Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Трехмерная система культивирования без сыворотки для стволовых клеток слезных желез

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

Трехмерный, бессывороточный метод культивирования стволовых клеток взрослой слезной железы (LG) хорошо зарекомендовал себя для индукции образования органоидов LG и дифференцировки в ацинарные или протоковидные клетки.

Abstract

Терапия на основе стволовых клеток слезных желез (LG) является перспективной стратегией для лечения заболеваний слезных желез. Однако отсутствие надежного, бессывороточного метода культивирования для получения достаточного количества стволовых клеток LG (LGSC) является одним из препятствий для дальнейших исследований и применения. Трехмерный (3D), бессывороточный метод культивирования для взрослых мышиных LGSC хорошо известен и показан здесь. LGSC могут непрерывно проходить и индуцироваться для дифференцировки в ацинарные или протоковидные клетки.

Для первичной культуры LGSC ЛОГ от 6-8-недельных мышей переваривали диспазой, коллагеназой I и трипсином-ЭДТА. В общей сложности 1 × 104 одиночные клетки были засеяны в 80 мкл матричной матрицы гелеобразной среды стволовых клеток железы (LGSCM) в каждой лунке 24-луночной пластины, предварительно покрытой 20 мкл матричного геля-матрицы LGSCM. Смесь затвердевали после инкубации в течение 20 мин при 37 °C и добавляли 600 мкл LGSCM.

Для поддержания LGSC LGSC, культивируемые в течение 7 дней, были дезагрегированы на отдельные клетки путем диспазы и трипсина-ЭДТА. Одиночные клетки имплантировали и культивировали в соответствии с методом, используемым в первичной культуре LGSC. LGSC могут проходить более 40 раз и непрерывно экспрессировать маркеры стволовых / прогениторных клеток Krt14, Krt5, P63 и nestin. LGSC, культивируемые в LGSCM, обладают способностью к самообновлению и могут дифференцироваться в ацинарные или протоковидные клетки in vitro и in vivo.

Introduction

Стволовые клетки слезной железы (LGSC) поддерживают обновление клеток слезной железы (LG) и являются источником ацинарных и протоковых клеток. Поэтому трансплантация LGSC считается альтернативным подходом для лечения тяжелых воспалительных повреждений и водно-дефицитной болезни сухого глаза (ADD)1,2,3. Несколько методов культивирования были применены для обогащения LGSC. Tiwari et al. отделили и культивировали первичные клетки LG с использованием коллагена I и матричного геля, дополненного несколькими факторами роста; однако клетки LG нельзя было непрерывно культивировать4. Используя двумерную (2D) культуру, стволовые клетки, полученные из LG, были выделены You et al.5 и Ackermann et al. 6, было обнаружено, что он экспрессирует гены маркера стволовых клеток /предшественников, Oct4, Sox2, Nanog и nestin, и может быть субкультурирован. Тем не менее, нет четких указаний на то, что эти клетки могут дифференцироваться в ацинарные или протоковые клетки, и нет эксперимента по трансплантации для проверки потенциала дифференцировки in vivo.

Недавно c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45-клетки были выделены из ЛОГ мышей с помощью проточной цитометрии, обнаружили экспрессию маркеров клеток-предшественников LG, таких как Pax6 и Runx1, и дифференцировали в протоки и ацины in vitro. У мышей с АДД ортотопическая инъекция с этими клетками может восстановить поврежденные ЛОГ и восстановить секреторную функцию ЛОГ2. Однако количество стволовых клеток, выделенных этим методом, было небольшим, и нет подходящих условий культивирования для расширения изолированных ЛГСК. Таким образом, необходимо создать соответствующую систему культивирования для эффективной изоляции и культивирования взрослых ЛГСК со стабильным и непрерывным расширением для изучения ЛГСК при лечении СДВ.

Органоиды, полученные из стволовых клеток или плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой группу клеток, которые гистологически похожи на родственные органы и могут поддерживать свое собственное обновление. После того, как органоид кишечника мыши был успешно культивирован Sato et al. в 2009году 7, органоиды из других органов культивировали последовательно, основываясь на системе культивирования Сато, таких как желчный пузырь8, печень9, поджелудочная железа10, желудок11, грудь12, легкие13, простата14 и слюнная железа15 . Из-за высокой доли взрослых стволовых клеток перед дифференцировкой клеток в органоидной культуре трехмерный (3D) метод органоидной культуры считается оптимальным для выделения и культивирования взрослых стволовых клеток LG.

Система культуры LGSC для взрослых мышей была создана в настоящем исследовании путем оптимизации метода 3D- культуры без сыворотки. Доказано, что LGSC, культивируемые как у нормальных, так и у мышей с добавленным добавлением, показали стабильную способность к самообновлению и пролиферации. После трансплантации в ДОБАВЛЕННЫЕ мышиные ЛОГ, LGSC колонизировали поврежденные ЛОГ и улучшили производство слезы. Кроме того, красные флуоресцентные LGSC были выделены из мышей ROSA26mT/mG и культивированы. Эта работа обеспечивает надежный ориентир для обогащения LGSC in vitro и аутотрансплантата LGSC в клиническом применении для терапии ADDED.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты в этом протоколе соответствовали руководящим принципам ухода за животными Этического комитета по испытаниям на животных Университета Сунь Ятсена. Все операции, связанные с ячейками, должны выполняться на ультрачистом верстаке в операционной ячейки. Все операции с использованием ксилола должны проводиться в вытяжных вытяжках.

1. Первичная культура LGSC

  1. Изоляция LG
    1. Возьмите 6-8-недельную самую мышь BALB / c и разрежьте кожу за ухом, чтобы обнажить LG и соединительную ткань вокруг нее. Отклейте соединительную ткань тупым рассечением с помощью пинцета и удалите LG.
    2. Дважды промойте ЛК 4 мл стерильного раствора PBS 10 мМ для удаления крови в посуде размером 6 см. Погрузите ЛК в 6 см посуду с 4 мл 75% этанола в течение 10 с и сразу же промойте 10 мМ PBS.
  2. Получение одиночных ячеек LG
    1. Используйте буферный раствор HEPES (50 мМ HEPES/KOH, рН 7,4; 150 мМ NaCl в сверхчистой воде) для приготовления диспазы 25 Ед/мл. Приготовьте 0,1% раствор коллагеназы I со сверхчистой водой.
    2. Разрезать ЛК на мелкие фрагменты (около 1мм3), перенести их в стерильную центрифужную трубку 15 мл и обработать ткани 500 мкл диспазы 25 Ед/мл и 500 мкл 0,1% коллагеназы I в течение 1 ч при 37 °C.
    3. Используйте 10 мМ PBS для приготовления раствора трипсина-ЭДТА (0,05 г/л трипсина, 0,04 г/л ЭДТА). Обрабатывают фрагменты LG со стадии 1.2.2 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 10 мин при 37 °C и диссоциируют фрагменты на одиночные клетки путем многократной пипетки.
    4. Отфильтруйте суспензию через фильтр 70 мкм, соберите фильтрат в стерильную центрифужную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 150 × г в течение 5 мин.
    5. После центрифугирования удалите супернатант, добавьте 10 мл 10 мМ PBS для промывки ячейки гранулы и центрифугируйте суспензию.
    6. Повторите шаг 1.2.5, удалите супернатант и добавьте 1 мл DMEM/F12 (смесь 1:1 модифицированной среды Eagle's Dulbecco и F-12 Ham) для повторного суспендирования клеточных гранул.
  3. Первичная культура LGSC
    1. Подготовьте среду стволовых клеток слезной железы (LGSCM), содержащую DMEM/F12, 1x N2 добавку, 1x B27 добавку, 2 мМ заменителя глутамина, 0,1 мМ YAAA (заменимые аминокислоты), 50 нг/мл мышиного эпидермального фактора роста (EGF), 100 нг/мл фактора роста фибробластов 10 (FGF10), 10 нг/мл Wnt3A и 10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK).
    2. Добавьте 20 мкл матричного геля-матрицы LGSCM (матричный гель: LGSCM = 1:1) в центр лунки 24-луночной пластины. Используйте наконечник пипетки, чтобы расширить его до круга (диаметр 6-8 мм) и инкубировать смесь в течение 20 мин при 37 °C, чтобы предварительно покрыть лунку.
    3. Используйте счетчик клеток для определения количества клеток и добавьте 40 мкл LGSCM в общей сложности 1 × 104 клеток в 40 мкл матричного геля. Аккуратно смешайте их с пипеткой для получения матричной смеси гель-LGSCM (матричный гель: LGSCM= 1:1).
    4. Используйте пипетку, чтобы осторожно опустить 80 мкл смеси на предварительно покрытую область в каждой скважине 24-луночной пластины на стадии 1.3.2.
    5. Инкубировать смесь в течение 20 мин при 37 °C и добавить 600 мкл LGSCM.
    6. Меняйте культуральную среду в каждой лунке один раз в два дня. После 7 дней посева ищите сферы LGSC диаметром 100-300 мкм под инвертированным микроскопом (окуляр: 10x, объектив: 4x).
      ПРИМЕЧАНИЕ: LGSC можно культивировать в общей сложности более 14 дней.
  4. Изолируйте и культивируйте первичные LGSC мышей ROSA26mT/mG и мышей DED (NOD/ShiLtJ), следуя описанным выше шагам.

2. Обслуживание и прохождение LGSC

  1. Уберите культуральную среду из сферы культуры хорошо.
  2. Дезагрегировать сферы LGSC, культивируемые в течение 7 дней путем инкубации в 20 мкл диспазы 10 Ед/мл и 100 мкл 10 мМ PBS в течение 30 мин при 37 °C.
  3. Переложите суспензию в центрифужную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 150 × г в течение 4 мин. Удалите супернатант.
  4. Обрабатывайте сферы 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C. Добавляют 1 мл 0,05% ингибитора трипсина (TI) и пипетку многократно, чтобы нейтрализовать трипсин и диссоциировать сферы на отдельные клетки.
  5. Центрифугу при 150 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант для получения LGSC в грануле. Добавьте 1 мл LGSCM для повторного суспендирования гранулы LGSC.
  6. Обложите одиночные ячейки, как описано на этапах 1.3.1-1.3.6.

3. Дифференциация LGSC

  1. Процедура 1: Увеличение времени культивирования LGSC с 7 до 14 дней с помощью системы культур LGSC для случайной дифференциации.
  2. Процедура 2: Изменение соотношения матричного геля и смеси LGSCM с 1:1 до 1:2 в начале культуры LGSC для дифференцировки протоковых клеток. Поместите LGSC в матрицу для индукции в течение 14 дней (см. шаг 1.3).
  3. Процедура 3: После прохождения замените LGSCM смесью LGSCM-10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для дифференцировки ацинарных клеток. Вызывают дифференциацию в течение 14 дней.

4. Обезвоживание тканей LG

  1. Получить ткани LG (этап 1.1.1) и промыть ЛК 4 мл стерильного 10 мМ раствора PBS в посуде 6 см в течение 2 мин. Переместите ткани на 10% раствор формалина для фиксации в течение 24 ч.
  2. Промыть неподвижные ткани 10 мМ PBS в течение 2 мин, чтобы удалить формалин, и перенести ткань в коробку для встраивания тканей. Поместите встраиваемую коробку в автоматический дегидратор.
  3. Используйте автоматический дегидратор для обезвоживания тканей следующим образом: 70% этанол, 2 ч; 80% этанол - 2 ч; 90% этанол, 30 мин; 95% этанол, 30 мин; абсолютный этанол, 30мин; абсолютный этанол- 2 ч; абсолютный этанол: 100% смесь ксилола (1:1), 30 мин; 100% ксилол, 30 мин; 100% ксилол, 2 ч; 100% ксилол: парафиновая (1:1) смесь, 30 мин; парафин, 2 ч; парафин,3 ч.

5. Дегидратация органоидов/сфер LG

  1. Получить органоиды/сферы LG (этапы 2.1-2.3) в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл и промыть органоиды/сферы LG 1 мл стерильного раствора PBS 10 мМ в течение 2 мин.
  2. Центрифугу при 100 × г в течение 1 мин и удаляют супернатант.
  3. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) следующим образом: добавьте 20 г PFA в смесь 400 мл 10 мМ PBS и 40 мкл 1 M NaOH, хорошо встряхните раствор и нагревайте его на водяной бане 65 °C в течение 2 ч до полного растворения PFA. После охлаждения до комнатной температуры используйте 10 мМ PBS, чтобы составить объем до 500 мл и хранить его при 4 °C.
  4. Добавьте 1 мл 4% PFA в микроцентрифужную трубку с органоидной/сферической гранулой и поместите трубку в холодильник с температурой 4 °C на срок не менее 24 ч для фиксации.
  5. После фиксации центрифугируют при 100 × г в течение 1 мин и удаляют надосадочный материал. Добавьте 1 мл 10 мМ PBS в микроцентрифужную трубку с органоидной/сферической гранулой и аккуратно перемешайте путем пипетирования в течение 2 мин, чтобы смыть PFA. Повторите этот шаг дважды.
  6. Центрифугу при 100 × г в течение 1 мин и удаляют супернатант.
  7. Нагревая встраиваемый гидрогель для растворения и добавления 50-60 мкл встраиваемого гидрогеля в органоидную/сферическую гранулу и смешивание. Пипетка смеси на парапленку в виде капли и подождите 5 мин, пока она затвердеет при комнатной температуре.
  8. Обезвоживайте гель с помощью органоидов/сфер в новой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл следующим образом.
    1. Добавьте в пробирку 1 мл 50% этанола, подождите 30 мин при комнатной температуре и извлеките жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг, последовательно изменяя концентрацию этанола до 70%, 80%, 90%, 95%.
    2. Добавьте 1 мл абсолютного этанола в пробирку, подождите 30 мин при комнатной температуре и удалите жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг.
    3. Добавьте в пробирку 1 мл смеси 0,5 мл абсолютного этанола и 0,5 мл 100% ксилола, подождите 30 мин при комнатной температуре и извлеките жидкость из трубки путем пипетки.
    4. Добавьте в трубку 1 мл 100% ксилола, подождите 30 минут при комнатной температуре и извлеките жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 5.8.5-5.8.6 должны выполняться в металлической ванне при температуре 65°С.
    5. Добавьте в трубку 1 мл смеси 0,5 мл парафина и 0,5 мл 100% ксилола, подождите 30 мин при 65 °C и удалите жидкость из трубки путем пипетки.
    6. Добавьте 1 мл парафина в пробирку, подождите 30 мин при 65 °C и извлеките жидкость из трубки путем пипетки. Повторите этот шаг и увеличьте время обработки до 1 ч.

6. Встраивание и секционирование парафина

  1. Встраивание парафина
    1. Перед встраиванием включите машину для встраивания и предварительно разогрейте ее, чтобы расплавить парафиновый воск в резервуаре для парафина.
    2. Поместите обезвоженную ткань или органоидный /сферический гель в канавку железной коробки для встраивания и поместите железную коробку в парафин машины для встраивания.
    3. Снимите пластиковую крышку и поместите пластиковую коробку для встраивания на железную коробку, чтобы покрыть ее. Переместите встраиваемую железную коробку на охлаждающий стол.
    4. После того, как парафин сконденсировался в блоки во встраиваемом ящике, извлеките его из железной коробки и нарежьте его непосредственно или временно храните в холодильнике с температурой 4 °C.
  2. Парафиновое секционирование
    1. Перед нарезкой парафина предварительно соберите слайсер парафина и добавьте дистиллированную воду в раковину слайсера для предварительного нагрева. Начинайте нарезку, когда температура воды поднимется до 42 °C.
    2. Закрепите образец на прорези образца парафинового слайсера. Отрегулируйте толщину сечения до 5 мкм во время нарезки.
    3. Секционируйте образец непрерывно. Исправьте полностью мозаичный участок на противоскользящем слайде в баке слайсера.
    4. После секционирования поместите слайды, прикрепленные к образцу ткани, в биохимический инкубатор при температуре 37 °C для сушки в течение 24 ч. Временно храните слайды в холодильнике при температуре 4 °C.

7. Окрашивание гематоксилином и эозином

  1. Расплавьте парафиновые срезы при 60 °C в течение 30 мин, замочите срезы в 100% ксилоле в течение 15 мин и повторите.
  2. Обработать срезы абсолютным этанолом на шейкере в течение 5 мин.
  3. Обработайте секции 90% этанолом, 80% этанолом и 70% этанолом на шейкере, каждый в течение 3 мин.
  4. Обработайте участки деионизированной водой на шейкере в течение 5 мин и 2 мин последовательно.
  5. Окрашивайте срезы на влажную коробку в течение 5 мин раствором гематоксилина 4 мг/мл. Смойте участки в проточной воде в течение 10 минут.
  6. Перемешайте срезы на шейкере сначала деионизированной водой в течение 2 мин, а затем 0,5%-1% эозином в течение 1 мин.
  7. Перемешиваем участки 70% этанолом, 80% этанолом и 90% этанолом на шейкере в течение 3 мин (каждый) последовательно. Перемешайте срезы абсолютным этанолом на шейкере в течение 5 мин.
  8. Замочите срезы в 100% ксилоле на 15 мин и повторите замачивание.
  9. Используйте пипетку или капельницу, чтобы добавить 3-4 капли нейтрального бальзама на слайд, и медленно накройте его закрывающим слайдом. Высушите горки на воздухе при комнатной температуре.

8. Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание

  1. Расплавите парафиновые срезы при 60 °C в течение 30 мин, замочите срезы в 100% ксилоле в течение 10 мин и повторите этот шаг дважды.
  2. Перемешивают срезы на шейкере сначала абсолютным этанолом, 90% этанолом и 80% этанолом в течение 2 мин (каждый), последовательно, а затем деионизированной водой в течение 3 мин. Повторите перемешивание деионизированной водой дважды.
  3. Перемешивают срезы на шейкере сначала смесью 20 мл 30%H2O2 и 180 мл метанола в течение 10 мин, а затем деионизированной водой в течение 5 мин. Повторите этот шаг три раза.
  4. Переложите срезы в предварительно сваренный буфер лимонной кислоты (1 л деионизированной воды с 3 г Na3C6H5O7,2H 2O и 0,4 г C6H8O7, pH 6,0), микроволновую печь в течение 10 мин, чтобы держать их в докритической температуре кипения, и охлаждать при комнатной температуре в течение 30 мин. Перемешайте срезы деионизированной водой на шейкере в течение 5 мин. Повторите этот шаг три раза.
  5. Перемешайте срезы 10 мМ PBS на шейкере в течение 5 мин, и повторите этот шаг три раза. Обложите область ткани на влажной коробке водоотталкивающим маркером, добавьте каплю готовой к употреблению неиммунной козьей сыворотки для покрытия образцов и поместите их при комнатной температуре на 1 ч.
  6. Удалите сыворотку, добавьте первичные антитела к образцам (см. Таблицу материалов) и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C. Удалите первичное антитело, перемешайте срезы с 10 мМ PBS на шейкере в течение 5 мин и повторите этот этап перемешивания с 10 мМ PBS три раза.
  7. Добавляют вторичные антитела (см. Таблицу материалов) для покрытия образцов и инкубируют их на влажном ящике в течение 30 мин при комнатной температуре. Перемешайте срезы с 10 мМ PBS на шейкере в течение 5 мин, и повторите шаг перемешивания три раза.
  8. Добавьте свежеприготовленный 0,03-0,05% раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB) для покрытия образцов на влажной коробке и окрашивания в течение 30-90 с. Смойте участки проточной водой в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте время окрашивания, наблюдая под световым микроскопом до появления желтого цвета.
  9. Добавьте 4 мг/мл раствора гематоксилина для покрытия образцов, окрашивайте в течение 5 мин на влажном ящике и промывайте участки проточной водой в течение 10 мин.
  10. Перемешайте секции на шейкере с 80% этанолом, 90% этанолом и абсолютным этанолом в течение 2 мин каждый, последовательно, и замочите секции в 100% ксилоле в течение 30 мин.
  11. Используйте пипетку или капельницу, чтобы добавить 3-4 капли нейтрального бальзама на слайд, и медленно накройте его закрывающим слайдом. Высушите горки на воздухе при комнатной температуре.

9. Глобальное иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов/сфер

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите органоиды/сферы, зафиксированные 4% раствором PFA в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл (см. шаги 5.1-5.4). Выполните флуоресцентную маркировку следующим образом.

  1. Обезвоживать органоиды/сферы, добавляя в пробирку 1 мл 30% раствора сахарозы и инкубировать его на ночь в холодильнике при 4 °C.
  2. Добавьте 100 мкл раствора PBST (10 мМ раствора PBS с 0,1% Triton X-100) в трубку для промывки органоидов/сфер в течение 5 мин, центрифугируйте трубку при 100 × г в течение 1 мин и соберите гранулу. Повторите этот шаг три раза.
  3. Добавить в тюбик 0,5-1 мл готовой к употреблению неиммунной козьей сыворотки и запечатать ее при комнатной температуре на 1 ч. Центрифугируют пробирку при 100 × г в течение 1 мин и собирают гранулы.
  4. Добавьте несколько капель разбавленного первичного антитела, чтобы просто покрыть гранулу и инкубировать в холодильнике при 4 °C в течение 48 ч. Центрифугируют пробирку при 100 × г в течение 1 мин и собирают гранулы.
  5. Повторите шаг 9.2.
  6. Добавьте несколько капель флуоресцентного вторичного антитела и раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в трубку, чтобы просто накрыть гранулу и инкубировать в холодильнике при 4 °C в течение 24 ч, избегая света.
  7. Повторите шаг 9.2, избегая света.
  8. Добавьте 100 мкл раствора PBST в пробирку и временно храните его в холодильнике с температурой 4 °C вдали от света. Наблюдайте и фотографируйте органоиды/сферы с помощью сканирующего микроскопа.

10. LGSC pLX-mВечерная трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Производство лентивирусных частиц должно осуществляться в шкафу биобезопасности и чистом стенде на уровне биобезопасности BSL2.

  1. Культивируйте лентивирусную упаковочную ячейку 293T в 6-луночную пластину с DMEM + 10% FBS при 37 °C, 5% CO2 в течение 3-5 дней для достижения 80% клеточной конфюентности.
  2. Трансфектируйте лентивирусный вектор pLX-mCherry в LGSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат реагента показан для одной лунки из 6-луночной пластины.
    1. Подготовьте две стерильные центрифужные трубки объемом 1,5 мл и добавьте 250 мкл DMEM/F12 в каждую трубку.
    2. Добавьте 7,5 мкл трансфекционного реагента в одну трубку и тщательно перемешайте реагент путем пипетирования.
    3. Добавьте 2 мкг плазмиды pLX-mCherry без эндотоксина и соответствующей плазмиды лентивирусной упаковки в другую трубку и добавьте трансфекционный реагент (2 мкл/мкг плазмиды).
    4. Смешайте жидкость в обеих центрифужных трубках и дайте смеси постоять 5 минут при комнатной температуре.
    5. Удалите питательную среду из клеток 293T и добавьте смесь из стадии 10.2.4 в клетки 293T. Через 8 ч изменить питательную среду на свежую ДМЭМ +10% ФБС.
    6. Через 48 ч впервые соберите супернатант вируса и отфильтруйте его через фильтр 0,45 мкм. Через 72 ч соберите супернатант вируса во второй раз и снова отфильтруйте его через фильтр 0,45 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните оба фильтрованных супернатанта на льду до трансдукции лентивируса.
  3. Получите LGSC от мышей DED (NOD/ShiLtJ) (см. шаг 1).
  4. Добавьте 1 мл предварительно собранного супернатанта pLX-mCherry lentivirus для повторного суспендирования клеток.
  5. Установите трубку центрифуги на шейкер в инкубаторе CO2 при 37 °C. Встряхните его со скоростью 100 оборотов в минуту, чтобы максимизировать контакт между лентивирусом и клетками. Через 8 ч центрифугируют смесь при 250 × г в течение 4 мин и удаляют надосадочное вещество.
  6. Добавьте 1 мл DMEM/F12 для повторного суспендирования гранулы клетки. Используйте счетчик клеток для определения количества клеток и засейте в общей сложности 1 × 104 клеток в 100 мкл матричного геля-матрицы LGSCM (матричный гель: LGSCM = 1:1) в каждую лунку из 24-луночной пластины, предварительно покрытой 20 мкл матрицы гель-LGSCM (см. шаг 1.3.2).
  7. После 7 дней культивирования (см. шаг 1) выберите сферы, демонстрирующие красную флуоресценцию под флуоресцентным микроскопом, чтобы расширить культуру.

11. Ортотопическая трансплантация LGSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические операции выполняются в операционной SPF, а все хирургические инструменты стерилизуются.

  1. Получите сферы LGSC у мышей ROSA26mT/mG с красной флуоресценцией (td-Tomato) или трансфекцией mCherry, культивируемых в течение 7 дней (см. шаг 1).
  2. Перед использованием охладите микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую смесь матричного геля 1:1 и DMEM/F12. Переваривайте сферы LGSC в отдельные клетки и повторно суспендируйте клетки с плотностью 2 × 106 клеток / мл в трубке.
  3. Анестезируют мышей NOD/ShiLtJ внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь NOD / ShiLtJ является идеальной моделью с идиопатическими симптомами ADD, включая снижение секреции слезы, воспалительную инфильтрацию и орбитальное изъязвление.
  4. После анестезии используйте физиологический раствор или ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость, а затем используйте офтальмологические ножницы, чтобы сделать 5-8 мм разрез в коже за ухом (около глаза) анестезирующих мышей, чтобы обнажить ЛОГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Йодофор следует строго использовать для дезинфекции вокруг разреза.
  5. Вводят 2 × 104 клеток в левую сторону LG и вводят смесь без клеток (см. шаг 11.2) в правую сторону LG в качестве контроля.
  6. После инъекции восстановить ЛОГ в исходное положение с помощью офтальмологических щипцов и зашить рану. Кормите мышей в течение 2 месяцев и наблюдайте за эффектом лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материал подушки клетки также должен быть строго стерилизован после операции, а материал подушки должен заменяться один раз в день. После наложения швов раны трамадол можно выборочно вводить в хвостовую вену мышей в стандартной дозе 2,5 мг/кг для достижения анальгезии.
  7. Обезболивают этих мышей через 2 месяца после эксперимента (см. шаг 11.3). Снимают симптомы глазной области.
    1. Во время анестезии ищите следующие симптомы: расслабление мышц шеи и конечностей; глубокое, медленное и устойчивое дыхание; сужение зрачка; исчезновение роговичного рефлекса.
    2. Во время анестезии и операции поддерживайте температуру тела мышей на уровне 37 °C. После операции добавьте соответствующие антибиотики в питьевую воду для мышей, чтобы снизить риск раневой инфекции. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не придут в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Не возвращайте мышей, перенесших операцию, в компанию других мышей до полного выздоровления.
    3. После съемки симптомов глазной области откройте программное обеспечение ImageJ, нажмите на Файл | Открыть | От руки выберите, удерживайте левую кнопку мыши и выберите область изъязвления орбиты на изображении. Нажмите на Анализ | Мера для получения относительной площади изъязвления.
  8. Нанесите фенольную красную хлопчатобумажную нить на боковую кантус анестезирующих мышей на 10 с; измерить и записать длину обесцвеченной части хлопчатобумажной нити. Усыпляют мышей вывихом шейного позвонка после измерения слезы.
  9. Рассекните мышей и получите ЛОГ для анализа IHC.

12. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом предварительно охладите центрифугу до 4 °C и убедитесь, что все реагенты и расходные материалы не загрязнены РНКазой.

  1. Соберите LGSC или фрагменты LG в микроцентрифужной трубке. Добавьте 1 мл буфера лизиса клеток и полностью лизируйте клетки или ткани вихревым колебанием.
  2. Добавьте 0,2 мл хлороформа, и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 10 мин после вихревого колебания в течение 1 мин. Центрифуга в течение 15 мин при 4 °C, 12 000 × г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования жидкость делится на три слоя, а РНК находится в самой верхней прозрачной водной фазе.
  3. Аккуратно выложите в пипетку самую верхнюю прозрачную водную фазу и перенесите ее в новую 1,5 мл центрифужную трубку без РНКазы.
  4. Добавьте равный объем изопропилового спирта и аккуратно перемешайте. Дайте смеси постоять при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем центрифугируйте в течение 15 мин при 4 °C, 12 000 × г.
  5. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 75% этанола. Инвертировать трубку для промывки гранул и центрифуги в течение 5 мин при 4 °C, 7 500 × г. Повторите этот шаг.
  6. Осторожно удалите супернатант и поместите трубку центрифуги в ультрачистый верстак, чтобы высушить его в течение примерно 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к следующему шагу, когда белая гранула станет полупрозрачной. Проводить все операции на льду.
  7. Добавьте 20 мкл воды без РНКА, чтобы полностью растворить гранулу. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов) и храните раствор РНК при -80 °C.

13. ПЦР

  1. Реакция обратной транскрипции
    1. Добавьте 1 мкг общей РНК (рассчитайте объем добавленного раствора РНК в соответствии с концентрацией раствора РНК) в реакционную трубку ПЦР и инкубируйте при 65 °C в течение 5 мин для денатурации.
    2. Положите его на лед в течение 1 мин, а затем добавьте воду без ферментов, пока общий объем не достигнет 12 мкл. Добавьте 4 мкл 4x DNA Master Mix и инкубируйте его при 37 °C в течение 5 мин.
    3. Положите трубку на лед, добавьте 4 мкл 5x RT Master Mix и аккуратно перемешайте. Установите следующие настройки ПЦР: 37 °C в течение 15 мин, 50 °C в течение 5 мин, 98 °C в течение 5 мин, 4 °C в течение 1 мин.
    4. Храните его при -20 °C или переходите к следующему шагу после завершения реакции обратной транскрипции.
  2. Реакция ПЦР
    1. Готовят реакцию ПЦР в ПЦР-трубке следующим образом: 14,1 мкл безферментной воды, 2 мкл dNTP, 2 мкл 10x Buffer, 0,8 мкл Primer (10 мкМ, 0,4 мкл Forward Primer и 0,4 мкл обратного праймера, см. Таблицу материалов), 1 мкл кДНК обратной транскрипции (см. стадию 13.1) и 0,1 мкл фермента Taq.
    2. Поместите подготовленную реакцию ПЦР в аппарат ПЦР для ПЦР. Обратитесь к инструкциям набора ферментов Taq для процедуры ПЦР (см. Таблицу материалов).
  3. Электрофорез агарозного геля
    1. Используйте аналитические весы для взвешивания 242 г Tris и 37,2 г Na2EDTA·2H2Oи добавьте их в стакан емкостью 1 л. Добавьте ~ 800 мл деионизированной воды и 57,1 мл ледниковой уксусной кислоты в стакан, хорошо перемешайте, добавьте деионизированную воду до 1 л, чтобы получить 50-кратный буфер TAE, и храните ее при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте 50x TAE буфер деионизированной водой перед использованием.
    2. Используйте аналитические весы, чтобы взвесить 1,2 г агарозы и добавить ее в коническую колбу, содержащую 80 мл 1x буфера TAE. Нагревайте его несколько раз в микроволновой печи до полного растворения.
    3. Охладите колбу под проточной водопроводной водой до тех пор, пока температура раствора не упадет до 60 °C. Добавить 8 мкл пятна нуклеиновой кислоты, после хорошего перемешивания влить раствор в желатинирующий бак, поместить гребень и дать ему постоять при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Вытащите гребень и загрузите продукты ПЦР в приготовленный агарозный гель. Выполняют электрофорез при 120 В в течение 30 мин.
    5. Поместите гель в систему визуализации ECL Gel и сфотографируйте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Создание 3D-системы культуры без сыворотки
В этом исследовании был разработан LGSCM, содержащий EGF, Wnt3A, FGF10 и Y-27632 для мышиных LGSC, и LGSC были успешно выделены и культивированы методом 3D-культуры (рисунок 1A). С помощью этого метода16 была создана успешная 3D, бессывороточная система культивирования LGSC от мышей C57BL/6, мышей NOD/ShiLtJ, BALB/c и ROSA26mT/mG мышей. Для самца мыши 1,5-2 × 106 клеток были получены из двух ЛОГ путем диссоциации. После одной недели культивирования образовывалось 30-60 сфер при посеве 1 × 104 LG-клеток в начале культуры. Более того, клетки, культивируемые этим методом, экспрессировали Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin и другие маркеры стволовых клеток16, что указывает на то, что полученные клетки обладали свойствами LGSC. Krt14 и Ki67 экспрессировались во всех сферах, образованных LGSC, культивируемых в течение 7 дней (рисунок 1B), что указывает на то, что LGSC обладали способностью к самообновлению.

Во время 7-дневной культуры сферы LGSC достигли диаметра 100 мкм. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) показало клеточность на 7-й день (рисунок 1C и рисунок 1F). Факторы обогащения ЛГСК, полученные после 7 дней первичной культуры и субкультуры, указывали на то, что обогащенные этим методом ЛГСК обладали сильной пролиферативной способностью (рисунок 1D). В этой системе LGSC можно было пройти более 40 раз, и они все еще сохраняли характеристики стволовых клеток (рисунок 1E и рисунок 1G). В заключение, в этой статье описывается протокол для создания 3D, безсыворочной системы культивирования для LGSC in vitro. Клетки, культивируемые по этому протоколу, обладают непрерывной и стабильной пролиферативной способностью.

Индуцировать дифференциацию in vitro
Проанализирована дифференциационная способность ЛГСК in vitro . При культивировании в течение более 7 дней LGSC постепенно теряли способность к росту, и экспрессия AQP5, Ltf, Krt19 и других маркеров, связанных с дифференцировкой, увеличивалась, в то время как экспрессия Krt14 постепенно снижаласьна 16. LGSC были индуцированы образованием большего количества бутонов FBS и низкой пропорции матричного геля (рисунок 2A, B). Кроме того, окрашивание H&E показало, что FBS может индуцировать сферы для создания большего количества кавитирующих структур (рисунок 2C).

Предыдущая работа предполагала, что снижение твердости матрицы способствует дифференциации LGSC в протоковидные органоиды. Клетки базального слоя сохраняли характеристики стволовых клеток, экспрессирующих Krt14, в то время как клетки базального верхнего слоя дифференцировались в протоковидные структуры с полостями и экспрессировали Krt19. Кроме того, добавление FBS может индуцировать дифференцировку LGSC в ацинароподобные органоиды, которые сохраняют характеристики стволовых клеток с высоким соотношением ядер/цитоплазма. Некоторые дифференцированные ацинароподобные клетки экспрессировали высокие уровни AQP5 с низким соотношением ядерный/цитоплазматический16.

 Ремонт LGSC  in vivo
Основываясь на приведенных выше экспериментах, способность LGSC восстанавливать поврежденные LGs была исследована с помощью ортотопической инъекции. После ортотопической инъекции ROSA-LGSC у мышей NOD/ShiLtJ рядом с ЛОГ образовались новые слезные дольки (рисунок 3A-C). Большинство долек состояли из зрелых ацинарных клеток с высокой экспрессией AQP5, и было образование внутридольковых протоков с низкой экспрессией AQP5 (рисунок 3D-F). После инъекции ROSA-LGSC в течение 8 недель измеряли распад вокруг орбиты реципиентов. Измерения показали, что инъекция LGSC уменьшала площадь распада на ~60% (рисунок 3G, H). Рассечение показало, что объем LG увеличивался после инъекции в течение 10 недель (рисунок 3I). Количество слезной секреции на стороне инъекции ROSA-LGSC было выше, чем на контрольной стороне, но ниже, чем у мышей дикого типа (рисунок 3J). Эти результаты показывают, что клетки, собранные этой культуральной системой, имеют характеристики LGSC и могут быть использованы для терапии стволовыми клетками у мышей с СДВ и ксерофтальмией.

Figure 1
Рисунок 1: Выделение и характеристика ЛГСК. (А) Стратегия первичной и непрерывной культуры прохождения ЛГСК. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание LGSC на 7-й день. LGSC экспрессируют маркер эпителиальных клеток E-кадгерин (красный), маркер стволовых клеток Krt14 (красный), маркер пролиферативных клеток Ki67 (красный). Встречное пятно, DAPI (синий). (C) Морфология LGSC в культуре за 1, 3, 5 и 7 дней. (D) Коэффициент относительного обогащения культуры LGSC в первичной культуре и субкультуре. Коэффициент относительного обогащения представляет собой отношение общего количества клеток, полученных после 7 дней посева, к числу клеток, посеянных в культуре. P < 0,01. (E) Транскрипция маркеров взрослых стволовых/прогениторных клеток LG мыши и различных проходных LGSC (P1, P10, P20 и P40). (F) Морфология (слева) и окрашивание H&E (справа) LGSC в первичной культуре на 7-й день. (G) ЛГСК, культивируемые в различных проходах (Р1, Р10, Р20 и Р40). Шкала стержней = 50 мкм (B, F, G), 100 мкм (C). Сокращения: LG = слезная железа; LGSC = стволовые клетки LG; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол;; NC = отрицательный контроль; TE = трипсин-ЭДТА; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Дифференциация LGSC in vitro. (A,B) Морфология LGSC, культивируемых в нормальной среде или дифференциационной среде. (A) LGSC культивируют в течение 10 дней в P10 (слева: нормальная среда, справа: FBS-содержащая среда). (B) LGSC культивируют в течение 14 дней в P31 (слева: нормальная среда, справа: среда с 1/3-м матричным гелем). (C) H&E окрашивание LGSC, культивируемых в течение 14 дней (вверху: нормальная среда, нижняя: FBS-содержащая среда). Шкала стержней = 100 мкм (A), 200 мкм (B), 50 мкм (C). Сокращения: LG = слезная железа; LGSC = стволовые клетки LG; H&E = гематоксилин и эозин; FBS = фетальная бычья сыворотка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Приживление аллотрансплантации LGSC и облегчение симптомов ADD. (A-F) Окрашивание IHC NOD/ShiLtJ LG трансплантируют 7-дневными культурами ROSA-LGSC через 8 недель. Используйте левую и правую стороны той же мыши, что и экспериментальная группа и контрольная группа. (А-С) Окрашивание IHC анти-td-томатным антителом; (Д-Ф) Окрашивание IHC антителом против AQP5; (А, Г) LG вводили транспортное средство (смесь матричного геля 1:1 и DMEM/F12), (B, E) LG вводили ROSA-LGSC, (C, F) увеличивали изображения черных квадратов в B, E (красная стрелка, внутридольковый проток). (Г, Н) Состояние орбиты глаза мыши NOD/ShiLtJ после инъекции ROSA-LGSC через 8 недель. Инъекция LGSC значительно облегчает распад вокруг глазной орбиты. (I) ЛОГ мыши NOD/ShiLtJ через 10 недель (слева: LG со стороны, вводимой клетками, справа: LG с контрольной стороны). (J) Объем разрыва мышей дикого типа и NOD/ShiLtJ, пересаженных 7-дневными культурами ROSA-LGSC через 8 недель. Объем разрыва впрыскиваемых в ROSA-LGSC НГ выше, чем у контрольных НГ, но значительно ниже, чем у ВТ ЛГ. n = 3; МЫШИ NOD/ShiLtJ, n = 4; Р < 0,01; *P < 0,05. Шкала стержней = 50 мкм (A-F). Сокращения: LG = слезная железа; LGSC = стволовые клетки LG; IHC = иммуногистохимический; WT = дикий тип; ADDED = водно-дефицитная болезнь сухого глаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существуют хорошо зарекомендовавшие себя методы выделения и культивирования in vitro слезных стволовых клеток для культуры слезных стволовых клеток и восстановления повреждений LG. Шатос и др.17 и Акерманни др. 6 успешно культивируемых и субкультурных слезных стволовых клеток крыс и мышей методами 2D-культивирования соответственно, что позволяет трансплантировать слезные стволовые клетки для лечения АДД. Исследования стволовых клеток18 и мезенхимальных стволовых клеток 19,20 ЛК, культивируемых в 2D, показали, что трансплантация этих клеток может в некоторой степени облегчить симптомы СДВ. Путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток, Gromovaet al. 2 отобрали стволовые клетки, экспрессирующие маркеры клеток-предшественников LG из мышиных LGs и дифференцировали их в протоки и acini in vitro, успешно реализуя дифференцировку взрослых стволовых клеток в функциональные клетки LGs. Также было показано, что трансплантация достаточного количества стволовых клеток может облегчить симптомы СДВ У мышей.

Для удовлетворения потребностей обогащения стволовых клеток и устранения сывороточной зависимости в существующих методах культивирования слезных стволовых клеток была создана система безсыворочных культур слезных стволовых клеток в этом протоколе на основе ранее опубликованных исследований и технологии органоидной 3D-культуры21. Таким образом, ожидается, что эта система будет способствовать клиническим исследованиям слезных стволовых клеток. В этом протоколе критические шаги включают первичную культуру, субкультуру и расширение LGSC, а также трансплантацию на месте LGSC в поврежденные LGS у мышей.

Первичная культура является основой для получения ЛГСК. Необходимо поддерживать стерильные условия во время первичной культуры. Лунка предварительно покрыта матрикс-гелем, чтобы избежать прилипшего роста клеток на дне клеточной культуры. При использовании матрикс-геля необходимо следовать инструкциям производителя, и всегда держать его в жидком состоянии перед добавлением в лунку, чтобы избежать потери матрикс-геля во время эксперимента и неравномерного матрикс-геля в культуре.

Количество засеянных клеток в первичной культуре составляет 10 000 клеток в лунку. На практике количество посеянных клеток может быть увеличено, если обеспечено соответствующее пространство для роста и снабжение клеток питательными веществами. Субкультура является важным шагом к очищению и обогащению стволовых клеток. После прохождения LGSC в поколении P1 образовали больше сфер, и было больше клеток поколения P1, чем поколения P0. Это указывает на то, что LGSC с пролиферативной способностью обогатились в этой системе.

Когда LGSC культивировались в этой 3D-системе в течение 10 дней, 0,05% трипсина-ЭДТА иногда было недостаточно для полного переваривания органоидов в отдельные клетки во время прохождения. Эта проблема была решена путем соответствующего увеличения времени пищеварения. Инъекционная терапия in situ является необходимой процедурой для проверки клинической ценности LGSC. Из-за небольших размеров и тонких и рыхлых тканей LGs у мышей клетки всегда теряются из места инъекции, если клеточная суспензия приготовлена в обычном физиологическом растворе или 10 мМ PBS для инъекции. Поэтому рекомендуется смешивать клеточную суспензию с матрикс-гелем для инъекций. Поскольку матричный гель, используемый в этой системе, затвердевает при температуре выше 10 ° C, клетки могут легко колонизироваться при введении в LG. Смесь клеток и матрикс-гель необходимо всегда держать на льду перед инъекцией, а инъекцию выполнять быстро.

В дополнение к изоляции LGSC от нормальных мышей, взрослые LGSC от мышей ADD были успешно изолированы и культивированы впервые с использованием этого протокола16. Однако эта система по-прежнему имеет недостатки и нерешенные проблемы. Во-первых, используемый матрикс-гель получен от мышей 22,23, что может вызывать реакции отторжения в организме человека и, следовательно, имеет ограниченную клиническую применимость. Необходимо улучшить систему культивирования, найдя соответствующие синтетические гели для замены матричного геля.

Во-вторых, необходимо усовершенствовать стратегию дифференциации в этом протоколе. Вместо того, чтобы продлевать время культивирования для дифференциации21 или добавлять сыворотку в культуральную среду, ожидается, что добавление конкретных факторов роста и изменение конкретных условий окружающей среды для направленной индукции даст желаемые результаты. Необходимо дополнительно изучить механизм поддержания и дифференциации ЛГСК путем выяснения сигнальных путей, вызывающих дифференцировку. Кроме того, предыдущие исследования показали, что миоэпителиальные клетки, культивируемые in vitro , также экспрессируют гены стволовых клеток, такие как Nestin, Musashi и Pax6, что указывает на то, что миоэпителиальные клетки также имеют характеристики стволовых клеток17.

Это исследование не обращало никакого внимания на миоэпителиальные клетки и, следовательно, не проверяло, существуют ли миоэпителиальные клетки в органоидах LG, идентифицируя специфические маркеры экспрессии миоэпителиальных клеток. Из-за ограниченности условий культивирования миоэпителиальные клетки не могли быть индуцированы или что их количество было слишком маленьким, чтобы их можно было наблюдать. Время культивирования может быть продлено, чтобы наблюдать, дифференцируются ли органоиды в дальнейшем в миоэпителиальные клетки или фокусируются на миоэпителиальных клетках в будущих исследованиях индукционной дифференцировки и улучшения системы.

В заключение, этот протокол предоставляет метод изучения LGSC для разработки, восстановления и регенерации LGs. Дифференцировка LGSC in vitro может стать основой будущей регенерации LGs in vitro, в то время как выделение и культивирование LGSC может решить проблему отторжения при аллотрансплантации стволовых клеток. Этот метод обеспечивает важную основу для клинического индивидуализированного лечения ксерофтальмии с помощью LGSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 31871413) и двумя программами гуандунской науки и техники (2017B020230002 и 2016B030231001). Мы искренне благодарны исследователям, которые помогли нам во время исследования, и сотрудникам, работающим в центре для животных, за их поддержку в уходе за животными.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Tags

Биология выпуск 184
Трехмерная система культивирования без сыворотки для стволовых клеток слезных желез
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter