Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale
Summary
Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l’induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.
Abstract
La terapia a base di cellule staminali della ghiandola lacrimale (LG) è una strategia promettente per le malattie della ghiandola lacrimale. Tuttavia, la mancanza di un metodo di coltura affidabile e privo di siero per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali LG (LGSC) è un ostacolo per ulteriori ricerche e applicazioni. Il metodo di coltura tridimensionale (3D), privo di siero per le LGSC di topo adulto è ben consolidato e mostrato qui. Le LGSC potrebbero essere continuamente passate e indotte a differenziarsi in cellule acinari o duttali.
Per la coltura primaria LGSC, gli LG di topi di 6-8 settimane sono stati digeriti con dispasi, collagenasi I e tripsina-EDTA. Un totale di 1 × 104 cellule singole sono state seminate in 80 μL di matrice di matrice di cellule staminali della ghiandola gel-lacrimale (LGSCM) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, preclusa con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice. La miscela è stata solidificata dopo l’incubazione per 20 minuti a 37 °C e sono stati aggiunti 600 μL di LGSCM.
Per il mantenimento della LGSC, le LGSC coltivate per 7 giorni sono state disaggregate in singole cellule mediante dispasi e tripsina-EDTA. Le singole cellule sono state impiantate e coltivate secondo il metodo utilizzato nella coltura primaria LGSC. Le LGSC potrebbero essere passate oltre 40 volte ed esprimere continuamente marcatori di cellule staminali/progenitrici Krt14, Krt5, P63 e nestin. Le LGSC coltivate in LGSCM hanno capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cellule acinari o duttali in vitro e in vivo.
Introduction
Le cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSC) mantengono il rinnovamento cellulare della ghiandola lacrimale (LG) e sono la fonte delle cellule acinari e duttali. Pertanto, il trapianto di LGSC è considerato un approccio alternativo per il trattamento di gravi danni infiammatori e malattia dell’occhio secco carente di acqua (ADDED)1,2,3. Diversi metodi di coltura sono stati applicati per arricchire le LGSC. Tiwari et al. hanno separato e coltivato cellule LG primarie utilizzando collagene I e gel di matrice integrato con diversi fattori di crescita; tuttavia, le cellule LG non potevano essere coltivate continuamente4. Utilizzando la coltura bidimensionale (2D), le cellule staminali derivate da LG di topo sono state isolate da You et al.5 e Ackermann et al. 6, trovato per esprimere i geni marcatori delle cellule staminali / progenitrici, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e potrebbe essere sottocoltato. Tuttavia, non vi è alcuna chiara indicazione che queste cellule possano differenziarsi in cellule acinari o duttali e non esiste un esperimento di trapianto per verificare il potenziale di differenziazione in vivo.
Recentemente, le cellule c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1–/CD34–/CD45– sono state isolate dagli LG di topo mediante citometria a flusso, hanno trovato per esprimere marcatori di cellule progenitrici LG, come Pax6 e Runx1, e differenziate in condotti e acini in vitro. Nei topi con ADDED, l’iniezione ortotopica con queste cellule potrebbe riparare gli LG danneggiati e ripristinare la funzione secretoria degli LG2. Tuttavia, il numero di cellule staminali isolate con questo metodo era piccolo e non ci sono condizioni di coltura adeguate per espandere le LGSC isolate. In sintesi, è necessario stabilire un sistema di coltura appropriato per isolare e coltivare efficacemente le LGSC adulte con un’espansione stabile e continua per lo studio delle LGSC nel trattamento dell’ADDED.
Gli organoidi derivati da cellule staminali o cellule staminali pluripotenti sono un gruppo di cellule che sono istologicamente simili agli organi correlati e possono mantenere il proprio rinnovamento. Dopo che l’organoide intestinale di topo è stato coltivato con successo da Sato et al. nel 20097, gli organoidi di altri organi sono stati coltivati in successione, sulla base del sistema di coltura di Sato, come la cistifellea8, il fegato9, il pancreas10, lo stomaco11, il seno12, il polmone13, la prostata14 e la ghiandola salivare15 . A causa dell’elevata percentuale di cellule staminali adulte prima della differenziazione cellulare in coltura di organoidi, il metodo di coltura organoide tridimensionale (3D) è considerato ottimale per l’isolamento e la coltura di cellule staminali adulte di LG.
Nel presente studio è stato istituito un sistema di coltura LGSC per topi adulti ottimizzando il metodo di coltura 3D senza siero. È dimostrato che le LGSC coltivate da topi sia normali che AGGIUNTI hanno mostrato una capacità stabile di auto-rinnovamento e proliferazione. Dopo il trapianto nei LG di topo AGGIUNTI, le LGSC hanno colonizzato i LG compromessi e migliorato la produzione di lacrime. Inoltre, le LGSC fluorescenti rosse sono state isolate da topi ROSA26mT/mG e coltivate. Questo lavoro fornisce un riferimento affidabile per l’arricchimento LGSC in vitro e l’autoinnesto LGSC in applicazione clinica per la terapia ADDED.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esistono metodi consolidati per l’isolamento e la coltura in vitro di cellule staminali lacrimali per la coltura di cellule staminali lacrimali e la riparazione delle lesioni LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 cellule staminali lacrimali coltivate e sottocoltate con successo di ratti e topi con metodi di coltura 2D, rispettivamente, rendendo possibile il trapianto di cellule staminali lacrimali per il trattamento di ADDED. Studi su cellule staminali<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 31871413) e da due programmi di scienza e tecnologia del Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Siamo davvero grati ai ricercatori che ci hanno aiutato durante lo studio e ai membri dello staff che lavorano nel centro animali per il loro supporto nella cura degli animali.
Materials
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | – | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | – | |
| Yeast Extract | OXID | – | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
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