Summary
成体涙腺(LG)幹細胞の三次元無血清培養法は、LGオルガノイドの形成および腺房または腺管様細胞への分化の誘導のために十分に確立されている。
Abstract
涙腺(LG)幹細胞ベースの治療は、涙腺疾患のための有望な戦略です。しかしながら、十分な数のLG幹細胞(LGSC)を得るための信頼性の高い無血清培養方法の欠如は、さらなる研究および応用のための1つの障害である。成体マウスLGSCsの三次元(3D)無血清培養法は十分に確立されており、ここに示されている。LGSCsを連続的に継代し、腺房または乳管様細胞に分化誘導することができた。
LGSC初代培養のために、6〜8週齢のマウスからのLGsを、ディスパーゼ、コラゲナーゼI、およびトリプシン−EDTAで消化した。合計1個×104個の単一細胞を、24 ウェルプレートの各ウェル中のマトリックスゲル涙腺幹細胞培地(LGSCM)マトリックス80μLに播種し、20μLのマトリックスゲルLGSCMマトリックスでプレコートした。この混合物を37°Cで20分間インキュベートした後に固化し、LGSCMを600μL添加した。
LGSC維持のために、7日間培養したLGSCsを、ディスパーゼおよびトリプシン−EDTAによって単一細胞に脱凝集させた。この単一細胞を移植し、LGSC初代培養に用いた方法に従って培養した。LGSCは40回以上継代することができ、ステム/前駆細胞マーカーKrt14、Krt5、P63、およびネスチンを連続的に発現することができる。LGSCMで培養されたLGSCCは自己複製能を有し、インビトロおよびインビボで腺房または乳管様細胞に分化し得る。
Introduction
涙腺幹細胞(LGSC)は、涙腺(LG)細胞の再生を維持し、腺房および乳管細胞の供給源である。したがって、LGSC移植は、重篤な炎症性損傷および水性欠損ドライアイ疾患(ADDED)1、2、3を治療するための代替的アプローチと考えられている。Tiwariらは、コラーゲンIおよびいくつかの成長因子を添加したマトリックスゲルを用いて初代LG細胞を分離および 培養した。しかしながら、LG細胞を連続的に培養することができなかった4。二次元(2D)培養を用いて、マウスLG由来幹細胞を、Youら5 およびAckermannらによって単離した。図6から、幹/前駆細胞マーカー遺伝子、 Oct4、 Sox2、 Nanog、および ネスチンを発現することが見出され、継代培養することができた。しかしながら、これらの細胞が腺房細胞や乳管細胞に分化しうるという明確な兆候はなく、 生体内での分化能を検証する移植実験もない。
最近、c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-細胞をフローサイトメトリーによりマウスLGから単離し、Pax6やRunx1などのLG前駆細胞マーカーを発現することが判明し、インビトロでダクトやアチーニに分化した。ADDのマウスでは、これらの細胞による同所性注射は、損傷したLGを修復し、LGs2の分泌機能を回復させることができる。しかしながら、この方法により単離された幹細胞の数は少なく、単離されたLGSCsを増殖させるのに好適な培養条件はなかった。要約すると、ADDEDの治療におけるLGSCsの研究のために、安定的かつ継続的な拡大を伴う成人LGSCを効果的に単離および培養するために、適切な培養システムを確立する必要がある。
幹細胞または多能性幹細胞に由来するオルガノイドは、関連する器官に組織学的に類似しており、それら自身の再生を維持することができる細胞群である。2009年に佐藤らによってマウス腸オルガノイドの培養に成功した後7、佐藤の培養系に基づいて他の臓器由来のオルガノイドを連続して培養し、例えば胆嚢8、肝臓9、膵臓10、胃11、乳房12、肺13、前立腺14、及び唾液腺15.オルガノイド培養における細胞分化前の成体幹細胞の割合が高いため、三次元(3D)オルガノイド培養法はLGの成体幹細胞の単離および培養に最適と考えられる。
本研究では、3D無血清培養法を最適化することにより、成体マウスLGSC培養系を確立した。正常マウスとADDマウスの両方から培養したLGSCsは、自己複製および増殖の安定した能力を示したことが証明されている。ADDマウスLGsへの移植後、LGSCsは障害のあるLGsに定着し、涙液産生を改善した。また、ROSA26mT/mG マウスから赤色蛍光LGSCsを単離し、培養した。この研究は、イン ビトロでの LGSC濃縮およびADD療法の臨床応用におけるLGSC自家移植片の信頼できる参照を提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルのすべての実験は、Sun Yat-sen Universityの動物実験に関する倫理委員会の動物ケアガイドラインに従っていました。すべてのセル関連操作は、セル操作室の超クリーンワークベンチで実行されます。キシレンを使用するすべての操作は、ヒュームフード内で行われるべきである。
1. LGSCの初代文化
- LG電子絶縁
- 生後6〜8週のBALB/cオスマウスを入手し、耳の後ろの皮膚を切ってLGとその周りの結合組織を露出させます。ピンセットの助けを借りて鈍い解剖によって結合組織を剥がし、LGを除去します。
- LGを4 mLの滅菌10 mM PBS溶液で2回すすぎ、6 cmディッシュ内の血液を除去します。LGsを6cmの皿に4mLの75%エタノールで10秒間浸漬し、直ちに10mM PBSで2回すすいでください。
- LG電子の単一セルを取得する
- HEPES緩衝液(50 mM Hepes/KO、pH 7.4;超純水中の150 mM NaCl)を使用して、25 U/mLのディスパーゼを調製する。超純水で0.1%コラゲナーゼI溶液を調製した。
