Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

نظام استزراع ثلاثي الأبعاد خال من المصل للخلايا الجذعية للغدة الدمعية

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

إن طريقة الاستزراع ثلاثية الأبعاد الخالية من المصل للخلايا الجذعية للغدة الدمعية البالغة (LG) راسخة لتحريض تكوين LG العضوي والتمايز إلى خلايا تشبه الخلايا الشبيهة بالقنوات.

Abstract

يعد العلاج القائم على الخلايا الجذعية في الغدة الدمعية (LG) استراتيجية واعدة لأمراض الغدة الدمعية. ومع ذلك ، فإن عدم وجود طريقة استزراع موثوقة وخالية من المصل للحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية LG (LGSCs) هو أحد العقبات أمام مزيد من البحث والتطبيق. طريقة الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) الخالية من المصل ل LGSCs للفئران البالغة راسخة ومعروضة هنا. يمكن تمرير LGSCs باستمرار وحثها على التمايز إلى خلايا تشبه الخلايا الشبيهة بالقنوات.

بالنسبة للثقافة الأولية LGSC ، تم هضم LGs من الفئران التي يتراوح عمرها بين 6 و 8 أسابيع باستخدام dispase و collagenase I و trypsin-EDTA. تم زرع ما مجموعه 1 × 104 خلايا مفردة في 80 ميكرولتر من مصفوفة الخلايا الجذعية المتوسطة للغدة الهلامية الدمعية (LGSCM) في كل بئر من صفيحة من 24 بئرا ، مغلفة مسبقا ب 20 ميكرولتر من مصفوفة هلام LGSCM المصفوفة. تم تصلب المزيج بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وإضافة 600 ميكرولتر من LGSCM.

لصيانة LGSC ، تم تصنيف LGSCs المستزرعة لمدة 7 أيام إلى خلايا مفردة عن طريق dispase و trypsin-EDTA. تم زرع الخلايا المفردة وزراعتها وفقا للطريقة المستخدمة في الثقافة الأولية LGSC. يمكن تمرير LGSCs أكثر من 40 مرة والتعبير باستمرار عن علامات الخلايا الجذعية / السلفية Krt14 و Krt5 و P63 و nestin. تتمتع LGSCs المستزرعة في LGSCM بقدرة على التجديد الذاتي ويمكن أن تتمايز إلى خلايا تشبه الخلايا الشبيهة بالقنوات في المختبر وفي الجسم الحي.

Introduction

تحافظ الخلايا الجذعية للغدة الدمعية (LGSCs) على تجديد خلايا الغدة الدمعية (LG) وهي مصدر الخلايا القنوية والقنوية. لذلك ، تعتبر زراعة LGSC نهجا بديلا لعلاج الأضرار الالتهابية الشديدة ومرض جفاف العين الناجم عن نقص مائي (ADDED) 1،2،3. تم تطبيق العديد من طرق الاستزراع لإثراء LGSCs. Tiwari et al. فصل وزراعة خلايا LG الأولية باستخدام الكولاجين I وهلام المصفوفة المكملة بالعديد من عوامل النمو. ومع ذلك ، لا يمكن زراعة خلايا LG باستمرار4. باستخدام ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) ، تم عزل الخلايا الجذعية المشتقة من LG بواسطة You et al.5 و Ackermann et al. 6 ، وجدت للتعبير عن جينات علامة الخلية الجذعية / السلف ، Oct4 ، Sox2 ، Nanog ، و nestin ، ويمكن زراعتها الفرعية. ومع ذلك ، لا يوجد مؤشر واضح على أن هذه الخلايا يمكن أن تتمايز إلى خلايا أسينار أو أقنية ، ولا توجد تجربة زرع للتحقق من إمكانات التمايز في الجسم الحي.

في الآونة الأخيرة ، تم عزل خلايا c-kit + dim / EpCAM + / Sca1-/CD34-/CD45- من LGs الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ووجد أنها تعبر عن علامات الخلايا السلفية LG ، مثل Pax6 و Runx1 ، وتم تمييزها إلى قنوات و acini في المختبر. في الفئران التي تحتوي على ADD ، يمكن للحقن التقويمي بهذه الخلايا إصلاح LGs التالفة واستعادة الوظيفة الإفرازية ل LGs2. ومع ذلك ، كان عدد الخلايا الجذعية المعزولة بهذه الطريقة صغيرا ، ولا توجد ظروف استزراع مناسبة لتوسيع LGSCs المعزولة. وباختصار، يلزم إنشاء نظام استزراع مناسب لعزل وزراعة LGSCs البالغة بشكل فعال مع التوسع المستقر والمستمر لدراسة LGSCs في علاج ADDED.

المواد العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات هي مجموعة من الخلايا التي تشبه نسيجيا الأعضاء ذات الصلة ويمكنها الحفاظ على تجديدها الخاص. بعد أن تم استزراع أمعاء الفئران بنجاح من قبل ساتو وآخرون في عام 20097 ، تم استزراع المواد العضوية من الأعضاء الأخرى على التوالي ، استنادا إلى نظام زراعة ساتو ، مثل المرارة8 والكبد9 والبنكرياس10 والمعدة 11 والثدي12 والرئة 13 والبروستاتا 14 والغدة اللعابية 15 . نظرا لارتفاع نسبة الخلايا الجذعية البالغة قبل تمايز الخلايا في الثقافة العضوية ، تعتبر طريقة الزراعة العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) مثالية لعزل وزراعة الخلايا الجذعية البالغة من LG.

تم إنشاء نظام ثقافة LGSC للفئران البالغة في هذه الدراسة من خلال تحسين طريقة الثقافة 3D الخالية من المصل. ثبت أن LGSCs المستزرعة من كل من الفئران العادية و ADDED أظهرت قدرة مستقرة على التجديد الذاتي والانتشار. بعد الزرع في LGs الماوس المضافة ، استعمرت LGSCs LGs الضعيفة وحسنت إنتاج المسيل للدموع. بالإضافة إلى ذلك ، تم عزل LGSCs الفلورسنت الأحمر من الفئران ROSA26mT / mG وزرعها. يوفر هذا العمل مرجعا موثوقا به لإثراء LGSC في المختبر والطعم الذاتي LGSC في التطبيق السريري للعلاج المضاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع التجارب في هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان للجنة الأخلاقية المعنية بالتجارب على الحيوانات بجامعة صن يات سن. يجب إجراء جميع العمليات المتعلقة بالخلايا على طاولة العمل فائقة النظافة في غرفة عمليات الخلية. يجب تنفيذ جميع العمليات باستخدام الزيلين في أغطية الدخان.

