Summary

Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l’induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.

Abstract

La terapia a base di cellule staminali della ghiandola lacrimale (LG) è una strategia promettente per le malattie della ghiandola lacrimale. Tuttavia, la mancanza di un metodo di coltura affidabile e privo di siero per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali LG (LGSC) è un ostacolo per ulteriori ricerche e applicazioni. Il metodo di coltura tridimensionale (3D), privo di siero per le LGSC di topo adulto è ben consolidato e mostrato qui. Le LGSC potrebbero essere continuamente passate e indotte a differenziarsi in cellule acinari o duttali.

Per la coltura primaria LGSC, gli LG di topi di 6-8 settimane sono stati digeriti con dispasi, collagenasi I e tripsina-EDTA. Un totale di 1 × 104 cellule singole sono state seminate in 80 μL di matrice di matrice di cellule staminali della ghiandola gel-lacrimale (LGSCM) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, preclusa con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice. La miscela è stata solidificata dopo l’incubazione per 20 minuti a 37 °C e sono stati aggiunti 600 μL di LGSCM.

Per il mantenimento della LGSC, le LGSC coltivate per 7 giorni sono state disaggregate in singole cellule mediante dispasi e tripsina-EDTA. Le singole cellule sono state impiantate e coltivate secondo il metodo utilizzato nella coltura primaria LGSC. Le LGSC potrebbero essere passate oltre 40 volte ed esprimere continuamente marcatori di cellule staminali/progenitrici Krt14, Krt5, P63 e nestin. Le LGSC coltivate in LGSCM hanno capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cellule acinari o duttali in vitro e in vivo.

Introduction

Le cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSC) mantengono il rinnovamento cellulare della ghiandola lacrimale (LG) e sono la fonte delle cellule acinari e duttali. Pertanto, il trapianto di LGSC è considerato un approccio alternativo per il trattamento di gravi danni infiammatori e malattia dell’occhio secco carente di acqua (ADDED)1,2,3. Diversi metodi di coltura sono stati applicati per arricchire le LGSC. Tiwari et al. hanno separato e coltivato cellule LG primarie utilizzando collagene I e gel di matrice integrato con diversi fattori di crescita; tuttavia, le cellule LG non potevano essere coltivate continuamente4. Utilizzando la coltura bidimensionale (2D), le cellule staminali derivate da LG di topo sono state isolate da You et al.5 e Ackermann et al. 6, trovato per esprimere i geni marcatori delle cellule staminali / progenitrici, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e potrebbe essere sottocoltato. Tuttavia, non vi è alcuna chiara indicazione che queste cellule possano differenziarsi in cellule acinari o duttali e non esiste un esperimento di trapianto per verificare il potenziale di differenziazione in vivo.

Recentemente, le cellule c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1/CD34/CD45 sono state isolate dagli LG di topo mediante citometria a flusso, hanno trovato per esprimere marcatori di cellule progenitrici LG, come Pax6 e Runx1, e differenziate in condotti e acini in vitro. Nei topi con ADDED, l’iniezione ortotopica con queste cellule potrebbe riparare gli LG danneggiati e ripristinare la funzione secretoria degli LG2. Tuttavia, il numero di cellule staminali isolate con questo metodo era piccolo e non ci sono condizioni di coltura adeguate per espandere le LGSC isolate. In sintesi, è necessario stabilire un sistema di coltura appropriato per isolare e coltivare efficacemente le LGSC adulte con un’espansione stabile e continua per lo studio delle LGSC nel trattamento dell’ADDED.

Gli organoidi derivati da cellule staminali o cellule staminali pluripotenti sono un gruppo di cellule che sono istologicamente simili agli organi correlati e possono mantenere il proprio rinnovamento. Dopo che l’organoide intestinale di topo è stato coltivato con successo da Sato et al. nel 20097, gli organoidi di altri organi sono stati coltivati in successione, sulla base del sistema di coltura di Sato, come la cistifellea8, il fegato9, il pancreas10, lo stomaco11, il seno12, il polmone13, la prostata14 e la ghiandola salivare15 . A causa dell’elevata percentuale di cellule staminali adulte prima della differenziazione cellulare in coltura di organoidi, il metodo di coltura organoide tridimensionale (3D) è considerato ottimale per l’isolamento e la coltura di cellule staminali adulte di LG.

Nel presente studio è stato istituito un sistema di coltura LGSC per topi adulti ottimizzando il metodo di coltura 3D senza siero. È dimostrato che le LGSC coltivate da topi sia normali che AGGIUNTI hanno mostrato una capacità stabile di auto-rinnovamento e proliferazione. Dopo il trapianto nei LG di topo AGGIUNTI, le LGSC hanno colonizzato i LG compromessi e migliorato la produzione di lacrime. Inoltre, le LGSC fluorescenti rosse sono state isolate da topi ROSA26mT/mG e coltivate. Questo lavoro fornisce un riferimento affidabile per l’arricchimento LGSC in vitro e l’autoinnesto LGSC in applicazione clinica per la terapia ADDED.

Protocol

Tutti gli esperimenti in questo protocollo hanno seguito le linee guida per la cura degli animali del Comitato etico sulla sperimentazione animale della Sun Yat-sen University. Tutte le operazioni relative alle celle devono essere eseguite sul banco di lavoro ultrapulito nella sala operatoria della cella. Tutte le operazioni con xilene devono essere effettuate in cappe aspiranti. 1. Cultura primaria LGSC Isolamento LG Procurati un topo maschio BALB/c di 6-8 s…

Representative Results

Stabilire un sistema di coltura 3D privo di sieroIn questo studio, È stato sviluppato LGSCM contenente EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 per LGSC di topo e le LGSC sono state isolate e coltivate con successo con un metodo di coltura 3D (Figura 1A). Un sistema di coltura 3D 3D privo di siero di successo di LGSC da topi C57BL / 6, topi NOD / ShiLtJ, topi BALB / c e topi ROSA26mT / mG è stato stabilito utilizzando questo metodo16. Per un topo …

Discussion

Esistono metodi consolidati per l’isolamento e la coltura in vitro di cellule staminali lacrimali per la coltura di cellule staminali lacrimali e la riparazione delle lesioni LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 cellule staminali lacrimali coltivate e sottocoltate con successo di ratti e topi con metodi di coltura 2D, rispettivamente, rendendo possibile il trapianto di cellule staminali lacrimali per il trattamento di ADDED. Studi su cellule staminali<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 31871413) e da due programmi di scienza e tecnologia del Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Siamo davvero grati ai ricercatori che ci hanno aiutato durante lo studio e ai membri dello staff che lavorano nel centro animali per il loro supporto nella cura degli animali.

Materials

Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID
Yeast Extract OXID
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC
Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG
Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC
Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC
Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT
Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA
Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT
Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC
Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

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Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

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