendelse. Den tredimensionelle (3D), serumfri dyrkningsmetode til lgsc'er med voksne mus er veletableret og vist her. LGSC'erne kunne kontinuerligt passeres og induceres til at differentiere til acinar eller duktallignende celler.

For LGSC primærkulturen blev LP'erne fra 6-8 uger gamle mus fordøjet med dispase, collagenase I og trypsin-EDTA. I alt 1 × 104 enkeltceller blev podet i 80 μL matrix gel-lacrimal kirtel stamcelle medium (LGSCM) matrix i hver brønd af en 24-brønd plade, forbelagt med 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Blandingen blev størknet efter inkubation i 20 minutter ved 37 °C, og der blev tilsat 600 μL LGSCM.

Til LGSC-vedligeholdelse blev LGSC'er dyrket i 7 dage opdelt i enkeltceller ved dispase og trypsin-EDTA. Enkeltcellerne blev implanteret og dyrket i henhold til den metode, der blev anvendt i LGSC primærkulturen. LGSC'er kunne passeres over 40 gange og kontinuerligt udtrykke stam- / stamcellemarkører Krt14, Krt5, P63 og nestin. LGSC'er dyrket i LGSCM har selvfornyelseskapacitet og kan differentiere sig til acinar- eller duktallignende celler in vitro og in vivo.

Introduction

Lacrimal kirtel stamceller (LGSC'er) opretholde lacrimal kirtel (LG) cellefornyelse og er kilden til acinar og duktal celler. Derfor betragtes LGSC-transplantation som en alternativ tilgang til behandling af alvorlig inflammatorisk skade og vandig-mangelfuld tør øjensygdom (TILFØJET)1,2,3. Tiwari et al. adskilte og dyrkede primære LG-celler ved hjælp af kollagen I og matrixgel suppleret med flere vækstfaktorer; LG-cellerne kunne dog ikke kontinuerligt dyrkes4. Ved hjælp af todimensionel (2D) kultur blev mus LG-afledte stamceller isoleret af You et al.5 og Ackermann et al. 6, fundet at udtrykke stam-/stamcellemarkørgenerne, Oct4, Sox2, Nanog og nestin, og kunne subkultureres. Der er imidlertid ingen klar indikation af, at disse celler kan differentiere sig til acinar- eller duktale celler, og der er ikke noget transplantationseksperiment for at verificere differentieringspotentialet in vivo.

For nylig blev c-kit + dim / EpCAM + / Sca1-/ CD34-/ CD45-celler isoleret fra muse-LP'er ved flowcytometri, fundet at udtrykke LG-stamcellemarkører, såsom Pax6 og Runx1, og differentieret i kanaler og acini in vitro. Hos mus med ADDED kan ortopisk injektion med disse celler reparere beskadigede LC'er og genoprette SEK'ernes sekretoriskefunktion. Antallet af stamceller isoleret ved denne metode var imidlertid lille, og der er ingen egnede kulturbetingelser for udvidelse af de isolerede LGSC'er. Sammenfattende skal der etableres et passende kultursystem til effektivt at isolere og dyrke voksne LGSC'er med stabil og kontinuerlig ekspansion til undersøgelse af LGSC'er i behandlingen af ADDED.

Organoider afledt af stamceller eller pluripotente stamceller er en gruppe celler, der histologisk ligner de beslægtede organer og kan opretholde deres egen fornyelse. Efter at musens tarmorganoid med succes blev dyrket af Sato et al. i 20097, blev organoider fra andre organer dyrket efter hinanden baseret på Satos kultursystem, såsom galdeblære8, lever9, bugspytkirtel10, mave11, bryst12, lunge13, prostata14 og spytkirtel15 . På grund af den høje andel af voksne stamceller før celledifferentiering i organoidkultur betragtes den tredimensionelle (3D) organoidkulturmetode som optimal til isolering og dyrkning af voksne stamceller fra LG.

Et LGSC-dyrkningssystem for voksne mus blev etableret i denne undersøgelse ved at optimere 3D, serumfri dyrkningsmetode. Det er bevist, at LGSC'erne dyrket fra både normale og TILFØJEDE mus viste en stabil kapacitet til selvfornyelse og spredning. Efter transplantation i ADDED-muse-LP'erne koloniserede LGSC'er de svækkede LC'er og forbedrede tåreproduktionen. Derudover blev røde fluorescerende LGSC'er isoleret fra ROSA26mT / mG mus og dyrket. Dette arbejde giver en pålidelig reference for LGSC berigelse in vitro og LGSC autograft i klinisk anvendelse til ADDED terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenterne i denne protokol fulgte retningslinjerne for dyrepleje fra Den Etiske Komité for Dyreforsøg ved Sun Yat-sen University. Alle cellerelaterede operationer skal udføres på det ultrarengørende arbejdsbord i celleoperationsrummet. Alle operationer med xylen skal udføres i røghætter.

1. LGSC primær kultur

  1. LG isolation
    1. Få en 6-8 uger gammel BALB/c hanmus, og skær huden bag øret for at udsætte LG og bindevævet omkring det. Skræl bindevævet af ved stump dissektion ved hjælp af pincet og fjern LG.
    2. Skyl GG'erne to gange med 4 ml steril 10 ml PBS-opløsning for at fjerne blod i et fad på 6 cm. Gl'erne nedsænkes i et 6 cm fad med 4 ml 75% ethanol i 10 s og skylles med 10 mM PBS to gange med det samme.
  2. Få enkeltceller af LG
    1. Brug HEPES-bufferopløsning (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl i ultrarent vand) til at forberede 25 U/ml dispase. Forbered 0,1% collagenase I-opløsningen med ultrarent vand.
    2. GG'erne skæres i små fragmenter (ca. 1 mm3), overføres til et sterilt 15 ml centrifugerør, og vævene behandles med 500 μL 25 U/ml dispase og 500 μL 0,1% collagenase I i 1 time ved 37 °C.
    3. Brug 10 mM PBS til fremstilling af trypsin-EDTA-opløsning (0,05 g/l trypsin, 0,04 g/l EDTA). LG-fragmenterne fra trin 1.2.2 behandles med 1 ml 0,05 % trypsin-EDTA i 10 minutter ved 37 °C, og fragmenterne dissocieres i enkeltceller ved pipettering gentagne gange.
    4. Suspensionen filtreres gennem et 70 μm filter, filtratet opsamles i et sterilt 15 ml centrifugerør, og centrifuger ved 150 × g i 5 min.
    5. Efter centrifugering fjernes supernatanten, der tilsættes 10 ml 10 ml PBS for at vaske cellepillet, og suspensionen centrifugeres.
    6. Trin 1.2.5 gentages, supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml DMEM/F12 (1:1 blanding af Dulbeccos modificerede Eagle's medium og Ham's F-12) for at resuspendere cellepillerne.
  3. LGSC primær kultur
    1. Forbered lacrimal kirtel stamcelle medium (LGSCM) indeholdende DMEM / F12, 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 2 mM glutamin erstatning, 0,1 mM NEAAs (uvæsentlige aminosyrer), 50 ng / ml murine epidermal vækstfaktor (EGF), 100 ng / ml fibroblast vækstfaktor 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A og 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitor).
    2. Der tilsættes 20 μL matrixgel-LGSCM matrix (matrixgel: LGSCM = 1:1) i midten af brønden på en 24-brøndplade. Brug en pipettespids til at udvide den til en cirkel (6-8 mm diameter), og inkuber blandingen i 20 minutter ved 37 °C for at forcoate brønden.
    3. Brug en celletæller til at bestemme cellenummeret og tilsæt 40 μL LGSCM med i alt 1 × 104 celler i 40 μL af matrixgelen. Bland dem forsigtigt med en pipette for at opnå en matrixgel-LGSCM-blanding (matrixgel: LGSCM = 1:1).
    4. Der anvendes en pipette til forsigtigt at sænke 80 μL af blandingen over det forlakerede område i hver brønd på 24-brøndpladen i trin 1.3.2.
    5. Blandingen inkuberes i 20 minutter ved 37 °C, og der tilsættes 600 μL LGSCM.
    6. Skift kulturmediet i hver brønd en gang hver anden dag. Efter 7 dages kultur skal du kigge efter LGSC-kugler, der er 100-300 μm diameter under det omvendte mikroskop (okular: 10x, mål: 4x).
      BEMÆRK: LGSC'er kan dyrkes i mere end 14 dage i alt.
  4. Isolat og dyrkning af primære LGSC'er af ROSA26mT/mG-mus og DED-mus (NOD/ShiLtJ) efter de trin, der er beskrevet ovenfor.

2. LGSC vedligeholdelse og passage

  1. Fjern kulturmediet fra kuglekulturen godt.
  2. LGSC-kuglerne, der dyrkes i 7 dage, opdeles ved inkubation i 20 μL 10 U/ml dispase og 100 μL 10 mM PBS i 30 minutter ved 37 °C.
  3. Ophængningen overføres til et 15 ml centrifugeglas, og centrifugen centrifugeres ved 150 × g i 4 min. Fjern supernatanten.
  4. Behandl kuglerne med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 °C. Tilsæt 1 ml 0,05% trypsinhæmmer (TI) og pipette gentagne gange for at neutralisere trypsin og dissociere kuglerne i enkeltceller.
  5. Centrifuger ved 150 × g i 5 minutter, og fjern supernatanten for at opnå LGSC'er i pelleten. Tilsæt 1 ml LGSCM for at genoplive LGSC-pelleten.
  6. Enkeltcellerne beplades som beskrevet i trin 1.3.1 til 1.3.6.

3. LGSC-differentiering

  1. Procedure 1: Udvid dyrkningstiden for LGSC'er fra 7 til 14 dage med LGSC-kultursystemet til tilfældig differentiering.
  2. Procedure 2: Skift forholdet mellem matrixgel-LGSCM-blandingen fra 1: 1 til 1: 2 i begyndelsen af LGSC-kulturen til differentiering af duktale celler. Frø LGSC'erne i matrixen til induktion i 14 dage (se trin 1.3).
  3. Procedure 3: Efter passage erstattes LGSCM med LGSCM-10% føtalt bovint serum (FBS) blanding til differentiering af acinarceller. Inducer differentiering i 14 dage.

4. DEHYDRERING AF LG-væv

  1. LG-væv (trin 1.1.1) udtages, og LG'erne skylles med 4 ml steril 10 ml PBS-opløsning i en skål på 6 cm i 2 minutter. Flyt vævene til 10% formalinopløsning til fiksering i 24 timer.
  2. Skyl det faste væv med 10 mM PBS i 2 minutter for at fjerne formalinet, og overfør vævet til en vævsindlejringsboks. Sæt indlejringsboksen i den automatiske dehydrator.
  3. Brug den automatiske dehydrator til at dehydrere vævene som følger: 70% ethanol, 2 timer; 80% ethanol, 2 timer; 90% ethanol, 30 minutter; 95% ethanol, 30 minutter; absolut ethanol, 30 minutter; absolut ethanol, 2 timer; absolut ethanol: 100% xylen (1: 1) blanding, 30 min; 100% xylen, 30 min; 100% xylen, 2 timer; 100% xylen: paraffin (1: 1) blanding, 30 min; paraffin, 2 timer; paraffin,3 timer.

