Summary
Den tredimensjonale, serumfrie kulturmetoden for voksne lacrimal kjertel (LG) stamceller er godt etablert for induksjon av LG organoiddannelse og differensiering i acinar eller ductal-lignende celler.
Abstract
Lacrimal kjertel (LG) stamcellebasert terapi er en lovende strategi for lacrimal kjertelsykdommer. Mangelen på en pålitelig, serumfri kulturmetode for å oppnå et tilstrekkelig antall LG stamceller (LGSCs) er imidlertid et hinder for videre forskning og anvendelse. Den tredimensjonale (3D), serumfrie kulturmetoden for voksenmus LGSC-er er godt etablert og vist her. LGSC-ene kan kontinuerlig overføres og induseres for å skille mellom acinar- eller kanallignende celler.
For LGSC primærkultur ble LGs fra 6-8 uker gamle mus fordøyd med dispase, kollagenaliser I og trypsin-EDTA. Totalt 1 × 104 enkeltceller ble sådd i 80 μL matrise gel-lacrimal kjertel stamcelle medium (LGSCM) matrise i hver brønn av en 24-brønns plate, forhåndslakkert med 20 μL matrise gel-LGSCM matrise. Blandingen ble størknet etter inkubasjon i 20 min ved 37 °C, og 600 μL LGSCM tilsatt.
For LGSC-vedlikehold ble LGSC-er dyrket i 7 dager disaggregatert i enkeltceller ved dispase og trypsin-EDTA. Enkeltcellene ble implantert og dyrket i henhold til metoden som ble brukt i LGSC primærkulturen. LGSCer kan passeres over 40 ganger og kontinuerlig uttrykke stamcellemarkører Krt14, Krt5, P63 og nestin. LGSCer dyrket i LGSCM har selvfornyelseskapasitet og kan skille seg ut i acinar eller kanallignende celler in vitro og in vivo.
Introduction
Lacrimal kjertel stamceller (LGSCs) opprettholde lacrimal kjertel (LG) celle fornyelse og er kilden til acinar og ductal celler. Derfor anses LGSC-transplantasjon som en alternativ tilnærming for behandling av alvorlig inflammatorisk skade og vandig mangelfull tørrøyesykdom (ADDED)1,2,3. Flere kulturmetoder har blitt brukt for å berike LGSCs. Tiwari et al. separerte og kultiverte primære LG-celler ved hjelp av kollagen I og matrisegel supplert med flere vekstfaktorer; LG-cellene kunne imidlertid ikke kontinuerlig dyrkes4. Ved hjelp av todimensjonal (2D) kultur ble mus LG-avledede stamceller isolert av You et al.5 og Ackermann et al. 6, funnet å uttrykke stamcellemarkørgenene, Oct4, Sox2, Nanog og nestin, og kan subkultureres. Det er imidlertid ingen klar indikasjon på at disse cellene kan skille seg ut i acinar- eller kanalceller, og det er ikke noe transplantasjonseksperiment for å verifisere differensieringspotensialet in vivo.
Nylig ble c-kit + dim / EpCAM + / Sca1 - / CD34 - / CD45 - celler isolert fra musen LGs ved flow cytometri, funnet å uttrykke LG stamcellemarkører, for eksempel Pax6 og Runx1, og differensiert i kanaler og acini in vitro. Hos mus med ADDED kan ortotopisk injeksjon med disse cellene reparere skadede LG-er og gjenopprette sekretorisk funksjon av LG2. Imidlertid var antall stamceller isolert av denne metoden liten, og det er ingen egnede kulturforhold for å utvide de isolerte LGSCene. Oppsummert må det etableres et passende kultursystem for effektivt å isolere og dyrke voksne LGSC-er med stabil og kontinuerlig utvidelse for studiet av LGSCer i behandlingen av ADDED.
Organoider avledet fra stamceller eller pluripotente stamceller er en gruppe celler som er histologisk lik de relaterte organene og kan opprettholde sin egen fornyelse. Etter at musens tarmorganoid ble vellykket dyrket av Sato et al. i 20097, ble organoider fra andre organer dyrket etter hverandre, basert på Satos kultursystem, som galleblæren8,leveren 9, bukspyttkjertelen10, mage11, bryst12, lunge13, prostata14 og spyttkjertel15 . På grunn av den høye andelen voksne stamceller før celledifferensiering i organoidkultur, anses den tredimensjonale (3D) organoidkulturmetoden som optimal for isolasjon og kultur av voksne stamceller i LG.
En voksen mus LGSC kultursystem ble etablert i den nåværende studien ved å optimalisere 3D, serumfri kulturmetode. Det er bevist at LGSC-ene dyrket fra både normale og ekstra mus viste en stabil kapasitet til selvfornyelse og spredning. Etter transplantasjon i ekstra muse-LG-ene koloniserte LGSCene de svekkede LG-ene og forbedret tåreproduksjon. I tillegg ble røde fluorescerende LGSCer isolert fra ROSA26mT / mG-mus og dyrket. Dette arbeidet gir en pålitelig referanse for LGSC berikelse in vitro og LGSC autograft i klinisk søknad om ADDED terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene i denne protokollen fulgte retningslinjene for dyrepleie i Den etiske komitéen for dyreforsøk ved Sun Yat-sen University. Alle cellerelaterte operasjoner skal utføres på den ultraclean arbeidsbenken i celleoperasjonsrommet. Alle operasjoner med xylen skal utføres i avtrekkshetter.
1. LGSC primærkultur
- LG-isolasjon
- Få en 6-8 uker gammel BALB / c mannlig mus, og kutt huden bak øret for å eksponere LG og bindevevet rundt den. Skrell av bindevevet ved stump disseksjon ved hjelp av pinsett og fjern LG.
- Skyll LG-ene to ganger med 4 ml steril 10 mM PBS-oppløsning for å fjerne blod i en 6 cm tallerken. Senk LG-ene i en 6 cm tallerken med 4 ml 75 % etanol i 10 s og skyll med 10 mM PBS to ganger umiddelbart.
- Få tak i enkeltceller av LG
- Bruk HEPES bufferløsning (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl i ultrarent vann) for å forberede 25 U/ml dispase. Forbered 0,1% kollagenaliser I-løsningen med ultrarent vann.
- Klipp LG-ene i små fragmenter (ca. 1 mm3), overfør dem til et sterilt 15 ml sentrifugerør, og behandle vevet med 500 μL 25 U/ml dispase og 500 μL 0,1% kollagase I i 1 time ved 37 °C.
- Bruk 10 mM PBS til å klargjøre trypsin-EDTA-oppløsning (0,05 g/l trypsin, 0,04 g/l EDTA). Behandle LG-fragmentene fra trinn 1.2.2 med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i 10 min ved 37 °C og fjern fragmentene i enkeltceller ved å pipettere gjentatte ganger.
- Filtrer suspensjonen gjennom et 70 μm filter, samle filtratet i et sterilt 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 150 × g i 5 minutter.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten, tilsett 10 ml 10 mM PBS for å vaske cellepelleten og sentrifuger suspensjonen.
- Gjenta trinn 1.2.5, fjern supernatanten og tilsett 1 ml DMEM/F12 (1:1-blanding av Dulbeccos modifiserte Eagles medium og Hams F-12) for å resuspendere cellepellets.
- LGSC primærkultur
- Forbered lacrimal kjertel stamcelle medium (LGSCM) som inneholder DMEM / F12, 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 2 mM glutaminerstatning, 0,1 mM NEAAer (unødvendige aminosyrer), 50 ng/ml murin epidermal vekstfaktor (EGF), 100 ng/ml fibroblast vekstfaktor 10 (FGF10), 10 ng/ml Wnt3A og 10 μM Y-27632 (ROCK-hemmer).
- Tilsett 20 μL matrise gel-LGSCM matrise (matrisegel: LGSCM = 1:1) i midten av brønnen på en 24-brønns plate. Bruk en pipettespiss til å utvide den til en sirkel (6-8 mm diameter) og inkuber blandingen i 20 min ved 37 °C for å precoat brønnen.
- Bruk en celleteller til å bestemme cellenummeret og tilsett 40 μL LGSCM med totalt 1 × 104 celler i 40 μL av matrisegelen. Bland dem forsiktig med en pipette for å få en matrisegel-LGSCM-blanding (matrisegel: LGSCM = 1:1).
- Bruk en pipette til forsiktig å slippe 80 μL av blandingen over det forhåndsbelagte området i hver brønn på 24-brønnsplaten i trinn 1.3.2.
- Inkuber blandingen i 20 min ved 37 °C og tilsett 600 μL LGSCM.
- Endre kulturmediet i hver brønn en gang annenhver dag. Etter 7 dager med kultur, se etter LGSC-sfærer som er 100-300 μm diameter under det omvendte mikroskopet (okular: 10x, mål: 4x).
MERK: LGSCer kan dyrkes i mer enn 14 dager totalt.
- Isoler og kultur primære LGSCer av ROSA26mT / mG mus og DED mus (NOD / ShiLtJ) ved å følge trinnene beskrevet ovenfor.
2. LGSC vedlikehold og passasje
- Fjern kulturmediet godt fra sfærekulturen.
- Disaggregate LGSC-sfærene dyrket i 7 dager ved inkubasjon i 20 μL av 10 U / ml dispase og 100 μL 10 mM PBS i 30 minutter ved 37 °C.
- Overfør suspensjonen til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 150 × g i 4 minutter. Fjern supernatanten.
- Behandle sfærene med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i 5 min ved 37 °C. Tilsett 1 ml 0,05% trypsinhemmer (TI) og pipette gjentatte ganger for å nøytralisere trypsin og dissosiere sfærene i enkeltceller.
- Sentrifuge ved 150 × g i 5 min og fjern supernatanten for å få LGSC i pelletsen. Legg til 1 ml LGSCM for å resuspendere LGSC-pelletsen.
- Plater enkeltcellene som beskrevet i trinn 1.3.1 til 1.3.6.
3. LGSC differensiering
- Prosedyre 1: Utvid kulturtiden til LGSC-er fra 7 til 14 dager med LGSC-kultursystemet for tilfeldig differensiering.
- Prosedyre 2: Endre forholdet mellom matrisegel-LGSCM-blandingen fra 1:1 til 1:2 i begynnelsen av LGSC-kulturen for differensiering av kanalceller. Frø LGSCene inn i matrisen for induksjon i 14 dager (se trinn 1.3).
- Prosedyre 3: Etter passasje, erstatt LGSCM med LGSCM-10% foster bovint serum (FBS) blanding for differensiering av acinarceller. Induser differensiering i 14 dager.
4. LG vev dehydrering
- Oppnå LG vev (trinn 1.1.1) og skyll LG-ene med 4 ml steril 10 mM PBS-oppløsning i en 6 cm tallerken i 2 min. Flytt vevet til 10% formalinløsning for fiksering i 24 timer.
- Skyll det faste vevet med 10 mM PBS i 2 minutter for å fjerne formalinet, og overfør vevet til en vevsinnbyggingsboks. Sett innebyggingsboksen i den automatiske dehydratoren.
- Bruk den automatiske dehydratoren til å dehydrere vevet som følger: 70% etanol, 2 t; 80% etanol, 2 t; 90% etanol, 30 min; 95% etanol, 30 min; absolutt etanol, 30min; absolutt etanol, 2 timer; absolutt etanol: 100% xylen (1: 1) blanding, 30 min; 100% xylen, 30 min; 100% xylen, 2 t; 100% xylen: paraffin (1: 1) blanding, 30 min; parafin, 2 timer; parafin, 3 timer.
5. LG organoid / sfære dehydrering
- Oppnå LG organoider/sfærer (trinn 2.1-2.3) i et 1,5 ml mikrosenterrør og skyll LG organoider/sfærer med 1 ml steril 10 mM PBS-oppløsning i 2 minutter.
- Sentrifuge ved 100 × g i 1 min og fjern supernatanten.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) -løsningen som følger: Tilsett 20 g PFA til en blanding av 400 ml 10 mM PBS og 40 μL 1 M NaOH, rist løsningen godt, og varm den i et 65 ° C vannbad i 2 timer til PFA er helt oppløst. Etter avkjøling til romtemperatur, bruk 10 mM PBS for å utgjøre volumet til 500 ml og oppbevar det ved 4 °C.
- Tilsett 1 ml PFA i mikrosenterrøret med organoid/sfærepellet og legg røret i et 4 °C kjøleskap i minst 24 timer for fiksering.
- Etter fiksering, sentrifuge ved 100 × g i 1 min og fjern supernatanten. Tilsett 1 ml 10 mM PBS i mikrocentrifugerøret med organoid/sfærepellet og bland forsiktig ved pipettering i 2 minutter for å skylle av PFA. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Sentrifuge ved 100 × g i 1 min og fjern supernatanten.
- Varm innstøpningshydrgel for å oppløse og tilsett 50-60 μL innstøtende hydrogel til organoid/ sfærepellet og bland. Pipette blandingen på parafilmen i form av en dråpe og vent i 5 min for at den skal størkne ved romtemperatur.
- Dehydrer gelen med organoider/sfærer i et nytt 1,5 ml mikrosenterrør som følger.
- Tilsett 1 ml 50% etanol til røret, vent i 30 min ved romtemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gjenta dette trinnet ved å endre etanolkonsentrasjonen til 70%, 80%, 90%, 95% suksessivt.
- Tilsett 1 ml absolutt etanol til røret, vent i 30 minutter ved romtemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gjenta dette trinnet.
- Tilsett 1 ml av en blanding av 0,5 ml absolutt etanol og 0,5 ml 100% xylen til røret, vent i 30 minutter ved romtemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering.
- Tilsett 1 ml 100% xylen til røret, vent i 30 min ved romtemperatur, og fjern væsken fra røret ved pipettering. Gjenta dette trinnet.
MERK: Trinn 5.8.5-5.8.6 må utføres i et metallbad ved 65 °C. - Tilsett 1 ml av en blanding av 0,5 ml parafin og 0,5 ml 100% xylen til røret, vent i 30 min ved 65 °C, og fjern væsken fra røret ved pipettering.
- Tilsett 1 ml paraffin i røret, vent i 30 min ved 65 °C, og fjern væsken fra røret ved å pipettere. Gjenta dette trinnet og utvid behandlingstiden til 1 time.
6. Paraffin innebygging og seksjonering
- Innebygging av parafin
- Før du legger inn, slå på innbyggingsmaskinen og forvarm den for å smelte parafinvoksen i parafintanken.
- Plasser det dehydrerte vevet eller organoid/sfæregelen i sporet på innbyggingsjernsboksen, og legg jernboksen i parafinen på innbyggingsmaskinen.
- Fjern plastlokket og legg plastinnbyggingsboksen på strykeboksen for å dekke den. Flytt innebyggingsjernboksen til et kjølebord.
- Etter at parafinen har kondensert i blokker i innbyggingsboksen, fjern den fra strykejernsboksen og skjær den direkte eller oppbevar den midlertidig i et 4 °C kjøleskap.
- Parafin seksjonering
- Før parafinslicing, forvarm parafinskiven og tilsett destillert vann til vasken på sliceren for forvarming. Begynn å kutte når vanntemperaturen stiger til 42 °C.
- Fest prøven på prøvesporet på parafinskiven. Juster seksjonstykkelsen til 5 μm under kutting.
- Del eksemplet kontinuerlig. Fest den helt flislagte delen på antislipsklien i slicertanken.
- Etter seksjonering, plasser lysbildene festet med prøvevev i en biokjemisk inkubator ved 37 °C for tørking i 24 timer. Oppbevar lysbildene midlertidig i kjøleskap ved 4 °C.
7. Hematoksylin og eosinfarging
- Smelt parafinseksjonene ved 60 °C i 30 minutter, bløtlegg seksjonene i 100% xylen i 15 min, og gjenta.
- Behandle seksjonene med absolutt etanol på en shaker i 5 min.
- Behandle seksjonene med 90% etanol, 80% etanol og 70% etanol på en shaker, hver i 3 min.
- Behandle seksjonene med deionisert vann på en shaker i 5 min og 2 min suksessivt.
- Flekk seksjonene på en våt boks i 5 min med 4 mg/ml hematoksylinoppløsning. Skyll seksjonene i rennende vann i 10 min.
- Agitate seksjonene på en shaker først med deionisert vann i 2 min og deretter med 0,5% -1% eosin i 1 min.
- Agitate seksjonene med 70% etanol, 80% etanol og 90% etanol på en shaker i 3 min (hver) suksessivt. Agitate seksjonene med absolutt etanol på en shaker i 5 min.
- Bløtlegg seksjonene i 100% xylen i 15 min og gjenta bløtleggingen.
- Bruk en pipette eller dropper for å legge til 3-4 dråper nøytral balsam på lysbildet, og dekk det sakte med en dekselsklie. Lufttørk skliene ved romtemperatur.
8. Immunhiistokjemisk (IHC) farging
- Smelt parafinseksjonene ved 60 °C i 30 minutter, bløtlegg seksjonene i 100% xylen i 10 min, og gjenta dette trinnet to ganger.
- Agitate seksjonene på en shaker først med absolutt etanol, 90% etanol og 80% etanol i 2 min (hver), suksessivt, og deretter med deionisert vann i 3 min. Gjenta agitasjonen med deionisert vann to ganger.
- Agitate seksjonene på en shaker først med en blanding av 20 ml 30% H2O2 og 180 ml metanol i 10 min og deretter avionisert vann i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Overfør seksjonene til ferdigkokt sitronsyrebuffer (1 L avionisert vann med 3 g Na3C6H5O 7,2H2O og 0,4 g C6H8O7, pH 6,0), mikrobølgeovn i 10 min for å holde dem på subkritisk kokepunkt, og avkjøl ved romtemperatur i 30 min. Rør seksjonene med deionisert vann på en shaker i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Agitate seksjonene med 10 mM PBS på en shaker i 5 min, og gjenta dette trinnet tre ganger. Legg vevsområdet på den våte boksen med en vannavstøtende markør, legg til en dråpe ferdig-til-bruk nonimmun geitserum for å dekke prøvene, og plasser dem ved romtemperatur i 1 time.
- Fjern serumet, tilsett primært antistoff til prøvene (se materialtabellen), og inkuber dem over natten ved 4 °C. Fjern det primære antistoffet, rør seksjonene med 10 mM PBS på en shaker i 5 min, og gjenta dette agitasjonstrinnet med 10 mM PBS tre ganger.
- Tilsett sekundært antistoff (se materialtabellen) for å dekke prøvene og inkubere dem på en våt boks i 30 minutter ved romtemperatur. Agitate seksjonene med 10 mM PBS på en shaker i 5 min, og gjenta agitasjon trinn tre ganger.
- Tilsett nytilberedt 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidin (DAB) løsning for å dekke prøvene på den våte boksen og flekk i 30-90 s. Skyll seksjonene med rennende vann i 10 min.
MERK: Kontroller fargingstiden ved å observere under et lysmikroskop til gul farge vises. - Tilsett 4 mg/ml hematoksylinoppløsning for å dekke prøvene, flekk i 5 min på en våt boks, og skyll seksjonene med rennende vann i 10 minutter.
- Agitate seksjonene på en shaker med 80% etanol, 90% etanol, og absolutt etanol i 2 min hver, suksessivt, og suge seksjonene i 100% xylen i 30 min.
- Bruk en pipette eller dropper for å legge til 3-4 dråper nøytral balsam på lysbildet, og dekk det sakte med en dekselsklie. Lufttørk skliene ved romtemperatur.
9. Global immunfluorescensfarging av organoider/sfærer
MERK: Samle organoidene/sfærene som er festet med 4 % PFA-oppløsning i et 1,5 ml mikrosenterrør (se trinn 5.1 til 5.4). Utfør fluorescensmerkingen som følger.
- Dehydrer organoidene/sfærene ved å tilsette 1 ml 30% sukroseoppløsning til røret og inkubere det over natten i kjøleskap ved 4 °C.
- Tilsett 100 μL PBST-oppløsning (10 mM PBS-oppløsning med 0,1% Triton X-100) til røret for å skylle organoidene / sfærene i 5 min, sentrifuger røret ved 100 × g i 1 min, og samle pelletsen. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Tilsett 0,5-1 ml bruksklart ikkeimmun geitserum til røret og forsegle det ved romtemperatur i 1 time. Sentrifuger røret ved 100 × g i 1 min og samle pelletsen.
- Tilsett flere dråper fortynnet primært antistoff for å bare dekke pellet og inkubere i kjøleskap ved 4 °C i 48 timer. Sentrifuger røret ved 100 × g i 1 min og samle pelletsen.
- Gjenta trinn 9.2.
- Tilsett flere dråper fluorescerende sekundært antistoff og 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) løsning på røret for å bare dekke pellet og inkubere i kjøleskap ved 4 °C i 24 timer, og unngå lys.
- Gjenta trinn 9.2, og unngå lys.
- Tilsett 100 μL PBST-oppløsning på røret og oppbevar det midlertidig i et 4 °C kjøleskap, borte fra lyset. Vær oppmerksom på og fotografer organoidene/sfærene ved hjelp av mikroskopet for skanning av lysark.
10. LGSC pLX-mCherry transfection
MERK: Produksjon av lentivirale partikler må utføres i et biosikkerhetsskap og en ren benk på BSL2 biosikkerhetsnivå.
- Kultur lentivirusemballasjecellen 293T i en 6-brønns plate med DMEM + 10% FBS ved 37 °C, 5 % CO2 i 3-5 dager for å nå 80 % cellesammenløp.
- Transfekt lentivirus vektor pLX-mCherry inn LGSCs.
MERK: Reagenspreparatet er indikert for en brønn på en 6-brønns plate.- Forbered to sterile 1,5 ml sentrifugerør og tilsett 250 μL DMEM/F12 på hvert rør.
- Tilsett 7,5 μL transfeksjonsreagens i ett rør og bland reagenset grundig ved pipettering.
- Tilsett 2 μg pLX-mCherry plasmid uten endotoksin og matchende lentivirusemballasje plasmid i et annet rør, og tilsett transfeksjonsreagenset (2 μL / μg plasmid).
- Bland væsken i begge sentrifugerørene og la blandingene stå i 5 min ved romtemperatur.
- Fjern kulturmediet til 293T-cellene og tilsett blandingen fra trinn 10.2.4 til 293T-cellene. Endre kulturmediet til fersk DMEM + 10% FBS etter 8 timer.
- Etter 48 timer samler du viruset supernatant for første gang og filtrerer det gjennom et 0,45 μm filter. Etter 72 timer samler du viruset supernatant for andre gang og filtrerer det gjennom et 0,45 μm filter igjen.
MERK: Oppbevar begge de filtrerte supernatantene på is til lentivirustransduksjon.
- Få LGSCene fra DED-mus (NOD/ShiLtJ) (se trinn 1).
- Tilsett 1 ml av det forhåndsavhentede pLX-mCherry lentivirus supernatant for å resuspendere cellene.
- Sett sentrifugerøret på en shaker i CO 2-inkubatoren ved 37 °C. Rist den ved 100 rpm for å maksimere kontakten mellom lentiviruset og cellene. Etter 8 timer sentrifugerer du blandingen ved 250 × g i 4 min og fjerner supernatanten.
- Tilsett 1 ml DMEM/F12 for å resuspendere cellepelleten. Bruk en celleteller for å bestemme cellenummeret og frøet totalt 1 × 104 celler i 100 μL matrisegel-LGSCM-matrise (matrisegel: LGSCM = 1:1) i hver brønn av en 24-brønns plate forhåndsbelagt med 20 μL matrisegel-LGSCM-matrise (se trinn 1.3.2).
- Etter 7 dager med kultur (se trinn 1) velger du sfærer som viser rød fluorescens under et fluorescensmikroskop for å utvide kulturen.
11. LGSC ortotopisk transplantasjon
MERK: Alle kirurgiske operasjoner utføres i et SPF-operasjonsrom, og alle kirurgiske instrumenter steriliseres.
- Få LGSC-sfærene fra ROSA26mT/mG-mus med rød fluorescens (td-tomat) eller mCherry-transfeksjon dyrket i 7 dager (se trinn 1).
- Avkjøl et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder en 1:1-blanding av matrisegel og DMEM/F12 på is før bruk. Fordøye LGSC-sfærene i enkeltceller og resuspender cellene med en tetthet på 2 × 106 celler / ml i røret.
- Bedøv NOD/ShiLtJ-musene ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital natrium (50 mg/kg).
MERK: NOD/ShiLtJ-mus er en ideell modell med idiopatiske EKSTRA symptomer, inkludert redusert tåresekresjon, inflammatorisk infiltrasjon og orbital sårdannelse. - Etter anestesi, bruk saltvann eller veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet, og bruk deretter oftalmisk saks for å lage et 5-8 mm kutt i huden bak øret (nær øyet) av bedøvelsesmusene for å eksponere LG-ene.
MERK: Iodoforn bør brukes strengt til desinfeksjon rundt snittet. - Injiser 2 × 104 celler i venstre LG og injiser blandingen uten celler (se trinn 11.2) i høyre LG som kontroll.
- Etter injeksjon, gjenopprett LP-ene til sine opprinnelige posisjoner med oftalmiske tang og suturer såret. Fôr musene i 2 måneder og observere effekten av behandlingen.
MERK: Burputematerialet må også steriliseres strengt etter operasjonen, og putematerialet bør skiftes ut en gang om dagen. Etter å ha suturert såret, kan tramadol injiseres selektivt i halevenen til mus ved standarddosen på 2,5 mg / kg for å oppnå smertestillende midler. - Bedøv disse musene 2 måneder etter eksperimentet (se trinn 11.3). Film symptomene på okulærområdet.
- Under anestesi, se etter følgende symptomer: nakke og lem muskel avslapning; dyp, langsom og jevn pusting; elev innsnevring; hornhinnen refleks forsvinning.
- Under anestesi og drift, hold kroppstemperaturen til mus ved 37 °C. Etter operasjonen, legg til passende antibiotika til drikkevannet for mus for å redusere risikoen for sårinfeksjon. Ikke la musene stå uten tilsyn før de har fått tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal heftelse. Ikke returner musene som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre mus til de er fullstendig gjenopprettet.
- Etter å ha filmet symptomene på okulærområdet, åpne ImageJ-programvaren, klikk på Fil | Åpne | Frihåndsvalg, hold nede venstre museknapp, og velg området med orbital sårdannelse i bildet. Klikk på Analyser | Mål for å oppnå det relative området av sårdannelse.
- Sett fenolrød bomullstråd på lateral canthus av bedøvelsesmus i 10 s; måle og registrere lengden på den misfargede delen av bomullstråden. Avlivet musene ved cervical vertebra dislokasjon etter tåremåling.
- Disseker musene og få LG-ene for IHC-analyse.
12. RNA-isolasjon
MERK: Før eksperimentet må sentrifugen forkjøles til 4 °C og garantere at alle reagenser og forbruksvarer er fri for RNAse-forurensning.
- Samle LGSCs eller LG fragmenter i en microcentrifuge tube. Tilsett 1 ml cellelysbuffer og lyse cellene eller vevet fullt ut ved virveloscillasjon.
- Tilsett 0,2 ml kloroform, og la den stå ved romtemperatur i 10 minutter etter virveloscillasjon i 1 min. Sentrifuge i 15 min ved 4 °C, 12 000 × g.
MERK: Etter sentrifugering er væsken delt inn i tre lag, og RNA er i den øverste gjennomsiktige vandige fasen. - Rør forsiktig den øverste gjennomsiktige vandige fasen og overfør den til et nytt 1,5 ml RNAsefritt sentrifugerør.
- Tilsett et likt volum isopropylalkohol og bland forsiktig. La blandingen stå ved romtemperatur i 10 min og sentrifuger deretter i 15 min ved 4 °C, 12 000 × g.
- Fjern supernatanten, og tilsett 1 ml 75% etanol. Snu røret for å vaske pellets og sentrifugering i 5 min ved 4 °C, 7500 × g. Gjenta dette trinnet.
- Fjern supernatanten forsiktig og legg sentrifugerøret i den ultraclean arbeidsbenken for å tørke den i ca. 20 minutter.
MERK: Fortsett til neste trinn når den hvite pelletsen blir gjennomsiktig. Utfør alle operasjoner på is. - Tilsett 20 μL RNAsefritt vann for å løse opp pelletsen helt. Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer (se materialtabellen) og oppbevar RNA-oppløsningen ved -80 °C.
13. PCR
- Omvendt transkripsjonsreaksjon
- Tilsett 1 μg total RNA (beregn volumet av tilsatt RNA-løsning i henhold til konsentrasjonen av RNA-løsningen) i PCR-reaksjonsrøret og inkuber ved 65 °C i 5 minutter for denaturering.
- Legg den på is i 1 min og tilsett deretter enzymfritt vann til det totale volumet når 12 μL. Tilsett 4 μL 4x DNA Master Mix og inkuber det ved 37 °C i 5 minutter.
- Sett røret på is, tilsett 4 μL 5x RT Master Mix, og bland det forsiktig. Still inn følgende PCR-innstillinger: 37 °C i 15 minutter, 50 °C i 5 minutter, 98 °C i 5 minutter, 4 °C i 1 min.
- Oppbevar den ved -20 °C, eller fortsett til neste trinn etter at den omvendte transkripsjonsreaksjonen er fullført.
- PCR-reaksjon
- Forbered PCR-reaksjonen i PCR-røret som følger: 14,1 μL enzymfritt vann, 2 μL dNTP, 2 μL 10x buffer, 0,8 μL primer (10 μM, 0,4 μL fremoverprimer og 0,4 μL reversprimer, se materialtabellen), 1 μL omvendt transkripsjon cDNA (se trinn 13.1) og 0.1 μL taq-enzym.
- Plasser den forberedte PCR-reaksjonen i PCR-apparatet for PCR. Se instruksjonene i Taq-enzymsettet for PCR-prosedyren (se materialtabellen).
- Agarose gel elektroforese
- Bruk en analytisk balanse til å veie 242 g Tris og 37,2 g Na2EDTA·2H2O og legg dem til et 1 L beger. Tilsett ~ 800 ml deionisert vann og 57,1 ml issyre til begeret, bland godt, tilsett deionisert vann til 1 L for å oppnå 50x TAE-buffer, og oppbevar den ved romtemperatur.
MERK: Fortynn 50x TAE buffer med deionisert vann før bruk. - Bruk en analytisk balanse til å veie 1,2 g agarose og legg den til en konisk kolbe som inneholder 80 ml 1x TAE buffer. Varm den gjentatte ganger i mikrobølgeovnen til den er helt oppløst.
- Avkjøl kolben under rennende vann fra springen til oppløsningstemperaturen synker til 60 °C. Tilsett 8 μL nukleinsyreflekk, hell løsningen i gelatiniseringstanken etter blanding av godt, plasser kammen og la den stå ved romtemperatur i 30 minutter.
- Trekk ut kammen og last PCR-produktene i den tilberedte agarosegelen. Utfør elektroforese ved 120 V i 30 min.
- Plasser gelen i ECL Gel-bildesystemet og fotografiet.
- Bruk en analytisk balanse til å veie 242 g Tris og 37,2 g Na2EDTA·2H2O og legg dem til et 1 L beger. Tilsett ~ 800 ml deionisert vann og 57,1 ml issyre til begeret, bland godt, tilsett deionisert vann til 1 L for å oppnå 50x TAE-buffer, og oppbevar den ved romtemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablere 3D, serumfritt kultursystem
I denne studien ble LGSCM som inneholder EGF, Wnt3A, FGF10 og Y-27632 for mus LGSC-er utviklet, og LGSC-er ble vellykket isolert og dyrket av en 3D-kulturmetode (figur 1A). Et vellykket 3D-, serumfritt kultursystem av LGSCer fra C57BL/6-mus, NOD/ShiLtJ-mus, BALB/c-mus og ROSA26mT/mG-mus er etablert ved hjelp av denne metoden16. For en mannlig mus ble 1,5-2 × 106 celler oppnådd fra to LG-er ved dissosiasjon. Etter en uke med kultur ble 30-60 sfærer dannet da sådd 1 × 104 LG-celler i begynnelsen av kulturen. Videre uttrykte cellene som ble dyrket av denne metoden Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin og andre stamcellemarkører16, noe som indikerer at cellene som ble oppnådd hadde egenskapene til LGSCs. Krt14 og Ki67 ble uttrykt på alle sfærer dannet av LGSC-er dyrket i 7 dager (figur 1B), noe som indikerer at LGSCene hadde selvfornyelseskapasitet.
Under en 7-dagers kultur nådde LGSCs sfærer en diameter på 100 μm. Hematoksylin og eosin (H&E) farging viste cellulæritet på dag 7 (figur 1C og figur 1F). Berikelsesfaktorene til LGSC-er oppnådd etter 7 dager med primærkultur og subkultur indikerte at LGSC-ene beriket med denne metoden hadde sterk proliferativ evne (figur 1D). I dette systemet kan LGSC-er passeres over 40 ganger, og de opprettholdt fortsatt stamcelleegenskaper (figur 1E og figur 1G). Til slutt beskriver denne artikkelen en protokoll for å etablere et 3D, serumfritt kultursystem for LGSCs in vitro. Cellene som dyrkes av denne protokollen har kontinuerlig og stabil proliferativ evne.
Indusere differensiering in vitro
Differensieringskapasiteten til LGSCs in vitro ble analysert. Når lgscs dyrket i mer enn 7 dager, mistet LGSCs gradvis vekstevnen, og uttrykket for AQP5, Ltf, Krt19 og andre markører forbundet med differensiering økte, mens uttrykket krt14 gradvis reduserte16. LGSCer ble indusert til å danne flere knopper av FBS og en lav andel matrisegel (figur 2A, B). Videre indikerte H&E-farging at FBS kunne indusere sfærene til å produsere mer kavitasjonsstrukturer (figur 2C).
Det forrige arbeidet antydet at redusert matrisehardhet fremmet differensiering av LGSCer til kanallignende organoider. De basale lagcellene opprettholdt egenskapene til stamceller som uttrykte Krt14, mens de basale øvre lagcellene differensiert i kanallignende strukturer med hulrom og uttrykte Krt19. I tillegg kan tilsetningen av FBS indusere differensiering av LGSC-er til acinarlignende organoider, som opprettholdt egenskapene til stamceller med høyt kjernefysisk / cytoplasmisk forhold. Noen differensierte acinarlignende celler uttrykte høye nivåer av AQP5 med lavt kjernefysisk / cytoplasmisk forhold16.
Reparer LGSCs in vivo
Basert på de ovennevnte eksperimentene ble LGSC-ens evne til å reparere skadede LG-er utforsket av ortotopisk injeksjon. Etter ortotopisk injeksjon av ROSA-LGSCer i NOD/ShiLtJ-mus ble det dannet nye lacrimale lobler ved siden av LG-ene (figur 3A-C). De fleste lobulene var sammensatt av modne acinarceller med høyt uttrykk for AQP5, og det var intralobulær kanaldannelse med lavt AQP5-uttrykk (figur 3D-F). Etter injeksjon av ROSA-LGSCer i 8 uker ble forfallet rundt mottakernes bane målt. Målingene indikerte at injeksjonen av LGSC-er reduserte forfallsområdet med ~ 60% (figur 3G, H). Disseksjonen viste at LG-volumet økte etter injeksjon i 10 uker (figur 3I). Mengden tåresekresjon på ROSA-LGSCs injeksjonssiden var høyere enn på kontrollsiden, men lavere enn hos villmus (figur 3J). Disse resultatene indikerer at cellene høstet av dette kultursystemet har egenskapene til LGSCer og kan brukes til stamcellebehandling hos mus med ADDED og xerophthalmia.
Figur 1: Isolasjon og karakterisering av LGSCs. (A) Strategien til LGSC primær og kontinuerlig passasjekultur. (B) Immunfluorescence farging av LGSCs på dag 7. LGSCs uttrykker epitelcellemarkør E-kaderin (rød), stamcellemarkør Krt14 (rød), proliferativ cellemarkør Ki67 (rød). Counterstain, DAPI (blå). (C) Morfologien til LGSCer i kultur i 1, 3, 5 og 7 dager. (D) Relativ berikelsesfaktor for LGSC-kultur i primærkultur og subkultur. Relativ berikelsesfaktor er forholdet mellom det totale antall celler oppnådd etter 7 dager med kultur til antall celler frøet i kulturen. P < 0,01. (E) Transkripsjon av voksne stamcellemarkører av musen LG og forskjellige passasje LGSCs (P1, P10, P20 og P40). (F) Morfologien (venstre) og H&E-farging (høyre) av LGSC-er i primærkulturen på dag 7. (G) LGSCer dyrket i forskjellige passasjer (P1, P10, P20 og P40). Skalastenger = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Forkortelser: LG = lacrimal kjertel; LGSCs = LG stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol;; NC = negativ kontroll; TE = trypsin-EDTA; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Differensiering av LGSCs in vitro. (A,B) Morfologi av LGSCer dyrket i normalt medium eller differensieringsmedium. (A) LGSC-er dyrket i 10 dager i P10 (venstre: normalt medium, høyre: FBS-inneholdende medium). (B) LGSC dyrket i 14 dager i P31 (venstre: normalt medium, høyre: medium med 1/3rd matrisegel). (C) H&E farging av LGSCs dyrket i 14 dager (topp: normalt medium, bunn: FBS-inneholdende medium). Skalastenger = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Forkortelser: LG = lacrimal kjertel; LGSCs = LG stamceller; H&E = hematoksylin og eosin; FBS = foster bovin serum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Engraftment av LGSCs allotransplantasjon og lindring av EKSTRA symptomer. (A-F) IHC farging av NOD / ShiLtJ LG transplantert med 7-dagers kulturer av ROSA-LGSCs etter 8 uker. Bruk venstre og høyre side av samme mus som den eksperimentelle gruppen og kontrollgruppen. (A-C) IHC farging med anti-td-tomat antistoff; (D-F) IHC farging med anti-AQP5 antistoff; (A, D) LG injisert med kjøretøy (1:1 blanding av matrise gel og DMEM / F12), (B, E) LG injisert med ROSA-LGSCs, (C, F) forstørrede bilder av de svarte rutene i B, E (rød pil, intralobulær kanal). (G, H) Tilstanden til NOD / ShiLtJ museøyebane etter injeksjon av ROSA-LGSCer ved 8 uker. Injeksjonen av LGSCs lindrer forfallet rundt øyebanen betydelig. (I) LGs av NOD / ShiLtJ musen på 10 uker (venstre: LG fra den celleinnsprøytede siden, høyre: LG fra kontrollsiden). (J) Tårevolum av villtype og NOD/ShiLtJ-mus transplantert med 7-dagers kulturer av ROSA-LGSC etter 8 uker. Rivevolumet av ROSA-LGSC-injiserte LG-er er høyere enn for kontroll-LG-ene, men betydelig lavere enn for WT LG-er. n = 3; NOD/ShiLtJ-mus, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Skalastenger = 50 μm (A-F). Forkortelser: LG = lacrimal kjertel; LGSCs = LG stamceller; IHC = immunhiistokjemisk; WT = wild-type; LAGT TIL = vandig-mangelfull tørrøyesykdom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes veletablerte metoder for isolasjon og in vitro kultur av lacrimal stamceller for lacrimal stamcelle kultur og LG skade reparasjon. Shatos et al.17 og Ackermannet al. 6 vellykket kultivert og subkulturert lacrimal stamceller av rotter og mus ved henholdsvis 2D-kulturmetoder, noe som gjør det mulig å transplantere lacrimal stamceller for behandling av ADDED. Studier på stamceller18 og mesenchymale stamceller 19,20 av LG dyrket i 2D viste at transplantasjonen av disse cellene til en viss grad kunne lindre symptomene på ADDED. Ved fluorescensaktivert cellesortering, Gromovaet al. 2 utvalgte stamceller som uttrykker LG stamcellemarkører fra mus-LG-er og differensierte dem i kanaler og acini in vitro, og innså vellykket differensiering av voksne stamceller i funksjonelle celler av LG-er. Det ble også vist at transplantasjon av et tilstrekkelig antall stamceller kunne lindre EKSTRA symptomer hos mus.
For å møte behovene til stamcelleberikelse og eliminere serumavhengighet i eksisterende lacrimal stamcellekulturmetoder, ble det serumfrie kultursystemet til lacrimal stamceller i denne protokollen etablert basert på tidligere publisert forskning og organoid 3D-kulturteknologi21. Dermed forventes dette systemet å fremme klinisk forskning på lacrimal stamceller. I denne protokollen inkluderer de kritiske trinnene primærkultur, subkultur og utvidelse av LGSC-er, og in situ-transplantasjon av LGSC-er til skadede LG-er hos mus.
Primærkultur er grunnlaget for å skaffe LGSCer. Det er nødvendig å opprettholde sterile forhold under primærkulturen. Brønnen er forhåndslakkert med matrise-gel for å unngå tilhengervekst av celler på bunnen av cellekulturen godt. Når du bruker matrise-gel, er det nødvendig å følge produsentens instruksjoner, og alltid holde den i flytende tilstand før du legger til brønnen for å unngå matrise-gel tap under eksperimentet og ujevn matrise-gel i kulturen.
Antall frøceller i primærkulturen er 10.000 celler/brønn. I praksis kan antall frøceller økes dersom passende vekstrom og næringstilførsel av celler sikres. Subkultur er et viktig skritt for å rense og berike stamceller. Etter passasje dannet LGSCs i P1-generasjonen flere sfærer, og det var flere P1-generasjonsceller enn P0-generasjonen. Dette indikerer at LGSC-er med proliferativ evne har blitt beriket i dette systemet.
Når LGSCer ble dyrket i dette 3D-systemet over 10 dager, var 0,05% trypsin-EDTA noen ganger ikke nok til å fordøye organoidene fullt ut i enkeltceller under passasjen. Dette problemet ble løst ved å forlenge fordøyelsestiden på riktig måte. In situ injeksjonsterapi er en nødvendig prosedyre for å verifisere den kliniske verdien av LGSCs. På grunn av den lille størrelsen og det tynne og løse vevet av LG hos mus, går celler alltid tapt fra injeksjonsstedet hvis cellesuspensjonen fremstilles i normal saltvann eller 10 mM PBS til injeksjon. Derfor anbefales det å blande cellefjæringen med matrise-gel til injeksjon. Fordi matrisegelen som brukes i dette systemet størkner ved temperaturer over 10 °C, kan cellene koloniseres lett når de injiseres i LG-ene. Blandingen av celler og matrisegel må alltid holdes på is før injeksjon, og injeksjonen utføres raskt.
I tillegg til å isolere LGSC-er fra normale mus, ble voksne LGSCer fra ADD-mus vellykket isolert og dyrket for første gang ved hjelp av denne protokollen16. Imidlertid har dette systemet fortsatt mangler og uløste problemer. For det første er matrisegelen som brukes avledet fra mus22,23, noe som kan forårsake avvisningsreaksjoner i menneskekroppen og derfor har begrenset klinisk anvendbarhet. Det er nødvendig å forbedre kultursystemet ved å finne passende syntetiske geler for å erstatte matrisegelen.
For det andre må differensieringsstrategien i denne protokollen forbedres. I stedet for å forlenge kulturtiden for differensiering21 eller legge til serum i kulturmediet, forventes det å gi de ønskede resultatene å legge til spesifikke vekstfaktorer og endre spesifikke miljøforhold for retningsinduksjon. Det er nødvendig å utforske mekanismen for vedlikehold og differensiering av LGSCer ved å belyse signalveiene som forårsaker differensiering. Videre har tidligere studier funnet at myoepithelialceller dyrket in vitro også uttrykker stamcellegener, som Nestin, Musashi og Pax6, noe som indikerer at myoepitheliale celler også har stamcelleegenskaper17.
Denne studien brydde seg ikke om myoepitheliale celler og bekreftet derfor ikke om myoepitheliale celler eksisterer i LG-organoidene ved å identifisere spesifikke uttrykksmarkører for myoepitheliale celler. På grunn av begrensningen av kulturforholdene kunne myoepitheliale celler ikke induseres eller at antallet deres var for lite til å bli observert. Kulturtiden kan utvides for å observere om organoidene ytterligere skiller seg ut i myoepitheliale celler, eller fokuserer på myoepitheliale celler i fremtidige studier av induksjonsdifferensiering og systemforbedring.
Til slutt gir denne protokollen en metode for å studere LGSCer for utvikling, reparasjon og regenerering av LG-er. Differensiering av LGSCs in vitro kan være grunnlaget for fremtidig in vitro regenerering av LGs, mens isolasjon og kultur av LGSCs kan løse problemet med avvisning i stamcelle allotransplantasjon. Denne metoden gir et viktig grunnlag for klinisk individualisert behandling av xerophthalmia med LGSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) og to programmer for Guangdong Science and Technology (2017B020230002 og 2016B030231001). Vi er virkelig takknemlige for forskerne som har hjulpet oss under studien og til de ansatte som jobber i dyresenteret for deres støtte til dyrepleie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | - | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | - | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | - | |
| Yeast Extract | OXID | - | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
- Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
- Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
- You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
- Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
- Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
- Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
- Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
- Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).