- LGsを小さな断片(約1mm3)に切断し、滅菌した15mL遠沈管に移し、500μLの25U/mLディスパーゼおよび500μLの0.1%コラゲナーゼIで組織を37°Cで1時間処理する。
- 10 mM PBS を使用して、トリプシン-EDTA 溶液 (0.05 g/L トリプシン、0.04 g/L EDTA) を調製します。ステップ1.2.2のLG断片を1mLの0.05%トリプシン-EDTAで37°Cで10分間処理し、ピペッティングを繰り返して断片を単一細胞に解離させる。
- 懸濁液を70μmのフィルターでろ過し、ろ液を滅菌15mL遠沈管に集め、150× g で5分間遠心分離した。
- 遠心分離後、上清を取り出し、10 mLの10 mM PBSを加えて細胞ペレットを洗浄し、懸濁液を遠心分離した。
- ステップ1.2.5を繰り返し、上清を除去し、1mLのDMEM/F12(ダルベッコ改変イーグル培地とハムF-12の1:1混合物)を加えて細胞ペレットを再懸濁する。
- LGSCの初代文化
- DMEM/F12、1x N2サプリメント、1x B27サプリメント、2 mM グルタミン代替物、0.1 mM NEAA(非必須アミノ酸)、50 ng/mL マウス上皮成長因子(EGF)、100 ng/mL 線維芽細胞増殖因子 10 (FGF10)、10 ng/mL Wnt3A、および 10 μM Y-27632 (ROCK 阻害剤) を含む涙腺幹細胞培地 (LGSCM) を調製します。
- 20 μL のマトリックスゲル-LGSCM マトリックス (マトリックスゲル: LGSCM = 1:1) を 24 ウェルプレートのウェルの中央に添加します。ピペットチップを使用して円(直径6〜8mm)に拡大し、混合物を37°Cで20分間インキュベートしてウェルをプレコートします。
- セルカウンターを使用して細胞数を決定し、合計1~104個の細胞を含む40μLのLGSCMを40μLのマトリックスゲル×加えます。これらをピペットで穏やかに混合し、マトリックスゲル-LGSCM混合物(マトリックスゲル:LGSCM=1:1)を得た。
- ピペットを使用して、ステップ1.3.2で24ウェルプレートの各ウェルのプレコート領域に混合物の80μLを慎重に滴下します。
- 混合物を37°Cで20分間インキュベートし、LGSCMを600μL加える。
- 各ウェルの培養液は2日に1回交換する。7日間の培養後、倒立顕微鏡下で直径100〜300μmのLGSC球体を探します(接眼レンズ:10倍、対物レンズ:4倍)。
注:LGSCは合計で14日以上培養することができます。
- ROSA26mT/mG マウスおよびDEDマウス(NOD/ShiLtJ)の初代LGSCsを上記の手順に従って単離および培養する。
2. LGSCのメンテナンスと通過
- スフェア培養ウェルから培養液を除去する。
- 7日間培養したLGSCスフェアを、20 μLの10 U/mLディスパーゼおよび10 μLの10 mM PBS中で37°Cで30分間インキュベートすることにより、脱凝集させた。
- 懸濁液を15mL遠沈管に移し、150× g で4分間遠心分離する。上清を除去する。
- スフェアを1mLの0.05%トリプシン-EDTAで37°Cで5分間処理する。 1 mLの0.05%トリプシン阻害剤(TI)とピペットを繰り返し加えて、トリプシンを中和し、スフェアを単一細胞に解離させる。
- 150× g で5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレット中のLGSCsを得た。LGSCMペレットを再懸濁するために1mLのLGSCMを加える。
- ステップ 1.3.1 から 1.3.6 の説明に従って単一セルをプレートします。
3. LGSCの差別化
- 手順1:ランダム分化のためにLGSC培養系を用いてLGSCの培養時間を7日から14日間に延長する。
- 手順2:管状細胞の分化のためにLGSC培養の開始時にマトリックスゲル−LGSCM混合物の比を1:1から1:2に変更する。LGSCをマトリックスに播種し、誘導のために14日間投与します(ステップ1.3を参照)。
- 手順3:継代後、腺房細胞の分化のためにLGSCMをLGSCM-10%ウシ胎児血清(FBS)混合物と交換する。14日間分化を誘導する。
4. LGの組織脱水
- LG組織を取得し(ステップ1.1.1)、LGを6cmディッシュ中の滅菌10mM PBS溶液4mLで2分間すすいでください。組織を10%ホルマリン溶液に移し、24時間固定する。
- 固定した組織を10mM PBSで2分間すすぎ、ホルマリンを除去し、組織包埋箱に組織を移した。埋め込みボックスを自動脱水機に入れます。
- 自動脱水機を使用して、次のように組織を脱水します:70%エタノール、2時間;80%エタノール、2時間;90%エタノール、30分;95%エタノール、30分;無水エタノール、30分;無水エタノール、2時間;無水エタノール:100%キシレン(1:1)混合物、30分;100%キシレン、30分;100%キシレン、2時間;100%キシレン:パラフィン(1:1)混合物、30分;パラフィン、2時間;パラフィン、3時間。
5. LGオルガノイド/球体脱水
- 1.5 mL の微小遠心チューブで LG オルガノイド/スフェアを入手し (ステップ 2.1-2.3)、LG オルガノイド/スフェアを 1 mL の滅菌 10 mM PBS 溶液で 2 分間リンスします。