5. LG organoid/kugle dehydrering

  1. Lg-organoider/kugler (trin 2.1-2.3) fås i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og LG-organoiderne/kuglerne skylles med 1 ml steril 10 ml PBS-opløsning i 2 min.
  2. Centrifuger ved 100 × g i 1 minut, og fjern supernatanten.
  3. 4% paraformaldehydopløsningen (PFA) fremstilles som følger: Der tilsættes 20 g PFA til en blanding af 400 ml 10 ml PBS og 40 μL 1 M NaOH, omryst opløsningen godt, og opvarm den i et 65 °C vandbad i 2 timer, indtil PFA er helt opløst. Efter afkøling til stuetemperatur skal du bruge 10 mM PBS til at gøre volumenet op til 500 ml og opbevare det ved 4 °C.
  4. Der tilsættes 1 ml 4 % PFA i mikrocentrifugerøret med organoid/kuglepellet, og røret anbringes i et køleskab ved 4 °C i mindst 24 timer til fiksering.
  5. Efter fiksering centrifugeres ved 100 × g i 1 minut og fjern supernatanten. Tilsæt 1 ml 10 ml PBS i mikrocentrifugerøret med organoid/kuglepellet og bland forsigtigt ved pipettering i 2 minutter for at skylle PFA af. Gentag dette trin to gange.
  6. Centrifuger ved 100 × g i 1 minut, og fjern supernatanten.
  7. Varmindlejringshydrogel for at opløse og tilsætte 50-60 μL indlejringshydrogel til organoid / kuglepellet og blandes. Pipetter blandingen på parafilmen i form af en dråbe og vent i 5 minutter på, at den størkner ved stuetemperatur.
  8. Dehydrere gelen med organoiderne/kuglerne i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør som følger.
    1. Tilsæt 1 ml 50% ethanol til røret, vent i 30 minutter ved stuetemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gentag dette trin ved at ændre ethanolkoncentrationen til 70%, 80%, 90%, 95% successivt.
    2. Tilsæt 1 ml absolut ethanol til røret, vent i 30 minutter ved stuetemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gentag dette trin.
    3. Tilsæt 1 ml af en blanding af 0,5 ml absolut ethanol og 0,5 ml 100% xylen til røret, vent i 30 minutter ved stuetemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering.
    4. Tilsæt 1 ml 100% xylen til røret, vent i 30 minutter ved stuetemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gentag dette trin.
      BEMÆRK: Trin 5.8.5-5.8.6 skal udføres i et metalbad ved 65 °C.
    5. Der tilsættes 1 ml af en blanding af 0,5 ml paraffin og 0,5 ml 100% xylen til røret, vent i 30 minutter ved 65 °C, og fjern væsken fra røret ved pipettering.
    6. Tilsæt 1 ml paraffin til røret, vent i 30 minutter ved 65 °C, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gentag dette trin, og forlæng behandlingstiden til 1 time.

6. Paraffinindlejring og sektionering

  1. Indlejring af paraffin
    1. Tænd indlejringsmaskinen inden indlejring og forvarm den for at smelte paraffinvoksen i paraffinbeholderen.
    2. Anbring det dehydrerede væv eller organoid/kuglegel i rillen på indlejringsjernsæsken, og sæt jernkassen i indlejringsmaskinens paraffin.
    3. Fjern plastlåget, og læg plastindlejringsboksen på jernkassen for at dække den. Flyt indlejringsjernskassen til et kølebord.
    4. Når paraffinen er kondenseret til blokke i indlejringsboksen, fjernes den fra jernkassen og skæres direkte i skiver eller opbevares midlertidigt i et køleskab med 4 °C.
  2. Paraffin sektionering
    1. Før paraffinskæring skal paraffinskiveren samles, og der tilsættes destilleret vand til skivens vask til forvarmning. Begynd at skære, når vandtemperaturen stiger til 42 °C.
    2. Prøven anbringes på paraffinskærerens prøveåbning. Sektionstykkelsen justeres til 5 μm under udskæring.
    3. Sektion prøven kontinuerligt. Fastgør den fuldt flisebelagte sektion på antislip-diaset i skæretanken.
    4. Efter sektionering anbringes lysbillederne med prøvevæv i en biokemisk inkubator ved 37 °C til tørring i 24 timer. Opbevar rutsjebanerne midlertidigt i køleskab ved 4 °C.

7. Hematoxylin og eosinfarvning

  1. Smelt paraffinsektionerne ved 60 °C i 30 min. blødgør sektionerne i 100% xylen i 15 min. og gentag.
  2. Behandl sektionerne med absolut ethanol på en shaker i 5 min.
  3. Behandl sektionerne med 90% ethanol, 80% ethanol og 70% ethanol på en shaker, hver i 3 minutter.
  4. Behandl sektionerne med deioniseret vand på en ryster i 5 min og 2 min successivt.
  5. Pletter sektionerne på en våd kasse i 5 minutter med 4 mg/ml hæmatoxylinopløsning. Skyl sektionerne i rindende vand i 10 min.
  6. Omrør sektionerne på en shaker først med deioniseret vand i 2 min og derefter med 0,5% -1% eosin i 1 min.
  7. Omrør sektionerne med 70% ethanol, 80% ethanol og 90% ethanol på en ryster i 3 minutter (hver) successivt. Omrør sektionerne med absolut ethanol på en ryster i 5 min.
  8. Blødgør sektionerne i 100% xylen i 15 minutter og gentag blødningen.
  9. Brug en pipette eller dråber til at tilføje 3-4 dråber neutral balsam til diaset, og dæk det langsomt med et dækglas. Lufttør gliderne ved stuetemperatur.

