Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

שיטת התרבית התלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת דמעה בוגרת (LG) מבוססת היטב על אינדוקציה של היווצרות והתמיינות של אורגנואידים LG לתאים דמויי אצינר או צינור.

Abstract

טיפול מבוסס תאי גזע בבלוטת הדמעות (LG) הוא אסטרטגיה מבטיחה למחלות בלוטות הדמעות. עם זאת, היעדרה של שיטת תרבית אמינה ונטולת סרום להשגת מספר מספיק של תאי גזע LG (LGSCs) הוא מכשול אחד למחקר ויישום נוספים. שיטת התרבות התלת-ממדית (התלת-ממדית) ללא סרום עבור LGSCs של עכברים בוגרים מבוססת היטב ומוצגת כאן. ניתן היה להעביר את ה-LGSCs באופן רציף ולגרום להם להתמיין לתאים דמויי אצינר או דמויי צינור.

עבור התרבות העיקרית של LGSC, LGs מעכברים בני 6-8 שבועות עוכלו עם דיספנס, קולגן I וטריפסין-EDTA. בסך הכל 1 × 104 תאים בודדים נזרעו לתוך 80 μL של מטריצה ג'ל-בלוטת דמעה של מטריצה בלוטת גזע בינונית (LGSCM) בכל באר של צלחת 24 בארות, מצופה מראש עם 20 μL של מטריצה ג'ל-LGSCM מטריצה. התערובת התמצקה לאחר הדגירה במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-600 μL של LGSCM נוספו.

לצורך תחזוקת LGSC, LGSCs בתרבית במשך 7 ימים פורקו לתאים בודדים על ידי פירוק וטריפסין-EDTA. התאים הבודדים הושתלו ותרבית על פי השיטה ששימשה בתרבית הראשונית של LGSC. LGSCs יכולים לעבור למעלה מ-40 פעמים ולבטא באופן רציף סמני תאי גזע/אב Krt14, Krt5, P63 ונסטין. LGSCs בתרבית LGSCM הם בעלי יכולת התחדשות עצמית ויכולים להתמיין לתאים דמויי אצינר או צינור במבחנה וב-in vivo.

Introduction

תאי גזע של בלוטת הדמעות (LGSCs) שומרים על התחדשות תאי בלוטת הדמעות (LG) והם המקור לתאי אצינר ותאים דוקטליים. לכן, השתלת LGSC נחשבת לגישה חלופית לטיפול בנזק דלקתי חמור ובמחלת עיניים יבשות עם מחסור מימי (ADDED)1,2,3. מספר שיטות תרבית יושמו כדי להעשיר את הלהט"בים. Tiwari et al. הפרידו ותרבית תאי LG ראשוניים בתרבית באמצעות קולגן I וג'ל מטריקס בתוספת מספר גורמי גדילה; עם זאת, תאי LG לא יכלו להיות בתרבית רציפה4. באמצעות תרבית דו-ממדית (דו-ממדית), תאי גזע שמקורם בעכבר LG בודדו על ידי You et al.5 ו-Ackermann et al. 6, שנמצא כמבטא את הגנים של סמן תאי גזע/אב, Oct4, Sox2, Nanog ו-nestin, וניתן היה לתת-תרבות. עם זאת, אין אינדיקציה ברורה לכך שתאים אלה יכולים להתמיין לתאי אצינר או צינור, ואין ניסוי השתלה כדי לאמת את פוטנציאל ההתמיינות in vivo.

לאחרונה, תאי c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- בודדו מתאי LGs של עכברים על ידי ציטומטריית זרימה, נמצאו כמבטאים סמני תאי אב LG, כגון Pax6 ו-Runx1, והתמיינו לתעלות ואצ'יני במבחנה. בעכברים עם ADDED, הזרקה אורתוטופית עם תאים אלה יכולה לתקן LGs פגומים ולשחזר את תפקוד ההפרשה של LGs2. עם זאת, מספר תאי הגזע שבודדו בשיטה זו היה קטן, ואין תנאי תרבית מתאימים להרחבת הלהט"בים המבודדים. לסיכום, יש להקים מערכת תרביות מתאימה כדי לבודד ולתרבות ביעילות LGSCs בוגרים עם התרחבות יציבה ומתמשכת לחקר LGSCs בטיפול ב- ADDED.

אורגנואידים המופקים מתאי גזע או מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם קבוצה של תאים הדומים מבחינה היסטולוגית לאיברים הקשורים ויכולים לשמור על התחדשות משלהם. לאחר שהאורגנואיד של מעי העכבר תרבית בהצלחה על ידי Sato et al. בשנת 20097, אורגנואידים מאיברים אחרים הועתקו ברצף, בהתבסס על מערכת התרבית של סאטו, כגון כיס המרה8, כבד9, לבלב10, קיבה11, שד12, ריאה13, ערמונית14 ובלוטת הרוק15 . בשל השיעור הגבוה של תאי גזע בוגרים לפני התמיינות תאים בתרבית אורגנואידים, שיטת תרבית האורגנואידים התלת-ממדית (3D) נחשבת אופטימלית לבידוד ולתרבית של תאי גזע בוגרים של LG.

מערכת תרבית LGSC של עכבר בוגר הוקמה במחקר הנוכחי על ידי אופטימיזציה של שיטת התרבות התלת-ממדית, ללא סרום. הוכח כי הלהט"בים שעברו תרבית הן מעכברים רגילים והן מעכברים שנוספו הראו יכולת יציבה של התחדשות עצמית והתפשטות. לאחר השתלה ב-LGs של העכברים הנוספו, LGSCs התיישבו ב-LGs הפגומים ושיפרו את ייצור הקרעים. בנוסף, LGSCs פלואורסצנטיים אדומים בודדו מעכברי ROSA26mT/mG ועברו תרבית. עבודה זו מספקת התייחסות אמינה להעשרת LGSC במבחנה ול- LGSC autograft ביישום קליני לטיפול נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בפרוטוקול זה פעלו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים של הוועדה האתית לניסוי בבעלי חיים של אוניברסיטת סון יאט-סן. כל הפעולות הקשורות לתאים יבוצעו על שולחן העבודה האולטרה-קליאני בחדר הניתוח של התא. כל הפעולות באמצעות קסילן אמורות להתבצע במנדפי אדים.

1. התרבות הראשונית של LGSC

  1. בידוד LG
    1. השיגו עכבר זכר BALB/c בן 6-8 שבועות, וחתכו את העור מאחורי האוזן כדי לחשוף את ה-LG ואת רקמת החיבור סביבו. מקלפים את רקמת החיבור על ידי כריתה קהה בעזרת פינצטה ומסירים את ה- LG.
    2. יש לשטוף את ה-LGs פעמיים עם 4 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית של 10 mM כדי להסיר דם בצלחת של 6 ס"מ. מטבלים את ה-LGs במנה של 6 ס"מ עם 4 מ"ל של 75% אתנול למשך 10 שניות ושוטפים עם 10 mM PBS פעמיים באופן מיידי.
  2. השג תאים בודדים של LG
    1. השתמש בתמיסת חיץ HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl במים אולטרה-אפורים) כדי להכין 25 U/mL dispase. הכינו את תמיסת ה-0.1% קולגן I עם מים אולטרה-פוריים.
    2. חותכים את ה-LGs לרסיסים קטנים (כ-1 מ"מ3), מעבירים אותם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל, ומטפלים ברקמות עם 500 μL של 25 U/mL dispase ו-500 μL של 0.1% collagenase I למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. השתמש ב- 10 mM PBS כדי להכין תמיסת טריפסין-EDTA (0.05 גרם / ל' טריפסין, 0.04 גרם / ל' EDTA). טפל בשברי LG משלב 1.2.2 עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ונתק את השברים לתאים בודדים על ידי צנרת שוב ושוב.
    4. מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 70 מיקרומטר, אוספים את התסיס לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 5 דקות.
    5. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט, הוסף 10 מ"ל של 10 mM PBS כדי לשטוף את גלולת התא, וצנטריפוגה את המתלים.
    6. חזור על שלב 1.2.5, הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 (תערובת 1:1 של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו ו- F-12 של Ham) כדי להחיות את כדורי התא.
  3. התרבות הראשונית של LGSC
    1. הכן את מדיום תאי הגזע של בלוטת הדמעות (LGSCM) המכיל DMEM/F12, תוסף N2 1x, תוסף B27 1x, תחליף גלוטמין 2 mM, 0.1 mM NEAAs (חומצות אמינו לא חיוניות), 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי מורין מורין (EGF), 100 ננוגרם/מ"ל פיברובלסט גורם גדילה 10 (FGF10), 10 ננוגרם/מ"ל Wnt3A ו-10 μM Y-27632 (מעכב ROCK).
    2. הוסף 20 μL של מטריצה ג'ל-LGSCM מטריצה (מטריצה ג'ל: LGSCM = 1:1) במרכז הבאר של צלחת 24 באר. השתמש בקצה פיפטה כדי להרחיב אותו לעיגול (קוטר 6-8 מ"מ) ולדגום את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעגל את הבאר.
    3. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא ולהוסיף 40 μL של LGSCM עם סך של 1 × 104 תאים לתוך 40 μL של ג'ל המטריצה. מערבבים אותם בעדינות עם פיפטה כדי לקבל תערובת מטריצה ג'ל-LGSCM (ג'ל מטריצה: LGSCM= 1:1).
    4. השתמשו בפיפטה כדי להפיל בזהירות 80 μL מהתערובת על פני האזור המצופה מראש בכל באר של צלחת 24 הבארות בשלב 1.3.2.
    5. דגירה של התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והוספת 600 μL של LGSCM.
    6. שנה את המדיום התרבותי בכל באר פעם ביומיים. לאחר 7 ימים של תרבית, חפשו כדורי LGSC בקוטר 100-300 מיקרומטר תחת המיקרוסקופ ההפוך (עינית: 10x, מטרה: 4x).
      הערה: LGSCs יכולים להיות מתורבתים במשך יותר מ -14 ימים בסך הכל.
  4. לבודד ולתרבות LGSCs ראשוניים של עכברי ROSA26mT/mG ועכברי DED (NOD/ShiLtJ) בעקבות השלבים שתוארו לעיל.

2. תחזוקה ומעבר של LGSC

  1. הסר היטב את המדיום התרבותי מתרבות התחום.
  2. לפרק את כדורי LGSC תרבית במשך 7 ימים על ידי דגירה ב 20 μL של 10 U / mL dispase ו 100 μL של 10 mM PBS במשך 30 דקות ב 37 ° C.
  3. מעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 4 דקות. הסר את ה-supernatant.
  4. טפל בכדורים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות ב 37 °C (74 °F). הוסיפו 1 מ"ל של מעכב טריפסין 0.05% (TI) ופיפטה שוב ושוב כדי לנטרל את הטריפסין ולנתק את הכדורים לתאים בודדים.
  5. צנטריפוגה ב 150 × g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant כדי לקבל LGSCs בכדור. הוסיפו 1 מ"ל של LGSCM כדי לבצע החייאה של גלולת LGSC.
  6. צלחת התאים הבודדים כמתואר בשלבים 1.3.1 עד 1.3.6.

3. בידול LGSC

  1. נוהל 1: הארכת זמן התרבות של LGSCs מ-7 ל-14 יום עם מערכת התרבות LGSC להבחנה אקראית.
  2. הליך 2: שנה את היחס בין תערובת המטריצה ג'ל-LGSCM מ-1:1 ל-1:2 בתחילת תרבית ה-LGSC לצורך התמיינות תאי צינור. זרעו את ה-LGSCs לתוך המטריצה לצורך אינדוקציה למשך 14 יום (עיין בשלב 1.3).
  3. הליך 3: לאחר המעבר, החליפו את ה-LGSCM בתערובת סרום בקר עוברי (FBS) LGSCM-10% לצורך התמיינות של תאים אסינאריים. לגרום להבחנה במשך 14 יום.

4. התייבשות רקמות LG

  1. להשיג רקמות LG (שלב 1.1.1) ולשטוף את LGs עם 4 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית 10 mM בצלחת 6 ס"מ במשך 2 דקות. העבירו את הרקמות לתמיסת פורמלין של 10% לקיבוע למשך 24 שעות.
  2. יש לשטוף את הרקמות הקבועות ב-10 mM PBS למשך 2 דקות כדי להסיר את הפורמלין, ולהעביר את הרקמה לתיבת הטבעת רקמות. שים את תיבת ההטבעה לתוך מייבש הכביסה האוטומטית.
  3. השתמש במתייבש האוטומטי כדי לייבש את הרקמות כדלקמן: 70% אתנול, 2 שעות; 80% אתנול, 2 שעות; 90% אתנול, 30 דקות; 95% אתנול, 30 דקות; אתנול מוחלט, 30 דקות; אתנול מוחלט, 2 שעות; אתנול מוחלט: 100% קסילן (1: 1) תערובת, 30 דקות; 100% קסילן, 30 דקות; 100% קסילן, 2 שעות; 100% קסילן: פרפין (1: 1) תערובת, 30 דקות; פרפין, 2 שעות; פרפין,3 ח.