- 100× g で1分間遠心分離し、上清を除去する。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を以下のように調製する:400mLの10mM PBSおよび40μLの1M NaOHの混合物に20gのPFAを加え、溶液をよく振って、PFAが完全に溶解するまで65°Cの水浴中で2時間加熱する。室温まで冷却後、10mM PBSを使用して500mLまでの容量を作り、4°Cで保存します。
- オルガノイド/スフェアペレットの入った微量遠心チューブに4%PFAを1mL加え、チューブを4°Cの冷蔵庫に少なくとも24時間入れて固定します。
- 固定後、100× g で1分間遠心分離し、上清を除去した。オルガノイド/スフェアペレットの入った微量遠心管に1mLの10mM PBSを加え、ピペッティングで2分間穏やかに混合してPFAを洗い流します。この手順を 2 回繰り返します。
- 100× g で1分間遠心分離し、上清を除去する。
- 包埋ハイドロゲルを加熱して溶解させ、包埋ハイドロゲル50~60 μLをオルガノイド/スフェアペレットに添加して混合する。混合物を液滴の形でパラフィルム上にピペットし、室温で固化するのを5分間待つ。
- 次のように、新しい1.5 mLの微量遠心管でオルガノイド/スフェアでゲルを脱水します。
- チューブに1mLの50%エタノールを加え、室温で30分間待ってから、ピペッティングによってチューブから液体を除去する。エタノール濃度を70%、80%、90%、95%に順次変化させてこの工程を繰り返す。
- チューブに1mLの無水エタノールを加え、室温で30分間待ってから、ピペッティングによってチューブから液体を除去する。この手順を繰り返します。
- 0.5mLの無水エタノールと0.5mLの100%キシレンの混合物1mLをチューブに加え、室温で30分間待ち、ピペッティングによってチューブから液体を除去する。
- 1mLの100%キシレンをチューブに加え、室温で30分間待ってから、ピペッティングによってチューブから液体を除去する。この手順を繰り返します。
メモ: 手順 5.8.5-5.8.6 は、65 °C の金属製浴中で実行する必要があります。 - 0.5mLのパラフィンと0.5mLの100%キシレンの混合物1mLをチューブに加え、65°Cで30分間待ち、ピペッティングによりチューブから液体を除去する。
- チューブに1mLのパラフィンを加え、65°Cで30分間待ち、ピペッティングによりチューブから液体を除去した。この手順を繰り返して、処理時間を 1 時間に延長します。
6. パラフィン埋め込みとセクショニング
- パラフィン埋め込み
- 埋め込む前に、包埋機の電源を入れて予熱し、パラフィンタンク内のパラフィンワックスを溶かしてください。
- 脱水組織またはオルガノイド/スフェアゲルを包埋鉄箱の溝に入れ、包埋機のパラフィンに鉄箱を入れます。
- プラスチック製の蓋を取り外し、プラスチック製の埋め込みボックスを鉄の箱の上に置き、覆います。埋め込み用鉄の箱を冷却テーブルに移動します。
- パラフィンが包埋箱でブロック状に凝縮したら、鉄の箱から取り出して直接スライスするか、4°Cの冷蔵庫に一時的に保管してください。
- パラフィンセクショニング
- パラフィンスライスする前に、パラフィンスライサーを事前に組み立て、予熱のためにスライサーのシンクに蒸留水を加えます。水温が42°Cに上昇したらスライスを開始します。
- パラフィンスライサーのサンプルスロットにサンプルを固定します。スライス中に断面の厚さを5μmに調整します。
- サンプルを連続的に切断します。スライサータンクの滑り止めスライドの完全にタイル張りのセクションを固定します。
- 切片化後、サンプル組織を貼り付けたスライドを37°Cの生化学インキュベーターに入れ、24時間乾燥させる。スライドを4°Cの冷蔵庫に一時保存する。
7. ヘマトキシリンおよびエオジン染色
- パラフィン切片を60°Cで30分間溶融し、切片を100%キシレンに15分間浸し、繰り返します。
- シェーカーの上で無水エタノールで切片を5分間処理する。
- 切片をシェーカー上で90%エタノール、80%エタノール、および70%エタノールでそれぞれ3分間処理する。
- シェーカーの上の脱イオン水で切片を5分、2分連続して処理します。
- 濡れた箱の上の切片を4mg/mLヘマトキシリン溶液で5分間染色する。流水で切片を10分間すすいでください。
- シェーカーでセクションを最初に脱イオン水で2分間攪拌し、次に0.5%〜1%のエオジンで1分間攪拌します。
- 70%エタノール、80%エタノール、および90%エタノールで切片をシェーカー上で3分間(それぞれ)連続して攪拌する。シェーカー上の無水エタノールで切片を5分間攪拌する。
- 切片を100%キシレンに15分間浸し、浸漬を繰り返す。
- ピペットまたはスポイトを使用して、3〜4滴のニュートラルバルサムをスライドに加え、カバースライドでゆっくりと覆います。スライドを室温で風乾する。
8. 免疫組織化学(IHC)染色
- パラフィン切片を60°Cで30分間溶融し、切片を100%キシレンに10分間浸し、この工程を2回繰り返す。
- シェーカー上の切片を、まず無水エタノール、90%エタノール、および80%エタノールで2分間(それぞれ)、連続して、次いで脱イオン水で3分間攪拌する。脱イオン水で攪拌を2回繰り返す。
- まず、20mLの30%H2O2と180mLのメタノールの混合物で10分間、次いで脱イオン水で5分間、シェーカー上で切片を攪拌する。この手順を 3 回繰り返します。