1. الثقافة الأساسية LGSC

  1. عزل إل جي
    1. احصل على فأر ذكر BALB / c عمره 6-8 أسابيع ، وقطع الجلد خلف الأذن لفضح LG والنسيج الضام المحيط به. قشر النسيج الضام عن طريق تشريح حاد بمساعدة ملاقط وإزالة LG.
    2. شطف LGs مرتين مع 4 مل من محلول PBS المعقم 10 mM لإزالة الدم في طبق 6 سم. اغمر LGs في طبق 6 سم مع 4 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ لمدة 10 ثوان واشطفها باستخدام 10 mM PBS مرتين على الفور.
  2. الحصول على خلايا مفردة من LG
    1. استخدم محلول HEPES العازل (50 ملليمتر هيبس/كوه، الرقم الهيدروجيني 7.4؛ 150 مللي متر كلوريد الصوديوم في الماء فائق النقاء) لإعداد 25 وحدة حرارية بريطانية/مل. تحضير محلول الكولاجيناز I بنسبة 0.1٪ بالماء فائق النقاء.
    2. قطع LGs إلى شظايا صغيرة (حوالي 1 مم3) ، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم 15 مل ، وعالج الأنسجة ب 500 ميكرولتر من 25 U / mL dispase و 500 μL من 0.1٪ collagenase I لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. استخدم 10 mM PBS لإعداد محلول التربسين-EDTA (0.05 جم / لتر من التربسين ، 0.04 جم / لتر EDTA). عالج شظايا LG من الخطوة 1.2.2 بسعة 1 مل من 0.05٪ من التربسين-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وقم بفصل الشظايا إلى خلايا مفردة عن طريق السحب بشكل متكرر.
    4. قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وجمع الترشيح في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة السوبرناثان ، وأضف 10 مل من 10 mM PBS لغسل حبيبات الخلية ، وطرد مركزي للتعليق.
    6. كرر الخطوة 1.2.5 ، وقم بإزالة supernatant ، وأضف 1 مل من DMEM / F12 (خليط 1: 1 من وسيط Eagle المعدل من Dulbecco و F-12 من Ham) لإعادة تعليق كريات الخلايا.
  3. الثقافة الأساسية LGSC
    1. تحضير وسط الخلايا الجذعية للغدة الدمعية (LGSCM) الذي يحتوي على DMEM / F12 ، ملحق 1x N2 ، ملحق 1x B27 ، بديل الجلوتامين 2 mM ، 0.1 mM NEAAs (الأحماض الأمينية غير الأساسية) ، عامل نمو البشرة الفئران 50 نانوغرام / مل (EGF) ، عامل نمو الخلايا الليفية 10 نانوغرام / مل 10 (FGF10) ، 10 نانوغرام / مل Wnt3A ، و 10 ميكرومتر Y-27632 (مثبط ROCK).
    2. أضف 20 ميكرولتر من مصفوفة هلام المصفوفة LGSCM (هلام المصفوفة: LGSCM = 1: 1) في وسط بئر صفيحة مكونة من 24 بئرا. استخدم طرف ماصة لتوسيعه إلى دائرة (قطرها 6-8 مم) واحتضن الخليط لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لطلاء البئر مسبقا.
    3. استخدم عداد خلية لتحديد رقم الخلية وإضافة 40 ميكرولتر من LGSCM مع ما مجموعه 1 × 104 خلايا إلى 40 ميكرولتر من هلام المصفوفة. امزجها بلطف مع ماصة للحصول على خليط هلام مصفوفة LGSCM (هلام المصفوفة: LGSCM = 1: 1).
    4. استخدم ماصة لإسقاط 80 ميكرولتر من الخليط بعناية فوق المنطقة المطلية مسبقا في كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا في الخطوة 1.3.2.
    5. احتضن الخليط لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية وأضف 600 ميكرولتر من LGSCM.
    6. تغيير الوسط الثقافي في كل بئر مرة كل يومين. بعد 7 أيام من الثقافة، ابحث عن كرات LGSC التي يتراوح قطرها بين 100 و300 ميكرومتر تحت المجهر المقلوب (النظارة: 10x، الهدف: 4x).
      ملاحظة: يمكن استزراع LGSCs لأكثر من 14 يوما في المجموع.
  4. عزل وزراعة LGSCs الأولية من الفئران ROSA26mT / mG والفئران DED (NOD / ShiLtJ) باتباع الخطوات الموضحة أعلاه.

2. صيانة LGSC والمرور

  1. إزالة الوسط الثقافي من ثقافة الكرة جيدا.
  2. قم بتصنيف مجالات LGSC المستزرعة لمدة 7 أيام عن طريق الحضانة في 20 ميكرولتر من 10 U / mL dispase و 100 μL من 10 mM PBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 150 × جم لمدة 4 دقائق. إزالة supernatant.
  4. عالج الكرات ب 1 مل من 0.05٪ من التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف 1 مل من مثبط التربسين 0.05٪ (TI) وماصة بشكل متكرر لتحييد التربسين وفصل الكرات إلى خلايا مفردة.
  5. جهاز طرد مركزي في 150 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant للحصول على LGSCs في الكرية. أضف 1 مل من LGSCM لإعادة تعليق حبيبات LGSC.
  6. قم بلوحة الخلايا المفردة كما هو موضح في الخطوات من 1.3.1 إلى 1.3.6.

3. تمايز LGSC

  1. الإجراء 1: تمديد وقت استزراع LGSCs من 7 إلى 14 يوما باستخدام نظام LGSC للاستزراع للتمايز العشوائي.
  2. الإجراء 2: تغيير نسبة خليط هلام المصفوفة LGSCM من 1: 1 إلى 1: 2 في بداية ثقافة LGSC لتمايز الخلايا القنوية. قم بزرع LGSCs في المصفوفة للحث لمدة 14 يوما (راجع الخطوة 1.3).
  3. الإجراء 3: بعد المرور ، استبدل LGSCM بخليط مصل البقر الجنيني LGSCM-10٪ (FBS) لتمايز الخلايا الأسينارية. حث التمايز لمدة 14 يوما.

4. LG جفاف الأنسجة

  1. احصل على أنسجة LG (الخطوة 1.1.1) واشطف LGs ب 4 مل من محلول PBS المعقم 10 mM في طبق 6 سم لمدة دقيقتين. انقل الأنسجة إلى محلول الفورمالين بنسبة 10٪ للتثبيت لمدة 24 ساعة.
  2. شطف الأنسجة الثابتة مع 10 mM PBS لمدة 2 دقيقة لإزالة الفورمالين ، ونقل الأنسجة إلى مربع تضمين الأنسجة. ضع صندوق التضمين في المجفف التلقائي.
  3. استخدم المجفف التلقائي لتجفيف الأنسجة على النحو التالي: 70٪ إيثانول ، 2 ساعة ؛ 80 ٪ من الإيثانول ، 2 ساعة ؛ 90 ٪ من الإيثانول ، 30 دقيقة ؛ 95 ٪ من الإيثانول ، 30 دقيقة ؛ الإيثانول المطلق ، 30 دقيقة ؛ الإيثانول المطلق ، 2 ساعة ؛ الإيثانول المطلق: 100٪ زيلين (1: 1) خليط ، 30 دقيقة ؛ 100٪ زيلين ، 30 دقيقة ؛ 100٪ زيلين ، 2 ساعة ؛ 100٪ زيلين: خليط البارافين (1: 1) ، 30 دقيقة ؛ البارافين ، 2 ساعة ؛ البارافين ، 3 ساعة.

5. LG العضوية / الكرة الجفاف

  1. احصل على عضويات / كرات LG (الخطوات 2.1-2.3) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وشطف الكرات العضوية / الكرات من LG ب 1 مل من محلول PBS المعقم 10 mM لمدة دقيقتين.
  2. جهاز طرد مركزي في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant.
  3. تحضير محلول بارافورمالديهايد 4٪ (PFA) على النحو التالي: أضف 20 جم من PFA إلى خليط من 400 مل من 10 mM PBS و 40 ميكرولتر من 1 M NaOH ، وهز المحلول جيدا ، وقم بتسخينه في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة حتى يذوب PFA تماما. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، استخدم 10 mM PBS لتكوين الحجم إلى 500 مل وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  4. أضف 1 مل من PFA بنسبة 4٪ في أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام بيليه العضوية / الكروية وضع الأنبوب في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل للتثبيت.
  5. بعد التثبيت ، جهاز طرد مركزي في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant. أضف 1 مل من 10 mM PBS إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع حبيبة العضوية / الكروية واخلطها بلطف عن طريق السحب لمدة دقيقتين لشطف PFA. كرر هذه الخطوة مرتين.
  6. جهاز طرد مركزي في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant.
  7. الحرارة تضمين هيدروجيل لإذابة وإضافة 50-60 ميكرولتر من تضمين هيدروجيل إلى بيليه العضوية / الكرة ومزيج. ماصة الخليط على parafilm في شكل قطرة وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تصلب في درجة حرارة الغرفة.
  8. جفف الجل مع المواد العضوية / الكرات في أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge على النحو التالي.
    1. أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ إلى الأنبوب ، وانتظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة السائل من الأنبوب عن طريق السحب. كرر هذه الخطوة عن طريق تغيير تركيز الإيثانول إلى 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ على التوالي.
    2. أضف 1 مل من الإيثانول المطلق إلى الأنبوب ، وانتظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة السائل من الأنبوب عن طريق السحب. كرر هذه الخطوة.
    3. أضف 1 مل من خليط من 0.5 مل من الإيثانول المطلق و 0.5 مل من الزيلين بنسبة 100٪ إلى الأنبوب ، وانتظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة السائل من الأنبوب عن طريق السحب.
    4. أضف 1 مل من الزيلين بنسبة 100٪ إلى الأنبوب ، وانتظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة السائل من الأنبوب عن طريق السحب. كرر هذه الخطوة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 5.8.5-5.8.6 في حمام معدني عند 65 درجة مئوية.
    5. أضف 1 مل من خليط من 0.5 مل من البارافين و 0.5 مل من الزيلين بنسبة 100٪ إلى الأنبوب ، وانتظر لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، وقم بإزالة السائل من الأنبوب عن طريق السحب.
    6. أضف 1 مل من البارافين إلى الأنبوب ، وانتظر لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، وقم بإزالة السائل من الأنبوب عن طريق السحب. كرر هذه الخطوة وقم بتمديد وقت المعالجة إلى 1 ساعة.

6. البارافين التضمين والتقسيم

  1. تضمين البارافين
    1. قبل التضمين ، قم بتشغيل آلة التضمين وقم بتسخينها مسبقا لإذابة شمع البارافين في خزان البارافين.
    2. ضع الأنسجة المجففة أو الجل العضوي / الكروي في أخدود صندوق حديد التضمين ، وضع صندوق الحديد في البارافين الخاص بآلة التضمين.
    3. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي ووضع صندوق التضمين البلاستيكي على الصندوق الحديدي لتغطيته. حرك صندوق حديد التضمين إلى طاولة تبريد.
    4. بعد أن يتكثف البارافين إلى كتل في صندوق التضمين ، قم بإزالته من الصندوق الحديدي وقم بتقطيعه مباشرة أو تخزينه مؤقتا في ثلاجة 4 درجات مئوية.
  2. تقسيم البارافين
    1. قبل تقطيع البارافين ، قم بتجميع قطاعة البارافين مسبقا وأضف الماء المقطر إلى حوض القطاعة للتسخين المسبق. ابدأ التقطيع عندما ترتفع درجة حرارة الماء إلى 42 درجة مئوية.
    2. قم بإصلاح العينة على فتحة العينة الخاصة بقطاعة البارافين. اضبط سمك القسم على 5 ميكرومتر أثناء التقطيع.
    3. قسم العينة بشكل مستمر. قم بإصلاح القسم المبلط بالكامل على الشريحة المضادة للانزلاق في خزان القطاعة.
    4. بعد التقسيم ، ضع الشرائح الملصقة بأنسجة العينة في حاضنة كيميائية حيوية عند 37 درجة مئوية للتجفيف لمدة 24 ساعة. قم بتخزين الشرائح مؤقتا في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.

7. تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين

  1. تذوب أقسام البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وينقع الأقسام في الزيلين بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة ، ويكرر.
  2. عالج الأقسام بالإيثانول المطلق على شاكر لمدة 5 دقائق.
  3. عالج الأقسام بنسبة 90٪ من الإيثانول و 80٪ من الإيثانول و 70٪ من الإيثانول على شاكر ، كل منها لمدة 3 دقائق.
  4. عالج الأقسام بالماء منزوع الأيونات على شاكر لمدة 5 دقائق و 2 دقيقة على التوالي.
  5. قم بتلطيخ الأقسام على صندوق رطب لمدة 5 دقائق بمحلول هيماتوكسيلين 4 مجم / مل. شطف الأقسام في الماء الجاري لمدة 10 دقائق.
  6. حرك الأقسام على شاكر أولا بالماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين ثم باستخدام 0.5٪ -1٪ eosin لمدة دقيقة واحدة.
  7. حرك الأقسام بنسبة 70٪ من الإيثانول و 80٪ من الإيثانول و 90٪ من الإيثانول على شاكر لمدة 3 دقائق (لكل منهما) على التوالي. حرك الأقسام بالإيثانول المطلق على شاكر لمدة 5 دقائق.
  8. انقع الأقسام في الزيلين بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة وكرر النقع.
  9. استخدم ماصة أو قطارة لإضافة 3-4 قطرات من البلسم المحايد إلى الشريحة ، وقم بتغطيتها ببطء بشريحة غطاء. جفف الشرائح في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

8. تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية (IHC)

  1. تذوب أقسام البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وينقع الأقسام في الزيلين بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، ويكرر هذه الخطوة مرتين.
  2. حرك الأقسام على شاكر أولا بالإيثانول المطلق ، والإيثانول بنسبة 90٪ ، والإيثانول بنسبة 80٪ لمدة 2 دقيقة (لكل منهما) ، على التوالي ، ثم بالماء منزوع الأيونات لمدة 3 دقائق. كرر الإثارة بالماء منزوع الأيونات مرتين.
  3. حرك المقاطع على شاكر أولا بمزيج من 20 مل من 30٪ H2O2 و 180 مل من الميثانول لمدة 10 دقائق ثم الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  4. انقل الأقسام إلى مخزن حامض الستريك العازل مسبقا (1 لتر ماء منزوع الأيونات مع 3 جم من Na3C 6 H5O 7.2H2O و 0.4 g C 6 H8O7 ، درجة الحموضة 6.0) ، ميكروويف لمدة 10 دقائق لإبقائها عند نقطة الغليان دون الحرجة ، وتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. حرك الأقسام بالماء منزوع الأيونات على شاكر لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  5. حرك الأقسام باستخدام 10 mM PBS على شاكر لمدة 5 دقائق ، وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات. أرفق منطقة الأنسجة على الصندوق الرطب بعلامة طاردة للماء ، وأضف قطرة من مصل الماعز غير المناعي الجاهز للاستخدام لتغطية العينات ، وضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  6. قم بإزالة المصل ، وأضف الأجسام المضادة الأولية إلى العينات (انظر جدول المواد) ، واحتضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي ، وحرك الأقسام باستخدام 10 mM PBS على شاكر لمدة 5 دقائق ، وكرر خطوة الإثارة هذه مع 10 mM PBS ثلاث مرات.
  7. أضف أجساما مضادة ثانوية (انظر جدول المواد) لتغطية العينات واحتضانها على صندوق مبلل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حرك الأقسام باستخدام 10 mM PBS على شاكر لمدة 5 دقائق ، وكرر خطوة الإثارة ثلاث مرات.
  8. أضف محلول 0.03-0.05٪ 3,3'-diaminobenzidine (DAB) المحضر حديثا لتغطية العينات على الصندوق الرطب والبقع لمدة 30-90 ثانية. شطف الأقسام بالماء الجاري لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: تحكم في وقت التلطيخ من خلال المراقبة تحت المجهر الضوئي حتى يظهر اللون الأصفر.
  9. أضف محلول هيماتوكسيلين 4 ملغم / مل لتغطية العينات ، وصمة عار لمدة 5 دقائق على صندوق مبلل ، وشطف الأقسام بالماء الجاري لمدة 10 دقائق.
  10. قم بتحريك الأقسام على شاكر مع 80٪ إيثانول ، و 90٪ إيثانول ، وإيثانول مطلق لمدة 2 دقيقة لكل منهما ، على التوالي ، وانقع الأقسام في 100٪ زيلين لمدة 30 دقيقة.
  11. استخدم ماصة أو قطارة لإضافة 3-4 قطرات من البلسم المحايد إلى الشريحة ، وقم بتغطيتها ببطء بشريحة غطاء. جفف الشرائح في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

9. تلطيخ التألق المناعي العالمي للعضويات / الكرات

ملاحظة: اجمع المواد العضوية/الكرات الثابتة بمحلول PFA بنسبة 4٪ في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (انظر الخطوات من 5.1 إلى 5.4). قم بإجراء وضع العلامات الفلورية على النحو التالي.

  1. تجفيف المواد العضوية / الكرات عن طريق إضافة 1 مل من محلول السكروز 30٪ إلى الأنبوب واحتضانه بين عشية وضحاها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
  2. أضف 100 ميكرولتر من محلول PBST (محلول PBS 10 mM مع 0.1٪ Triton X-100) إلى الأنبوب لشطف المواد العضوية / الكرات لمدة 5 دقائق ، وطرد مركزي للأنبوب عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وجمع الكرية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  3. أضف 0.5-1 مل من مصل الماعز غير المناعي الجاهز للاستخدام إلى الأنبوب وأغلقه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. الطرد المركزي للأنبوب في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة وجمع الكرية.
  4. أضف عدة قطرات من الجسم المضاد الأولي المخفف لتغطية الكريات فقط واحتضانها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة. الطرد المركزي للأنبوب في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة وجمع الكرية.
  5. كرر الخطوة 9.2.
  6. أضف عدة قطرات من جسم مضاد ثانوي فلورسنت ومحلول 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) إلى الأنبوب لتغطية الكريات فقط واحتضانها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة ، وتجنب الضوء.
  7. كرر الخطوة 9.2 مع تجنب الضوء.
  8. أضف 100 ميكرولتر من محلول PBST إلى الأنبوب وقم بتخزينه مؤقتا في ثلاجة 4 درجات مئوية ، بعيدا عن الضوء. مراقبة وتصوير المواد العضوية / الكرات باستخدام المجهر الضوئي ورقة الضوء.

10. LGSC pLX-mCherry transfection

ملاحظة: يجب أن يتم إنتاج جزيئات الفيروسات اللحمية في خزانة للسلامة الأحيائية ومقعد نظيف على مستوى السلامة الأحيائية BSL2.

  1. قم بزراعة خلية تغليف فيروس lentivirus 293T في لوحة من 6 آبار مع DMEM + 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 لمدة 3-5 أيام للوصول إلى 80٪ من التقاء الخلية.
  2. نقل ناقل الفيروس اللئيم pLX-mCherry إلى LGSCs.
    ملاحظة: يشار إلى إعداد الكاشف لبئر واحد من لوحة 6 آبار.
    1. قم بإعداد أنبوبين معقمين لأجهزة الطرد المركزي سعة 1.5 مل وأضف 250 ميكرولتر من DMEM / F12 إلى كل أنبوب.
    2. أضف 7.5 ميكرولتر من كاشف النقل إلى أنبوب واحد واخلط الكاشف جيدا عن طريق السحب.
    3. أضف 2 ميكروغرام من بلازميد pLX-mCherry بدون سموم داخلية وبلازميد تغليف فيروس lentivirus مطابق في أنبوب آخر ، وأضف كاشف النقل (2 ميكرولتر / ميكروغرام من البلازميد).
    4. امزج السائل في كل من أنابيب أجهزة الطرد المركزي واترك المخاليط تقف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. أزل الوسط الزرعي للخلايا 293T وأضف الخليط من الخطوة 10.2.4 إلى الخلايا 293T. قم بتغيير وسيط الثقافة إلى DMEM طازج + 10٪ FBS بعد 8 ساعات.
    6. بعد 48 ساعة ، قم بجمع الفيروس الخارق لأول مرة وقم بتصفيته من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. بعد 72 ساعة ، اجمع الفيروس الخارق للمرة الثانية وقم بتصفيته من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر مرة أخرى.
      ملاحظة: قم بتخزين كل من المواد الفائقة المصفاة على الجليد حتى يتم نقل فيروس lentivirus.
  3. احصل على LGSCs من فئران دائرة التنمية الاقتصادية (NOD / ShiLtJ) (انظر الخطوة 1).
  4. أضف 1 مل من supernatant pLX-mCherry lentivirus الذي تم جمعه مسبقا لإعادة تعليق الخلايا.
  5. اضبط أنبوب جهاز الطرد المركزي على شاكر في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية. رجه عند 100 دورة في الدقيقة لزيادة الاتصال بين الفيروس الليفي والخلايا. بعد 8 ساعات ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 250 × جم لمدة 4 دقائق وقم بإزالة السوبرناتانت.
  6. أضف 1 مل من DMEM/F12 لإعادة تعليق حبيبات الخلية. استخدم عداد خلية لتحديد عدد الخلايا وزرع ما مجموعه 1 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من مصفوفة هلام المصفوفة LGSCM (هلام المصفوفة: LGSCM = 1: 1) في كل بئر من صفيحة من 24 بئرا مغلفة مسبقا ب 20 ميكرولتر من مصفوفة هلام LGSCM المصفوفة (انظر الخطوة 1.3.2).
  7. بعد 7 أيام من الثقافة (انظر الخطوة 1) ، حدد المجالات التي تعرض التألق الأحمر تحت مجهر التألق لتوسيع الثقافة.

11. LGSC زرع العظام

ملاحظة: يتم إجراء جميع العمليات الجراحية في غرفة عمليات SPF ، ويتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية.

  1. احصل على كرات LGSC من فئران ROSA26mT / mG مع التألق الأحمر (td-Tomato) أو نقل mCherry المستزرع لمدة 7 أيام (انظر الخطوة 1).
  2. قم بتبريد أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل الذي يحتوي على خليط 1: 1 من هلام المصفوفة و DMEM / F12 على الثلج قبل الاستخدام. هضم كرات LGSC إلى خلايا مفردة وإعادة تعليق الخلايا بكثافة 2 × 106 خلايا / مل في الأنبوب.
  3. تخدير الفئران NOD / ShiLtJ عن طريق الحقن داخل الصفاق من الصوديوم بنتوباربيتال (50 ملغ / كغ).
    ملاحظة: فأر NOD / ShiLtJ هو نموذج مثالي مع أعراض ADD مجهولة السبب ، بما في ذلك انخفاض إفراز الدموع ، والتسلل الالتهابي ، والتقرح المداري.
  4. بعد التخدير ، استخدم مرهما ملحيا أو بيطريا على العينين لمنع الجفاف ، ثم استخدم مقص العيون لإجراء قطع 5-8 مم في الجلد خلف الأذن (بالقرب من العين) من الفئران المخدرة لفضح LGs.
    ملاحظة: يجب استخدام اليود بشكل صارم للتطهير حول الشق.
  5. حقن 2 × 104 خلايا في LG على الجانب الأيسر وحقن الخليط بدون خلايا (انظر الخطوة 11.2) في LG على الجانب الأيمن كعنصر تحكم.
  6. بعد الحقن ، قم باستعادة LGs إلى مواقعها الأصلية باستخدام ملقط العيون وخياطة الجرح. إطعام الفئران لمدة 2 أشهر ومراقبة تأثير العلاج.
    ملاحظة: يجب أيضا تعقيم مادة وسادة القفص بشكل صارم بعد العملية ، ويجب استبدال مادة الوسادة مرة واحدة في اليوم. بعد خياطة الجرح ، يمكن حقن الترامادول بشكل انتقائي في الوريد الذيل للفئران بجرعة قياسية تبلغ 2.5 مجم / كجم لتحقيق التسكين.
  7. تخدير هذه الفئران بعد شهرين من التجربة (انظر الخطوة 11.3). تصوير أعراض منطقة العين.
    1. أثناء التخدير ، ابحث عن الأعراض التالية: استرخاء عضلات الرقبة والأطراف. التنفس العميق والبطيء والثابت. تضييق التلميذ. اختفاء منعكس القرنية.
    2. أثناء التخدير والتشغيل ، حافظ على درجة حرارة جسم الفئران عند 37 درجة مئوية. بعد الجراحة ، أضف المضادات الحيوية المناسبة إلى مياه الشرب للفئران لتقليل خطر الإصابة بعدوى الجروح. لا تترك الفئران دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء الصارم. لا تعيد الفئران التي خضعت لعملية جراحية إلى شركة الفئران الأخرى حتى تتعافى تماما.
    3. بعد تصوير أعراض منطقة العين ، افتح برنامج ImageJ ، وانقر فوق ملف | فتح | تحديدات يدوية، اضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر، وحدد منطقة التقرح المداري في الصورة. انقر على تحليل | قياس للحصول على المنطقة النسبية للتقرح.
  8. ضع خيط القطن الأحمر الفينول على الكانثوس الجانبي للفئران المخدرة لمدة 10 ثوان ؛ قياس وتسجيل طول الجزء المتغير اللون من خيط القطن. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع فقرات عنق الرحم بعد قياس الدموع.
  9. تشريح الفئران والحصول على LGs لتحليل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية.

12. عزل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: قبل التجربة، قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية وضمان خلو جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية من تلوث الحمض النووي الريبي.

  1. جمع LGSCs أو شظايا LG في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 1 مل من مخزن الخلايا العازل لتحلل الخلايا وقم بتحليل الخلايا أو الأنسجة بالكامل عن طريق تذبذب الدوامة.
  2. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم ، واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بعد تذبذب الدوامة لمدة دقيقة واحدة. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، 12000 × غرام.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ينقسم السائل إلى ثلاث طبقات ، ويكون الحمض النووي الريبي في المرحلة المائية الشفافة العليا.
  3. قم بماصة الطور المائي العلوي الشفاف بعناية وانقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد خال من الحمض النووي الريبي سعة 1.5 مل.
  4. أضف كمية متساوية من كحول الأيزوبروبيل واخلطه بلطف. اترك الخليط يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ثم جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، 12000 × جم.
  5. إزالة supernatant ، وإضافة 1 مل من 75 ٪ من الإيثانول. اقلب الأنبوب لغسل الكريات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية أو 7500 × جم. كرر هذه الخطوة.
  6. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية ووضع أنبوب الطرد المركزي في طاولة العمل فائقة التنظيف لتجفيفه لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: انتقل إلى الخطوة التالية عندما تصبح الكريات البيضاء شفافة. تنفيذ جميع العمليات على الجليد.
  7. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي لإذابة الكريات تماما. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد) وقم بتخزين محلول الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية.

13. تفاعل البوليميراز المتسلسل

  1. تفاعل النسخ العكسي
    1. أضف 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (احسب حجم محلول الحمض النووي الريبي المضاف وفقا لتركيز محلول الحمض النووي الريبي) في أنبوب تفاعل PCR واحتضنه عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتمسخه.
    2. ضعه على الثلج لمدة 1 دقيقة ثم أضف الماء الخالي من الإنزيم حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 12 ميكرولتر. أضف 4 ميكرولتر من 4x DNA Master Mix واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. ضع الأنبوب على الجليد ، وأضف 4 ميكرولتر من 5x RT Master Mix ، واخلطه بلطف. اضبط إعدادات PCR التالية: 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، و50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة.
    4. قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية بعد اكتمال تفاعل النسخ العكسي.
  2. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
    1. قم بإعداد تفاعل PCR في أنبوب PCR على النحو التالي: 14.1 ميكرولتر من الماء الخالي من الإنزيم ، و 2 ميكرولتر من dNTP ، و 2 ميكرولتر من 10x Buffer ، و 0.8 ميكرولتر من التمهيدي (10 ميكرومتر ، و 0.4 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 0.4 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، راجع جدول المواد) ، و 1 ميكرولتر من cDNA النسخ العكسي (راجع الخطوة 13.1) و 0.1 ميكرولتر من إنزيم Taq.
    2. ضع تفاعل البوليميراز المتسلسل المحضر في جهاز PCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل. ارجع إلى تعليمات مجموعة إنزيم Taq لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (انظر جدول المواد).
  3. الرحلان الكهربائي هلام أغاروز
    1. استخدم ميزانا تحليليا لوزن 242 جم من Tris و 37.2 جم من Na 2 EDTA·2H 2O وأضفهما إلى كوب سعة 1 لتر. أضف ~ 800 مل من الماء منزوع الأيونات و 57.1 مل من حمض الخليك الجليدي إلى الكأس ، واخلطه جيدا ، وأضف الماء منزوع الأيونات إلى 1 لتر للحصول على 50x TAE buffer ، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قم بتخفيف المخزن المؤقت 50x TAE بالماء منزوع الأيونات قبل الاستخدام.
    2. استخدم ميزانا تحليليا لوزن 1.2 غرام من الأغاروز وأضفه إلى قارورة مخروطية تحتوي على 80 مل من مخزن مؤقت 1x TAE. سخنيه مرارا وتكرارا في فرن الميكروويف حتى يذوب تماما.
    3. تبرد القارورة تحت ماء الصنبور الجاري حتى تنخفض درجة حرارة المحلول إلى 60 درجة مئوية. أضف 8 ميكرولتر من بقع الحمض النووي ، صب المحلول في خزان الجيلاتينية بعد الخلط جيدا ، وضع المشط ، واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. اسحب المشط وقم بتحميل منتجات PCR في جل الأغاروز المحضر. أداء الكهربائي في 120 فولت لمدة 30 دقيقة.
    5. ضع الجل في نظام التصوير ECL Gel وتصويره.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنشاء 3D ، نظام ثقافة خالية من المصل
في هذه الدراسة ، تم تطوير LGSCM التي تحتوي على EGF و Wnt3A و FGF10 و Y-27632 ل LGSCs الفأر ، وتم عزل LGSCs بنجاح وزراعتها بطريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1A). تم إنشاء نظام استزراع ثلاثي الأبعاد ناجح خال من المصل من LGSCs من الفئران C57BL/6 وفئران NOD / ShiLtJ وفئران BALB / c وفئران ROSA26mT / mG باستخدام هذه الطريقة16. بالنسبة للفأر الذكر ، تم الحصول على 1.5-2 × 106 خلايا من اثنين من LGs عن طريق الانفصال. بعد أسبوع واحد من الثقافة ، تم تشكيل 30-60 كرة عند بذر 1 × 104 خلايا LG في بداية الثقافة. علاوة على ذلك ، عبرت الخلايا المستزرعة بهذه الطريقة عن Epcam و Krt5 و Krt14 و P63 و nestin وغيرها من علامات الخلايا الجذعية16 ، مما يشير إلى أن الخلايا التي تم الحصول عليها لها خصائص LGSCs. تم التعبير عن Krt14 و Ki67 في جميع المجالات التي شكلتها LGSCs المستزرعة لمدة 7 أيام (الشكل 1B) ، مما يشير إلى أن LGSCs لديها قدرة على التجديد الذاتي.

خلال ثقافة لمدة 7 أيام ، وصلت كرات LGSCs إلى قطر 100 ميكرومتر. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) خلوية في اليوم 7 (الشكل 1C والشكل 1F). وتشير عوامل إثراء LGSCs التي تم الحصول عليها بعد 7 أيام من الثقافة الأولية والثقافة الفرعية إلى أن LGSCs التي تم إثراؤها بهذه الطريقة لديها قدرة تكاثرية قوية (الشكل 1D). في هذا النظام ، يمكن تمرير LGSCs أكثر من 40 مرة ، وما زالت تحافظ على خصائص الخلايا الجذعية (الشكل 1E والشكل 1G). في الختام ، تصف هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء نظام استزراع 3D خال من المصل ل LGSCs في المختبر. الخلايا المستزرعة بواسطة هذا البروتوكول لديها قدرة تكاثرية مستمرة ومستقرة.

تحفيز التمايز في المختبر
تم تحليل قدرة التمايز ل LGSCs في المختبر. عندما تم استزراعها لأكثر من 7 أيام ، فقدت LGSCs تدريجيا القدرة على النمو ، وزاد التعبير عن AQP5 و Ltf و Krt19 والعلامات الأخرى المرتبطة بالتمايز ، في حين انخفض التعبير عن Krt14 تدريجيا16. تم حث LGSCs على تكوين المزيد من البراعم بواسطة FBS ونسبة منخفضة من هلام المصفوفة (الشكل 2A ، B). علاوة على ذلك، أشار تلطيخ H&E إلى أن FBS يمكن أن يحفز الكرات على إنتاج المزيد من هياكل التجويف (الشكل 2C).

اقترح العمل السابق أن انخفاض صلابة المصفوفة عزز تمايز LGSCs إلى عضويات تشبه القنوات. حافظت خلايا الطبقة القاعدية على خصائص الخلايا الجذعية التي تعبر عن Krt14 ، في حين أن خلايا الطبقة العليا القاعدية تميزت إلى هياكل تشبه القناة مع تجاويف وعبرت عن Krt19. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي إضافة FBS إلى تمايز LGSCs إلى عضويات تشبه الأسنار ، والتي حافظت على خصائص الخلايا الجذعية ذات النسبة النووية / السيتوبلازمية العالية. عبرت بعض الخلايا المتمايزة الشبيهة بالأسينار عن مستويات عالية من AQP5 مع انخفاض النسبة النووية / السيتوبلازمية16.

 إصلاح LGSCs  في الجسم الحي
استنادا إلى التجارب المذكورة أعلاه ، تم استكشاف قدرة LGSCs على إصلاح LGs التالفة عن طريق الحقن التقويمي. بعد الحقن التقويمي ل ROSA-LGSCs في فئران NOD / ShiLtJ ، تم تشكيل فصيصات دمعية جديدة بجوار LGs (الشكل 3A-C). كانت معظم الفصيصات تتكون من خلايا أسينار ناضجة ذات تعبير عال عن AQP5 ، وكان هناك تكوين قناة داخل الفصيص مع تعبير منخفض AQP5 (الشكل 3D-F). بعد حقن ROSA-LGSCs لمدة 8 أسابيع ، تم قياس الاضمحلال حول مدار المتلقين. أشارت القياسات إلى أن حقن LGSCs قلل من منطقة الاضمحلال بنسبة ~ 60٪ (الشكل 3G ، H). أظهر التشريح أن حجم LG زاد بعد الحقن لمدة 10 أسابيع (الشكل 3I). كانت كمية إفراز الدموع على جانب حقن ROSA-LGSCs أعلى من جانب التحكم ولكنها أقل من الفئران من النوع البري (الشكل 3J). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا التي يتم حصادها بواسطة نظام الزراعة هذا لها خصائص LGSCs ويمكن استخدامها للعلاج بالخلايا الجذعية في الفئران المصابة ب ADD و xerophthalmia.

Figure 1
الشكل 1: عزل وتوصيف LGSCs . (أ) استراتيجية LGSC ثقافة المرور الأولية والمستمرة. (ب) تلطيخ التألق المناعي ل LGSCs في اليوم 7. LGSCs تعبر عن علامة الخلايا الظهارية E-cadherin (الأحمر) ، علامة الخلايا الجذعية Krt14 (الأحمر) ، علامة الخلايا التكاثرية Ki67 (الأحمر). كاونتر ستاين، دابي (أزرق). (ج) مورفولوجيا LGSCs في الثقافة لمدة 1 و 3 و 5 و 7 أيام. (د) عامل الإثراء النسبي لثقافة LGSC في الثقافة الأولية والثقافة الفرعية. عامل التخصيب النسبي هو نسبة العدد الإجمالي للخلايا التي تم الحصول عليها بعد 7 أيام من الزراعة إلى عدد الخلايا المزروعة في الثقافة. ف < 0.01. (ه) نسخ علامات الخلايا الجذعية / السلفية البالغة للماوس LG و LGSCs ذات المرور المختلفة (P1 و P10 و P20 و P40). (و) المورفولوجيا (يسار) وتلطيخ H&E (يمين) من LGSCs في الثقافة الأولية في اليوم 7. (ز) LGSCs المستزرعة في مقاطع مختلفة (P1 و P10 و P20 و P40). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (B ، F ، G) ، 100 ميكرومتر (C). الاختصارات: LG = الغدة الدمعية. LGSCs = الخلايا الجذعية LG; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole;; NC = السيطرة السلبية; TE = التربسين-EDTA; H & E = الهيماتوكسيلين والإيوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تمايز LGSCs في المختبر. (A ، B) مورفولوجيا LGSCs المستزرعة في الوسط العادي أو وسط التمايز. (أ) LGSCs المستزرعة لمدة 10 أيام في P10 (يسار: الوسط العادي، اليمين: الوسط المحتوي على FBS). (ب) LGSCs المستزرعة لمدة 14 يوما في P31 (اليسار: الوسط العادي ، اليمين: الوسط مع 1/3rd matrix gel). (C) تلطيخ H&E ل LGSCs المستزرعة لمدة 14 يوما (أعلى: وسط عادي ، أسفل: وسط يحتوي على FBS). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A)، 200 ميكرومتر (B)، 50 ميكرومتر (C). الاختصارات: LG = الغدة الدمعية. LGSCs = الخلايا الجذعية LG; H & E = الهيماتوكسيلين والإيوزين. FBS = مصل البقر الجنيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تطعيم LGSCs وتخفيف الأعراض المضافة. (A-F) تلطيخ IHC ل NOD / ShiLtJ LG المزروع مع ثقافات لمدة 7 أيام من ROSA-LGSCs بعد 8 أسابيع. استخدم الجانبين الأيسر والأيمن من نفس الماوس مثل المجموعة التجريبية والمجموعة الضابطة. (أ-ج) تلطيخ IHC بالأجسام المضادة للطماطم المضادة ؛ (مد إلى واو) تلطيخ IHC بالأجسام المضادة المضادة ل AQP5 ؛ (أ، دال) LG حقن مع السيارة (1: 1 خليط من هلام المصفوفة و DMEM / F12) ، (B ، E) LG حقن مع ROSA-LGSCs ، (C ، F) الصور المكبرة للمربعات السوداء في B ، E (السهم الأحمر ، القناة داخل الفصيص). (ز، ح) حالة مدار عين الفأر NOD / ShiLtJ بعد حقن ROSA-LGSCs في 8 أسابيع. حقن LGSCs يخفف بشكل كبير من الاضمحلال حول مدار العين. (I) LGs من الماوس NOD / ShiLtJ في 10 أسابيع (يسار: LG من الجانب المحقون بالخلية ، يمين: LG من جانب التحكم). (ي) حجم الدموع من النوع البري والفئران NOD / ShiLtJ المزروعة مع ثقافات لمدة 7 أيام من ROSA-LGSCs بعد 8 أسابيع. حجم التمزق ل LGs المحقونة ب ROSA-LGSC أعلى من حجم LGs الضابطة ولكنه أقل بكثير من حجم LGs WT. n = 3 ؛ الفئران NOD / ShiLtJ ، n = 4 ؛ P < 0.01 ؛ *P < 0.05. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (A-F). الاختصارات: LG = الغدة الدمعية. LGSCs = الخلايا الجذعية LG; IHC = الكيميائية النسيجية المناعية; WT = نوع البرية; ADD = مرض جفاف العين الناجم عن نقص مائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك طرق راسخة لعزل الخلايا الجذعية الدمعية وزراعتها في المختبر لزراعة الخلايا الجذعية الدمعية وإصلاح إصابات LG. شاتوس وآخرون.17 وأكرمانوآخرون. 6 الخلايا الجذعية الدمعية المستزرعة بنجاح وشبه المستزرعة من الجرذان والفئران بطرق زراعة 2D ، على التوالي ، مما يجعل من الممكن زرع الخلايا الجذعية الدمعية لعلاج ADDED. أظهرت الدراسات التي أجريت على الخلايا الجذعية18 والخلايا الجذعية الوسيطة19,20 من LGs المستزرعة في 2D أن زرع هذه الخلايا يمكن أن يخفف من أعراض ADD إلى حد ما. عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلور ، Gromovaet al. 2 خلايا جذعية مختارة تعبر عن علامات الخلايا السلفية LG من LGs الفئران وتميزها إلى قنوات و acini في المختبر ، وتحقيق بنجاح تمايز الخلايا الجذعية البالغة إلى خلايا وظيفية من LGs. كما تبين أن زرع عدد كاف من الخلايا الجذعية يمكن أن يخفف من أعراض ADD في الفئران.

لتلبية احتياجات إثراء الخلايا الجذعية والقضاء على الاعتماد على المصل في طرق زراعة الخلايا الجذعية الدمعية الحالية ، تم إنشاء نظام زراعة الخلايا الجذعية الدمعية الخالي من المصل في هذا البروتوكول بناء على الأبحاث المنشورة سابقا وتكنولوجيا زراعة 3D العضوية21. وبالتالي ، من المتوقع أن يعزز هذا النظام الأبحاث السريرية على الخلايا الجذعية الدمعية. في هذا البروتوكول ، تشمل الخطوات الحاسمة الثقافة الأولية ، والثقافة الفرعية وتوسيع LGSCs ، وزرع LGSCs في الموقع في LGS المصابة في الفئران.

الثقافة الأولية هي الأساس للحصول على LGSCs. من الضروري الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الثقافة الأولية. يتم طلاء البئر مسبقا بمصفوفة هلام لتجنب النمو الملتصق بالخلايا في الجزء السفلي من مزرعة الخلايا جيدا. عند استخدام matrix-gel ، من الضروري اتباع تعليمات الشركة المصنعة ، والاحتفاظ بها دائما في الحالة السائلة قبل إضافتها إلى البئر لتجنب فقدان matrix-gel أثناء التجربة وهلام المصفوفة غير المتساوي في الثقافة.

عدد الخلايا البذرية في الثقافة الأولية هو 10000 خلية / بئر. في الممارسة العملية ، يمكن زيادة عدد الخلايا البذرية إذا تم ضمان مساحة النمو المناسبة وإمدادات المغذيات من الخلايا. الزراعة الفرعية هي خطوة مهمة لتنقية وإثراء الخلايا الجذعية. بعد المرور ، شكلت LGSCs في جيل P1 المزيد من المجالات ، وكان هناك المزيد من خلايا الجيل P1 أكثر من جيل P0. وهذا يدل على أن LGSCs ذات القدرة على التكاثر قد تم إثراؤها في هذا النظام.

عندما تم استزراع LGSCs في هذا النظام ثلاثي الأبعاد على مدار 10 أيام ، لم يكن 0.05٪ من التربسين-EDTA كافيا في بعض الأحيان لهضم المواد العضوية بالكامل إلى خلايا مفردة أثناء المرور. تم حل هذه المشكلة عن طريق تمديد وقت الهضم بشكل مناسب. العلاج بالحقن في الموقع هو إجراء ضروري للتحقق من القيمة السريرية ل LGSCs. نظرا لصغر الحجم والأنسجة الرقيقة والفضفاضة ل LGs في الفئران ، يتم فقدان الخلايا دائما من موقع الحقن إذا تم إعداد تعليق الخلية في محلول ملحي طبيعي أو 10 mM PBS للحقن. لذلك ، يوصى بخلط تعليق الخلية مع هلام المصفوفة للحقن. نظرا لأن هلام المصفوفة المستخدم في هذا النظام يتصلب عند درجات حرارة أعلى من 10 درجات مئوية ، يمكن للخلايا أن تستعمر بسهولة عند حقنها في LGs. يجب دائما الاحتفاظ بخليط الخلايا وهلام المصفوفة على الجليد قبل الحقن ، ويتم الحقن بسرعة.

بالإضافة إلى عزل LGSCs عن الفئران العادية ، تم عزل LGSCs البالغة من الفئران المضافة بنجاح واستزراعها لأول مرة باستخدام هذا البروتوكول16. ومع ذلك ، لا يزال هذا النظام يعاني من أوجه قصور ومشاكل لم يتم حلها. أولا ، يتم اشتقاق هلام المصفوفة المستخدم من الفئران 22,23 ، والتي قد تسبب تفاعلات الرفض في جسم الإنسان ، وبالتالي ، فإن لها قابلية تطبيق سريرية محدودة. من الضروري تحسين نظام الثقافة من خلال إيجاد المواد الهلامية الاصطناعية المناسبة لتحل محل هلام المصفوفة.

ثانيا، تحتاج استراتيجية التمايز في هذا البروتوكول إلى تحسين. بدلا من تمديد وقت الاستزراع للتمايز21 أو إضافة مصل في وسط الاستزراع ، من المتوقع أن تعطي إضافة عوامل نمو محددة وتغيير ظروف بيئية محددة للتحريض الاتجاهي النتائج المرجوة. ومن الضروري مواصلة استكشاف آلية صيانة وتمايز LGSCs من خلال توضيح مسارات الإشارات التي تسبب التمايز. علاوة على ذلك ، وجدت دراسات سابقة أن الخلايا الظهارية العضلية المستزرعة في المختبر تعبر أيضا عن جينات الخلايا الجذعية ، مثل Nestin و Musashi و Pax6 ، مما يشير إلى أن الخلايا الظهارية العضلية لها أيضا خصائص الخلايا الجذعية17.

لم تولي هذه الدراسة أي اهتمام للخلايا الظهارية العضلية ، وبالتالي ، لم تتحقق مما إذا كانت الخلايا الظهارية العضلية موجودة في عضويات LG من خلال تحديد علامات تعبير محددة للخلايا الظهارية العضلية. نظرا لمحدودية ظروف الزرع ، لا يمكن تحفيز الخلايا الظهارية العضلية أو أن عددها كان صغيرا جدا بحيث لا يمكن ملاحظته. يمكن تمديد وقت الزراعة لمراقبة ما إذا كانت المواد العضوية تتمايز بشكل أكبر إلى خلايا ظهارية عضلية ، أو التركيز على الخلايا الظهارية العضلية في الدراسات المستقبلية للتمايز الحثي وتحسين النظام.

في الختام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة لدراسة LGSCs لتطوير وإصلاح وتجديد LGs. يمكن أن يكون التمايز بين LGSCs في المختبر أساسا لتجديد LGs في المختبر في المستقبل ، في حين أن عزل وثقافة LGSCs يمكن أن يحل مشكلة الرفض في زراعة الخلايا الجذعية. توفر هذه الطريقة أساسا مهما للعلاج الفردي السريري ل xerophthalmia مع LGSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31871413) وبرنامجين من قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا (2017B020230002 و 2016B030231001). نحن ممتنون حقا للباحثين الذين ساعدونا خلال الدراسة وللموظفين العاملين في مركز الحيوانات لدعمهم في رعاية الحيوانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Tags

علم الأحياء، العدد 184،
نظام استزراع ثلاثي الأبعاد خال من المصل للخلايا الجذعية للغدة الدمعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter