涙腺幹細胞のための3次元、無血清培養システム
Summary
成体涙腺(LG)幹細胞の三次元無血清培養法は、LGオルガノイドの形成および腺房または腺管様細胞への分化の誘導のために十分に確立されている。
Abstract
涙腺(LG)幹細胞ベースの治療は、涙腺疾患のための有望な戦略です。しかしながら、十分な数のLG幹細胞(LGSC)を得るための信頼性の高い無血清培養方法の欠如は、さらなる研究および応用のための1つの障害である。成体マウスLGSCsの三次元(3D)無血清培養法は十分に確立されており、ここに示されている。LGSCsを連続的に継代し、腺房または乳管様細胞に分化誘導することができた。
LGSC初代培養のために、6〜8週齢のマウスからのLGsを、ディスパーゼ、コラゲナーゼI、およびトリプシン−EDTAで消化した。合計1個×104個の単一細胞を、24 ウェルプレートの各ウェル中のマトリックスゲル涙腺幹細胞培地(LGSCM)マトリックス80μLに播種し、20μLのマトリックスゲルLGSCMマトリックスでプレコートした。この混合物を37°Cで20分間インキュベートした後に固化し、LGSCMを600μL添加した。
LGSC維持のために、7日間培養したLGSCsを、ディスパーゼおよびトリプシン−EDTAによって単一細胞に脱凝集させた。この単一細胞を移植し、LGSC初代培養に用いた方法に従って培養した。LGSCは40回以上継代することができ、ステム/前駆細胞マーカーKrt14、Krt5、P63、およびネスチンを連続的に発現することができる。LGSCMで培養されたLGSCCは自己複製能を有し、インビトロおよびインビボで腺房または乳管様細胞に分化し得る。
Introduction
涙腺幹細胞(LGSC)は、涙腺(LG)細胞の再生を維持し、腺房および乳管細胞の供給源である。したがって、LGSC移植は、重篤な炎症性損傷および水性欠損ドライアイ疾患(ADDED)1、2、3を治療するための代替的アプローチと考えられている。Tiwariらは、コラーゲンIおよびいくつかの成長因子を添加したマトリックスゲルを用いて初代LG細胞を分離および 培養した。しかしながら、LG細胞を連続的に培養することができなかった4。二次元(2D)培養を用いて、マウスLG由来幹細胞を、Youら5 およびAckermannらによって単離した。図6から、幹/前駆細胞マーカー遺伝子、 Oct4、 Sox2、 Nanog、および ネスチンを発現することが見出され、継代培養することができた。しかしながら、これらの細胞が腺房細胞や乳管細胞に分化しうるという明確な兆候はなく、 生体内での分化能を検証する移植実験もない。
最近、c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34–/CD45–細胞をフローサイトメトリーによりマウスLGから単離し、Pax6やRunx1などのLG前駆細胞マーカーを発現することが判明し、インビトロでダクトやアチーニに分化した。ADDのマウスでは、これらの細胞による同所性注射は、損傷したLGを修復し、LGs2の分泌機能を回復させることができる。しかしながら、この方法により単離された幹細胞の数は少なく、単離されたLGSCsを増殖させるのに好適な培養条件はなかった。要約すると、ADDEDの治療におけるLGSCsの研究のために、安定的かつ継続的な拡大を伴う成人LGSCを効果的に単離および培養するために、適切な培養システムを確立する必要がある。
幹細胞または多能性幹細胞に由来するオルガノイドは、関連する器官に組織学的に類似しており、それら自身の再生を維持することができる細胞群である。2009年に佐藤らによってマウス腸オルガノイドの培養に成功した後7、佐藤の培養系に基づいて他の臓器由来のオルガノイドを連続して培養し、例えば胆嚢8、肝臓9、膵臓10、胃11、乳房12、肺13、前立腺14、及び唾液腺15.オルガノイド培養における細胞分化前の成体幹細胞の割合が高いため、三次元(3D)オルガノイド培養法はLGの成体幹細胞の単離および培養に最適と考えられる。
本研究では、3D無血清培養法を最適化することにより、成体マウスLGSC培養系を確立した。正常マウスとADDマウスの両方から培養したLGSCsは、自己複製および増殖の安定した能力を示したことが証明されている。ADDマウスLGsへの移植後、LGSCsは障害のあるLGsに定着し、涙液産生を改善した。また、ROSA26mT/mG マウスから赤色蛍光LGSCsを単離し、培養した。この研究は、イン ビトロでの LGSC濃縮およびADD療法の臨床応用におけるLGSC自家移植片の信頼できる参照を提供する。
Protocol
このプロトコルのすべての実験は、Sun Yat-sen Universityの動物実験に関する倫理委員会の動物ケアガイドラインに従っていました。すべてのセル関連操作は、セル操作室の超クリーンワークベンチで実行されます。キシレンを使用するすべての操作は、ヒュームフード内で行われるべきである。 1. LGSCの初代文化 LG電子絶縁 生後6〜8週のBALB/cオスマ?…
Representative Results
3D無血清培養システムの確立本研究では、マウスLGSCs用のEGF、Wnt3A、FGF10、Y-27632を含むLGSCMを開発し、3D培養法によるLGSCCsの単離・培養に成功しました(図1A)。この方法を用いて、C57BL/6マウス、NOD/ShiLtJマウス、BALB/cマウス、およびROSA26mT/mG マウスからのLGSCの3D無血清培養系が成功裏に確立されました16。雄マウスの場合、解離によ?…
Discussion
涙腺幹細胞培養およびLG傷害修復のための涙腺幹細胞の単離および体外培養のための十分に確立された方法がある。Shatos et al.17 および Ackermannet al.6ラット及びマウスの涙道幹細胞をそれぞれ2D培養法により培養及び継代培養することに成功し、ADDの治療のために涙道幹細胞を移植することが可能となった。2Dで培養されたLGsの幹細胞<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(第31871413号)と広東省科学技術の2つのプログラム(2017B020230002と2016B030231001)からの助成金によって支援されました。研究中に私たちを助けてくれた研究者と、動物ケアのサポートのために動物センターで働くスタッフに本当に感謝しています。
Materials
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | – | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | – | |
| Yeast Extract | OXID | – | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
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Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).