- 切片をプレボイルドクエン酸緩衝液(3gのNa3C6H5O7.2H2Oおよび0.4gのC6H8O7、pH6.0を含む1Lの脱イオン水)に移し、マイクロ波で10分間、それらを亜臨界沸点に保ち、室温で30分間冷却する。シェーカーの上の脱イオン水でセクションを5分間攪拌します。この手順を 3 回繰り返します。
- シェーカー上の10 mM PBSで切片を5分間攪拌し、このステップを3回繰り返します。濡れた箱の上の組織領域を撥水性マーカーで囲み、すぐに使用できる非免疫ヤギ血清を一滴加えてサンプルを覆い、室温で1時間置きます。
- 血清を取り出し、一次抗体をサンプルに加え( 材料表参照)、4°Cで一晩インキュベートした。 一次抗体を除去し、切片をシェーカー上の10 mM PBSで5分間撹拌し、この撹拌工程を10 mM PBSで3回繰り返した。
- 二次抗体( 材料表を参照)を加えてサンプルを覆い、湿った箱の上で室温で30分間インキュベートします。シェーカー上の10mM PBSで切片を5分間攪拌し、攪拌工程を3回繰り返した。
- 新しく調製した0.03-0.05%3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を加えて、濡れた箱の上のサンプルを覆い、30-90秒間染色する。流水で切片を10分間すすいでください。
メモ:黄色が現れるまで光学顕微鏡で観察して染色時間を制御します。 - 4mg/mLヘマトキシリン溶液を加えてサンプルを覆い、濡れた箱に5分間染色し、流水で切片を10分間すすいでください。
- 80%エタノール、90%エタノール、無水エタノールでシェーカーで切片を2分間ずつ連続して攪拌し、切片を100%キシレンに30分間浸します。
- ピペットまたはスポイトを使用して、3〜4滴のニュートラルバルサムをスライドに加え、カバースライドでゆっくりと覆います。スライドを室温で風乾する。
9. オルガノイド/スフェアのグローバル免疫蛍光染色
メモ: 4% PFA 溶液で固定したオルガノイド/スフェアを 1.5 mL の微量遠心チューブに集めます (手順 5.1 ~ 5.4 を参照)。以下のようにして蛍光標識を行う。
- 30%スクロース溶液1mLをチューブに加えてオルガノイド/スフェアを脱水し、4°Cの冷蔵庫で一晩インキュベートします。
- チューブに 100 μL の PBST 溶液 (0.1% Triton X-100 を含む 10 mM PBS 溶液) を加えてオルガノイド/スフェアを 5 分間すすぎ、チューブを 100 × g で 1 分間遠心分離し、ペレットを回収します。この手順を 3 回繰り返します。
- すぐに使用できる非免疫ヤギ血清0.5〜1mLをチューブに加え、室温で1時間密封する。チューブを100× g で1分間遠心分離し、ペレットを回収する。
- 希釈した一次抗体を数滴加えてペレットを覆うだけで、4°Cの冷蔵庫で48時間インキュベートします。チューブを100 × g で1分間遠心分離し、ペレットを回収する。
- 手順 9.2 を繰り返します。
- 蛍光二次抗体と4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液を数滴チューブに加え、ペレットを覆い、4°Cの冷蔵庫で24時間インキュベートし、光を避けます。
- 手順 9.2 を繰り返して、光を避けます。
- チューブにPBST溶液100μLを加え、光から離して4°Cの冷蔵庫に一時的に保管します。光シート走査顕微鏡を用いてオルガノイド/球体を観察し、撮影する。
10. LGSC pLX-mチェリートランスフェクション
注:レンチウイルス粒子の製造は、BSL2バイオセーフティレベルでバイオセーフティキャビネットとクリーンベンチで実行する必要があります。
- レンチウイルス包装細胞293TをDMEM+10%FBSと共に6ウェルプレート中で37°Cで培養し、5%CO2 で3〜5日間、80%細胞コンフルエントに達する。
- レンチウイルスベクターpLX-mCherryをLGSCにトランスフェクトする。
注:試薬調製は、6ウェルプレートの1ウェルに対して示されています。- 滅菌 1.5 mL 遠沈管を 2 本用意し、各管に 250 μL の DMEM/F12 を追加します。
- 1本のチューブに7.5 μLのトランスフェクション試薬を加え、ピペッティングにより試薬を十分に混合します。
- エンドトキシンを含まないpLX-mCherryプラスミド2 μgとマッチングレンチウイルスパッケージングプラスミドを別のチューブに加え、トランスフェクション試薬(プラスミド2 μL/μg)を追加します。
- 両方の遠沈管で液体を混合し、混合物を室温で5分間放置する。
- 293T細胞の培養液を除去し、ステップ10.2.4からの混合物を293T細胞に加える。8時間後に培養液を新鮮なDMEM+10%FBSに変更する。
- 48時間後、ウイルス上清を初めて採取し、0.45μmのフィルターでろ過します。72時間後、ウイルス上清を2回目に回収し、再度0.45μmフィルターでろ過します。
注:ろ過した上清は両方とも、レンチウイルスの形質導入まで氷上に保管してください。
- DEDマウス(NOD/ShiLtJ)からLGSCを取得します(ステップ1を参照)。
- 予め回収したpLX-mCherryレンチウイルス上清1mLを加え、細胞を再懸濁する。
- 遠沈管を37°CのCO2 インキュベーター内のシェーカーにセットする。 レンチウイルスと細胞との接触を最大化するために100rpmで振ってください。8時間後、混合物を250× g で4分間遠心分離し、上清を除去する。
- 1 mL の DMEM/F12 を加えて、細胞ペレットを再懸濁します。セルカウンターを使用して細胞数を決定し、20 ×μLのマトリックスゲル-LGSCMマトリックスでプレコートされた24ウェルプレートの各ウェルに、合計1~104 個の細胞を100 μLのマトリックスゲル-LGSCMマトリックス(マトリックスゲル:LGSCM = 1:1)に播種します(ステップ1.3.2を参照)。
- 7日間の培養後(ステップ1参照)、蛍光顕微鏡下で赤色蛍光を呈するスフェアを選択し、培養物を拡大した。
11. LGSC同所性移植
注:すべての外科手術はSPF手術室で行われ、すべての手術器具は滅菌されています。
- 赤色蛍光(td-トマト)またはmCherryトランスフェクションで7日間培養したROSA26mT/mG マウスからLGSCスフェアを取得します(ステップ1を参照)。
- 使用前に、マトリックスゲルとDMEM/F12の1:1混合物を含む1.5mL微量遠心チューブを氷上で冷却します。LGSCスフェアを単一細胞に消化し、チューブ内で2〜106 細胞/ mLの密度で細胞×再懸濁する。
- ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)の腹腔内注射によりNOD/ShiLtJマウスを麻酔する。
注:NOD/ShiLtJマウスは、涙液分泌の減少、炎症性浸潤、眼窩潰瘍などの特発性付加症状を有する理想的なモデルである。 - 麻酔後、乾燥を防ぐために目に生理食塩水または獣医軟膏を使用し、次に眼科用はさみを使用して麻酔薬マウスの耳の後ろ(目の近く)の皮膚に5〜8mmのカットを行い、LGを露出させます。
注:ヨードフォアは、切開部周辺の消毒に厳密に使用する必要があります。 - 左側のLGに2個×104 個の細胞を注入し、対照として細胞を含まない混合物を右側のLGに注入する(ステップ11.2を参照)。
- 注射後、LGを眼科用鉗子で元の位置に復元し、創傷を縫合する。マウスに2ヶ月間給餌し、治療の効果を観察します。
注:ケージクッション材も手術後に厳密に滅菌する必要があり、クッション材は1日1回交換する必要があります。創傷を縫合した後、トラマドールを2.5mg / kgの標準用量でマウスの尾静脈に選択的に注射して鎮痛を達成することができる。 - 実験の2ヶ月後にこれらのマウスを麻酔する(ステップ11.3参照)。眼領域の症状をフィルム化する。
- 麻酔中に, 次の症状を探します: 首と四肢の筋肉の弛緩;深く、ゆっくりと、そして安定した呼吸。瞳孔の狭窄;角膜反射失踪。
- 麻酔および手術中は、マウスの体温を37°Cに保ちます。 手術後、創傷感染のリスクを減らすために、マウス用の飲料水に適切な抗生物質を加える。彼らが胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。手術を受けたマウスは、完全に回復するまで他のマウスの会社に戻さないでください。
- 眼領域の症状を撮影した後、ImageJソフトウェアを開き、[ ファイル]をクリック||を開くフリーハンド選択、マウスの左ボタンを押したまま、画像 内の眼窩潰瘍の領域 を選択します。 [分析]|をクリックします。測定 して、潰瘍の相対面積を求める。
- フェノールレッド綿糸を麻酔薬マウスの側方カンサスに10秒間置きます。綿糸の変色した部分の長さを測定して記録します。涙液測定後の頸椎脱臼によりマウスを安楽死させる。
- マウスを解剖し、IHC分析のためにLGsを得る。
12. RNA の単離
注:実験の前に、遠心分離機を4°Cに予冷し、すべての試薬と消耗品にRNAse汚染がないことを確認してください。
- LGSCまたはLGフラグメントを微量遠心チューブに集めます。1mLの細胞溶解バッファーを加え、渦振動によって細胞または組織を完全に溶解する。
- クロロホルム0.2 mLを加え、ボルテックス振動を1分間行った後、室温で10分間静置した。遠心分離機を4°Cで15分間、12,000× g。
注:遠心分離後、液体は3つの層に分割され、RNAは最上部の透明な水相にある。 - 最上部の透明水相を慎重にピペットでつなぎ、新しい 1.5 mL RNAse フリー遠沈管に移します。
- 等量のイソプロピルアルコールを加え、穏やかに混ぜる。混合物を室温で10分間静置し、次いで4°C、12,000× gで15分間遠心分離する。
- 上清を除去し、1mLの75%エタノールを加える。チューブを反転させてペレットを洗浄し、4°C、7,500×gで5分間遠心分離 する。この手順を繰り返します。
- 上清を慎重に取り除き、遠心分離管を超清潔な作業台に入れて約20分間乾燥させます。
メモ:白いペレットが半透明になったら、次の手順に進みます。氷上ですべての操作を実行します。 - RNAseを含まない水を20μL加えてペレットを完全に溶解する。分光光度計( 材料表参照)を用いてRNA濃度を測定し、RNA溶液を-80°Cで保存する。
13. PCR
- 逆転写反応
- PCR反応チューブに全RNAを1μg(RNA溶液の濃度に応じて添加したRNA溶液の体積を計算する)を加え、65°Cで5分間インキュベートして変性させます。
- 氷の上に1分間置き、全量が12μLに達するまで酵素を含まない水を加えます。4 μLの4x DNAマスターミックスを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
- チューブを氷の上に置き、4 μL の 5x RT マスターミックスを加え、軽く混ぜます。37 °C で 15 分間、50 °C で 5 分間、98 °C で 5 分間、4 °C で 1 分間、PCR 設定を行います。
- -20°Cで保存するか、逆転写反応終了後に次のステップに進んでください。
- PCR反応
- 14.1 μL の酵素フリー水、2 μL の dNTP、2 μL の 10x バッファー、0.8 μL のプライマー (10 μM、0.4 μL のフォワードプライマー、および 0.4 μL のリバースプライマー、 材料表を参照)、1 μL の逆転写 cDNA (ステップ 13.1 を参照)、および 0.1 μL の Taq 酵素。
- 調製したPCR反応物をPCR用のPCR装置に入れる。PCR手順については、Taq酵素キットの説明書を参照してください( 材料表を参照)。
- アガロースゲル電気泳動
- 分析天秤を使用して、242gのトリスと37.2gのNa2EDTA・2H2Oの重量を量り、1Lビーカーに加えます。ビーカーに約800mLの脱イオン水と57.1mLの氷酢酸を加え、よく混ぜ合わせ、1Lに脱イオン水を加えて50x TAE緩衝液を得て、室温で保存する。
注:使用前に50x TAEバッファーを脱イオン水で希釈してください。 - 分析天秤を使用して1.2gのアガロースを計量し、80mLの1x TAEバッファーを含む円錐フラスコに加えます。完全に溶解するまで電子レンジで繰り返し加熱します。
- 溶液温度が60°Cに下がるまで水道水の下でフラスコを冷却する。 核酸染色剤を8 μL加え、よく混合した後に溶液を糊化槽に注ぎ、櫛を入れ、室温で30分間静置した。
- 櫛を引き出し、調製したアガロースゲルにPCR産物をロードする。電気泳動を 120 V で 30 分間行います。
- ゲルをECLゲルイメージングシステムに置き、写真を撮ります。
- 分析天秤を使用して、242gのトリスと37.2gのNa2EDTA・2H2Oの重量を量り、1Lビーカーに加えます。ビーカーに約800mLの脱イオン水と57.1mLの氷酢酸を加え、よく混ぜ合わせ、1Lに脱イオン水を加えて50x TAE緩衝液を得て、室温で保存する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D無血清培養システムの確立
本研究では、マウスLGSCs用のEGF、Wnt3A、FGF10、Y-27632を含むLGSCMを開発し、3D培養法によるLGSCCsの単離・培養に成功しました(図1A)。この方法を用いて、C57BL/6マウス、NOD/ShiLtJマウス、BALB/cマウス、およびROSA26mT/mG マウスからのLGSCの3D無血清培養系が成功裏に確立されました16。雄マウスの場合、解離により2つのLGsから1.5-2×106 個の細胞が得られた。1週間の培養後、培養開始時に1〜104 個のLG細胞を播種すると、30〜60個のスフィ×が形成された。また、この方法で培養した細胞は、Epcam、Krt5、Krt14、P63、ネスチン、その他の幹細胞マーカー16を発現し、得られた細胞がLGSCの性質を有していたことを示しており、Krt14およびKi67は、LGSCsを7日間培養して形成された全てのスフェアにおいて発現しており(図1B)、LGSCsが自己複製能を有していたことを示している。
7日間の培養中に、LGSCs球体は直径100μmに達した。ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色は、7日目に細胞性を示した(図1Cおよび図1F)。初代培養および継代培養の7日後に得られたLGSCsの濃縮因子は、この方法で濃縮されたLGSCsが強い増殖能を有することを示した(図1D)。このシステムでは、LGSCは40回以上継代することができ、依然として幹細胞特性を維持していた(図1Eおよび図1G)。結論として、この論文は、インビトロでLGSCのための3D、無血清培養システムを確立するためのプロトコルを記述する。このプロトコールによって培養された細胞は、連続的かつ安定した増殖能を有する。
インビトロで分化を誘導する
インビトロでのLGSCsの分化能を解析した。7日以上培養すると、LGSCは徐々に増殖能を失い、AQP5、Ltf、Krt19、および分化に関連する他のマーカーの発現が増加したが、Krt14の発現は徐々に減少した16。LGSCは、FBSおよび低い割合のマトリックスゲルによってより多くの芽を形成するように誘導された(図2A、B)。さらに、H&E染色は、FBSが球体により多くのキャビテーション構造を生成するように誘導できることを示した(図2C)。
以前の研究は、マトリックス硬度の低下がLGSCの管状オルガノイドへの分化を促進することを示唆した。基底層細胞はKrt14を発現する幹細胞の特徴を維持し、基底上層細胞は空洞を有するダクト様構造に分化し、Krt19を発現した。さらに、FBSの添加は、LGSCを腺房様オルガノイドに分化誘導することができ、それは高い核/細胞質比を有する幹細胞の特性を維持した。いくつかの分化した腺房様細胞は、低い核/細胞質比で高レベルのAQP5を発現した16。
インビボでのLGSCの修復
上記の実験に基づいて、損傷したLGを修復するLGSCの能力は、同所性注射によって探求された。NOD/ShiLtJマウスにROSA-LGSCを同所性注射した後、LGに隣接して新しい涙小葉が形成された(図3A-C)。小葉の大部分はAQP5を高発現する成熟腺房細胞で構成され、AQP5発現の低い小葉管形成があった(図3D-F)。ROSA-LGSCを8週間注射した後、レシピエントの軌道周りの崩壊を測定した。測定は、LGSCの注入が崩壊面積を〜60%減少させることを示した(図3G、H)。解剖は、注射後10週間にLG体積が増加することを示した(図3I)。ROSA-LGSCs注射側の涙液分泌量は、対照側よりも高かったが、野生型マウスよりも低かった(図3J)。これらの結果は、この培養系によって採取された細胞がLGSCsの特性を有し、ADDおよび眼球乾燥症を有するマウスにおける幹細胞療法に使用できることを示している。
図1:LGSCの単離と特性評価 (A)LGSCの一次継代培養および連続継代培養の戦略。(B)7日目におけるLGSCsの免疫蛍光染色。LGSCsは、上皮細胞マーカーE-カドヘリン(赤)、幹細胞マーカーKrt14(赤)、増殖性細胞マーカーKi67(赤)を発現する。カウンターステイン、DAPI(青)。(C)1、3、5、および7日間の培養におけるLGSCの形態。(d)初代培養および継代培養におけるLGSC培養の相対的濃縮因子。相対濃縮因子は、培養物に播種した細胞数に対する培養7日後に得られた全細胞数の比率である。P < 0.01.(E)マウスLGおよび異なる継代LGSC(P1、P10、P20、およびP40)の成体ステム/前駆細胞マーカーの転写。(F)7日目の初代培養におけるLGSCsの形態(左)およびH&E染色(右)。(g)異なる継代(P1、P10、P20、およびP40)で培養したLGSCs。スケールバー = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C).略語: LG = 涙腺;LGSCs=LG幹細胞;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;;NC = ネガティブコントロール;TE = トリプシン-EDTA;H&E=ヘマトキシリンおよびエオジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:インビトロでのLGSCsの分化 (A,B) 通常の培地または分化培地で培養したLGSCの形態。(a)LGSCsをP10(左:通常培地、右:FBS含有培地)中で10日間培養する。(b)LGSCsをP31(左:通常培地、右:1/3番目のマトリックスゲルを用いた培地)中で14日間培養した。(c)14日間培養したLGSCsのH&E染色(上段:通常培地、下段:FBS含有培地)。スケールバー = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C).略語: LG = 涙腺;LGSCs=LG幹細胞;H&E = ヘマトキシリンおよびエオジン;FBS = ウシ胎児血清。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:LGSCの同種移植の生着と付加症状の軽減(A-F)8週間後にROSA-LGSCの7日間の培養物を移植したNOD/ShiLtJ LGのIHC染色。実験群及び対照群と同じマウスの左右両側を使用する。(A-C)抗td-トマト抗体によるIHC染色;(D-F)抗AQP5抗体によるIHC染色;(A、D)ビヒクルを注射したLG(マトリックスゲルとDMEM/F12の1:1混合物)、(B、E)ROSA-LGSCを注射したLG、(C、F)B、Eの黒い四角の拡大画像(赤矢印、小葉内管)。(G、H)8週目にROSA-LGSCを注射した後のNOD/ShiLtJマウス眼窩の状態。LGSCの注射は、眼窩の周りの崩壊を有意に緩和する。(I)10週目におけるNOD/ShiLtJマウスのLGs(左:細胞注射側からのLG、右:対照側からのLG)。(J)8週間後にROSA-LGSCsの7日間培養物を移植した野生型マウスおよびNOD/ShiLtJマウスの涙液量。ROSA-LGSC注射LGの涙液量は、対照LGの涙液量よりも高いが、WT LGの涙液量よりも有意に低い。NOD/ShiLtJマウス、n = 4;P < 0.01;*P < 0.05 です。スケールバー = 50 μm (A-F)。略語: LG = 涙腺;LGSCs=LG幹細胞;IHC = 免疫組織化学的;WT = ワイルドタイプ;ADDED = 水系欠損ドライアイ疾患。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
涙腺幹細胞培養およびLG傷害修復のための涙腺幹細胞の単離および体外培養のための十分に確立された方法がある。Shatos et al.17 および Ackermannet al.6ラット及びマウスの涙道幹細胞をそれぞれ2D培養法により培養及び継代培養することに成功し、ADDの治療のために涙道幹細胞を移植することが可能となった。2Dで培養されたLGsの幹細胞18および間葉系幹細胞19,20に関する研究は、これらの細胞の移植がADDの症状をある程度緩和できることを示した。蛍光活性化細胞選別による、Gromovaら。マウスLGsからLG前駆細胞マーカーを発現する幹細胞を2個選択し、インビトロでダクトやアシニに分化させ、成体幹細胞のLGsの機能細胞への分化に成功しました。また、十分な数の幹細胞の移植がマウスにおけるADD症状を緩和することができることも示された。
幹細胞濃縮の必要を満たし、既存の涙筋幹細胞培養方法における血清依存性を排除するために、このプロトコルにおける涙筋幹細胞の無血清培養システムは、以前に公開された研究およびオルガノイド3D培養技術に基づいて確立された21。したがって、このシステムは、涙道幹細胞の臨床研究を促進することが期待される。このプロトコルでは、重要なステップには、LGSCの初代培養、継代培養および拡大、ならびにマウスの損傷したLGへのLGSCの その場 移植が含まれる。
初代培養はLGSCを取得するための基礎です。初代培養中は無菌状態を維持する必要があります。ウェルは、細胞培養ウェルの底部における細胞の付着増殖を避けるために、マトリックスゲルでプレコーティングされている。マトリックスゲルを使用する場合は、製造業者の指示に従い、実験中のマトリックスゲルの損失および培養中の不均一なマトリックスゲルを避けるために、ウェルに添加する前に常に液体状態に保つ必要があります。
初代培養における播種細胞数は10,000細胞/ウェルである。実際には、細胞の適切な増殖空間および栄養供給が確保されれば、播種される細胞の数を増加させることができる。継代培養は、幹細胞を精製および濃縮するための重要なステップです。継代後、P1世代のLGSCはより多くのスフェアを形成し、P0世代よりも多くのP1世代の細胞が存在した。これは、このシステムにおいて増殖能を有するLGSCが増強されていることを示している。
LGSCをこの3Dシステムで10日間にわたって培養した場合、0.05%トリプシン-EDTAは、継代中にオルガノイドを単一細胞に完全に消化するのに十分ではないことがありました。この問題は、消化時間を適切に延長することによって解決された。 その場での 注射療法は、LGSCの臨床的価値を検証するために必要な手順です。マウスのLGsのサイズが小さく、組織が薄くて緩いため、細胞懸濁液を通常の生理食塩水または注射用の10mM PBSで調製すると、細胞は常に注射部位から失われます。したがって、注射のために細胞懸濁液をマトリックスゲルと混合することが推奨される。このシステムで使用されるマトリックスゲルは10°Cを超える温度で固化するので、細胞はLGに注入されると容易にコロニー形成することができる。細胞とマトリックスゲルの混合物は、注射前に常に氷上に保持されなければならず、注射は迅速に行われる。
正常マウスからLGSCを単離することに加えて、ADDマウスから成体LGSCsを単離し、このプロトコルを用いて初めて培養することに成功した16。しかし、このシステムには欠陥と未解決の問題があります。第1に、使用されるマトリックスゲルは、マウス22,23に由来するものであり、これは人体において拒絶反応を引き起こす可能性があり、したがって、臨床適用性は限られている。マトリックスゲルを置き換える適切な合成ゲルを見つけることによって培養系を改善する必要がある。
第二に、このプロトコルにおける差別化戦略を改善する必要があります。分化21 のための培養時間を延長したり、培養培地に血清を添加したりする代わりに、特定の成長因子を添加し、指向性誘導のための特定の環境条件を変更すると、所望の結果が得られることが期待される。分化を引き起こすシグナル伝達経路を解明することにより、LGSCsの維持・分化のメカニズムをさらに解明する必要がある。さらに、これまでの研究 では、インビトロで 培養した筋上皮細胞がNestin、Musashi、Pax6などの幹細胞遺伝子も発現していることが判明しており、筋上皮細胞にも幹細胞特性があることが示されています17。
この研究は筋上皮細胞に何の注意も払わなかったため、筋上皮細胞の特異的発現マーカーを同定することによって、LGオルガノイド中に筋上皮細胞が存在するかどうかを検証しなかった。培養条件の制限により、筋上皮細胞を誘導できなかったり、その数が少なすぎて観察できなかったりした。培養時間を延長して、オルガノイドがさらに筋上皮細胞に分化するかどうかを観察するか、分化誘導および系改善の将来の研究において筋上皮細胞に焦点を当てることができる。
結論として、このプロトコルは、LGの開発、修復、および再生のためにLGSCを研究するための方法を提供する。インビトロでのLGSCの分化は、LGの将来の インビトロ 再生の基礎となる可能性があり、LGSCの単離および培養は、幹細胞同種移植における拒絶反応の問題を解決することができる。 この方法は、LGSCによる眼球乾燥症の臨床的個別化治療のための重要な基礎を提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(第31871413号)と広東省科学技術の2つのプログラム(2017B020230002と2016B030231001)からの助成金によって支援されました。研究中に私たちを助けてくれた研究者と、動物ケアのサポートのために動物センターで働くスタッフに本当に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | - | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | - | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | - | |
| Yeast Extract | OXID | - | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
- Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
- Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
- You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
- Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
- Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
- Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
- Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
- Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).