8. Immunohistokemisk (IHC) farvning

  1. Smelt paraffinsektionerne ved 60 °C i 30 min. blødgør sektionerne i 100% xylen i 10 min. og gentag dette trin to gange.
  2. Omrør sektionerne på en shaker først med absolut ethanol, 90% ethanol og 80% ethanol i 2 minutter (hver), successivt og derefter med deioniseret vand i 3 minutter. Gentag omrøringen med deioniseret vand to gange.
  3. Omrør sektionerne på en shaker først med en blanding af 20 ml 30% H2O2 og 180 ml methanol i 10 minutter og derefter deioniseret vand i 5 minutter. Gentag dette trin tre gange.
  4. Overfør sektionerne til forkogt citronsyrebuffer (1 L deioniseret vand med 3 g Na3C6H5O 7,2H2O og 0,4 g C6H8O7, pH 6,0), mikrobølgeovn i 10 minutter for at holde dem på subkritisk kogepunkt og afkøles ved stuetemperatur i 30 min. Omrør sektionerne med deioniseret vand på en ryster i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
  5. Omrør sektionerne med 10 mM PBS på en ryster i 5 minutter, og gentag dette trin tre gange. Omslut vævsområdet på vådboksen med en vandafvisende markør, tilsæt en dråbe brugsklart nonimmun gedeserum til at dække prøverne, og placer dem ved stuetemperatur i 1 time.
  6. Serummet fjernes, der tilsættes primært antistof til prøverne (se materialetabellen), og de inkuberes natten over ved 4 °C. Fjern det primære antistof, omrør sektionerne med 10 mM PBS på en ryster i 5 minutter, og gentag dette omrøringstrin med 10 mM PBS tre gange.
  7. Der tilsættes sekundært antistof (se materialetabellen) for at dække prøverne og inkubere dem på en våd kasse i 30 minutter ved stuetemperatur. Omrør sektionerne med 10 mM PBS på en ryster i 5 minutter, og gentag omrøringstrinnet tre gange.
  8. Der tilsættes frisklavet 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidinopløsning (DAB) for at dække prøverne på vådkassen og pletter i 30-90 s. Skyl sektionerne med rindende vand i 10 min.
    BEMÆRK: Kontroller farvningstiden ved at observere under et lysmikroskop, indtil gul farve vises.
  9. Tilsæt 4 mg/ml hæmatoxylinopløsning for at dække prøverne, pletter i 5 minutter på en våd kasse, og skyl sektionerne med rindende vand i 10 min.
  10. Omrør sektionerne på en shaker med 80% ethanol, 90% ethanol og absolut ethanol i 2 minutter hver successivt, og blød sektionerne i 100% xylen i 30 min.
  11. Brug en pipette eller dråber til at tilføje 3-4 dråber neutral balsam til diaset, og dæk det langsomt med et dækglas. Lufttør gliderne ved stuetemperatur.

9. Global immunfluorescensfarvning af organoider / kugler

BEMÆRK: Organoiderne/kuglerne, der er fastgjort med 4% PFA-opløsning, opsamles i et 1,5 ml mikrocentrifugerør (se trin 5.1 til 5.4). Udfør fluorescensmærkningen som følger.

  1. Organoiderne/kuglerne dehydreres ved tilsætning af 1 ml 30% saccharoseopløsning til røret og inkuberes natten over i køleskab ved 4 °C.
  2. Der tilsættes 100 μL PBST-opløsning (10 mM PBS-opløsning med 0,1 % Triton X-100) til røret for at skylle organoiderne/kuglerne i 5 min., røret centrifugeres ved 100 × g i 1 min., og pelleten opsamles. Gentag dette trin tre gange.
  3. Tilsæt 0,5-1 ml brugsklart nonimmun gedeserum til røret og forsegl det ved stuetemperatur i 1 time. Centrifuger røret ved 100 × g i 1 min og saml pelleten.
  4. Tilsæt flere dråber fortyndet primært antistof for blot at dække pelleten og inkuberes i køleskab ved 4 °C i 48 timer. Centrifuger røret ved 100 × g i 1 min og saml pelleten.
  5. Gentag trin 9.2.
  6. Tilsæt flere dråber af et fluorescerende sekundært antistof og 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) opløsning til røret for blot at dække pelleten og inkuberes i køleskab ved 4 ° C i 24 timer, undgå lys.
  7. Gentag trin 9.2, undgå lys.
  8. Der tilsættes 100 μL PBST-opløsning til røret, og det opbevares midlertidigt i et køleskab med 4 °C væk fra lyset. Observer og fotografer organoiderne / kuglerne ved hjælp af lysarkscanningsmikroskopet.

10. LGSC pLX-mCherry transfektion

BEMÆRK: Produktion af lentivirale partikler skal udføres i et biosikkerhedsskab og en ren bænk på BSL2 biosikkerhedsniveau.

  1. Lentivirusemballagecellen 293T dyrkes i en 6-brønds plade med DMEM + 10% FBS ved 37 °C, 5% CO2 i 3-5 dage for at nå 80% cellesammenløb.
  2. Transfektér lentivirusvektoren pLX-mCherry til LGSC'er.
    BEMÆRK: Reagensforberedelse er angivet for en brønd på en 6-brønds plade.
    1. Der fremstilles to sterile 1,5 ml centrifugerør, og der tilsættes 250 μL DMEM/F12 til hvert rør.
    2. Der tilsættes 7,5 μL transfektionsreagens til et rør, og reagenset blandes grundigt ved pipettering.
    3. Der tilsættes 2 μg pLX-mCherry plasmid uden endotoksin og matchende lentivirusemballageplasmid i et andet rør, og transfektionsreagenset (2 μL/μg plasmid) tilsættes.
    4. Bland væsken i begge centrifugerør og lad blandingerne stå i 5 min ved stuetemperatur.
    5. 293T-cellernes dyrkningsmedium fjernes, og blandingen tilsættes fra trin 10.2.4 til 293T-cellerne. Skift kulturmediet til frisk DMEM + 10% FBS efter 8 timer.
    6. Efter 48 timer opsamles virussupernatanten for første gang og filtreres gennem et 0,45 μm filter. Efter 72 timer opsamles virussupernatanten for anden gang og filtreres gennem et 0,45 μm filter igen.
      BEMÆRK: Opbevar begge filtrerede supernatanter på is indtil lentivirustransduktion.
  3. Hent LGSC'erne fra DED-mus (NOD/ShiLtJ) (se trin 1).
  4. Tilsæt 1 ml af det prækollektiverede pLX-mCherry lentivirus supernatant for at resuspendere cellerne.
  5. Centrifugerøret anbringes på en ryster i CO2 -inkubatoren ved 37 °C. Ryst det ved 100 o / min for at maksimere kontakten mellem lentivirus og cellerne. Efter 8 timer centrifugeres blandingen ved 250 × g i 4 minutter og supernatanten fjernes.
  6. Tilsæt 1 ml DMEM / F12 for at resuspendere cellepillen. Brug en celletæller til at bestemme celletallet og frø i alt 1 × 104 celler i 100 μL matrixgel-LGSCM-matrix (matrixgel: LGSCM = 1:1) i hver brønd af en 24-brøndplade, der er forlakeret med 20 μL matrixgel-LGSCM-matrix (se trin 1.3.2).
  7. Efter 7 dages dyrkning (se trin 1) skal du vælge kugler, der udviser rød fluorescens under et fluorescensmikroskop for at udvide kulturen.

11. LGSC ortopisk transplantation

BEMÆRK: Alle kirurgiske operationer udføres i en SPF-operationsstue, og alle kirurgiske instrumenter steriliseres.

  1. Få LGSC-kuglerne fra ROSA26mT/mG-mus med rød fluorescens (td-Tomat) eller mCherry-transfektion dyrket i 7 dage (se trin 1).
  2. Et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende en 1:1 blanding af matrixgel og DMEM/F12 afkøles på is før brug. Fordøje LGSC-kuglerne i enkeltceller og resuspend cellerne med en densitet på 2 × 106 celler / ml i røret.
  3. Bedøv NOD/ShiLtJ-musene ved intraperitoneal injektion af pentobarbital natrium (50 mg/kg).
    BEMÆRK: NOD / ShiLtJ mus er en ideel model med idiopatiske TILFØJEDE symptomer, herunder reduceret tåresekretion, inflammatorisk infiltration og orbital ulceration.
  4. Efter anæstesi skal du bruge saltvand eller dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, og brug derefter oftalmisk saks til at lave et 5-8 mm snit i huden bag øret (nær øjet) på de bedøvelsesmus for at udsætte LG'erne.
    BEMÆRK: Iodophor bør strengt anvendes til desinfektion omkring snittet.
  5. 2 × 104 celler sprøjtes ind i LG i venstre side, og blandingen uden celler (se trin 11.2) sprøjtes ind i LG's højre side som kontrol.
  6. Efter injektion skal LP'erne gendannes til deres oprindelige positioner med oftalmiske pincet og suturere såret. Foder musene i 2 måneder og observer effekten af behandlingen.
    BEMÆRK: Burpudematerialet skal også være strengt steriliseret efter operationen, og pudematerialet skal udskiftes en gang dagligt. Efter suturering af såret kan tramadol selektivt injiceres i halevenen på mus ved standarddosis på 2,5 mg/ kg for at opnå analgesi.
  7. Bedøv disse mus 2 måneder efter forsøget (se trin 11.3). Film symptomerne på den okulære region.
    1. Under anæstesi skal du kigge efter følgende symptomer: nakke- og lemmer muskelafslapning; dyb, langsom og stabil vejrtrækning; elev indsnævring; hornhinderefleks forsvinden.
    2. Under anæstesi og drift skal musens kropstemperatur holdes ved 37 °C. Efter operationen tilsættes passende antibiotika til drikkevandet til mus for at reducere risikoen for sårinfektion. Lad ikke musene være uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal liggende. Returner ikke musene, der har gennemgået kirurgi, til andre mus, før de er fuldt genoprettet.
    3. Når du har filmet symptomerne på det okulære område, skal du åbne softwaren ImageJ, klikke på File | Åbn | Frihåndsvalg, hold venstre museknap nede, og vælg området med orbital ulceration i billedet. Klik på Analyser | Mål for at opnå det relative område af sårdannelse.
  8. Sæt den phenolrøde bomuldstråd på den laterale canthus af bedøvelsesmus i 10 s; måle og registrere længden af den misfarvede del af bomuldstråden. Afliv musene ved dislokation af halshvirvlen efter tåremåling.
  9. Disseker musene og få LC'erne til IHC-analyse.

12. RNA-isolering

BEMÆRK: Før eksperimentet skal centrifugen forkøles til 4 °C, og det garanteres, at alle reagenser og forbrugsstoffer er fri for RNAse-forurening.

  1. Saml LGSC'er eller LG-fragmenter i et mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 ml cellelysisbuffer og lys cellerne eller vævene fuldt ud ved hvirveloscillation.
  2. Tilsæt 0,2 ml chloroform, og lad det stå ved stuetemperatur i 10 minutter efter hvirveloscillation i 1 min. Centrifuger i 15 minutter ved 4 °C, 12.000 × g.
    BEMÆRK: Efter centrifugering er væsken opdelt i tre lag, og RNA'et er i den øverste gennemsigtige vandige fase.
  3. Pipetter forsigtigt den øverste gennemsigtige vandige fase og overfør den til et nyt 1,5 ml RNAse-frit centrifugerør.
  4. Tilsæt et lige volumen isopropylalkohol og bland forsigtigt. Lad blandingen stå ved stuetemperatur i 10 minutter og centrifugeres derefter i 15 minutter ved 4 °C, 12.000 × g.
  5. Fjern supernatanten, og tilsæt 1 ml 75% ethanol. Vend røret om for at vaske pelleten og centrifugere i 5 minutter ved 4 °C, 7.500 × g. Gentag dette trin.
  6. Fjern supernatanten forsigtigt, og sæt centrifugerøret i det ultrarensende arbejdsbord for at tørre det i ca. 20 minutter.
    BEMÆRK: Fortsæt til næste trin, når den hvide pille bliver gennemskinnelig. Udfør alle operationer på is.
  7. Der tilsættes 20 μL RNAsefrit vand for at opløse pelleten fuldstændigt. Rna-koncentrationen måles ved hjælp af et spektrofotometer (se materialetabellen), og RNA-opløsningen opbevares ved -80 °C.

13. PCR

  1. Omvendt transkriptionsreaktion
    1. Der tilsættes 1 μg total RNA (beregn volumenet af tilsat RNA-opløsning i henhold til koncentrationen af RNA-opløsningen) i PCR-reaktionsrøret og inkuberes ved 65 °C i 5 min til denaturering.
    2. Læg det på is i 1 min og tilsæt derefter enzymfrit vand, indtil det samlede volumen når 12 μL. Tilsæt 4 μL 4x DNA Master Mix og inkuber det ved 37 ° C i 5 min.
    3. Læg røret på is, tilsæt 4 μL 5x RT Master Mix, og bland det forsigtigt. Indstil følgende PCR-indstillinger: 37 °C i 15 minutter, 50 °C i 5 minutter, 98 °C i 5 minutter, 4 °C i 1 minut.
    4. Opbevar det ved -20 °C, eller fortsæt til næste trin, når den omvendte transkriptionsreaktion er afsluttet.
  2. PCR-reaktion
    1. Forbered PCR-reaktionen i PCR-røret som følger: 14,1 μL enzymfrit vand, 2 μL dNTP, 2 μL 10x buffer, 0,8 μL primer (10 μM, 0,4 μL forward primer og 0,4 μL omvendt primer, se materialetabellen), 1 μL omvendt transkription cDNA (se trin 13.1) og 0,1 μL Taq-enzym.
    2. Anbring den forberedte PCR-reaktion i PCR-apparatet til PCR. Se instruktionerne i Taq-enzymsættet til PCR-proceduren (se materialetabellen).
  3. Agarose gel elektroforese
    1. Der anvendes en analysevægt til at veje 242 g Tris og 37,2 g Na2EDTA·2H2O, og de tilsættes til et 1 L bægerglas. Tilsæt ~ 800 ml deioniseret vand og 57,1 ml iseddikesyre til bægeret, bland godt, tilsæt deioniseret vand til 1 L for at opnå 50x TAE-buffer, og opbevar det ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Fortynd 50x TAE-buffer med deioniseret vand før brug.
    2. Der anvendes en analysevægt til at veje 1,2 g agarose, og den tilsættes til en konisk kolbe indeholdende 80 ml 1x TAE-buffer. Varm det gentagne gange i mikrobølgeovnen, indtil det er helt opløst.
    3. Kolben afkøles under rindende postevand, indtil opløsningens temperatur falder til 60 °C. Tilsæt 8 μL nukleinsyreplet, hæld opløsningen i gelatineringstanken efter blanding godt, læg kammen og lad den stå ved stuetemperatur i 30 minutter.
    4. Træk kammen ud og læg PCR-produkterne i den tilberedte agarosegel. Udfør elektroforese ved 120 V i 30 min.
    5. Anbring gelen i ECL Gel-billeddannelsessystemet, og foto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etabler 3D, serumfrit kultursystem
I denne undersøgelse blev LGSCM indeholdende EGF, Wnt3A, FGF10 og Y-27632 til LGSC'er til mus udviklet, og LGSC'er blev med succes isoleret og dyrket ved en 3D-dyrkningsmetode (figur 1A). Et vellykket 3D, serumfrit dyrkningssystem af LGSC'er fra C57BL/6-mus, NOD/ShiLtJ-mus, BALB/c-mus og ROSA26mT/mG-mus er blevet etableret ved hjælp af denne metode16. For en hanmus blev 1,5-2 × 106 celler opnået fra to LP'er ved dissociation. Efter en uges kultur blev der dannet 30-60 kugler ved såning af 1 × 104 LG-celler i begyndelsen af kulturen. Desuden udtrykte cellerne dyrket ved denne metode Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin og andre stamcellemarkører16, hvilket indikerer, at de opnåede celler havde egenskaberne af LGSC'er. Krt14 og Ki67 blev udtrykt i alle kugler dannet af LGSC'er dyrket i 7 dage (figur 1B), hvilket indikerer, at LGSC'erne havde selvfornyelseskapacitet.

I løbet af en 7-dages kultur nåede LGSC-kugler en diameter på 100 μm. Hematoxylin og eosin (H&E) farvning viste cellularitet på dag 7 (figur 1C og figur 1F). Berigelsesfaktorerne for LGSC'er opnået efter 7 dages primær kultur og subkultur indikerede, at LGSC'erne beriget med denne metode havde stærk proliferativ evne (figur 1D). I dette system kunne LGSC'er passeres over 40 gange, og de opretholdt stadig stamcelleegenskaber (figur 1E og figur 1G). Afslutningsvis beskriver dette papir en protokol til etablering af et 3D, serumfrit kultursystem for LGSC'er in vitro. Cellerne dyrket af denne protokol har kontinuerlig og stabil proliferativ evne.

Inducer differentiering in vitro
Differentieringskapaciteten for LGSC'er in vitro blev analyseret. Når de blev dyrket i mere end 7 dage, mistede LGSC'er gradvist vækstevnen, og ekspressionen af AQP5, Ltf, Krt19 og andre markører forbundet med differentiering steg, mens ekspressionen af Krt14 gradvist faldt16. LGSC'er blev induceret til at danne flere knopper af FBS og en lav andel af matrixgel (figur 2A, B). Desuden indikerede H&E-farvning, at FBS kunne få kuglerne til at producere mere kaviterende strukturer (figur 2C).

Det tidligere arbejde foreslog, at faldende matrixhårdhed fremmede differentieringen af LGSC'er i duktalelignende organoider. Basallagscellerne opretholdt egenskaberne ved stamceller, der udtrykte Krt14, mens de basale øvre lagceller differentierede sig i kanallignende strukturer med hulrum og udtrykte Krt19. Desuden kunne tilføjelsen af FBS fremkalde differentiering af LGSC'er i acinarlignende organoider, hvilket opretholdt egenskaberne ved stamceller med højt nukleart / cytoplasmatisk forhold. Nogle differentierede acinarlignende celler udtrykte høje niveauer af AQP5 med lavt nukleart / cytoplasmisk forhold16.

 Reparer LGSC'er  in vivo
Baseret på ovenstående eksperimenter blev LGSC'ernes evne til at reparere beskadigede LP'er undersøgt ved ortopisk injektion. Efter ortopisk injektion af ROSA-LGSC'er i NOD/ShiLtJ-mus blev der dannet nye lacrimale lobuler ved siden af LG'erne (figur 3A-C). De fleste af lobulerne var sammensat af modne acinarceller med høj ekspression af AQP5, og der var intralobulær kanaldannelse med lav AQP5-ekspression (figur 3D-F). Efter injektion af ROSA-LGSC'er i 8 uger blev henfaldet omkring modtagernes kredsløb målt. Målingerne viste, at injektionen af LGSC'er reducerede henfaldsområdet med ~ 60% (figur 3G, H). Dissektionen viste, at LG-volumenet steg efter injektion i 10 uger (figur 3I). Mængden af tåresekretion på ROSA-LGSC-injektionssiden var højere end på kontrolsiden, men lavere end hos vildtypemus (figur 3J). Disse resultater indikerer, at cellerne høstet af dette kultursystem har karakteristika for LGSC'er og kan bruges til stamcelleterapi hos mus med ADDED og xerophthalmia.

Figure 1
Figur 1: Isolering og karakterisering af LGSC'er. (A) Strategien for LGSC primær og kontinuerlig passagekultur. (B) Immunofluorescensfarvning af LGSC'er på dag 7. LGSC'er udtrykker epitelcellemarkør E-cadherin (rød), stamcellemarkør Krt14 (rød), proliferativ cellemarkør Ki67 (rød). Counterstain, DAPI (blå). (C) Morfologien af LGSC'er i kultur i 1, 3, 5 og 7 dage. (D) Relativ berigelsesfaktor for LGSC-kultur i primær kultur og subkultur. Relativ berigelsesfaktor er forholdet mellem det samlede antal celler opnået efter 7 dages kultur og antallet af celler podet i kultur. P < 0,01. (E) Transkription af voksne stam-/stamcellemarkører for musen LG og forskellige passage LGSC'er (P1, P10, P20 og P40). (F) Morfologien (venstre) og H&E-farvning (højre) af LGSC'er i primær kultur på dag 7. (G) LGSC'er dyrket i forskellige passager (P1, P10, P20 og P40). Skalastænger = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Forkortelser: LG = lacrimal kirtel; LGSC'er = LG stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; NC = negativ kontrol TE = trypsin-EDTA; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Differentiering af LGSC'er in vitro. (A,B) Morfologi af LGSC'er dyrket i normalt medium eller differentieringsmedium. (A) LGSC'er dyrket i 10 dage i P10 (venstre: normalt medium, højre: FBS-holdigt medium). (B) LGSC'er dyrket i 14 dage i P31 (venstre: normalt medium, højre: medium med 1/3rd matrix gel). (C) H&E-farvning af LGSC'er dyrket i 14 dage (øverst: normalt medium, nederst: FBS-holdigt medium). Skalastænger = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Forkortelser: LG = lacrimal kirtel; LGSC'er = LG stamceller; H&E = hæmatoxylin og eosin; FBS = føtalt bovint serum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Indpodning af LGSC-allotransplantation og lindring af TILFØJEDE symptomer. (A-F) IHC-farvning af NOD/ShiLtJ LG transplanteret med 7-dages kulturer af ROSA-LGSC'er efter 8 uger. Brug venstre og højre side af den samme mus som forsøgsgruppen og kontrolgruppen. (A-C) IHC-farvning med anti-td-tomatantistof; (D-F) IHC farvning med anti-AQP5 antistof; (A, D) LG injiceret med køretøj (1: 1 blanding af matrixgel og DMEM / F12), (B, E) LG injiceret med ROSA-LGSC'er, (C, F) de forstørrede billeder af de sorte firkanter i B, E (rød pil, intralobulær kanal). (G, H) Tilstanden af NOD/ShiLtJ musens øjenbane efter injektion af ROSA-LGSC'er efter 8 uger. Injektionen af LGSC'er lindrer signifikant forfaldet omkring øjets kredsløb. (I) LP'er for NOD/ShiLtJ-musen efter 10 uger (venstre: LG fra den celleindsprøjtede side, højre: LG fra kontrolsiden). (J) Dråbevolumen af vildtype- og NOD/ShiLtJ-mus transplanteret med 7-dages kulturer af ROSA-LGSC'er efter 8 uger. Rivvolumenet af ROSA-LGSC-injicerede LC'er er højere end kontrol-LP'ernes, men signifikant lavere end WT-LG'ernes. n = 3; NOD/ShiLtJ mus, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Skalastænger = 50 μm (A-F). Forkortelser: LG = lacrimal kirtel; LGSC'er = LG stamceller; IHC = immunohistokemisk; WT = vildtype; TILFØJET = vandig-mangelfuld tør øjensygdom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er veletablerede metoder til isolering og in vitro-dyrkning af lacrimal stamceller til lacrimal stamcellekultur og LG skade reparation. Shatos et al.17 og Ackermannet al. 6 succesfuldt dyrkede og subkulturerede lacrimale stamceller fra henholdsvis rotter og mus ved hjælp af henholdsvis 2D-dyrkningsmetoder, hvilket gør det muligt at transplantere lacrimale stamceller til behandling af ADDED. Undersøgelser af stamceller18 og mesenkymale stamceller19,20 af LP'er dyrket i 2D viste, at transplantationen af disse celler til en vis grad kunne lindre symptomerne på ADDED. Ved fluorescensaktiveret cellesortering, Gromovaet al. 2 udvalgte stamceller, der udtrykker LG-stamcellemarkører fra muse-LP'er og differentierede dem i kanaler og acini in vitro, med succes realiserede differentieringen af voksne stamceller i funktionelle celler af LC'er. Det blev også vist, at transplantation af et tilstrækkeligt antal stamceller kunne lindre TILFØJEDE symptomer hos mus.

For at imødekomme behovene for stamcelleberigelse og eliminere serumafhængighed i eksisterende lacrimal stamcellekulturmetoder blev det serumfrie kultursystem for lacrimale stamceller i denne protokol etableret baseret på tidligere offentliggjort forskning og organoid 3D-kulturteknologi21. Dette system forventes således at fremme klinisk forskning i lacrimale stamceller. I denne protokol omfatter de kritiske trin primær kultur, subkultur og udvidelse af LGSC'er og in situ-transplantation af LGSC'er til skadede LC'er hos mus.

Primær kultur er grundlaget for at opnå LGSC'er. Det er nødvendigt at opretholde sterile forhold under primær kultur. Brønden er forbelagt med matrix-gel for at undgå vedhængende vækst af celler i bunden af cellekulturbrønden. Ved anvendelse af matrix-gel er det nødvendigt at følge producentens anvisninger og altid holde det i flydende tilstand før tilsætning til brønden for at undgå matrix-geltab under eksperimentet og den ujævne matrix-gel i kulturen.

Antallet af podede celler i primær kultur er 10.000 celler / brønd. I praksis kan antallet af podede celler øges, hvis der sikres passende vækstrum og næringsstofforsyning af celler. Subkultur er et vigtigt skridt til at rense og berige stamceller. Efter passage dannede LGSC'er i P1-generation flere kugler, og der var flere P1-generationsceller end P0-generationen. Dette indikerer, at LGSC'er med proliferativ evne er blevet beriget i dette system.

Når LGSC'er blev dyrket i dette 3D-system over 10 dage, var 0,05% trypsin-EDTA undertiden ikke nok til fuldt ud at fordøje organoiderne i enkeltceller under passagen. Dette problem blev løst ved at forlænge fordøjelsestiden korrekt. På grund af den lille størrelse og det tynde og løse væv af LP'er i mus, går celler altid tabt fra injektionsstedet, hvis cellesuspensionen fremstilles i normal saltvand eller 10 mM PBS til injektion. Derfor anbefales det at blande cellesuspensionen med matrix-gel til injektion. Fordi matrix-gelen, der anvendes i dette system, størkner ved temperaturer over 10 ° C, kan celler kolonisere let, når de injiceres i LB'erne. Blandingen af celler og matrix-gel skal altid opbevares på is før injektion, og injektionen udføres hurtigt.

Ud over at isolere LGSC'er fra normale mus blev voksne LGSC'er fra ADDED-mus med succes isoleret og dyrket for første gang ved hjælp af denne protokol16. Dette system har dog stadig mangler og uløste problemer. For det første er den anvendte matrix-gel afledt af mus22,23, hvilket kan forårsage afvisningsreaktioner i menneskekroppen og derfor har begrænset klinisk anvendelighed. Det er nødvendigt at forbedre kultursystemet ved at finde passende syntetiske geler til at erstatte matrixgelen.

For det andet skal differentieringsstrategien i denne protokol forbedres. I stedet for at forlænge dyrkningstiden for differentiering21 eller tilføje serum i kulturmediet forventes tilføjelse af specifikke vækstfaktorer og ændring af specifikke miljøbetingelser for retningsbestemt induktion at give de ønskede resultater. Det er nødvendigt yderligere at undersøge mekanismen for vedligeholdelse og differentiering af LGSC'er ved at belyse de signalveje, der forårsager differentiering. Desuden har tidligere undersøgelser vist, at myoepitelceller dyrket in vitro også udtrykker stamcellegener, såsom Nestin, Musashi og Pax6, hvilket indikerer, at myoepitelceller også har stamcelleegenskaber17.

Denne undersøgelse var ikke opmærksom på myoepitelceller og verificerede derfor ikke, om myoepitelceller findes i LG-organoiderne ved at identificere specifikke ekspressionsmarkører for myoepitelceller. På grund af begrænsningen af kulturbetingelserne kunne myoepitelceller ikke induceres, eller at deres antal var for lille til at blive observeret. Dyrkningstiden kan forlænges for at observere, om organoiderne yderligere differentierer sig til myoepitelceller eller fokuserer på myoepitelceller i fremtidige undersøgelser af induktionsdifferentiering og systemforbedring.

Afslutningsvis giver denne protokol en metode til at studere LGSC'er til udvikling, reparation og regenerering af LC'er. Differentieringen af LGSC'er in vitro kan danne grundlag for fremtidig in vitro-regenerering af LGSC'er, mens LGSC'ers isolation og kultur kan løse problemet med afvisning i stamcellealttransplantation. Denne metode giver et vigtigt grundlag for klinisk individualiseret behandling af xerophthalmia med LGSC'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) og to programmer for Guangdong Science and Technology (2017B020230002 og 2016B030231001). Vi er virkelig taknemmelige for de forskere, der har hjulpet os under undersøgelsen og for de medarbejdere, der arbejder i dyrecentret for deres støtte i dyrepleje.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Tags

Biologi udgave 184
Tredimensionelt, serumfrit kultursystem til stamceller fra lacrimalkirtlen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter