Summary

Трехмерная система культивирования без сыворотки для стволовых клеток слезных желез

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

Трехмерный, бессывороточный метод культивирования стволовых клеток взрослой слезной железы (LG) хорошо зарекомендовал себя для индукции образования органоидов LG и дифференцировки в ацинарные или протоковидные клетки.

Abstract

Терапия на основе стволовых клеток слезных желез (LG) является перспективной стратегией для лечения заболеваний слезных желез. Однако отсутствие надежного, бессывороточного метода культивирования для получения достаточного количества стволовых клеток LG (LGSC) является одним из препятствий для дальнейших исследований и применения. Трехмерный (3D), бессывороточный метод культивирования для взрослых мышиных LGSC хорошо известен и показан здесь. LGSC могут непрерывно проходить и индуцироваться для дифференцировки в ацинарные или протоковидные клетки.

Для первичной культуры LGSC ЛОГ от 6-8-недельных мышей переваривали диспазой, коллагеназой I и трипсином-ЭДТА. В общей сложности 1 × 104 одиночные клетки были засеяны в 80 мкл матричной матрицы гелеобразной среды стволовых клеток железы (LGSCM) в каждой лунке 24-луночной пластины, предварительно покрытой 20 мкл матричного геля-матрицы LGSCM. Смесь затвердевали после инкубации в течение 20 мин при 37 °C и добавляли 600 мкл LGSCM.

Для поддержания LGSC LGSC, культивируемые в течение 7 дней, были дезагрегированы на отдельные клетки путем диспазы и трипсина-ЭДТА. Одиночные клетки имплантировали и культивировали в соответствии с методом, используемым в первичной культуре LGSC. LGSC могут проходить более 40 раз и непрерывно экспрессировать маркеры стволовых / прогениторных клеток Krt14, Krt5, P63 и nestin. LGSC, культивируемые в LGSCM, обладают способностью к самообновлению и могут дифференцироваться в ацинарные или протоковидные клетки in vitro и in vivo.

Introduction

Стволовые клетки слезной железы (LGSC) поддерживают обновление клеток слезной железы (LG) и являются источником ацинарных и протоковых клеток. Поэтому трансплантация LGSC считается альтернативным подходом для лечения тяжелых воспалительных повреждений и водно-дефицитной болезни сухого глаза (ADD)1,2,3. Несколько методов культивирования были применены для обогащения LGSC. Tiwari et al. отделили и культивировали первичные клетки LG с использованием коллагена I и матричного геля, дополненного несколькими факторами роста; однако клетки LG нельзя было непрерывно культивировать4. Используя двумерную (2D) культуру, стволовые клетки, полученные из LG, были выделены You et al.5 и Ackermann et al. 6, было обнаружено, что он экспрессирует гены маркера стволовых клеток /предшественников, Oct4, Sox2, Nanog и nestin, и может быть субкультурирован. Тем не менее, нет четких указаний на то, что эти клетки могут дифференцироваться в ацинарные или протоковые клетки, и нет эксперимента по трансплантации для проверки потенциала дифференцировки in vivo.

Недавно c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34/CD45-клетки были выделены из ЛОГ мышей с помощью проточной цитометрии, обнаружили экспрессию маркеров клеток-предшественников LG, таких как Pax6 и Runx1, и дифференцировали в протоки и ацины in vitro. У мышей с АДД ортотопическая инъекция с этими клетками может восстановить поврежденные ЛОГ и восстановить секреторную функцию ЛОГ2. Однако количество стволовых клеток, выделенных этим методом, было небольшим, и нет подходящих условий культивирования для расширения изолированных ЛГСК. Таким образом, необходимо создать соответствующую систему культивирования для эффективной изоляции и культивирования взрослых ЛГСК со стабильным и непрерывным расширением для изучения ЛГСК при лечении СДВ.

Органоиды, полученные из стволовых клеток или плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой группу клеток, которые гистологически похожи на родственные органы и могут поддерживать свое собственное обновление. После того, как органоид кишечника мыши был успешно культивирован Sato et al. в 2009году 7, органоиды из других органов культивировали последовательно, основываясь на системе культивирования Сато, таких как желчный пузырь8, печень9, поджелудочная железа10, желудок11, грудь12, легкие13, простата14 и слюнная железа15 . Из-за высокой доли взрослых стволовых клеток перед дифференцировкой клеток в органоидной культуре трехмерный (3D) метод органоидной культуры считается оптимальным для выделения и культивирования взрослых стволовых клеток LG.

Система культуры LGSC для взрослых мышей была создана в настоящем исследовании путем оптимизации метода 3D- культуры без сыворотки. Доказано, что LGSC, культивируемые как у нормальных, так и у мышей с добавленным добавлением, показали стабильную способность к самообновлению и пролиферации. После трансплантации в ДОБАВЛЕННЫЕ мышиные ЛОГ, LGSC колонизировали поврежденные ЛОГ и улучшили производство слезы. Кроме того, красные флуоресцентные LGSC были выделены из мышей ROSA26mT/mG и культивированы. Эта работа обеспечивает надежный ориентир для обогащения LGSC in vitro и аутотрансплантата LGSC в клиническом применении для терапии ADDED.

Protocol

Все эксперименты в этом протоколе соответствовали руководящим принципам ухода за животными Этического комитета по испытаниям на животных Университета Сунь Ятсена. Все операции, связанные с ячейками, должны выполняться на ультрачистом верстаке в операционной ячейки. Все операции с ис…

Representative Results

Создание 3D-системы культуры без сывороткиВ этом исследовании был разработан LGSCM, содержащий EGF, Wnt3A, FGF10 и Y-27632 для мышиных LGSC, и LGSC были успешно выделены и культивированы методом 3D-культуры (рисунок 1A). С помощью этого метода16 была создана успешная 3D…

Discussion

Существуют хорошо зарекомендовавшие себя методы выделения и культивирования in vitro слезных стволовых клеток для культуры слезных стволовых клеток и восстановления повреждений LG. Шатос и др.17 и Акерманни др. 6 успешно культивируемых и субкультурных сл…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 31871413) и двумя программами гуандунской науки и техники (2017B020230002 и 2016B030231001). Мы искренне благодарны исследователям, которые помогли нам во время исследования, и сотрудникам, работающим в центре для животных, за их поддержку в уходе за животными.

Materials

Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID
Yeast Extract OXID
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC
Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG
Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC
Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC
Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT
Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA
Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT
Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC
Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Play Video

Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

View Video