Den tredimensionelle, serumfri dyrkningsmetode til voksne lacrimal kirtel (LG) stamceller er veletableret til induktion af LG organoiddannelse og differentiering i acinar eller duktallignende celler.
Lacrimal kirtel (LG) stamcellebaseret terapi er en lovende strategi for lacrimal kirtel sygdomme. Manglen på en pålidelig, serumfri dyrkningsmetode til opnåelse af et tilstrækkeligt antal LG-stamceller (LGSC’er) er imidlertid en hindring for yderligere forskning og anvendelse. Den tredimensionelle (3D), serumfri dyrkningsmetode til lgsc’er med voksne mus er veletableret og vist her. LGSC’erne kunne kontinuerligt passeres og induceres til at differentiere til acinar eller duktallignende celler.
For LGSC primærkulturen blev LP’erne fra 6-8 uger gamle mus fordøjet med dispase, collagenase I og trypsin-EDTA. I alt 1 × 104 enkeltceller blev podet i 80 μL matrix gel-lacrimal kirtel stamcelle medium (LGSCM) matrix i hver brønd af en 24-brønd plade, forbelagt med 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Blandingen blev størknet efter inkubation i 20 minutter ved 37 °C, og der blev tilsat 600 μL LGSCM.
Til LGSC-vedligeholdelse blev LGSC’er dyrket i 7 dage opdelt i enkeltceller ved dispase og trypsin-EDTA. Enkeltcellerne blev implanteret og dyrket i henhold til den metode, der blev anvendt i LGSC primærkulturen. LGSC’er kunne passeres over 40 gange og kontinuerligt udtrykke stam- / stamcellemarkører Krt14, Krt5, P63 og nestin. LGSC’er dyrket i LGSCM har selvfornyelseskapacitet og kan differentiere sig til acinar- eller duktallignende celler in vitro og in vivo.
Lacrimal kirtel stamceller (LGSC’er) opretholde lacrimal kirtel (LG) cellefornyelse og er kilden til acinar og duktal celler. Derfor betragtes LGSC-transplantation som en alternativ tilgang til behandling af alvorlig inflammatorisk skade og vandig-mangelfuld tør øjensygdom (TILFØJET)1,2,3. Tiwari et al. adskilte og dyrkede primære LG-celler ved hjælp af kollagen I og matrixgel suppleret med flere vækstfaktorer; LG-cellerne kunne dog ikke kontinuerligt dyrkes4. Ved hjælp af todimensionel (2D) kultur blev mus LG-afledte stamceller isoleret af You et al.5 og Ackermann et al. 6, fundet at udtrykke stam-/stamcellemarkørgenerne, Oct4, Sox2, Nanog og nestin, og kunne subkultureres. Der er imidlertid ingen klar indikation af, at disse celler kan differentiere sig til acinar- eller duktale celler, og der er ikke noget transplantationseksperiment for at verificere differentieringspotentialet in vivo.
For nylig blev c-kit + dim / EpCAM + / Sca1–/ CD34–/ CD45-celler isoleret fra muse-LP’er ved flowcytometri, fundet at udtrykke LG-stamcellemarkører, såsom Pax6 og Runx1, og differentieret i kanaler og acini in vitro. Hos mus med ADDED kan ortopisk injektion med disse celler reparere beskadigede LC’er og genoprette SEK’ernes sekretoriskefunktion. Antallet af stamceller isoleret ved denne metode var imidlertid lille, og der er ingen egnede kulturbetingelser for udvidelse af de isolerede LGSC’er. Sammenfattende skal der etableres et passende kultursystem til effektivt at isolere og dyrke voksne LGSC’er med stabil og kontinuerlig ekspansion til undersøgelse af LGSC’er i behandlingen af ADDED.
Organoider afledt af stamceller eller pluripotente stamceller er en gruppe celler, der histologisk ligner de beslægtede organer og kan opretholde deres egen fornyelse. Efter at musens tarmorganoid med succes blev dyrket af Sato et al. i 20097, blev organoider fra andre organer dyrket efter hinanden baseret på Satos kultursystem, såsom galdeblære8, lever9, bugspytkirtel10, mave11, bryst12, lunge13, prostata14 og spytkirtel15 . På grund af den høje andel af voksne stamceller før celledifferentiering i organoidkultur betragtes den tredimensionelle (3D) organoidkulturmetode som optimal til isolering og dyrkning af voksne stamceller fra LG.
Et LGSC-dyrkningssystem for voksne mus blev etableret i denne undersøgelse ved at optimere 3D, serumfri dyrkningsmetode. Det er bevist, at LGSC’erne dyrket fra både normale og TILFØJEDE mus viste en stabil kapacitet til selvfornyelse og spredning. Efter transplantation i ADDED-muse-LP’erne koloniserede LGSC’er de svækkede LC’er og forbedrede tåreproduktionen. Derudover blev røde fluorescerende LGSC’er isoleret fra ROSA26mT / mG mus og dyrket. Dette arbejde giver en pålidelig reference for LGSC berigelse in vitro og LGSC autograft i klinisk anvendelse til ADDED terapi.
Der er veletablerede metoder til isolering og in vitro-dyrkning af lacrimal stamceller til lacrimal stamcellekultur og LG skade reparation. Shatos et al.17 og Ackermannet al. 6 succesfuldt dyrkede og subkulturerede lacrimale stamceller fra henholdsvis rotter og mus ved hjælp af henholdsvis 2D-dyrkningsmetoder, hvilket gør det muligt at transplantere lacrimale stamceller til behandling af ADDED. Undersøgelser af stamceller18 og me…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) og to programmer for Guangdong Science and Technology (2017B020230002 og 2016B030231001). Vi er virkelig taknemmelige for de forskere, der har hjulpet os under undersøgelsen og for de medarbejdere, der arbejder i dyrecentret for deres støtte i dyrepleje.
Animal(Mouse) | |||
Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
Equipment | |||
Analytical balance | Sartorius | ||
Automatic dehydrator | Thermo | ||
Blood counting chamber | BLAU | ||
Cell Counter | CountStar | ||
CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
Frozen tissue slicer | Lecia | ||
Horizontal centrifuge | CENCE | ||
Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
Inverted microscope | Olympus | ||
Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
Liquid nitrogen container | Thermo | ||
Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
Micropipettor | Gilson | ||
Microwave oven | Panasonic | ||
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
Paraffin slicing machine | Thermo | ||
PCR Amplifier | Eppendorf | ||
pH value tester | Sartorius | ||
4 °C Refrigerator | Haier | ||
Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
-80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
-20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
Ultra pure water purification system | ELGA | ||
Reagent | |||
Animal Experiment | |||
HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
Cell Culture | |||
B27 | Gibco | 17504044 | |
Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
Dispase | BD | 354235 | |
DMEM | Sigma | D6429 | |
DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
NEAA | Gibco | 11140050 | |
N2 | Gibco | 17502048 | |
R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Y-27632 | Selleck | S1049 | |
HE staining & Immunostaining | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
DAPI | Thermo | 62248 | |
Eosin | BASO | 68115 | |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
RT-PCR & qRT-PCR | |||
Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
TRIzol | Magen | R4801-02 | |
Vector Construction & Cell Transfection | |||
Agar | OXID | – | |
Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
Trytone | OXID | – | |
Yeast Extract | OXID | – | |
Primers and Sequence | Company | ||
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
Vector | |||
pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |