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Biology

लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल के लिए त्रि-आयामी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

वयस्क लैक्रिमल ग्रंथि (एलजी) स्टेम कोशिकाओं के लिए त्रि-आयामी, सीरम मुक्त संस्कृति विधि एलजी ऑर्गेनोइड गठन के प्रेरण और एसीनार या डक्टल जैसी कोशिकाओं में भेदभाव के लिए अच्छी तरह से स्थापित है।

Abstract

लैक्रिमल ग्रंथि (एलजी) स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा लैक्रिमल ग्रंथि रोगों के लिए एक आशाजनक रणनीति है। हालांकि, पर्याप्त संख्या में एलजी स्टेम सेल (एलजीएससी) प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय, सीरम मुक्त संस्कृति विधि की कमी आगे के शोध और अनुप्रयोग के लिए एक बाधा है। वयस्क माउस एलजीएससी के लिए त्रि-आयामी (3 डी), सीरम मुक्त संस्कृति विधि अच्छी तरह से स्थापित है और यहां दिखाया गया है। एलजीएससी को लगातार पारित किया जा सकता है और एसीनार या डक्टल जैसी कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।

एलजीएससी प्राथमिक संस्कृति के लिए, 6-8 सप्ताह के चूहों के एलजी को डिसपेज, कोलेजनेज आई और ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ पचाया गया था। कुल 1 × 104 एकल कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल-लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल माध्यम (एलजीएससीएम) मैट्रिक्स के 80 μL में 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में वरीयता दी गई थी, मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मैट्रिक्स के 20 μL के साथ प्रीकोटेड किया गया था। मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के बाद जम गया था, और एलजीएससीएम के 600 μL जोड़ा गया था।

एलजीएससी रखरखाव के लिए, 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत एलजीएससी को डिसपेज और ट्रिप्सिन-ईडीटीए द्वारा एकल कोशिकाओं में अलग किया गया था। एकल कोशिकाओं को एलजीएससी प्राथमिक संस्कृति में उपयोग की जाने वाली विधि के अनुसार प्रत्यारोपित और सुसंस्कृत किया गया था। एलजीएससी को 40 से अधिक बार पारित किया जा सकता है और लगातार स्टेम / पूर्वज सेल मार्कर केआरटी 14, केआरटी 5, पी 63 और नेस्टिन को व्यक्त किया जा सकता है। एलजीएससीएम में सुसंस्कृत एलजीएससी में आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और इन विट्रो और विवो में एसीनार या डक्टल जैसी कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं।

Introduction

लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल (एलजीएससी) लैक्रिमल ग्रंथि (एलजी) सेल नवीकरण बनाए रखते हैं और एसीनार और डक्टल कोशिकाओं का स्रोत होते हैं। इसलिए, एलजीएससी प्रत्यारोपण को गंभीर भड़काऊ क्षति और जलीय-कमी वाले शुष्क आंख रोग (एडीडी) 1,2,3 के इलाज के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण माना जाता है। एलजीएससी को समृद्ध करने के लिए कई संस्कृति विधियों को लागू किया गया है तिवारी एट अल कोलेजन आई और मैट्रिक्स जेल का उपयोग करके अलग और सुसंस्कृत प्राथमिक एलजी कोशिकाओं को कई विकास कारकों के साथ पूरक किया गया है; हालाँकि, एलजी कोशिकाओं को लगातार सुसंस्कृत नहीं किया जा सका4. द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृति का उपयोग करते हुए, माउस एलजी-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं को यू एट अल 5 और एकरमैन एट अल द्वारा अलग किया गया था। पूर्वज सेल मार्कर जीन, अक्टूबर 4, सोक्स 2, नैनोग और नेस्टिन को व्यक्त करने के लिए पाया गया, और उपसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, कोई स्पष्ट संकेत नहीं है कि ये कोशिकाएं एसिनार या डक्टल कोशिकाओं में अंतर कर सकती हैं, और विवो में भेदभाव क्षमता को सत्यापित करने के लिए कोई प्रत्यारोपण प्रयोग नहीं है।

हाल ही में, सी-किट + मंद / ईपीसीएएम +/ एससीए 1-/ सीडी 34-/ सीडी 45- कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा माउस एलजी से अलग किया गया था, जो एलजी पूर्वज सेल मार्करों, जैसे पैक्स 6 और रनक्स 1 को व्यक्त करने के लिए पाया गया था, और इन विट्रो में नलिकाओं और एसिनी में विभेदित किया गया था। जोड़ा के साथ चूहों में, इन कोशिकाओं के साथ ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन क्षतिग्रस्त एलजी की मरम्मत और एलजी2 के स्रावी समारोह को बहाल कर सकता है। हालांकि, इस पद्धति द्वारा पृथक स्टेम कोशिकाओं की संख्या छोटी थी, और पृथक एलजीएससी के विस्तार के लिए कोई उपयुक्त संस्कृति की स्थिति नहीं है। संक्षेप में, एडीजेड के उपचार में एलजीएससी के अध्ययन के लिए स्थिर और निरंतर विस्तार के साथ वयस्क एलजीएससी को प्रभावी ढंग से अलग करने और संस्कृति करने के लिए एक उपयुक्त संस्कृति प्रणाली स्थापित करने की आवश्यकता है।

स्टेम कोशिकाओं या प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त ऑर्गेनोइड कोशिकाओं का एक समूह है जो हिस्टोलॉजिकल रूप से संबंधित अंगों के समान हैं और अपने स्वयं के नवीकरण को बनाए रख सकते हैं। 20097 में, अन्य अंगों से ऑर्गेनोइड को सातो की संस्कृति प्रणाली के आधार पर उत्तराधिकार में सुसंस्कृत किया गया था, जैसे पित्ताशय की थैली8, यकृत9, अग्न्याशय10, पेट11, स्तन12, फेफड़े13, प्रोस्टेट14, और लार ग्रंथि15 . ऑर्गेनोइड संस्कृति में सेल भेदभाव से पहले वयस्क स्टेम कोशिकाओं के उच्च अनुपात के कारण, तीन आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड संस्कृति विधि को एलजी के वयस्क स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए इष्टतम माना जाता है।

3 डी, सीरम मुक्त संस्कृति विधि का अनुकूलन करके वर्तमान अध्ययन में एक वयस्क माउस एलजीएससी संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई थी। यह साबित हुआ है कि सामान्य और अतिरिक्त चूहों दोनों से सुसंस्कृत एलजीएससी ने आत्म-नवीकरण और प्रसार की स्थिर क्षमता दिखाई। जोड़े गए माउस एलजी में प्रत्यारोपण के बाद, एलजीएससी ने बिगड़ा हुआ एलजी का उपनिवेश किया और आंसू उत्पादन में सुधार किया। इसके अलावा, लाल फ्लोरोसेंट एलजीएससी को आरओएसए 26एमटी / एमजी चूहों से अलग किया गया और सुसंस्कृत किया गया। यह काम जोड़ा चिकित्सा के लिए नैदानिक अनुप्रयोग में इन विट्रो और एलजीएससी ऑटोग्राफ्ट में एलजीएससी संवर्धन के लिए एक विश्वसनीय संदर्भ प्रदान करता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी प्रयोगों ने सूर्य यात-सेन विश्वविद्यालय के पशु परीक्षण पर नैतिक समिति के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन किया। सेल से संबंधित सभी ऑपरेशन सेल ऑपरेशन रूम में अल्ट्राक्लीन वर्कबेंच पर किए जाने हैं। जाइलीन का उपयोग करने वाले सभी ऑपरेशन धुएं के हुड में किए जाने हैं।

1. एलजीएससी प्राथमिक संस्कृति

  1. एलजी अलगाव
    1. सी पुरुष माउस प्राप्त करें, और एलजी और इसके चारों ओर संयोजी ऊतक को उजागर करने के लिए कान के पीछे की त्वचा को काट लें। चिमटी की मदद से कुंद विच्छेदन द्वारा संयोजी ऊतक को छीलें और एलजी को हटा दें।
    2. 6 सेमी डिश में रक्त को हटाने के लिए बाँझ 10 एमएम पीबीएस समाधान के 4 एमएल के साथ एलजी को दो बार कुल्लाएं। 10 एस के लिए 75% इथेनॉल के 4 एमएल के साथ 6 सेमी डिश में एलजी विसर्जित करें और तुरंत दो बार 10 एमएम पीबीएस के साथ कुल्ला करें।
  2. एलजी की एकल कोशिकाओं को प्राप्त करें
    1. 25 यू / एमएल डिस्पेज तैयार करने के लिए एचईपीईएस बफर समाधान (50 एमएम एचईपीईएस / केओएच, पीएच 7.4; अल्ट्राप्योर पानी में 150 एमएम एनएसीएल) का उपयोग करें। अल्ट्राप्योर पानी के साथ 0.1% कोलेजनेज आई समाधान तैयार करें।
    2. छोटे टुकड़ों (लगभग 1 मिमी3) में एलजी को काटें, उन्हें बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 25 यू / एमएल डिस्पेस के 500 μL और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 0.1% कोलेजनेज I के 500 μL के साथ ऊतकों का इलाज करें।
    3. ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (0.05 ग्राम / एल ट्रिप्सिन, 0.04 ग्राम / एल ईडीटीए) तैयार करने के लिए 10 एमएम पीबीएस का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल के साथ चरण 1.2.2 से एलजी टुकड़ों का इलाज करें और बार-बार पाइपिंग करके टुकड़ों को एकल कोशिकाओं में अलग करें।
    4. एक 70 μm फिल्टर के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर, एक बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में छानना इकट्ठा, और 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, सेल गोली को धोने के लिए 10 एमएम पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें, और निलंबन को अपकेंद्रित्र करें।
    6. चरण 1.2.5 दोहराएं, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और सेल छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए डीएमईएम / एफ 12 (डलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम और हैम के एफ -12 का 1: 1 मिश्रण) के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. एलजीएससी प्राथमिक संस्कृति
    1. एफ 12, 1 एक्स एन 2 पूरक, 1 एक्स बी 27 पूरक, 2 एमएम ग्लूटामाइन विकल्प, 0.1 एमएम एनईएए (गैर-आवश्यक अमीनो एसिड), 50 एनजी / एमएल म्यूरिन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 100 एनजी / एमएल फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 10 (एफजीएफ 10), 10 एनजी / एमएल डब्ल्यूएनटी 3 ए, और 10 एनजी / एमएल डब्ल्यूएनटी 3 ए युक्त लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल माध्यम (एलजीएससीएम) तैयार करें।
    2. 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं के केंद्र में मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मैट्रिक्स (मैट्रिक्स जेल: एलजीएससीएम = 1: 1) के 20 μL जोड़ें। एक विंदुक टिप का प्रयोग करें एक सर्कल (6-8 मिमी व्यास) के लिए विस्तार करने के लिए और अच्छी तरह से प्रीकोट करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
    3. सेल नंबर निर्धारित करने के लिए एक सेल काउंटर का उपयोग करें और मैट्रिक्स जेल के 40 μL में कुल 1 × 104 कोशिकाओं के साथ एलजीएससीएम के 40 μL जोड़ें। मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मिश्रण (मैट्रिक्स जेल: एलजीएससीएम = 1: 1) प्राप्त करने के लिए उन्हें धीरे-धीरे एक पिपेट के साथ मिलाएं।
    4. चरण 1.3.2 में 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्रीकोटेड क्षेत्र पर मिश्रण के 80 μL को ध्यान से छोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं और एलजीएससीएम के 600 μL जोड़ें।
    6. हर दो दिन में एक बार प्रत्येक कुएं में संस्कृति माध्यम बदलें। संस्कृति के 7 दिनों के बाद, एलजीएससी क्षेत्रों की तलाश करें जो उल्टे माइक्रोस्कोप (आईपीस: 10 एक्स, उद्देश्य: 4 एक्स) के तहत 100-300 μm व्यास हैं।
      नोट: एलजीएससी को कुल मिलाकर 14 दिनों से अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  4. ऊपर वर्णित चरणों का पालन करते हुए आरओएसए 26एमटी / एमजी चूहों और डीईडी चूहों (एनओडी / शिल्टजे) के प्राथमिक एलजीएससी को अलग और संस्कृति दें।

2. एलजीएससी रखरखाव और मार्ग

  1. क्षेत्र संस्कृति से संस्कृति माध्यम को अच्छी तरह से हटा दें।
  2. एमएल डिस्पेस के 20 μL और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10 एमएम पीबीएस के 100 μL में इनक्यूबेशन करके 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत एलजीएससी क्षेत्रों को अलग करें।
  3. 4 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए निलंबन स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल के साथ गोले का इलाज करें। ट्रिप्सिन को बेअसर करने और एकल कोशिकाओं में गोले को अलग करने के लिए बार-बार 0.05% ट्रिप्सिन अवरोधक (टीआई) और पिपेट के 1 एमएल जोड़ें।
  5. 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और गोली में एलजीएससी प्राप्त करने के लिए सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। एलजीएससी गोली को फिर से निलंबित करने के लिए एलजीएससीएम के 1 एमएल जोड़ें।
  6. चरण 1.3.1 से 1.3.6 में वर्णित एकल कोशिकाओं को प्लेट करें।

3. एलजीएससी भेदभाव

  1. प्रक्रिया 1: यादृच्छिक भेदभाव के लिए एलजीएससी संस्कृति प्रणाली के साथ एलजीएससी के संस्कृति समय को 7 से 14 दिनों तक बढ़ाएं।
  2. प्रक्रिया 2: डक्टल कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एलजीएससी संस्कृति की शुरुआत में मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मिश्रण के अनुपात को 1: 1 से 1: 2 तक बदलें। 14 दिनों के लिए प्रेरण के लिए मैट्रिक्स में एलजीएससी बीज (चरण 1.3 देखें)।
  3. प्रक्रिया 3: पारित होने के बाद, एलजीएससीएम को एलजीएससीएम -10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) मिश्रण के साथ एसीनार कोशिकाओं के भेदभाव के लिए बदलें। 14 दिनों के लिए भेदभाव को प्रेरित करें।

4. एलजी ऊतक निर्जलीकरण

  1. एलजी ऊतकों (चरण 1.1.1) प्राप्त करें और 2 मिनट के लिए 6 सेमी पकवान में बाँझ 10 एमएम पीबीएस समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ एलजी कुल्ला। 24 घंटे के लिए निर्धारण के लिए 10% फॉर्मलिन समाधान के लिए ऊतकों ले जाएँ।
  2. फॉर्मलिन को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 10 एमएम पीबीएस के साथ निश्चित ऊतकों को कुल्ला, और ऊतक को एक ऊतक एम्बेडिंग बॉक्स में स्थानांतरित करें। एम्बेडिंग बॉक्स को स्वचालित डिहाइड्रेटर में रखें।
  3. निम्नानुसार ऊतकों को निर्जलित करने के लिए स्वचालित निर्जलीकरण का उपयोग करें: 70% इथेनॉल, 2 घंटे; 80% इथेनॉल, 2 घंटे; 90% इथेनॉल, 30 मिनट; 95% इथेनॉल, 30 मिनट; निरपेक्ष इथेनॉल, 30 मिनट; निरपेक्ष इथेनॉल, 2 घंटे; निरपेक्ष इथेनॉल: 100% जाइलीन (1: 1) मिश्रण, 30 मिनट; 100% जाइलीन, 30 मिनट; 100% जाइलीन, 2 घंटे; 100% जाइलीन: पैराफिन (1: 1) मिश्रण, 30 मिनट; पैराफिन, 2 घंटे; पैराफिन, 3 घंटे।

5. एलजी ऑर्गेनोइड /

  1. गोले (चरण 2.1-2.3) 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में प्राप्त करें और 2 मिनट के लिए बाँझ 10 एमएम पीबीएस समाधान के 1 एमएल के साथ एलजी ऑर्गेनोइड /
  2. 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान निम्नानुसार तैयार करें: 10 एमएम पीबीएस के 400 एमएल और 1 एम एनएओएच के 40 μL के मिश्रण में 20 ग्राम पीएफए जोड़ें, समाधान को अच्छी तरह से हिलाएं, और इसे 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2 घंटे के लिए गर्म करें जब तक कि पीएफए पूरी तरह से भंग न हो जाए। कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद, वॉल्यूम को 500 एमएल तक बनाने के लिए 10 एमएम पीबीएस का उपयोग करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. क्षेत्र गोली के साथ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 4% पीएफए का 1 एमएल जोड़ें और निर्धारण के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें।
  5. निर्धारण के बाद, 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। क्षेत्र गोली के साथ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 10 एमएम पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और पीएफए को कुल्ला करने के लिए 2 मिनट के लिए पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  6. 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  7. हीट एम्बेडिंग हाइड्रोगेल भंग करने और ऑर्गेनोइड /क्षेत्र गोली और मिश्रण करने के लिए एम्बेडिंग हाइड्रोगेल के 50-60 μL जोड़ने के लिए। एक छोटी बूंद के रूप में पैराफिल्म पर मिश्रण पिपेट और कमरे के तापमान पर जमने के लिए 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  8. निम्नानुसार एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ऑर्गेनोइड / गोले के साथ जेल को निर्जलित करें।
    1. ट्यूब में 50% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पाइपिंग द्वारा ट्यूब से तरल निकालें। इथेनॉल एकाग्रता को क्रमिक रूप से 70%, 80%, 90%, 95% में बदलकर इस चरण को दोहराएं।
    2. ट्यूब में पूर्ण इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पाइपिंग द्वारा ट्यूब से तरल निकालें। इस चरण को दोहराएं।
    3. ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर पूर्ण इथेनॉल और 100% जाइलीन के 0.5 एमएल के मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पाइपिंग द्वारा ट्यूब से तरल निकालें।
    4. ट्यूब में 100% जाइलीन का 1 एमएल जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पाइपिंग द्वारा ट्यूब से तरल निकालें। इस चरण को दोहराएं।
      नोट: चरण 5.8.5-5.8.6 65 डिग्री सेल्सियस पर एक धातु स्नान में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    5. ट्यूब में पैराफिन के 0.5 एमएल और 100% जाइलीन के 0.5 एमएल के मिश्रण का 1 एमएल जोड़ें, 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पाइपिंग द्वारा ट्यूब से तरल निकालें।
    6. ट्यूब में पैराफिन के 1 एमएल जोड़ें, 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पाइपिंग द्वारा ट्यूब से तरल निकालें। इस चरण को दोहराएं और प्रसंस्करण समय को 1 घंटे तक बढ़ाएं।

6. पैराफिन एम्बेडिंग और सेक्शनिंग

  1. पैराफिन एम्बेडिंग
    1. एम्बेडिंग से पहले, एम्बेडिंग मशीन को चालू करें और पैराफिन टैंक में पैराफिन मोम को पिघलाने के लिए इसे पहले से गरम करें।
    2. एम्बेडिंग लोहे के बॉक्स के नाली में निर्जलित ऊतक या ऑर्गेनोइड / गोले जेल रखें, और एम्बेडिंग मशीन के पैराफिन में लोहे के बॉक्स को रखें।
    3. प्लास्टिक के ढक्कन को हटा दें और इसे कवर करने के लिए लोहे के बॉक्स पर प्लास्टिक एम्बेडिंग बॉक्स रखें। एम्बेडिंग लोहे के बॉक्स को शीतलन तालिका में ले जाएं।
    4. पैराफिन एम्बेडिंग बॉक्स में ब्लॉक में संघनित होने के बाद, इसे लोहे के बॉक्स से हटा दें और इसे सीधे स्लाइस करें या इसे अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
  2. पैराफिन सेक्शनिंग
    1. पैराफिन स्लाइसिंग से पहले, पैराफिन स्लाइसर को प्रीसेंबल करें और प्रीहीटिंग के लिए स्लाइसर के सिंक में आसुत जल जोड़ें। जब पानी का तापमान 42 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ जाता है तो टुकड़ा करना शुरू करें।
    2. पैराफिन स्लाइसर के नमूना स्लॉट पर नमूना ठीक करें। टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान 5 μm करने के लिए अनुभाग मोटाई समायोजित करें।
    3. लगातार नमूने को अनुभाग करें। स्लाइसर टैंक में एंटीस्लिप स्लाइड पर पूरी तरह से टाइल वाले अनुभाग को ठीक करें।
    4. सेक्शनिंग के बाद, 24 घंटे के लिए सुखाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जैव रासायनिक इनक्यूबेटर में नमूना ऊतक के साथ चिपका स्लाइड रखें। अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में स्लाइड स्टोर करें।

7. हेमटॉक्सिलिन और इओसिन धुंधला

  1. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन वर्गों पिघलाएं, 15 मिनट के लिए 100% जाइलीन में वर्गों को भिगोएं, और दोहराएं।
  2. 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पूर्ण इथेनॉल के साथ वर्गों का इलाज करें।
  3. 90% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, और एक प्रकार के बरतन पर 70% इथेनॉल के साथ वर्गों का इलाज करें, प्रत्येक 3 मिनट के लिए।
  4. क्रमिक रूप से 5 मिनट और 2 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर विआयनीकृत पानी के साथ वर्गों का इलाज करें।
  5. एमएल हेमटॉक्सिलिन समाधान के साथ 5 मिनट के लिए एक गीले बॉक्स पर वर्गों को दाग दें। 10 मिनट के लिए बहते पानी में वर्गों कुल्ला।
  6. 2 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ पहले एक प्रकार के बरतन पर वर्गों आंदोलन और फिर 1 मिनट के लिए 0.5% -1% eosin के साथ।
  7. क्रमिक रूप से 3 मिनट (प्रत्येक) के लिए एक प्रकार के बरतन पर 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, और 90% इथेनॉल के साथ वर्गों आंदोलन। 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पूर्ण इथेनॉल के साथ वर्गों आंदोलन।
  8. 15 मिनट के लिए 100% जाइलीन में वर्गों को भिगोएँ और भिगोने को दोहराएं।
  9. स्लाइड में तटस्थ बाल्सम की 3-4 बूंदें जोड़ने के लिए एक पिपेट या ड्रॉपर का उपयोग करें, और इसे धीरे-धीरे कवर स्लाइड के साथ कवर करें। कमरे के तापमान पर स्लाइड्स को हवा से सुखाएं।

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला हो जाना

  1. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन वर्गों पिघलाएं, 10 मिनट के लिए 100% जाइलीन में वर्गों को भिगोएं, और इस चरण को दो बार दोहराएं।
  2. निरपेक्ष इथेनॉल, 90% इथेनॉल, और 2 मिनट (प्रत्येक) के लिए 80% इथेनॉल के साथ पहले एक प्रकार के बरतन पर वर्गों को उत्तेजित करें, क्रमिक रूप से, और फिर 3 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ। विआयनीकृत पानी के साथ आंदोलन को दो बार दोहराएं।
  3. 10 मिनट के लिए 30% एच 2 ओ 2 और 180 एमएल मेथनॉल के20एमएल के मिश्रण के साथ पहले एक प्रकार के बरतन पर वर्गों को उत्तेजित करें और फिर 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  4. वर्गों को प्रीबॉइल्ड साइट्रिक एसिड बफर (ना 3 सी 6 एच5ओ7.2 एच 2 ओ और 0.4 ग्राम सी6एच8ओ7, पीएच 6.0के3ग्राम के साथ 1 एल विआयनीकृत पानी) में स्थानांतरित करें, उन्हें सबक्रिटिकल क्वथनांक पर रखने के लिए 10 मिनट के लिए माइक्रोवेव करें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें। 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर विआयनीकृत पानी के साथ वर्गों आंदोलन। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  5. 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर 10 एमएम पीबीएस के साथ वर्गों आंदोलन, और तीन बार इस कदम को दोहराने। पानी-रिपेलेंट मार्कर के साथ गीले बॉक्स पर ऊतक क्षेत्र को संलग्न करें, नमूनों को कवर करने के लिए तैयार-टू-यूज नॉनइम्यून बकरी सीरम की एक बूंद जोड़ें, और उन्हें 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
  6. सीरम निकालें, नमूनों में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें, 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर 10 एमएम पीबीएस के साथ वर्गों आंदोलन, और तीन बार 10 एमएम पीबीएस के साथ इस आंदोलन कदम को दोहराने।
  7. नमूनों को कवर करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गीले बॉक्स पर उन्हें सेते हैं। 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर 10 एमएम पीबीएस के साथ वर्गों आंदोलन, और आंदोलन कदम तीन बार दोहराने।
  8. गीले बॉक्स पर नमूनों को कवर करने और 30-90 एस के लिए दाग करने के लिए ताजा तैयार 0.03-0.05% 3,3'-डायमिनोबेन्ज़िडाइन (डीएबी) समाधान जोड़ें। 10 मिनट के लिए बहते पानी के साथ वर्गों कुल्ला।
    नोट: पीले रंग प्रकट होता है जब तक एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखकर धुंधला समय को नियंत्रित करें।
  9. एमएल हेमटॉक्सिलिन समाधान जोड़ें नमूने को कवर करने के लिए, एक गीले बॉक्स पर 5 मिनट के लिए दाग, और 10 मिनट के लिए बहते पानी के साथ वर्गों कुल्ला।
  10. 80% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, और 2 मिनट प्रत्येक के लिए निरपेक्ष इथेनॉल के साथ एक प्रकार के बरतन पर वर्गों आंदोलन, क्रमिक रूप से, और 30 मिनट के लिए 100% जाइलीन में वर्गों को भिगोना।
  11. स्लाइड में तटस्थ बाल्सम की 3-4 बूंदें जोड़ने के लिए एक पिपेट या ड्रॉपर का उपयोग करें, और इसे धीरे-धीरे कवर स्लाइड के साथ कवर करें। कमरे के तापमान पर स्लाइड्स को हवा से सुखाएं।

9. ऑर्गेनोइड/गोले का वैश्विक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना

नोट: 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 4% पीएफए समाधान के साथ तय किए गए ऑर्गेनोइड /गोले एकत्र करें (चरण 5.1 से 5.4 देखें)। प्रतिदीप्ति लेबलिंग निम्नानुसार करें।

  1. गोले को ट्यूब में 30% सुक्रोज समाधान के 1 एमएल जोड़कर निर्जलित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में रात भर सेते हैं।
  2. 5 मिनट के लिए ऑर्गेनोइड/गोले कुल्ला करने के लिए ट्यूब में पीबीएसटी समाधान (0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ 10 एमएम पीबीएस समाधान) के 100 μL जोड़ें, 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें, और गोली इकट्ठा करें। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
  3. ट्यूब में 0.5-1 एमएल तैयार गैर-प्रतिरक्षित बकरी सीरम जोड़ें और इसे 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सील करें। 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और गोली इकट्ठा।
  4. सिर्फ गोली को कवर करने के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी की कई बूंदें जोड़ें और 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में सेते हैं। 1 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और गोली इकट्ठा।
  5. चरण 9.2 दोहराएँ।
  6. गोली को कवर करने और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में इनक्यूबेट करने के लिए ट्यूब में फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी और 4 ', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) समाधान की कई बूंदें जोड़ें, प्रकाश से परहेज करें।
  7. प्रकाश से परहेज करते हुए चरण 9.2 दोहराएं।
  8. ट्यूब के लिए पीबीएसटी समाधान के 100 μL जोड़ें और प्रकाश से दूर एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में अस्थायी रूप से स्टोर। प्रकाश-शीट स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ऑर्गेनोइड / गोले का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें।

10. एलजीएससी पीएलएक्स-एमचेरी अभिकर्मक

नोट: लेंटिवायरल कणों का उत्पादन एक जैव सुरक्षा कैबिनेट और बीएसएल 2 जैव सुरक्षा स्तर पर एक साफ बेंच में किया जाना चाहिए।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर डीएमईएम + 10% एफबीएस के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट में लेंटीवायरस पैकेजिंग सेल293 टी की संस्कृति, 3-5 दिनों के लिए 5% सीओ 2 80% सेल संगम तक पहुंचने के लिए।
  2. लेंटिवायरस वेक्टर पीएलएक्स-एमचेरी को एलजीएससी में ट्रांसफेक्ट करें।
    नोट: अभिकर्मक तैयारी एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक अच्छी तरह से के लिए संकेत दिया है।
    1. दो बाँझ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में डीएमईएम / एफ 12 के 250 μL जोड़ें।
    2. अभिकर्मक अभिकर्मक के 7.5 μL एक ट्यूब के लिए जोड़ें और अभिकर्मक अच्छी तरह से पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
    3. एंडोटॉक्सिन के बिना पीएलएक्स-एमचेरी प्लास्मिड के 2 μg जोड़ें और एक और ट्यूब में लेंटीवायरस पैकेजिंग प्लास्मिड का मिलान करें, और अभिकर्मक अभिकर्मक (प्लास्मिड के 2 μL /
    4. दोनों अपकेंद्रित्र ट्यूबों में तरल मिलाएं और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक खड़े होने दें।
    5. 293 टी कोशिकाओं की संस्कृति माध्यम निकालें और चरण 10.2.4 से 293 टी कोशिकाओं के लिए मिश्रण जोड़ें। 8 घंटे के बाद ताजा डीएमईएम + 10% एफबीएस के लिए संस्कृति माध्यम बदलें।
    6. 48 घंटे के बाद, पहली बार वायरस सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और इसे 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। 72 घंटे के बाद, दूसरी बार वायरस सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और इसे फिर से 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      नोट: लेंटीवायरस पारगमन तक बर्फ पर दोनों फ़िल्टर किए गए सतह पर तैरनेवाले स्टोर करें।
  3. डीईडी चूहों (एनओडी / शिल्टजे) से एलजीएससी प्राप्त करें (चरण 1 देखें)।
  4. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए प्रीकलेक्टेड पीएलएक्स-एमचेरी लेंटीवायरस सतह पर तैरनेवाला का 1 एमएल जोड़ें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में एक प्रकार के बरतन पर अपकेंद्रित्र ट्यूब सेट करें। लेंटीवायरस और कोशिकाओं के बीच संपर्क को अधिकतम करने के लिए इसे 100 आरपीएम पर हिलाएं। 8 घंटे के बाद, 4 मिनट के लिए 250 × ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. सेल गोली को फिर से निलंबित करने के लिए डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल जोड़ें। सेल नंबर निर्धारित करने के लिए एक सेल काउंटर का उपयोग करें और मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मैट्रिक्स (मैट्रिक्स जेल: एलजीएससीएम = 1: 1) के 100 μL में मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मैट्रिक्स (मैट्रिक्स जेल: एलजीएससीएम = 1: 1) के प्रत्येक कुएं में कुल 1 × 104 कोशिकाओं को 20 μL मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मैट्रिक्स के साथ प्रीकोटेड किया गया (चरण 1.3.2 देखें)।
  7. संस्कृति के 7 दिनों के बाद (चरण 1 देखें), संस्कृति का विस्तार करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने वाले क्षेत्रों का चयन करें।

11. एलजीएससी ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण

नोट: सभी सर्जिकल ऑपरेशन एक एसपीएफ़ ऑपरेटिंग रूम में किए जाते हैं, और सभी सर्जिकल उपकरण निष्फल होते हैं।

  1. लाल प्रतिदीप्ति (टीडी-टमाटर) या 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत एमचेरी अभिकर्मक के साथ आरओएसए 26एमटी / एमजी चूहों से एलजीएससी क्षेत्र प्राप्त करें (चरण 1 देखें)।
  2. उपयोग करने से पहले बर्फ पर मैट्रिक्स जेल और डीएमईएम / एफ 12 के 1: 1 मिश्रण युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब को ठंडा करें। एकल कोशिकाओं में एलजीएससी क्षेत्रों को पचाएं और ट्यूब में 2 × 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. पेंटोबार्बिटल सोडियम (50 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनओडी / शिल्टजे चूहों को संवेदनाहारी करें।
    शिल्टजे माउस अज्ञातहेतुक अतिरिक्त लक्षणों के साथ एक आदर्श मॉडल है, जिसमें कम आंसू स्राव, भड़काऊ घुसपैठ और कक्षीय अल्सरेशन शामिल हैं।
  4. संज्ञाहरण के बाद, सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर खारा या पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें, और फिर एलजी को उजागर करने के लिए संवेदनाहारी चूहों के कान (आंख के पास) के पीछे की त्वचा में 5-8 मिमी कटौती करने के लिए नेत्र कैंची का उपयोग करें।
    नोट: चीरा के चारों ओर कीटाणुशोधन के लिए आयोडोफोर का सख्ती से उपयोग किया जाना चाहिए।
  5. बाईं ओर एलजी में 2 × 104 कोशिकाओं को इंजेक्ट करें और नियंत्रण के रूप में दाईं ओर एलजी में कोशिकाओं के बिना मिश्रण (चरण 11.2 देखें) इंजेक्ट करें।
  6. इंजेक्शन के बाद, नेत्र संदंश के साथ एलजी को उनके मूल पदों पर बहाल करें और घाव को सीवन करें। 2 महीने के लिए चूहों को खिलाएं और उपचार के प्रभाव का निरीक्षण करें।
    नोट: पिंजरे कुशन सामग्री को ऑपरेशन के बाद सख्ती से निष्फल किया जाना चाहिए, और कुशन सामग्री को दिन में एक बार प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। घाव को टांका लगाने के बाद, एनाल्जेसिया प्राप्त करने के लिए ट्रामाडोल को चुनिंदा रूप से चूहों की पूंछ नस में 2.5 मिलीग्राम /
  7. प्रयोग के 2 महीने बाद इन चूहों को संवेदनाहारी करें (चरण 11.3 देखें)। ओकुलर क्षेत्र के लक्षणों को फिल्माएं।
    1. संज्ञाहरण के दौरान, निम्नलिखित लक्षणों की तलाश करें: गर्दन और अंग की मांसपेशियों में छूट; गहरी, धीमी और स्थिर श्वास; पुतली संकीर्णता; कॉर्नियल रिफ्लेक्स गायब हो गया।
    2. संज्ञाहरण और ऑपरेशन के दौरान, चूहों के शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। सर्जरी के बाद, घाव संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए चूहों के लिए पीने के पानी में उचित एंटीबायोटिक्स जोड़ें। चूहों को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वे स्टर्नल रिकंबेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर लें। पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य चूहों की कंपनी में सर्जरी से गुजरने वाले चूहों को वापस न करें।
    3. ओकुलर क्षेत्र के लक्षणों को फिल्माने के बाद, इमेजजे सॉफ्टवेयर खोलें, फ़ाइल | पर क्लिक करें | खोलें फ्रीहैंड चयन, बाएं माउस बटन को दबाए रखें, और छवि में कक्षीय अल्सरेशन के क्षेत्र का चयन करें। एनालिसिस | पर क्लिक करें अल्सरेशन के सापेक्ष क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए उपाय करें।
  8. 10 एस के लिए संवेदनाहारी चूहों के पार्श्व कैंथस पर फिनोल लाल सूती धागा रखो; सूती धागे के विकृत भाग की लंबाई को मापें और रिकॉर्ड करें। आंसू माप के बाद ग्रीवा कशेरुक अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु।
  9. चूहों को विच्छेदित करें और आईएचसी विश्लेषण के लिए एलजी प्राप्त करें।

12. आरएनए अलगाव

नोट: प्रयोग से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र प्रीकूल और गारंटी सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों आरएनएएसई संदूषण से मुक्त हैं।

  1. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एलजीएससी या एलजी टुकड़े इकट्ठा करें। सेल लाइसिस बफर के 1 एमएल जोड़ें और भंवर दोलन द्वारा कोशिकाओं या ऊतकों को पूरी तरह से लाइज करें।
  2. क्लोरोफॉर्म के 0.2 एमएल जोड़ें, और इसे 1 मिनट के लिए भंवर दोलन के बाद 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें। 4 डिग्री सेल्सियस, 12,000 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, तरल को तीन परतों में विभाजित किया जाता है, और आरएनए सबसे ऊपरी पारदर्शी जलीय चरण में होता है।
  3. ध्यान से विंदुक सबसे ऊपरी पारदर्शी जलीय चरण और यह एक नए 1.5 एमएल आरएनएएसई मुक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित।
  4. आइसोप्रोपिल अल्कोहल की एक समान मात्रा जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं। मिश्रण को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस, 12,000 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और 75% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस, 7,500 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए गोली और अपकेंद्रित्र धोने के लिए ट्यूब पलटें। इस चरण को दोहराएं।
  6. सतह पर तैरनेवाला सावधानी से निकालें और लगभग 20 मिनट के लिए इसे सुखाने के लिए अल्ट्राक्लीन वर्कबेंच में अपकेंद्रित्र ट्यूब डाल दिया।
    नोट: अगले चरण के लिए आगे बढ़ें जब सफेद गोली पारदर्शी हो जाती है। बर्फ पर सभी ऑपरेशन करें।
  7. गोली को पूरी तरह से भंग करने के लिए आरएनएएसई मुक्त पानी के 20 μL जोड़ें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें) और -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए समाधान स्टोर करें।

13. पीसीआर

  1. रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया
    1. पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में कुल आरएनए (आरएनए समाधान की एकाग्रता के अनुसार जोड़ा आरएनए समाधान की मात्रा की गणना) का 1 μg जोड़ें और विकृतीकरण के लिए 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. इसे 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखें और फिर एंजाइम मुक्त पानी जोड़ें जब तक कि कुल मात्रा 12 μL तक नहीं पहुंच जाती। 4x डीएनए मास्टर मिक्स के 4 μL जोड़ें और इसे 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. बर्फ पर ट्यूब रखो, 5x आरटी मास्टर मिक्स के 4 μL जोड़ें, और इसे धीरे से मिलाएं। निम्नलिखित पीसीआर सेटिंग्स सेट करें: 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    4. इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  2. पीसीआर प्रतिक्रिया
    1. पीसीआर ट्यूब में पीसीआर प्रतिक्रिया निम्नानुसार तैयार करें: एंजाइम मुक्त पानी का 14.1 μL, dNTP का 2 μL, 10x बफर का 2 μL, प्राइमर का 0.8 μL (10 μM, फॉरवर्ड प्राइमर का 0.4 μL, और रिवर्स प्राइमर का 0.4 μL, सामग्री की तालिका देखें), रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सीडीएनए का 1 μL (चरण 13.1 देखें) और 0.1 μL
    2. पीसीआर के लिए पीसीआर उपकरण में तैयार पीसीआर प्रतिक्रिया रखें। पीसीआर प्रक्रिया के लिए टैक एंजाइम किट के निर्देशों का संदर्भ लें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. अगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन
    1. ट्रिस के 242 ग्राम और ना 2 ईडीटीए ·2 एच 2ओ के 37.2 ग्राम वजनके लिए एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करें और उन्हें 1 एल बीकर में जोड़ें। बीकर में ~ 800 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी और 57.1 एमएल ग्लेशियल एसिटिक एसिड जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, 50x टीएई बफर प्राप्त करने के लिए 1 एल में विआयनीकृत पानी जोड़ें, और इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      नोट: उपयोग करने से पहले विआयनीकृत पानी के साथ 50x TAE बफर पतला।
    2. 1.2 ग्राम एगरोज़ का वजन करने के लिए एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करें और इसे 1x TAE बफर के 80 मिलीलीटर युक्त शंक्वाकार फ्लास्क में जोड़ें। इसे माइक्रोवेव ओवन में बार-बार गर्म करें जब तक कि पूरी तरह से घुल न जाए।
    3. फ्लास्क को नल के पानी के नीचे ठंडा करें जब तक कि समाधान तापमान 60 डिग्री सेल्सियस तक न गिर जाए। न्यूक्लिक एसिड दाग के 8 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद जिलेटिनाइजिंग टैंक में समाधान डालें, कंघी रखें, और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें।
    4. कंघी को बाहर निकालें और तैयार एगरोज जेल में पीसीआर उत्पादों को लोड करें। 30 मिनट के लिए 120 वी पर वैद्युतकणसंचलन करें।
    5. जेल को ईसीएल जेल इमेजिंग सिस्टम और फोटोग्राफ में रखें।

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Representative Results

3 डी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली स्थापित करें
इस अध्ययन में, माउस एलजीएससी के लिए ईजीएफ, डब्ल्यूएनटी 3 ए, एफजीएफ 10 और वाई -27632 युक्त एलजीएससीएम विकसित किया गया था, और एलजीएससी को 3 डी संस्कृति विधि (चित्रा 1 ए) द्वारा सफलतापूर्वक अलग और सुसंस्कृत किया गया था। सी 57 बीएल / 6 चूहों, एनओडी / शिल्टजे चूहों, बीएएलबी / सी चूहों और आरओएसए 26एमटी / एमजी चूहों से एलजीएससी की एक सफल 3 डी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली इस विधि का उपयोग करके स्थापित की गई है। एक पुरुष माउस के लिए, 1.5-2 × 106 कोशिकाओं को पृथक्करण द्वारा दो एलजी से प्राप्त किया गया था। संस्कृति के एक सप्ताह के बाद, संस्कृति की शुरुआत में 1 × 104 एलजी कोशिकाओं को बोने पर 30-60 गोले बनाए गए थे। इसके अलावा, इस पद्धति द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं ने ईपीसीएएम, केआरटी 5, केआरटी 14, पी 63, नेस्टिन और अन्य स्टेम सेलमार्करों 16 को व्यक्त किया, यह दर्शाता है कि प्राप्त कोशिकाओं में एलजीएससी के गुण थे। केआरटी 14 और केआई 67 को 7 दिनों (चित्रा 1 बी) के लिए सुसंस्कृत एलजीएससी द्वारा गठित सभी क्षेत्रों में व्यक्त किया गया था, यह दर्शाता है कि एलजीएससी में आत्म-नवीकरण क्षमता थी।

7-दिवसीय संस्कृति के दौरान, एलजीएससी के गोले 100 μm के व्यास तक पहुंच गए। हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला दिन 7 (चित्रा 1 सी और चित्रा 1 एफ) में सेलुलरिटी दिखाता है। प्राथमिक संस्कृति और उपसंस्कृति के 7 दिनों के बाद प्राप्त एलजीएससी के संवर्धन कारकों ने संकेत दिया कि इस पद्धति से समृद्ध एलजीएससी में मजबूत प्रसार क्षमता (चित्रा 1 डी) थी। इस प्रणाली में, एलजीएससी को 40 से अधिक बार पारित किया जा सकता है, और उन्होंने अभी भी स्टेम सेल विशेषताओं (चित्रा 1 ई और चित्रा 1 जी) को बनाए रखा है। अंत में, यह पत्र इन विट्रो में एलजीएससी के लिए 3 डी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं में निरंतर और स्थिर प्रसार क्षमता है।

इन विट्रो में भेदभाव को प्रेरित करें
इन विट्रो में एलजीएससी की भेदभाव क्षमता का विश्लेषण किया गया था। जब 7 दिनों से अधिक समय तक सुसंस्कृत किया गया, तो एलजीएससी ने धीरे-धीरे विकास क्षमता खो दी, और भेदभाव से जुड़े एक्यूपी 5, एलटीएफ, केआरटी 1 9 और अन्य मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जबकि केआरटी 14 की अभिव्यक्ति धीरे-धीरे16 कम हो गई। एलजीएससी को एफबीएस द्वारा अधिक कलियों और मैट्रिक्स जेल (चित्रा 2 ए, बी) के कम अनुपात को बनाने के लिए प्रेरित किया गया था। इसके अलावा, एच एंड ई धुंधला संकेत दिया है कि एफबीएस अधिक गुहिकायन संरचनाओं (चित्रा 2 सी) का उत्पादन करने के लिए गोले प्रेरित कर सकता है।

पिछले काम ने सुझाव दिया कि मैट्रिक्स कठोरता को कम करने से एलजीएससी के भेदभाव को डक्टल-जैसे ऑर्गेनोइड में बढ़ावा मिला। बेसल परत कोशिकाओं ने केआरटी 14 को व्यक्त करने वाली स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं को बनाए रखा, जबकि बेसल ऊपरी परत कोशिकाओं ने गुहाओं के साथ वाहिनी जैसी संरचनाओं में विभेदित किया और केआरटी 19 व्यक्त किया। इसके अलावा, एफबीएस के अलावा एलजीएससी के भेदभाव को एसीनार जैसे ऑर्गेनोइड में प्रेरित कर सकता है, जो उच्च परमाणु / साइटोप्लाज्मिक अनुपात के साथ स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं को बनाए रखता है। कुछ विभेदित एसीनार जैसी कोशिकाओं ने कम परमाणु / साइटोप्लाज्मिक अनुपात16 के साथ एक्यूपी 5 के उच्च स्तर को व्यक्त किया।

 वीवो में एलजीएससी की मरम्मत करें  
उपरोक्त प्रयोगों के आधार पर, क्षतिग्रस्त एलजी की मरम्मत करने की एलजीएससी की क्षमता ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन द्वारा पता लगाया गया था। शिल्टजे चूहों में आरओएसए-एलजीएससी के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के बाद, एलजी (चित्रा 3 ए-सी) के निकट नए लैक्रिमल लोब्यूल्स का गठन किया गया था। अधिकांश लोब्यूल एक्यूपी 5 की उच्च अभिव्यक्ति के साथ परिपक्व एसीनार कोशिकाओं से बने थे, और कम एक्यूपी 5 अभिव्यक्ति (चित्रा 3 डी-एफ) के साथ इंट्रालोबुलर वाहिनी गठन था। 8 सप्ताह के लिए आरओएसए-एलजीएससी के इंजेक्शन के बाद, प्राप्तकर्ताओं की कक्षा के चारों ओर क्षय को मापा गया था। माप ने संकेत दिया कि एलजीएससी के इंजेक्शन ने क्षय क्षेत्र को ~ 60% (चित्रा 3 जी, एच) तक कम कर दिया। विच्छेदन से पता चला है कि एलजी मात्रा 10 सप्ताह (चित्रा 3 आई) के लिए इंजेक्शन के बाद वृद्धि हुई है। आरओएसए-एलजीएससी इंजेक्शन पक्ष पर आंसू स्राव की मात्रा नियंत्रण पक्ष की तुलना में अधिक थी लेकिन जंगली प्रकार के चूहों (चित्रा 3 जे) की तुलना में कम थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस संस्कृति प्रणाली द्वारा काटी गई कोशिकाओं में एलजीएससी की विशेषताएं हैं और इसका उपयोग चूहों में स्टेम सेल थेरेपी के लिए किया जा सकता है जोड़ा तथा ज़ेरोफथाल्मिया।

Figure 1
चित्रा 1: एलजीएससी का अलगाव और लक्षण वर्णन (ए) एलजीएससी प्राथमिक और निरंतर मार्ग संस्कृति की रणनीति। (बी) दिन 7 पर एलजीएससी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। एलजीएससी उपकला सेल मार्कर ई-कैडरिन (लाल), स्टेम सेल मार्कर केआरटी 14 (लाल), प्रोलिफेरेटिव सेल मार्कर केआई 67 (लाल) व्यक्त करते हैं। काउंटरस्टेन, डीएपीआई (नीला)। (सी) 1, 3, 5 और 7 दिनों के लिए संस्कृति में एलजीएससी की आकृति विज्ञान। (डी) प्राथमिक संस्कृति और उपसंस्कृति में एलजीएससी संस्कृति का सापेक्ष संवर्धन कारक। सापेक्ष संवर्धन कारक संस्कृति के 7 दिनों के बाद प्राप्त कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुपात संस्कृति में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या से है। पी < 0.01. (ई) माउस एलजी और विभिन्न मार्ग एलजीएससी (पी 1, पी 10, पी 20, और पी 40) के वयस्क स्टेम / पूर्वज सेल मार्करों का प्रतिलेखन। (एफ) दिन 7 पर प्राथमिक संस्कृति में एलजीएससी की आकृति विज्ञान (बाएं) और एच एंड ई धुंधला (दाएं)। (जी) एलजीएससी विभिन्न मार्गों (पी 1, पी 10, पी 20 और पी 40) में सुसंस्कृत हैं। स्केल सलाखों = 50 μm (बी, एफ, जी), 100 μm (सी)। संक्षिप्त नाम: एलजी = अश्रु ग्रंथि; एलजीएससी = एलजी स्टेम सेल; डीएपीआई = 4 ',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल;; एनसी = नकारात्मक नियंत्रण; टीई = ट्रिप्सिन-ईडीटीए; एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो में एलजीएससी का भेदभाव (ए, बी) सामान्य माध्यम या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत एलजीएससी की आकृति विज्ञान। (ए) एलजीएससी पी 10 में 10 दिनों के लिए सुसंस्कृत (बाएं: सामान्य माध्यम, दाएं: एफबीएस युक्त माध्यम)। (बी) पी 31 में 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत एलजीएससी (बाएं: सामान्य माध्यम, दाएं: 1/3 मैट्रिक्स जेल के साथ मध्यम)। (सी) 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत एलजीएससी के एच एंड ई धुंधला (शीर्ष: सामान्य माध्यम, नीचे: एफबीएस युक्त माध्यम)। स्केल बार = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C)। संक्षिप्त नाम: एलजी = अश्रु ग्रंथि; एलजीएससी = एलजी स्टेम सेल; एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एलजीएससी एलोट्रांसप्लांटेशन का एनग्राफ्टमेंट और अतिरिक्त लक्षणों की राहत( ए-एफ) 8 सप्ताह के बाद आरओएसए-एलजीएससी की 7-दिवसीय संस्कृतियों के साथ प्रत्यारोपित एनओडी / शिएलटीजे एलजी का आईएचसी धुंधला हो जाना। प्रयोगात्मक समूह और नियंत्रण समूह के रूप में एक ही माउस के बाएं और दाएं किनारों का उपयोग करें। (ए-सी) एंटी-टीडी-टमाटर एंटीबॉडी के साथ आईएचसी धुंधला; (डी-एफ) एंटी-एक्यूपी 5 एंटीबॉडी के साथ आईएचसी धुंधला; (ए, डी) एफ 12 का मिश्रण), (बी, ई) एलजी आरओएसए-एलजीएससी के साथ इंजेक्ट किया गया, (सी, एफ) बी, ई (लाल तीर, इंट्रालोबुलर वाहिनी) में काले वर्गों की आवर्धित छवियां। (जी, एच) 8 सप्ताह में आरओएसए-एलजीएससी के इंजेक्शन के बाद एनओडी / शिल्टजे माउस आंख कक्षा की स्थिति। एलजीएससी का इंजेक्शन आंखों की कक्षा के चारों ओर क्षय को काफी कम करता है। शिल्टजे माउस के एलजी (बाएं: सेल-इंजेक्शन की तरफ से एलजी, दाएं: नियंत्रण पक्ष से एलजी)। (जे) 8 सप्ताह के बाद आरओएसए-एलजीएससी की 7-दिवसीय संस्कृतियों के साथ प्रत्यारोपित जंगली प्रकार और एनओडी / शिल्टजे चूहों की आंसू मात्रा। आरओएसए-एलजीएससी-इंजेक्शन एलजी की आंसू मात्रा नियंत्रण एलजी की तुलना में अधिक है लेकिन डब्ल्यूटी एलजी की तुलना में काफी कम है। शिल्टजे चूहों, एन = 4; पी < 0.01; * पी < 0.05. स्केल सलाखों = 50 μm (ए-एफ)। संक्षिप्त नाम: एलजी = अश्रु ग्रंथि; एलजीएससी = एलजी स्टेम सेल; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिकल; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; जोड़ा गया = जलीय कमी वाली सूखी आंख की बीमारी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

लैक्रिमल स्टेम सेल संस्कृति और एलजी चोट की मरम्मत के लिए लैक्रिमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो संस्कृति के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं। शतोस एट अल .17 और एकरमैनएट अल। 6 क्रमशः 2 डी संस्कृति विधियों द्वारा चूहों और चूहों के लैक्रिमल स्टेम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक सुसंस्कृत और उपसंस्कृत किया गया, जिससे एडीजेड के उपचार के लिए लैक्रिमल स्टेम कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना संभव हो गया। स्टेम सेल 18 और मेसेनकाइमल स्टेम सेल19,20 पर अध्ययन 2 डी में सुसंस्कृत एलजी से पता चला है कि इन कोशिकाओं का प्रत्यारोपण कुछ हद तक एडीडी के लक्षणों से राहत दे सकता है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा, ग्रोमोवाएट अल। 2 चयनित स्टेम सेल माउस एलजी से एलजी पूर्वज सेल मार्करों को व्यक्त करते हैं और उन्हें नलिकाओं और इन विट्रो में एसिनी में विभेदित करते हैं, सफलतापूर्वक एलजी के कार्यात्मक कोशिकाओं में वयस्क स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को महसूस करते हैं। यह भी दिखाया गया था कि पर्याप्त संख्या में स्टेम कोशिकाओं का प्रत्यारोपण चूहों में अतिरिक्त लक्षणों को कम कर सकता है।

स्टेम सेल संवर्धन की जरूरतों को पूरा करने और मौजूदा लैक्रिमल स्टेम सेल संस्कृति विधियों में सीरम निर्भरता को खत्म करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में लैक्रिमल स्टेम कोशिकाओं की सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली पहले प्रकाशित अनुसंधान और ऑर्गेनोइड 3 डी संस्कृति प्रौद्योगिकी21 के आधार पर स्थापित की गई थी। इस प्रकार, इस प्रणाली से लैक्रिमल स्टेम कोशिकाओं पर नैदानिक अनुसंधान को बढ़ावा देने की उम्मीद है। इस प्रोटोकॉल में, महत्वपूर्ण कदम प्राथमिक संस्कृति, उपसंस्कृति और एलजीएससी का विस्तार, और चूहों में घायल एलजी में एलजीएससी के सीटू प्रत्यारोपण में शामिल हैं।

प्राथमिक संस्कृति एलजीएससी प्राप्त करने का आधार है। प्राथमिक संस्कृति के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखना आवश्यक है। अच्छी तरह से सेल संस्कृति के तल पर कोशिकाओं के पक्षपाती विकास से बचने के लिए अच्छी तरह से मैट्रिक्स-जेल के साथ प्रीकोटेड है। मैट्रिक्स-जेल का उपयोग करते समय, निर्माता के निर्देशों का पालन करना आवश्यक है, और प्रयोग के दौरान मैट्रिक्स-जेल हानि और संस्कृति में असमान मैट्रिक्स-जेल से बचने के लिए कुएं के अलावा इसे हमेशा तरल अवस्था में रखें।

प्राथमिक संस्कृति में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या 10,000 कोशिकाओं / व्यवहार में, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या बढ़ाई जा सकती है यदि उचित विकास स्थान और कोशिकाओं की पोषक तत्वों की आपूर्ति सुनिश्चित की जाती है। स्टेम कोशिकाओं को शुद्ध और समृद्ध करने के लिए उपसंस्कृति एक महत्वपूर्ण कदम है। पारित होने के बाद, पी 1 पीढ़ी में एलजीएससी ने अधिक गोले बनाए, और पी 0 पीढ़ी की तुलना में अधिक पी 1 पीढ़ी की कोशिकाएं थीं। यह इंगित करता है कि प्रोलिफेरेटिव क्षमता वाले एलजीएससी को इस प्रणाली में समृद्ध किया गया है।

जब एलजीएससी को 10 दिनों में इस 3 डी प्रणाली में सुसंस्कृत किया गया था, तो 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए कभी-कभी पारित होने के दौरान एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड को पूरी तरह से पचाने के लिए पर्याप्त नहीं था। पाचन काल को उचित रूप से बढ़ाकर इस समस्या का समाधान किया गया। सीटू इंजेक्शन थेरेपी एलजीएससी के नैदानिक मूल्य को सत्यापित करने के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है चूहों में एलजी के छोटे आकार और पतले और ढीले ऊतकों के कारण, कोशिकाएं हमेशा इंजेक्शन साइट से खो जाती हैं यदि सेल निलंबन सामान्य खारा या इंजेक्शन के लिए 10 एमएम पीबीएस में तैयार किया जाता है। इसलिए, इंजेक्शन के लिए मैट्रिक्स-जेल के साथ सेल निलंबन को मिलाने की सिफारिश की जाती है। क्योंकि इस प्रणाली में उपयोग किया जाने वाला मैट्रिक्स-जेल 10 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर जम जाता है, एलजी में इंजेक्शन लगाने पर कोशिकाएं आसानी से उपनिवेश कर सकती हैं। कोशिकाओं और मैट्रिक्स-जेल के मिश्रण को हमेशा इंजेक्शन से पहले बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और इंजेक्शन जल्दी से किया जाना चाहिए।

सामान्य चूहों से एलजीएससी को अलग करने के अलावा, जोड़े गए चूहों से वयस्क एलजीएससी को इस प्रोटोकॉल16 का उपयोग करके पहली बार सफलतापूर्वक अलग और सुसंस्कृत किया गया था। हालांकि, इस प्रणाली में अभी भी कमियां और अनसुलझी समस्याएं हैं। सबसे पहले, उपयोग किया जाने वाला मैट्रिक्स-जेल चूहों22,23 से लिया गया है, जो मानव शरीर में अस्वीकृति प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है और इसलिए, सीमित नैदानिक प्रयोज्यता है। मैट्रिक्स जेल को बदलने के लिए उपयुक्त सिंथेटिक जैल ढूंढकर संस्कृति प्रणाली में सुधार करना आवश्यक है।

दूसरा, इस प्रोटोकॉल में भेदभाव रणनीति में सुधार करने की आवश्यकता है। भेदभाव21 के लिए संस्कृति समय का विस्तार करने या संस्कृति माध्यम में सीरम जोड़ने के बजाय, विशिष्ट विकास कारकों को जोड़ने और दिशात्मक प्रेरण के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों को बदलने से वांछित परिणाम देने की उम्मीद है। भेदभाव के कारण सिग्नलिंग मार्गों को स्पष्ट करके एलजीएससी के रखरखाव और भेदभाव के तंत्र का पता लगाना आवश्यक है। इसके अलावा, पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि इन विट्रो में सुसंस्कृत मायोएपिथेलियल कोशिकाएं स्टेम सेल जीन, जैसे नेस्टिन, मुसाशी और पैक्स 6 को भी व्यक्त करती हैं, यह दर्शाता है कि मायोएपिथेलियल कोशिकाओं में स्टेम सेल विशेषताएं भी होती हैं17.

इस अध्ययन ने मायोएपिथेलियल कोशिकाओं पर कोई ध्यान नहीं दिया और इसलिए, यह सत्यापित नहीं किया कि मायोएपिथेलियल कोशिकाओं के विशिष्ट अभिव्यक्ति मार्करों की पहचान करके एलजी ऑर्गेनोइड में मायोएपिथेलियल कोशिकाएं मौजूद हैं या नहीं। संस्कृति की स्थिति की सीमा के कारण, मायोएपिथेलियल कोशिकाओं को प्रेरित नहीं किया जा सका या उनकी संख्या देखी जाने के लिए बहुत छोटी थी। संस्कृति के समय को यह देखने के लिए बढ़ाया जा सकता है कि क्या ऑर्गेनोइड मायोएपिथेलियल कोशिकाओं में अंतर करते हैं, या प्रेरण भेदभाव और सिस्टम सुधार के भविष्य के अध्ययनों में मायोएपिथेलियल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

अंत में, यह प्रोटोकॉल एलजी के विकास, मरम्मत और उत्थान के लिए एलजीएससी का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। इन विट्रो में एलजीएससी का भेदभाव एलजी के भविष्य के इन विट्रो उत्थान का आधार हो सकता है, जबकि एलजीएससी का अलगाव और संस्कृति स्टेम सेल एलोट्रांसप्लांटेशन में अस्वीकृति की समस्या को हल कर सकती है। यह विधि एलजीएससी के साथ ज़ेरोफथाल्मिया के नैदानिक व्यक्तिगत उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण आधार प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31871413) और गुआंग्डोंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी के दो कार्यक्रमों (2017 बी 020230002 और 2016 बी 030231001) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम वास्तव में उन शोधकर्ताओं के आभारी हैं जिन्होंने अध्ययन के दौरान हमारी मदद की है और पशु देखभाल में उनके समर्थन के लिए पशु केंद्र में काम करने वाले कर्मचारियों के सदस्यों के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

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References

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जीव विज्ञान अंक 184
लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल के लिए त्रि-आयामी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली
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Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

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