5. התייבשות אורגנואידית/כדורית LG

  1. השג אורגנואידים/כדורים של LG (שלבים 2.1-2.3) בצינור מיקרוצנטריפוג' של 1.5 מ"ל ושטוף את האורגנואידים/כדורים של LG עם 1 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית של 10 mM למשך 2 דקות.
  2. צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
  3. הכן את הפתרון 4% paraformaldehyde (PFA) כדלקמן: להוסיף 20 גרם של PFA לתערובת של 400 מ"ל של 10 mM PBS ו 40 μL של 1 M NaOH, לנער את הפתרון היטב, ולחמם אותו באמבט מים 65 °C במשך 2 שעות עד PFA מומס לחלוטין. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, השתמש ב- 10 mM PBS כדי להגדיל את הנפח ל- 500 מ"ל ולאחסן אותו ב- 4 °C (76 °F).
  4. הוסיפו 1 מ"ל של 4% PFA לתוך צינור microcentrifuge עם הכדור האורגנואידי/כדורי והכניסו את הצינור למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לקיבוע.
  5. לאחר הקיבוע, צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של 10 mM PBS לתוך צינור microcentrifuge עם כדור האורגנואיד/כדור ומערבבים בעדינות על ידי צנרת למשך 2 דקות כדי לשטוף את ה-PFA. חזור על שלב זה פעמיים.
  6. צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
  7. מחממים את ההידרוג'ל להטבעה כדי להתמוסס ומוסיפים 50-60 μL של הטבעת הידרוג'ל לכדור האורגנואיד/כדור ולתערובת. מקטרים את התערובת על הפרפילם בצורה של טיפה ומחכים 5 דקות עד שהיא תתמצק בטמפרטורת החדר.
  8. ייבשו את הג'ל עם האורגנואידים/כדורים בצינור מיקרוצנטריפוג' חדש של 1.5 מ"ל באופן הבא.
    1. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אתנול לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה על ידי שינוי ריכוז האתנול ל-70%, 80%, 90%, 95% ברצף.
    2. מוסיפים 1 מ"ל של אתנול מוחלט לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה.
    3. מוסיפים 1 מ"ל של תערובת של 0.5 מ"ל של אתנול מוחלט ו-0.5 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת.
    4. מוסיפים 1 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה.
      הערה: שלבים 5.8.5-5.8.6 חייבים להתבצע באמבט מתכת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
    5. מוסיפים 1 מ"ל של תערובת של 0.5 מ"ל של פרפין ו-0.5 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת.
    6. מוסיפים 1 מ"ל של פרפין לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה והאריך את זמן העיבוד לשעה אחת.

6. הטבעה וחתך של פרפין

  1. הטמעת פרפין
    1. לפני ההטבעה, הפעילו את מכונת ההטבעה וחממו אותה מראש כדי להמיס את שעוות הפרפין במיכל הפרפין.
    2. מניחים את הרקמה המיובשת או את ג'ל האורגנואיד/כדור לתוך החריץ של קופסת הברזל המוטמעת, ומכניסים את קופסת הברזל לתוך הפרפין של מכונת ההטבעה.
    3. הסירו את מכסה הפלסטיק והניחו את קופסת ההטבעה מפלסטיק על קופסת הברזל כדי לכסות אותה. הזז את תיבת הברזל המוטמעת לשולחן קירור.
    4. לאחר שהפרפין התעבה לבלוקים בתיבת ההטבעה, הסר אותו מקופסת הברזל ופרוס אותו ישירות או אחסן אותו באופן זמני במקרר של 4 מעלות צלזיוס.
  2. חתך פרפין
    1. לפני חיתוך הפרפין, הרכיבו מראש את פרוסת הפרפין והוסיפו מים מזוקקים לכיור של החתך לחימום מקדים. התחילו לחתוך כאשר טמפרטורת המים עולה ל-42 מעלות צלזיוס.
    2. תקן את המדגם בחריץ המדגם של פרוסת הפרפין. התאם את עובי המקטע ל- 5 מיקרומטר במהלך החיתוך.
    3. חתך את המדגם ברציפות. תקן את החלק המרוצפת במלואה בשקופית האנטי-סליק במיכל הפריסה.
    4. לאחר החתך, מניחים את השקופיות המודבקות עם רקמת דגימה באינקובטור ביוכימי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך 24 שעות. אחסנו באופן זמני את השקופיות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

7. צביעת המטוקסילין ואוזין

  1. ממיסים את קטעי הפרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 15 דקות, וחוזרים על הפעולה.
  2. התייחסו לקטעים עם אתנול מוחלט על שייקר במשך 5 דקות.
  3. טפלו בקטעים עם 90% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול על שייקר, כל אחד למשך 3 דקות.
  4. טפלו בקטעים במים שעברו דה-יוניזציה על שייקר במשך 5 דקות ו-2 דקות ברצף.
  5. הכתימו את החלקים על קופסה רטובה למשך 5 דקות בתמיסת המטוקסילין במינון 4 מ"ג/מ"ל. שוטפים את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות.
  6. התסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם מים שעברו דה-יוניזציה למשך 2 דקות ולאחר מכן עם 0.5%-1% eosin למשך דקה אחת.
  7. התסיסו את הקטעים עם 70% אתנול, 80% אתנול ו-90% אתנול על שייקר במשך 3 דקות (כל אחד) ברצף. להתסיס את הקטעים עם אתנול מוחלט על שייקר במשך 5 דקות.
  8. משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 15 דקות וחוזרים על ההשריה.
  9. השתמשו בפיפטה או בטפטפת כדי להוסיף 3-4 טיפות של בלסם נייטרלי למגלשה, ולכסו אותה באיטיות בשקופית כיסוי. ייבשו את המגלשות באוויר בטמפרטורת החדר.

8. צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC)

  1. ממיסים את קטעי הפרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 10 דקות, וחוזרים על שלב זה פעמיים.
  2. התסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם אתנול מוחלט, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 2 דקות (כל אחד), ברצף, ולאחר מכן עם מים שעברו דה-יוניזציה למשך 3 דקות. חזור על התסיסה עם מים שעברו דה-יוניזציה פעמיים.
  3. תסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם תערובת של 20 מ"ל של 30% H2O2 ו-180 מ"ל של מתנול למשך 10 דקות ולאחר מכן הוציאו מים למשך 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  4. מעבירים את החלקים למאגר חומצה ציטרית מקודם (1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה עם 3 גרם של Na3C6H5O7.2H 2O ו-0.4 גרם C6H8O7, pH 6.0), מיקרוגל למשך 10 דקות כדי לשמור אותם בנקודת רתיחה תת-קריטית, וקירור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. התסיסו את הקטעים עם מים שעברו דה-יוניזציה על שייקר במשך 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  5. התסיסו את הקטעים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזרו על שלב זה שלוש פעמים. צרפו את אזור הרקמה בקופסה הרטובה בטוש דוחה מים, הוסיפו טיפה של סרום עזים לא מוכן לשימוש לכיסוי הדגימות, והניחו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  6. הסירו את הסרום, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לדגימות (ראו טבלת החומרים), והדגרו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הנוגדן העיקרי, התסיס את החלקים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזור על שלב התסיסה הזה עם 10 mM PBS שלוש פעמים.
  7. הוסיפו נוגדנים משניים (ראו טבלת החומרים) כדי לכסות את הדגימות ולדגום אותן על קופסה רטובה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התסיסו את הקטעים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזרו על שלב התסיסה שלוש פעמים.
  8. הוסיפו תמיסת 0.03-0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) שהוכנה טרייה כדי לכסות את הדגימות על הקופסה הרטובה ואת הכתם במשך 30-90 שניות. שטפו את החלקים במים זורמים במשך 10 דקות.
    הערה: שלוט בזמן ההכתמה על-ידי תצפית תחת מיקרוסקופ אור עד להופעת הצבע הצהוב.
  9. מוסיפים תמיסת המטוקסילין 4 מ"ג/מ"ל לכיסוי הדגימות, מכתימים למשך 5 דקות על קופסה רטובה ושוטפים את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות.
  10. התסיסו את הקטעים על שייקר עם 80% אתנול, 90% אתנול ואתנול מוחלט למשך 2 דקות כל אחד, ברצף, והשרו את החלקים ב-100% קסילן למשך 30 דקות.
  11. השתמשו בפיפטה או בטפטפת כדי להוסיף 3-4 טיפות של בלסם נייטרלי למגלשה, ולכסו אותה באיטיות בשקופית כיסוי. ייבשו את המגלשות באוויר בטמפרטורת החדר.

9. צביעה אימונופלואורסצנטית גלובלית של אורגנואידים/כדורים

הערה: אסוף את האורגנואידים/כדורים הקבועים בתמיסת PFA של 4% בצינור מיקרוצנטריפוג' של 1.5 מ"ל (ראו שלבים 5.1 עד 5.4). בצע את התיוג הפלואורסצנטי באופן הבא.

  1. לייבש את האורגנואידים/כדורים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% לצינור ולדגום אותו למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף 100 μL של תמיסת PBST (תמיסת 10 mM PBS עם 0.1% Triton X-100) לצינור כדי לשטוף את האורגנואידים / הכדורים במשך 5 דקות, צנטריפוגה של הצינור ב 100 × גרם למשך דקה אחת, ולאסוף את הכדור. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  3. הוסיפו 0.5-1 מ"ל של סרום עזים לא-אימוני מוכן לשימוש לצינור ואטמו אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. צנטריפוגה את הצינור ב 100 × g במשך דקה אחת ולאסוף את הכדור.
  4. הוסיפו מספר טיפות של נוגדן ראשוני מדולל כדי לכסות את הכדור ולדגום במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. צנטריפוגה הצינור ב 100 × גרם במשך דקה אחת ולאסוף את הכדור.
  5. חזור על שלב 9.2.
  6. הוסיפו מספר טיפות של נוגדן משני פלואורסצנטי ותמיסת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לצינור כדי פשוט לכסות את הכדור ולדגום במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, תוך הימנעות מאור.
  7. חזור על שלב 9.2, תוך הימנעות מאור.
  8. הוסיפו תמיסת PBST של 100 μL לצינור ואחסנו אותה באופן זמני במקרר של 4 מעלות צלזיוס, הרחק מהאור. צפו וצלמו את האורגנואידים/כדורים באמצעות מיקרוסקופ סריקת יריעות האור.

10. LGSC pLX-m צ'רי טרנספקציה

הערה: ייצור של חלקיקים lentiviral חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית וספסל נקי ברמת בטיחות ביולוגית BSL2.

  1. תרבית את תא האריזה של lentivirus 293T בצלחת של 6 בארות עם DMEM + 10% FBS ב-37 °C, 5% CO2 במשך 3-5 ימים כדי להגיע ל-80% מפגש תאים.
  2. תעבירו את וקטור ה-lentivirus pLX-mCherry ל-LGSCs.
    הערה: הכנת ריאגנטים מסומנת עבור באר אחת של צלחת 6 בארות.
    1. הכינו שני צינורות צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל והוסיפו 250 μL של DMEM/F12 לכל צינור.
    2. הוסיפו 7.5 μL של מגיב טרנספקציה לצינור אחד וערבבו את המגיב ביסודיות על ידי צנרת.
    3. הוסיפו 2 מיקרוגרם של פלסמיד pLX-mCherry ללא אנדוטוקסין והתאמת פלסמיד אריזת לנטי-וירוס לצינור אחר, והוסיפו את מגיב הטרנספקציה (2 μLL/μg של פלסמיד).
    4. ערבבו את הנוזל בשני צינורות הצנטריפוגה ותנו לתערובות לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הסר את מדיום התרבית של תאי 293T והוסף את התערובת משלב 10.2.4 לתאי 293T. שנה את מדיום התרבות ל- DMEM טרי + 10% FBS לאחר 8 שעות.
    6. לאחר 48 שעות, אספו את חומר העל של הנגיף בפעם הראשונה וסננו אותו דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. לאחר 72 שעות, אספו את חומר העל של הנגיף בפעם השנייה וסננו אותו שוב דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר.
      הערה: אחסן את שני הסופרנאטים המסוננים על קרח עד להתמרת נגיף הלנטי.
  3. השג את ה- LGSCs מעכברי DED (NOD / ShiLtJ) (ראה שלב 1).
  4. הוסיפו 1 מ"ל של ה-pLX-mCherry lentivirus supernatant המקדים כדי להחיות את התאים.
  5. הגדר את צינור הצנטריפוגה על שייקר בחממת CO2 ב -37 מעלות צלזיוס. מנענעים אותו ב-100 סל"ד כדי למקסם את המגע בין נגיף הלנטי לתאים. לאחר 8 שעות, צנטריפוגה התערובת ב 250 × גרם במשך 4 דקות ולהסיר את supernatant.
  6. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 כדי להחיות את גלולת התא. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא ולזרוע סך של 1 × 104 תאים לתוך 100 μL של מטריצת מטריצה ג'ל-LGSCM (מטריצה ג'ל: LGSCM = 1:1) בכל באר של צלחת בת 24 בארות מקושטת מראש עם 20 μL של מטריצת מטריצה ג'ל-LGSCM (ראה שלב 1.3.2).
  7. לאחר 7 ימים של תרבית (ראו שלב 1), בחרו כדורים המציגים פלואורסצנציה אדומה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להרחיב את התרבות.

11. השתלה אורתוטופית LGSC

הערה: כל הניתוחים מבוצעים בחדר ניתוח SPF, וכל כלי הניתוח מעוקרים.

  1. קבל את הכדורים של LGSC מעכברי ROSA26mT/mG עם פלואורסצנציה אדומה (td-Tomato) או טרנספקציה mCherry מתורבתת במשך 7 ימים (ראה שלב 1).
  2. יש לקרר שפופרת מיקרו-צנטריפוג' בגודל 1.5 מ"ל המכילה תערובת של 1:1 של ג'ל מטריקס ו-DMEM/F12 על קרח לפני השימוש. עיכלו את כדורי ה-LGSC לתאים בודדים ובצעו החייאה של התאים בצפיפות של 2 ×-106 תאים/מ"ל בצינור.
  3. מרדימים את עכברי ה-NOD/ShiLtJ על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטלי (50 מ"ג/ק"ג).
    הערה: עכבר NOD/ShiLtJ הוא מודל אידיאלי עם תסמיני ADDED אידיופטיים, כולל הפרשת דמעות מופחתת, חדירה דלקתית וכיב מסלולי.
  4. לאחר ההרדמה, השתמש במשחה מלוחה או במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש, ולאחר מכן השתמש במספריים עיניים כדי לבצע חתך של 5-8 מ"מ בעור מאחורי האוזן (ליד העין) של עכברי ההרדמה כדי לחשוף את LGs.
    הערה: יש להשתמש ביודופור אך ורק לחיטוי סביב החתך.
  5. הזריקו 2 × 104 תאים לתוך LG בצד שמאל והזיקו את התערובת ללא תאים (ראו שלב 11.2) לתוך LG בצד ימין כבקרה.
  6. לאחר ההזרקה, להחזיר את LGs למקומם המקורי עם מלקחיים עיניים ולתפור את הפצע. להאכיל את העכברים במשך 2 חודשים ולבחון את ההשפעה של הטיפול.
    הערה: חומר כרית הכלוב חייב גם להיות מעוקר בקפדנות לאחר הניתוח, ויש להחליף את חומר הכרית פעם ביום. לאחר תפירת הפצע, ניתן להזריק טרמדול באופן סלקטיבי לווריד הזנב של עכברים במינון הסטנדרטי של 2.5 מ"ג/ק"ג כדי להשיג משכך כאבים.
  7. הרדימו את העכברים האלה חודשיים לאחר הניסוי (ראו שלב 11.3). לצלם את הסימפטומים של אזור העין.
    1. במהלך ההרדמה, חפש את הסימפטומים הבאים: הרפיית שרירי הצוואר והגפיים; נשימה עמוקה, איטית ויציבה; צמצום התלמיד; היעלמות רפלקס הקרנית.
    2. במהלך ההרדמה והניתוח, שמור על טמפרטורת הגוף של עכברים ב 37 °C (74 °F). לאחר הניתוח, הוסיפו אנטיביוטיקה מתאימה למי השתייה לעכברים כדי להפחית את הסיכון לזיהום בפצעים. אל תשאירו את העכברים ללא השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה. אל תחזירו את העכברים שעברו ניתוח לחברתם של עכברים אחרים עד להחלמה מלאה.
    3. לאחר צילום הסימפטומים של אזור העין, פתח את תוכנת ImageJ, לחץ על קובץ | | פתוח בחירות ביד חופשית, החזק את לחצן העכבר השמאלי ובחר את אזור הכיב המסלולי בתמונה. לחץ על נתח | למדוד כדי לקבל את האזור היחסי של כיב.
  8. שים את חוט הכותנה האדום פנול על הקנטוס הצדדי של עכברי הרדמה במשך 10 שניות; למדוד ולתעד את אורך החלק הדהוי של חוט הכותנה. המתת חסד את העכברים על ידי נקע חוליות צוואר הרחם לאחר מדידת דמעות.
  9. לנתח את העכברים ולקבל את LGs לניתוח IHC.

12. בידוד RNA

הערה: לפני הניסוי, precool את הצנטריפוגה ל 4 °C ולהבטיח שכל הריאגנטים והמתכלים נקיים מזיהום RNAse.

  1. אסוף LGSCs או שברי LG בצינור microcentrifuge. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר ליזה של תאים ושחררו באופן מלא את התאים או הרקמות על ידי תנודת מערבולת.
  2. הוסיפו 0.2 מ"ל של כלורופורם, ותנו לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לאחר תנודת המערבולת למשך דקה אחת. צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, הנוזל מחולק לשלוש שכבות, והרנ"א נמצא בשלב מימי שקוף עליון.
  3. פשטו בזהירות את הפאזה המימית השקופה העליונה והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה חדש ללא RNAse במינון 1.5 מ"ל.
  4. מוסיפים נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל ומערבבים בעדינות. תנו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ואז צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם.
  5. הסר את ה-supernatant, והוסף 1 מ"ל של 75% אתנול. הפוך את הצינור כדי לשטוף את הכדור והצנטריפוגה במשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, 7,500 × גרם. חזור על שלב זה.
  6. הסר את הסופרנט בזהירות והכניס את צינור הצנטריפוגה לשולחן העבודה האולטרה-קליאני כדי לייבש אותו במשך כ -20 דקות.
    הערה: המשך לשלב הבא כאשר הכדור הלבן הופך להיות שקוף. בצע את כל הפעולות על הקרח.
  7. הוסיפו 20 μL של מים נטולי RNAse כדי להמיס את הכדור לחלוטין. מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר (ראה טבלת החומרים) ואחסן את תמיסת הרנ"א בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

13. PCR

  1. תגובת שעתוק הפוכה
    1. הוסף 1 מיקרוגרם של רנ"א כולל (חשב את נפח תמיסת הרנ"א הנוספת בהתאם לריכוז תמיסת הרנ"א) לתוך צינור תגובת ה- PCR ודגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לדנטורציה.
    2. שים אותו על קרח למשך דקה אחת ולאחר מכן הוסף מים ללא אנזימים עד שהנפח הכולל מגיע ל-12 μL. הוסף 4 μL של 4x DNA Master Mix ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הניחו את הצינור על קרח, הוסיפו 4 μL של 5x RT Master Mix וערבבו אותו בעדינות. הגדר את הגדרות ה- PCR הבאות: 37 ° C למשך 15 דקות, 50 ° C למשך 5 דקות, 98 ° C למשך 5 דקות, 4 ° C למשך דקה אחת.
    4. אחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או המשך לשלב הבא לאחר השלמת תגובת התמלול ההפוכה.
  2. תגובת PCR
    1. הכינו את תגובת ה-PCR בצינור ה-PCR באופן הבא: 14.1 μL של מים נטולי אנזימים, 2 μL של dNTP, 2 μL של 10x Buffer, 0.8 μL של פריימר (10 μM, 0.4 μL של פריימר קדמי ו-0.4 μL של פריימר הפוך, עיין בטבלת החומרים), 1 μL של cDNA שעתוק הפוך (עיין בשלב 13.1) ו-0.1 μL של אנזים Taq.
    2. מקם את תגובת ה- PCR המוכנה במנגנון ה- PCR עבור PCR. עיין בהוראות של ערכת האנזים Taq עבור הליך PCR (ראה טבלת החומרים).
  3. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
    1. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 242 גרם של Tris ו- 37.2 גרם של Na2EDTA·2H2O והוסף אותם לכוס 1 L. מוסיפים כ-800 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ו-57.1 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לכוס, מערבבים היטב, מוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה ל-1 ליטר כדי להשיג חיץ TAE של פי 50, ומאחסנים אותם בטמפרטורת החדר.
      הערה: דילול חיץ TAE 50x עם מים שעברו דה-יוניזציה לפני השימוש.
    2. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 1.2 גרם של אגרוז ולהוסיף אותו לבקבוקון חרוטי המכיל 80 מ"ל של 1x מאגר TAE. מחממים אותו שוב ושוב בתנור המיקרוגל עד שהוא מומס לחלוטין.
    3. מצננים את הבקבוקון תחת מי ברז זורמים עד שטמפרטורת התמיסה יורדת ל-60 מעלות צלזיוס. מוסיפים 8 μL של כתם חומצת גרעין, יוצקים את התמיסה למיכל הג'לטיניזציה לאחר ערבוב טוב, מניחים את המסרק ומניחים לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    4. שלפו את המסרק וטענו את מוצרי ה-PCR בג'ל האגרוז המוכן. בצע אלקטרופורזה ב 120 V במשך 30 דקות.
    5. הניחו את הג'ל במערכת ההדמיה ECL Gel ותצלמו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקמת מערכת תרביות תלת-ממדית, ללא סרום
במחקר זה פותח LGSCM המכיל EGF, Wnt3A, FGF10 ו-Y-27632 עבור LGSCs של עכברים, ו-LGSCs בודדו בהצלחה ותורבתו על ידי שיטת תרבית תלת-ממדית (איור 1A). מערכת תרבית תלת-ממדית מוצלחת ללא סרום של LGSCs מעכברי C57BL/6, עכברי NOD/ShiLtJ, עכברי BALB/c ועכברי ROSA26mT/mG הוקמה בשיטה זו16. עבור עכבר זכר, 1.5-2 × 106 תאים התקבלו משני LGs על ידי דיסוציאציה. לאחר שבוע אחד של תרבית, נוצרו 30-60 כדורים בעת זריעה של 1 × 104 תאי LG בתחילת התרבית. יתר על כן, התאים שעברו תרבית בשיטה זו ביטאו את Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin וסמנים אחרים של תאי גזע16, מה שמצביע על כך שלתאים שהתקבלו היו תכונות של LGSCs. Krt14 ו-Ki67 באו לידי ביטוי בכל הספירות שנוצרו על ידי LGSCs בתרבית במשך 7 ימים (איור 1B), מה שמצביע על כך של-LGSCs הייתה יכולת חידוש עצמי.

במהלך תרבות של 7 ימים, כדורי LGSCs הגיעו לקוטר של 100 מיקרומטר. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) הראתה את התאים ביום 7 (איור 1C ואיור 1F). גורמי ההעשרה של LGSCs שהושגו לאחר 7 ימים של תרבות ראשונית ותת-תרבות הצביעו על כך של-LGSCs שהועשרו בשיטה זו הייתה יכולת התפשטות חזקה (איור 1D). במערכת זו, LGSCs יכלו לעבור יותר מ-40 פעמים, והם עדיין שמרו על מאפייני תאי גזע (איור 1E ואיור 1G). לסיכום, מאמר זה מתאר פרוטוקול להקמת מערכת תרבית תלת-ממדית ללא סרום עבור LGSCs במבחנה. לתאים שעברו תרבית על ידי פרוטוקול זה יש יכולת התפשטות רציפה ויציבה.

לגרום להבחנה במבחנה
יכולת ההבחנה של LGSCs במבחנה נותחה. כאשר תרבית במשך יותר מ -7 ימים, LGSCs איבדו בהדרגה את יכולת הצמיחה, והביטוי של AQP5, Ltf, Krt19 וסמנים אחרים הקשורים להבחנה גדל, בעוד שהביטוי של Krt14 ירד בהדרגה16. LGSCs הונעו ליצור יותר ניצנים על ידי FBS ושיעור נמוך של ג'ל מטריצה (איור 2A,B). יתר על כן, צביעת H&E הצביעה על כך ש-FBS יכול לגרום לכדורים לייצר יותר מבנים מתקתקים (איור 2C).

העבודה הקודמת הציעה כי הפחתת קשיות המטריצה קידמה את ההבחנה של LGSCs לאורגנואידים דמויי צינורות. תאי השכבה הבסיסית שמרו על המאפיינים של תאי גזע המבטאים את Krt14, בעוד שתאי השכבה העליונה הבסיסית התמינו למבנים דמויי תעלות עם חללים וביטאו את Krt19. בנוסף, תוספת של FBS יכולה לגרום להתמיינות של LGSCs לאורגנואידים דמויי אסינאר, אשר שמרו על המאפיינים של תאי גזע עם יחס גרעיני/ציטופלסמי גבוה. חלק מהתאים דמויי האצינר הממוינים ביטאו רמות גבוהות של AQP5 עם יחס גרעיני/ציטופלסמי נמוך16.

 תיקון LGSCs  in vivo
בהתבסס על הניסויים הנ"ל, היכולת של LGSCs לתקן LGs פגומים נחקרה על ידי הזרקה אורתוטופית. לאחר הזרקה אורתוטופית של ROSA-LGSCs בעכברי NOD/ShiLtJ, נוצרו אונות דמעות חדשות בצמוד ל-LGs (איור 3A-C). רוב הלובולים היו מורכבים מתאי אצינר בוגרים עם ביטוי גבוה של AQP5, והייתה היווצרות תעלות אינטראוליות עם ביטוי AQP5 נמוך (איור 3D-F). לאחר הזרקת ROSA-LGSCs במשך 8 שבועות, נמדדה הדעיכה סביב מסלולם של המושתלים. המדידות הצביעו על כך שהזרקת LGSCs הפחיתה את שטח הריקבון בכ-60% (איור 3G, H). הניתוח הראה כי נפח ה-LG עלה לאחר ההזרקה במשך 10 שבועות (איור 3I). כמות הפרשת הדמעות בצד ההזרקה של ROSA-LGSCs הייתה גבוהה יותר מאשר בצד הבקרה, אך נמוכה יותר מאשר בעכברים מסוג בר (איור 3J). תוצאות אלה מצביעות על כך שהתאים שנקטפו על ידי מערכת תרביות זו הם בעלי מאפיינים של LGSCs וניתן להשתמש בהם לטיפול בתאי גזע בעכברים עם ADDED וזירופתלמיה.

Figure 1
איור 1: בידוד ואפיון של LGSCs. (A) האסטרטגיה של תרבות המעבר הראשונית והמתמשכת של LGSC. (B) צביעה אימונופלואורסצנטית של LGSCs ביום 7. LGSCs מבטאים את סמן תאי האפיתל E-cadherin (אדום), סמן תאי גזע Krt14 (אדום), סמן תאים שגשוג Ki67 (אדום). נגדי, DAPI (כחול). (C) המורפולוגיה של LGSCs בתרבות למשך 1, 3, 5 ו-7 ימים. (ד) גורם העשרה יחסי של תרבות LGSC בתרבות הראשונית ובתת-התרבות. גורם העשרה יחסי הוא היחס בין המספר הכולל של התאים המתקבלים לאחר 7 ימי תרבית למספר התאים שנזרעו בתרבית. עמ' < 0.01. (E) שעתוק של סמני תאי גזע/אב בוגרים של העכבר LG ומעברים שונים של LG (P1, P10, P20 ו-P40). (F) המורפולוגיה (משמאל) והכתמת H&E (מימין) של LGSCs בתרבות הראשונית ביום 7. (G) LGSCs מתורבתים בקטעים שונים (P1, P10, P20 ו-P40). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (B, F, G), 100 מיקרומטר (C). קיצורים: LG = בלוטת הדמעות; LGSCs = תאי גזע LG; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול;; NC = שליטה שלילית; TE = טריפסין-EDTA; H&E = המטוקסילין ואוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הבחנה של LGSCs במבחנה.(A,B) מורפולוגיה של LGSCs המתורבתים במדיום רגיל או במדיום הבחנה רגיל. (A) LGSCs תרבית במשך 10 ימים ב-P10 (משמאל: בינוני רגיל, מימין: מדיום המכיל FBS). (B) LGSCs תרבית במשך 14 יום ב-P31 (משמאל: בינוני רגיל, מימין: בינוני עם ג'למטריצה 1/3). (C) צביעת H&E של ה-LGSCs בתרבית במשך 14 יום (למעלה: בינוני נורמלי, למטה: מדיום המכיל FBS). סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A), 200 מיקרומטר (B), 50 מיקרומטר (C). קיצורים: LG = בלוטת הדמעות; LGSCs = תאי גזע LG; H&E = המטוקסילין ואוזין; FBS = סרום בקר עוברי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: השתלת ההקצאה של LGSCs והקלה על תסמינים נוספים. (A-F) צביעת IHC של NOD/ShiLtJ LG מושתלת בתרביות של 7 ימים של ROSA-LGSCs לאחר 8 שבועות. השתמש בצד שמאל וימני של אותו עכבר כמו קבוצת הניסוי וקבוצת הביקורת. (א-ג) צביעת IHC עם נוגדן נגד עגבניות td; (ד-ו) צביעת IHC בנוגדן נגד AQP5; (א, ד) LG מוזרק עם רכב (1:1 תערובת של ג'ל מטריקס ו- DMEM /F12), (B, E) LG מוזרק עם ROSA-LGSCs, (C, F) את התמונות המוגדלות של הריבועים השחורים ב- B, E (חץ אדום, צינור אינטראלובלרי). (ז, ח) מצבו של מסלול עין העכבר NOD/ShiLtJ לאחר הזרקת ROSA-LGSCs לאחר 8 שבועות. הזרקת LGSCs מקלה באופן משמעותי על הדעיכה סביב מסלול העין. (I) LGs של עכבר NOD/ShiLtJ ב-10 שבועות (משמאל: LG מהצד המוזרק לתא, מימין: LG מצד הבקרה). (J) נפח הדמעות של עכברי NOD/ShiLtJ מסוג בר ו-NOD/ShiLtJ שהושתלו בתרביות של 7 ימים של ROSA-LGSCs לאחר 8 שבועות. נפח הקרע של LGs המוזרקים ROSA-LGSC גבוה מזה של LGs הבקרה אך נמוך משמעותית מזה של LGs WT. n = 3; עכברי NOD/ShiLtJ, n = 4; עמ' < 0.01; *פ' < 0.05. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A-F). קיצורים: LG = בלוטת הדמעות; LGSCs = תאי גזע LG; IHC = אימונוהיסטוכימי; WT = סוג פראי; ADDED = מחלת עיניים יבשות עם מחסור מימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנן שיטות מבוססות היטב לבידוד ותרבית חוץ גופית של תאי גזע דמעתיים לתרבית תאי גזע דמעה ותיקון פציעת LG. Shatos et al.17 ו- Ackermannet al. 6 תאי גזע דמע תת-תרבותיים בתרבית ותת-תרבותית של חולדות ועכברים בהצלחה בשיטות תרבית דו-ממדיות, בהתאמה, מה שמאפשר להשתיל תאי גזע דמעות לטיפול ב-ADDED. מחקרים על תאי גזע18 ותאי גזע מזנכימליים 19,20 של LGs בתרבית בתרבית בדו-ממד הראו כי השתלה של תאים אלה יכולה להקל על הסימפטומים של ADDED במידה מסוימת. על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה, Gromovaet al. 2 תאי גזע נבחרים המבטאים סמנים של תאי אב LG מ-LGs של עכברים והתמיינו אותם לתעלות ואצ'יני במבחנה, תוך מימוש מוצלח של התמיינות תאי גזע בוגרים לתאים פונקציונליים של LGs. כמו כן, הודגם כי השתלה של מספר מספיק של תאי גזע יכולה להקל על תסמיני ADDED בעכברים.

כדי לענות על הצרכים של העשרת תאי גזע ולבטל את התלות בסרום בשיטות קיימות של תרביות תאי גזע דמעות, הוקמה מערכת תרביות נטולות סרום של תאי גזע דמעות בפרוטוקול זה על סמך מחקר שפורסם בעבר וטכנולוגיית תרבית תלת-ממדית אורגנואידית21. לפיכך, מערכת זו צפויה לקדם מחקר קליני על תאי גזע דמעות. בפרוטוקול זה, השלבים הקריטיים כוללים תרבות ראשונית, תת-תרבות והרחבה של LGSCs, והשתלה באתרה של LGSCs לתוך LGs פצועים בעכברים.

תרבות ראשונית היא הבסיס להשגת LGSCs. יש צורך לשמור על תנאים סטריליים במהלך התרבות הראשונית. הבאר מעוצבת מראש עם מטריצה-ג'ל כדי למנוע צמיחה דביקה של תאים בתחתית תרבית התאים היטב. בעת שימוש מטריצה-ג'ל, יש צורך לעקוב אחר הוראות היצרן, ותמיד לשמור אותו במצב נוזלי לפני תוספת לבאר כדי למנוע אובדן מטריצה-ג'ל במהלך הניסוי ואת מטריקס-ג'ל לא אחיד בתרבית.

מספר התאים הנזרעים בתרבית ראשונית הוא 10,000 תאים/באר. בפועל, ניתן להגדיל את מספר התאים שנזרעו אם מבטיחים מרחב גדילה מתאים ואספקת חומרים מזינים של תאים. תת-תרבות היא צעד חשוב לטיהור ולהעשרת תאי גזע. לאחר המעבר, LGSCs בדור P1 יצרו יותר כדורים, והיו יותר תאים מדור P1 מאשר דור P0. זה מצביע על כך ש- LGSCs עם יכולת התפשטות הועשרו במערכת זו.

כאשר LGSCs עברו תרבית במערכת תלת-ממדית זו במשך 10 ימים, 0.05% טריפסין-EDTA לעיתים לא הספיקו כדי לעכל באופן מלא את האורגנואידים לתאים בודדים במהלך המעבר. בעיה זו נפתרה על ידי הארכת זמן העיכול כראוי. טיפול בהזרקת in situ הוא הליך הכרחי כדי לאמת את הערך הקליני של LGSCs. בשל הגודל הקטן והרקמות הדקות והרופפות של LGs בעכברים, תאים תמיד הולכים לאיבוד ממקום ההזרקה אם תרחיף התא מוכן במי מלח רגילים או 10 mM PBS להזרקה. לכן, מומלץ לערבב את תרחיף התא עם מטריצה-ג'ל להזרקה. מכיוון שהמטריקס-ג'ל המשמש במערכת זו מתמצק בטמפרטורות מעל 10 מעלות צלזיוס, תאים יכולים להתיישב בקלות כאשר הם מוזרקים לתוך LGs. תערובת התאים והמטריקס-ג'ל חייבת תמיד להישמר על קרח לפני ההזרקה, וההזרקה מבוצעת במהירות.

בנוסף לבידוד LGSCs מעכברים רגילים, LGSCs בוגרים מעכברים שנוספו בהצלחה בודדו ותרבית בהצלחה בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה16. עם זאת, במערכת זו עדיין יש ליקויים ובעיות לא פתורות. ראשית, המטריקס-ג'ל שבו נעשה שימוש נגזר מעכברים22,23, מה שעלול לגרום לתגובות דחייה בגוף האדם, ולכן יש לו תחולה קלינית מוגבלת. יש צורך לשפר את מערכת התרבית על ידי מציאת ג'לים סינתטיים מתאימים כדי להחליף את ג'ל המטריצה.

שנית, יש לשפר את אסטרטגיית ההבחנה בפרוטוקול זה. במקום להאריך את זמן התרבית לבידול21 או להוסיף סרום במדיום התרבית, הוספת גורמי גדילה ספציפיים ושינוי תנאים סביבתיים ספציפיים להשראת כיוון צפויים לתת את התוצאות הרצויות. יש צורך להמשיך ולחקור את המנגנון של תחזוקה והבחנה של LGSCs על ידי הבהרת מסלולי האיתות הגורמים להבחנה. יתר על כן, מחקרים קודמים מצאו כי תאי מיואפיתל בתרבית במבחנה מבטאים גם גנים של תאי גזע, כגון Nestin, Musashi ו-Pax6, מה שמצביע על כך שלתאי מיופיתל יש גם מאפיינים של תאי גזע17.

מחקר זה לא הקדיש תשומת לב לתאי מיואפיתל, ולכן לא אימת אם תאים מיואפיתליאליים קיימים באורגנואידים של LG על ידי זיהוי סמני ביטוי ספציפיים של תאי מיופיתל. בשל מגבלת תנאי התרבית, לא ניתן היה לגרום לתאי מיואפיתל או שמספרם היה קטן מכדי שניתן יהיה לצפות בהם. ניתן להאריך את זמן התרבית כדי לבחון אם האורגנואידים מתמיינים עוד יותר לתאי מיואפיתל, או להתמקד בתאי מיואפיתל במחקרים עתידיים של התמיינות אינדוקציה ושיפור המערכת.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה לחקר LGSCs לפיתוח, תיקון והתחדשות של LGs. ההבחנה של LGSCs במבחנה יכולה להיות הבסיס להתחדשות עתידית במבחנה של LGs, בעוד שהבידוד והתרבית של LGSCs יכולים לפתור את בעיית הדחייה בהקצאת תאי גזע. שיטה זו מספקת בסיס חשוב לטיפול קליני מותאם אישית של xerophthalmia עם LGSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31871413) ושתי תוכניות של מדע וטכנולוגיה של גואנגדונג (2017B020230002 ו- 2016B030231001). אנו אסירי תודה לחוקרים שעזרו לנו במהלך המחקר ולאנשי הצוות העובדים במרכז לבעלי החיים על תמיכתם בטיפול בבעלי חיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Tags

ביולוגיה גיליון 184
מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter