Summary
用于成体泪腺（LG）干细胞的三维无血清培养方法对于诱导LG类器官形成并分化为腺泡或导管状细胞已经确立。
Abstract
基于泪腺（LG）干细胞的治疗是治疗泪腺疾病的有希望的策略。然而，缺乏可靠的无血清培养方法来获得足够数量的LG干细胞（LGSC）是进一步研究和应用的一个障碍。用于成人小鼠LGSC的三维（3D），无血清培养方法已经建立并在此处显示。LGSC可以连续传代并诱导分化为腺泡或导管样细胞。
对于LGSC原代培养，用分散酶，胶原酶I和胰蛋白酶 - EDTA消化来自6-8周龄小鼠的LGs。将总共1×104 个单细胞接种到24孔板的每个孔中的80μL基质凝胶泪腺干细胞培养基（LGSCM）基质中，并用20μL基质凝胶-LGSCM基质预涂。将混合物在37°C下孵育20分钟后固化，并加入600μLLGSCM。
对于LGSC维持，通过分散酶和胰蛋白酶- EDTA将培养7天的LGSC分解成单细胞。根据LGSC原代培养中使用的方法植入和培养单个细胞。LGSC可以传代40次以上，并连续表达干细胞/祖细胞标志物Krt14，Krt5，P63和巢蛋白。在LGSCM中培养的LGSC具有自我更新能力，可以在 体外 和 体内分化成腺泡或导管样细胞。
Introduction
泪腺干细胞（LGSC）维持泪腺（LG）细胞更新，是腺泡和导管细胞的来源。因此，LGSC移植被认为是治疗严重炎症损伤和水缺乏性干眼病（ADD）的替代方法1，2，3。Tiwari等人使用胶原蛋白I和基质凝胶分离和培养原代LG细胞，并补充了几种生长因子;然而，LG细胞不能连续培养4。使用二维（2D）培养，由You等人5和阿克曼等人分离出小鼠LG衍生的干细胞。6、发现表达干细胞/祖细胞标记基因的Oct4、Sox2、纳米和巢蛋白，并可进行传代培养。然而，没有明确的迹象表明这些细胞可以分化成腺泡或导管细胞，也没有移植实验来验证体内的分化潜力。
最近，通过流式细胞术从小鼠LG中分离出c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- 细胞，发现其表达LG祖细胞标志物，如Pax6和Runx1， 并在体外分化成导管和阿西尼。在具有ADDD的小鼠中，用这些细胞进行原位注射可以修复受损的LG并恢复LG2的分泌功能。然而，通过这种方法分离的干细胞数量很少，并且没有合适的培养条件来扩增分离的LGSC。综上所述，需要建立适当的培养体系，以有效分离和培养具有稳定和持续扩增的LGS成体LGSC，以研究LGSC在ADD处理中的应用。
来自干细胞或多能干细胞的类器官是一组在组织学上与相关器官相似的细胞，可以维持自己的更新。在Sato等人于2009年7成功培养小鼠肠道类器官后，基于佐藤的培养系统，连续培养来自其他器官的类器官，如胆囊8，肝脏9，胰腺10，胃11，乳房12，肺13，前列腺14和唾液腺15.由于成体干细胞在类器官培养中分化前的比例很高，因此三维（3D）类器官培养方法被认为是LG成体干细胞分离和培养的最佳选择。
本研究通过优化3D无血清培养方法建立了成年小鼠LGSC培养系统。结果表明，从正常和ADD小鼠培养的LGSC显示出稳定的自我更新和增殖能力。移植到添加的小鼠LG后，LGSC定植受损的LG并改善了泪液的产生。此外，从ROSA26mT / mG 小鼠中分离红色荧光LGSC并进行培养。本研究为LGSC 体外 富集和LGSC自体移植在临床应用中的附加治疗提供了可靠的参考。
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Protocol
该协议中的所有实验都遵循中山大学动物试验伦理委员会的动物护理指南。所有与细胞相关的操作都将在单元操作室的超洁净工作台上进行。所有使用二甲苯的操作都将在通风橱中进行。
1. 初级培养
- 低压合成材料隔离
- 获取6-8周龄的BALB / c雄性小鼠，并切开耳朵后面的皮肤以暴露LG及其周围的结缔组织。在镊子的帮助下通过钝性解剖剥离结缔组织并去除LG。
- 用4 mL无菌10 mM PBS溶液冲洗LFG两次，以去除6厘米培养皿中的血液。将LG浸入装有4 mL 75%乙醇的6厘米培养皿中10秒，然后立即用10 mM PBS冲洗两次。
- 获得LG的单细胞
- 使用HEPES缓冲溶液（50 mM肝素/KOH，在超纯水中pH 7.4; 150mM NaCl）制备25 U / mL分散酶。用超纯水制备0.1%胶原酶I溶液。
- 将LG切成小片段（约1mm3），将其转移到无菌的15mL离心管中，并在37°C下用500μL 25 U / mL分散酶和500μL0.1%胶原酶I处理组织1小时。
- 使用10mM PBS制备胰蛋白酶 - EDTA溶液（0.05克/升胰蛋白酶，0.04克/升EDTA）。用1mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37°C下处理步骤1.2.2中的LG片段10分钟，并通过反复移液将片段解离成单个细胞。
- 通过70μm过滤器过滤悬浮液，将滤液收集到无菌的15mL离心管中，并以150× g 离心5分钟。
- 离心后，取出上清液，加入10 mL 10 mM PBS洗涤细胞沉淀，离心悬浮液。
- 重复步骤1.2.5，除去上清液，加入1mL DMEM / F12（杜尔贝科修饰的鹰培养基和汉姆的F-12的1：1混合物）以重悬细胞沉淀。
- 原代菌种
- 制备含有DMEM / F12，1x N2补充剂，1x B27补充剂，2mM谷氨酰胺替代品，0.1mMNEA（非必需氨基酸），50ng / mL鼠表皮生长因子（EGF），100ng / mL成纤维细胞生长因子10（FGF10），10ng / mL Wnt3A和10μM Y-27632（岩石抑制剂）的泪腺干细胞培养基（LGSCM）。
- 在24孔板的孔中心加入20μL基质凝胶- LGSCM基质（基质凝胶：LGSCM = 1：1）。使用移液器吸头将其膨胀到圆形（直径6-8mm），并将混合物在37°C下孵育20分钟以预涂孔。
- 使用细胞计数器确定细胞数量，并将40μLLGSCM与总共1×104 个细胞加入40μL基质凝胶中。用移液管轻轻混合，得到基质凝胶-LGSCM混合物（基质凝胶：LGSCM= 1：1）。
- 在步骤1.3.2中，使用移液管小心地将80μL混合物滴在24孔板的每个孔的预涂区域上。
- 将混合物在37°C下孵育20分钟，并加入600μLLGSCM。
- 每两天更换一次每个孔中的培养基。培养7天后，在倒置显微镜下寻找直径为100-300μm的LGSC球体（目镜：10x，物镜：4x）。
注意：LGSC 总共可以培养超过 14 天。
- 按照上述步骤分离和培养ROSA26mT / mG 小鼠和DED小鼠（NOD / ShiLtJ）的初级LGSC。
2. 线路电缆的维护和通过
- 从球体培养井中取出培养基。
- 通过在20μL10 U / mL分散酶和100μL 10mM PBS中在37°C下孵育30分钟来分解培养7天的LGSC球。
- 将悬浮液转移到15mL离心管中，并以150× g 离心4分钟。取出上清液。
- 在37°C下用1mL 0.05%胰蛋白酶- EDTA处理球体5分钟。 加入1mL 0.05%胰蛋白酶抑制剂（TI）并反复移液以中和胰蛋白酶并将球体解离成单个细胞。
- 以150× g 离心5分钟，除去上清液以获得沉淀中的LGSC。加入1毫升LGSCM以重悬LGSC沉淀。
- 按照步骤1.3.1至1.3.6中所述对单个细胞进行平板。
3. 表面活性物质的鉴别
- 程序1：使用LGSC培养系统将LGSC的培养时间从7天延长至14天，以进行随机分化。
- 步骤2：在LGSC培养开始时将基质凝胶- LGSCM混合物的比例从1：1更改为1：2，用于导管细胞的分化。将LGSC种子到基质中进行诱导14天（参见步骤1.3）。
- 程序3：传代后，用LGSCM-10%胎牛血清（FBS）混合物代替LGSCM，用于腺泡细胞的分化。诱导分化 14 天。
4. LG组织脱水
- 获得LG组织（步骤1.1.1）并用4mL无菌10mM PBS溶液在6cm培养皿中冲洗LG2分钟。将组织移动到10%福尔马林溶液中以固定24小时。
- 用10mM PBS冲洗固定组织2分钟以除去福尔马林，并将组织转移到组织包埋盒中。将包埋盒放入自动脱水机中。
- 使用自动脱水机使组织脱水如下：70%乙醇，2小时;80%乙醇，2小时;90%乙醇，30分钟;95%乙醇，30分钟;无水乙醇，30分钟;无水乙醇，2小时;无水乙醇：100%二甲苯（1：1）混合物，30分钟;100%二甲苯，30分钟;100%二甲苯， 2小时;100%二甲苯：石蜡（1：1）混合物，30分钟;石蜡，2小时;石蜡，3小时。
5. LG类器官/球体脱水
- 在1.5mL微量离心管中获得LG类器官/球体（步骤2.1-2.3），并用1mL无菌10mM PBS溶液冲洗LG类器官/球体2分钟。
- 以100× g 离心1分钟并除去上清液。
- 按如下方式制备4%多聚甲醛（PFA）溶液：将20g PFA加入400 mL 10 mM PBS和40μL1 M NaOH的混合物中，充分摇动溶液，并在65°C水浴中加热2小时，直到PFA完全溶解。冷却至室温后，使用10 mM PBS将体积增加到500 mL并将其储存在4°C。
- 将1mL 4%PFA加入具有类器官/球形颗粒的微量离心管中，并将管放入4°C冰箱中至少24小时以进行固定。
- 固定后，以100× g 离心1分钟并除去上清液。将1mL 10 mM PBS加入具有类器官/球形沉淀的微量离心管中，并通过移液2分钟轻轻混合以冲洗掉PFA。重复此步骤两次。
- 以100× g 离心1分钟并除去上清液。
- 热包埋水凝胶溶解并加入50-60μL包埋水凝胶到类器官/球形颗粒中并混合。将混合物以液滴的形式移液到石蜡膜上，并等待5分钟，使其在室温下固化。
- 将凝胶与类器官/球体在新的1.5 mL微量离心管中脱水，如下所示。
- 向管中加入1mL 50%乙醇，在室温下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤，依次将乙醇浓度更改为70%，80%，90%，95%。
- 向管中加入1mL无水乙醇，在室温下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤。
- 向管中加入1mL 0.5mL无水乙醇和0.5mL 100%二甲苯的混合物，在室温下等待30分钟，并通过移液从管中取出液体。
- 向管中加入1mL 100%二甲苯，在室温下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤。
注意：步骤5.8.5-5.8.6必须在65°C的金属浴中进行。 - 向管中加入1mL 0.5mL石蜡和0.5mL 100%二甲苯的混合物，在65°C下等待30分钟，并通过移液从管中取出液体。
- 向管中加入1mL石蜡，在65°C下等待30分钟，然后通过移液从管中取出液体。重复此步骤并将处理时间延长至1小时。
6. 石蜡包埋和切片
- 石蜡包埋
- 在包埋之前，打开包埋机并预热以融化石蜡罐中的石蜡。
- 将脱水组织或类器官/球凝胶放入包埋铁盒的凹槽中，并将铁盒放入包埋机的石蜡中。
- 取下塑料盖，将塑料嵌入盒放在铁盒上以覆盖它。将嵌入的铁盒移到冷却台上。
- 石蜡在包埋盒中凝结成块后，将其从铁盒中取出并直接切片或暂时储存在4°C冰箱中。
- 石蜡切片
- 在石蜡切片之前，预组装石蜡切片机，并将蒸馏水加入切片机的水槽中进行预热。当水温上升到42°C时开始切片。
- 将样品固定在石蜡切片机的样品槽上。在切片过程中将切片厚度调整为5μm。
- 连续切除样品。将完全平铺的部分固定在切片机罐中的防滑滑块上。
- 切片后，将贴有样品组织的载玻片置于37°C的生化培养箱中干燥24小时。暂时将载玻片存放在4°C的冰箱中。
7. 苏木精和曙红染色
- 将石蜡切片在60°C下熔化30分钟，将切片浸泡在100%二甲苯中15分钟，然后重复。
- 在振荡器上用无水乙醇处理切片5分钟。
- 在振荡器上用90%乙醇，80%乙醇和70%乙醇处理切片，每次3分钟。
- 在摇床上用去离子水连续处理切片5分钟和2分钟。
- 用4mg / mL苏木精溶液在湿盒子上染色切片5分钟。在自来水中冲洗切片10分钟。
- 首先用去离子水在摇床上搅拌切片2分钟，然后用0.5%-1%曙红搅拌1分钟。
- 连续用70%乙醇，80%乙醇和90%乙醇在摇床上搅拌切片3分钟（每个）。用无水乙醇在摇床上搅拌切片5分钟。
- 将切片浸泡在100%二甲苯中15分钟，然后重复浸泡。
- 使用移液管或滴管向载玻片中加入3-4滴中性香脂，并用盖玻片慢慢覆盖。在室温下风干载玻片。
8. 免疫组化 （IHC） 染色
- 将石蜡切片在60°C下熔化30分钟，将切片浸泡在100%二甲苯中10分钟，然后重复此步骤两次。
- 首先用无水乙醇，90%乙醇和80%乙醇连续搅拌振荡器上的切片2分钟（每个），然后用去离子水搅拌3分钟。用去离子水重复搅拌两次。
- 首先用20mL的30%H2 O 2和180mL甲醇的混合物搅拌振荡器上的切片10分钟，然后去离子水搅拌5分钟。重复此步骤三次。
- 将切片转移到预沸的柠檬酸缓冲液中（1L去离子水与3g Na3C6H5O7.2H 2O和0.4g C6H8O7，pH 6.0），微波10分钟以使其保持在亚临界沸点，并在室温下冷却30分钟。在摇床上用去离子水搅拌切片5分钟。重复此步骤三次。
- 用10 mM PBS在摇床上搅拌切片5分钟，然后重复此步骤三次。用憎水标记物将组织区域封闭在湿盒子上，加入一滴即用型非免疫山羊血清以覆盖样品，并将其置于室温下1小时。
- 取出血清，向样品中加入一抗（参见 材料表），并在4°C下孵育过夜。 取出一抗，在振荡器上用10mM PBS搅拌切片5分钟，并用10mM PBS重复该搅拌步骤三次。
- 加入二抗（参见 材料表）以覆盖样品，并在室温下在湿盒上孵育30分钟。用10 mM PBS在摇床上搅拌切片5分钟，并重复搅拌步骤三次。
- 加入新鲜制备的0.03-0.05%3，3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液，以覆盖湿盒上的样品并染色30-90秒。用自来水冲洗切片10分钟。
注意：通过在光学显微镜下观察直到出现黄色来控制染色时间。 - 加入4mg / mL苏木精溶液覆盖样品，在湿盒上染色5分钟，然后用自来水冲洗切片10分钟。
- 在振荡器上用80%乙醇，90%乙醇和无水乙醇搅拌切片2分钟，连续，并将切片浸泡在100%二甲苯中30分钟。
- 使用移液管或滴管向载玻片中加入3-4滴中性香脂，并用盖玻片慢慢覆盖。在室温下风干载玻片。
9. 类器官/球体的全球免疫荧光染色
注意：将用4%PFA溶液固定的类器官/球体收集在1.5 mL微量离心管中（参见步骤5.1至5.4）。按如下方式进行荧光标记。
- 通过将1mL 30%蔗糖溶液加入管中并使其在4°C的冰箱中孵育过夜，使类器官/球体脱水。
- 向管中加入100μLPST溶液（10mM PBS溶液与0.1%Triton X-100）以冲洗类器官/球体5分钟，将管以100× g 离心1分钟，并收集沉淀。重复此步骤三次。
- 向管中加入0.5-1 mL即用型非免疫山羊血清，并在室温下密封1小时。将管以100× g 离心1分钟并收集沉淀。
- 加入几滴稀释的一抗，仅覆盖沉淀，并在4°C的冰箱中孵育48小时。将管以100× g 离心1分钟并收集沉淀。
- 重复步骤 9.2。
- 向管中加入几滴荧光二抗和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，仅覆盖沉淀并在4°C的冰箱中孵育24小时，避免光照。
- 重复步骤9.2，避开光线。
- 向管中加入100μLPBST溶液，并将其暂时储存在远离光线的4°C冰箱中。使用光片扫描显微镜观察和拍摄类器官/球体。
10. LGSC pLX-樱桃转染
注：慢病毒颗粒的生产必须在BSL2生物安全级别的生物安全柜和洁净工作台中进行。
- 将慢病毒包装细胞293T培养在DMEM + 10%FBS的6孔板中，在37°C，5%CO2 下3-5天，以达到80%的细胞汇合度。
- 将慢病毒载体 pLX-mCherry 转染到 LGSC 中。
注意：试剂制备适用于6孔板的一孔。- 准备两个无菌的1.5 mL离心管，并向每个管中加入250μL DMEM / F12。
- 向一个管中加入7.5μL转染试剂，并通过移液将试剂充分混合。
- 将不含内毒素和匹配的慢病毒包装质粒的pLX-mCherry质粒加入另一管中，并加入转染试剂（2μL / μg质粒）。
- 在两个离心管中混合液体，让混合物在室温下静置5分钟。
- 除去293T细胞的培养基，并将步骤10.2.4中的混合物加入到293T细胞中。8小时后将培养基改为新鲜的DMEM + 10%FBS。
- 48小时后，首次收集病毒上清液并通过0.45μm过滤器过滤。72小时后，第二次收集病毒上清液，并再次通过0.45μm过滤器过滤。
注意：将两种过滤的上清液储存在冰上，直到慢病毒转导。
- 从二苯乙烯醚小鼠（NOD/氧化痣）获得LGSC（参见步骤1）。
- 加入1mL预收集的pLX-mCherry慢病毒上清液以重悬细胞。
- 将离心管放在CO2 培养箱中的振荡器上，温度为37°C。 以100rpm的速度摇晃它，以最大化慢病毒和细胞之间的接触。8小时后，将混合物以250× g 离心4分钟并除去上清液。
- 加入1 mL DMEM / F12以重悬细胞沉淀。使用细胞计数器确定细胞数量，并将总共1个×104 个细胞接种到100μL基质凝胶-LGSCM基质（基质凝胶：LGSCM = 1：1）中，每个孔板预涂有20μL基质凝胶-LGSCM基质（参见步骤1.3.2）。
- 培养7天后（参见步骤1），在荧光显微镜下选择具有红色荧光的球体以扩大培养物。
11. 原位移植
注意：所有外科手术都在SPF手术室进行，所有手术器械都经过消毒。
- 从具有红色荧光（td-番茄）或樱桃转染7天的ROSA26mT / mG 小鼠中获取LGSC球（参见步骤1）。
- 使用前将含有基质凝胶和 DMEM/F12 混合物的 1.5 mL 微量离心管冷却至冰上。将LGSC球消化成单个细胞，并将细胞以2×106 个细胞/ mL的密度重悬于管中。
- 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（50mg / kg）麻醉NOD / ShiLtJ小鼠。
注意：NOD / ShiLtJ小鼠是具有特发性附加症状的理想模型，包括泪液分泌减少，炎症浸润和眼眶溃疡。 - 麻醉后，在眼睛上使用生理盐水或兽医软膏以防止干燥，然后用眼用剪刀在麻醉小鼠的耳朵后面（眼睛附近）的皮肤上做一个5-8毫米的切口，以暴露LG。
注意：碘伏应严格用于切口周围的消毒。 - 将2×104 个细胞注入左侧LG中，并将没有细胞的混合物（参见步骤11.2）注入右侧LG作为对照。
- 注射后，用眼用镊子将LG恢复到其原始位置并缝合伤口。喂养小鼠2个月并观察治疗效果。
注：保持架垫材料在操作后也必须严格灭菌，垫子材料应每天更换一次。缝合伤口后，曲马多可以以2.5mg / kg的标准剂量选择性地注射到小鼠的尾静脉中，以实现镇痛。 - 在实验后2个月麻醉这些小鼠（见步骤11.3）。拍摄眼部区域的症状。
- 在麻醉期间，寻找以下症状：颈部和肢体肌肉松弛;深呼吸，缓慢和稳定;瞳孔缩小;角膜反射消失。
- 在麻醉和手术期间，将小鼠的体温保持在37°C。 手术后，在小鼠的饮用水中加入适当的抗生素，以降低伤口感染的风险。不要让小鼠无人看管，直到它们恢复足够的意识来维持胸骨卧位。在完全康复之前，不要将接受过手术的小鼠送回其他小鼠的陪伴下。
- 拍摄眼部区域的症状后，打开ImageJ软件，单击 文件|打开|徒手选择，按住鼠标左键，然后选择图像 中的眼眶溃疡区域 。点击 分析|测量 以获得溃疡的相对面积。
- 将酚红棉线放在麻醉小鼠的侧囊上10秒;测量并记录棉线变色部分的长度。撕裂测量后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 解剖小鼠并获取用于IHC分析的LG。
12. 核糖核酸分离
注意：在实验之前，将离心机预冷至4°C，并保证所有试剂和消耗品均不受RNAse污染。
- 在微量离心管中收集LGSC或LG片段。加入1mL细胞裂解缓冲液，通过涡旋振荡完全裂解细胞或组织。
- 加入0.2mL氯仿，并在涡旋振荡1分钟后在室温下静置10分钟。在4°C下离心15分钟，12，000× g。
注意：离心后，液体分为三层，RNA处于最上层透明的水相。 - 小心地移液最上层的透明水相，并将其转移到新的1.5 mL无RNAse离心管中。
- 加入等体积的异丙醇，轻轻混合。让混合物在室温下静置10分钟，然后在4°C，12，000× g下离心15分钟。
- 除去上清液，加入1mL 75%乙醇。倒置管以洗涤沉淀并在4°C，7，500× g下离心5分钟。重复此步骤。
- 小心地取出上清液，将离心管放入超洁净工作台中干燥约20分钟。
注意：当白色颗粒变得半透明时，继续下一步。在冰上进行所有操作。 - 加入20μL无RNAse水以完全溶解沉淀。使用分光光度计测量RNA浓度（参见 材料表）并将RNA溶液储存在-80°C。
13. 聚合酶链反应
- 逆转录反应
- 将1μg总RNA（根据RNA溶液的浓度计算添加的RNA溶液的体积）加入PCR反应管中，并在65°C下孵育5分钟以进行变性。
- 将其放在冰上1分钟，然后加入无酶水，直到总体积达到12μL.加入4μL的4x DNA预混液，并在37°C下孵育5分钟。
- 将试管放在冰上，加入4μL 5x RT预混液，轻轻混合。设置以下PCR设置：37°C持续15分钟，50°C持续5分钟，98°C持续5分钟，4°C持续1分钟。
- 将其储存在-20°C或逆转录反应完成后继续下一步。
- 聚合酶链反应
- 在PCR管中制备PCR反应如下：14.1μL无酶水，2μLdNTP，2μL10x缓冲液，0.8μL引物（10μM，0.4μL正向引物和0.4μL反向引物，参见 材料表），1μL逆转录cDNA（参考步骤13.1）和0.1μLTaq酶。
- 将制备的PCR反应置于PCR装置中进行PCR。有关 PCR 程序，请参阅 Taq 酶试剂盒的说明（参见 材料表）。
- 琼脂糖凝胶电泳
- 使用分析天平称量242克Tris和37.2克Na2EDTA·2H2O，并将它们加入1升烧杯中。向烧杯中加入约800 mL去离子水和57.1 mL冰醋酸，充分混合，向1L中加入去离子水，得到50x TAE缓冲液，并在室温下储存。
注意：使用前用去离子水稀释50x TAE缓冲液。 - 使用分析天平称量1.2g琼脂糖，并将其加入含有80 mL 1x TAE缓冲液的锥形烧瓶中。在微波炉中反复加热，直到完全溶解。
- 在流动的自来水中冷却烧瓶，直到溶液温度降至60°C。 加入8μL核酸染色剂，充分混合后将溶液倒入糊化罐中，放置梳子，并在室温下静置30分钟。
- 拉出梳子并将PCR产物加载到制备的琼脂糖凝胶中。在120 V下进行电泳30分钟。
- 将凝胶放入ECL凝胶成像系统中并拍照。
- 使用分析天平称量242克Tris和37.2克Na2EDTA·2H2O，并将它们加入1升烧杯中。向烧杯中加入约800 mL去离子水和57.1 mL冰醋酸，充分混合，向1L中加入去离子水，得到50x TAE缓冲液，并在室温下储存。
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Representative Results
建立 3D、无血清培养系统
本研究开发了含有EGF、Wnt3A、FGF10和Y-27632的小鼠LGSC，并通过3D培养方法成功分离和培养LGSC（图1A）。使用该方法已经建立了来自C57BL / 6小鼠，NOD / ShiLtJ小鼠，BALB / c小鼠和ROSA26mT / mG小鼠的LGSC的成功3D，无血清培养系统16。对于雄性小鼠，通过解离从两个LG获得1.5-2×10 6个细胞。培养一周后，在培养开始时接种1×104个LG细胞时形成30-60个球体。此外，用这种方法培养的细胞表达Epcam，Krt5，Krt14，P63，巢蛋白和其他干细胞标记物16，表明获得的细胞具有LGSC的性质。
在为期7天的培养中，LGSC球体的直径达到100μm。苏木精和曙红（H&E）染色在第7天显示出细胞性（图1C 和 图1F）。原代培养和传代培养7 d后获得的LGSC富集因子表明，该方法富集的LGSC具有较强的增殖能力（图1D）。在该系统中，LGSC可以传代超过40次，并且它们仍然保持干细胞特性（图1E 和 图1G）。总之，本文描述了在 体外建立LGSC的3D无血清培养系统的方案。通过该方案培养的细胞具有连续和稳定的增殖能力。
在体外诱导分化
分析了LGSC 在体外 的分化能力。培养7 d以上时，LGSC逐渐丧失生长能力，AQP5、Ltf、Krt19等与分化相关的标志物表达增加，而Krt14的表达量逐渐下降16个。通过FBS和低比例的基质凝胶诱导LGSC形成更多的芽（图2A，B）。此外，H&E染色表明FBS可以诱导球体产生更多的空化结构（图2C）。
先前的工作表明，降低基质硬度促进了LGSC分化为导管状类器官。基底层细胞保持干细胞表达Krt14的特征，而基底层上层细胞分化成具有空腔的导管状结构并表达Krt19。此外，FBS的加入可诱导LGSC分化为腺泡样类器官，从而保持干细胞具有高核/细胞质比的特性。一些分化的腺泡样细胞表达高水平的AQP5，核/细胞质比低16。
在体内修复液化硅
基于上述实验，通过原位注射探索了LGSC修复受损LG的能力。在NOD / ShiLtJ小鼠中原位注射ROSA-LGSC后，在LG附近形成新的泪小叶（图3A-C）。大多数小叶由AQP5表达高的成熟腺泡细胞组成，并且存在低AQP5表达的小叶内管形成（图3D-F）。在注射ROSA-LGSC8周后，测量受体轨道周围的衰变。测量结果表明，LGSC的注入使衰变面积减少了约60%（图3G，H）。解剖显示注射10周后LG体积增加（图3I）。ROSA-LGSC注射侧的泪液分泌量高于对照侧，但低于野生型小鼠（图3J）。这些结果表明，该培养系统收获的细胞具有LGSC的特性，可用于ADD和干眼症小鼠的干细胞治疗。
图1：LGSC的分离和表征（A）LGSC初级和连续传代培养的策略。（B）第7天LGSC的免疫荧光染色。LGSC表达上皮细胞标志物E-钙粘蛋白（红色），干细胞标志物Krt14（红色），增殖细胞标志物Ki67（红色）。复染，达皮（蓝色）。（C）LGSC在培养物中1、3、5和7天的形态。（D）初级培养和亚培养中LGSC培养的相对富集因子。相对富集因子是培养7天后获得的细胞总数与培养物中接种的细胞数之比。第<0.01页。（E）小鼠LG和不同传代LGSC（P1，P10，P20和P40）的成体茎/祖细胞标记物的转录。（F）第7天初级培养中LGSC的形态（左）和H&E染色（右）。（G）在不同通道（P1、P10、P20和P40）中培养的LGSC。比例尺 = 50 微米 （B， F， G）， 100 微米 （C）。缩写： LG = 泪腺;LGSC = LG干细胞;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚;;NC = 阴性对照;TE = 胰蛋白酶 -乙二胺四乙酸;H&E = 苏木精和曙红。请点击此处查看此图的大图。
图2：LGSC 的体外分化 （A，B）在正常培养基或分化培养基中培养的LGSC的形态。（A）在P10中培养10天的LGSC（左：正常培养基，右：含FBS的培养基）。（B）在P31中培养14天的LGSC（左：正常培养基，右：具有1/3基质凝胶的 培养基）。（C）对培养14天的LGSC进行H&E染色（顶部：正常培养基，底部：含FBS的培养基）。比例尺 = 100 微米 （A）、200 微米 （B）、50 微米 （C）。缩写： LG = 泪腺;LGSC = LG干细胞;H&E = 苏木精和曙红;FBS = 胎牛血清。 请点击此处查看此图的大图。
图3：移植LGSC同种异体移植和缓解附加症状（A-F）NOD / ShiLtJ LG的IHC染色在8周后移植了ROSA-LGSC的7天培养物。使用同一鼠标的左侧和对照组作为实验组和对照组。（自动对照）用抗td-番茄抗体进行IHC染色;（D-F）用抗AQP5抗体进行免疫组化染色;（答、四）LG注射载体（基质凝胶和DMEM / F12的1：1混合物），（B，E）LG注射罗莎-LGSC，（C，F）B，E（红色箭头，小叶内导管）中黑色方块的放大图像。（G，H）注射ROS-LGSC后8周NOD / ShiLtJ小鼠眼眶的状况。LGSC的注射显着减轻了眼眶周围的衰变。（I） NOD/ShiLtJ 小鼠在 10 周时的 LG（左：细胞注射侧的 LG，右：控制侧的 LG）。（J）野生型和NOD / ShiLtJ小鼠的撕裂体积，在8周后移植7天ROSA-LGSC培养物。罗莎-LGSC注射液的撕血量高于对照液化糖，但显著低于WT液化物。发光二极管/希氏杀伤性粒细胞， n = 4;P < 0.01;*P < 0.05。比例尺 = 50 μm （A-F）。缩写： LG = 泪腺;LGSC = LG干细胞;IHC = 免疫组化;WT = 野生型;ADD =缺水性干眼病。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
有完善的泪液干细胞分离和 体外 培养方法，用于泪液干细胞培养和LG损伤修复。沙托斯等人17 和阿克曼等人。6 .分别通过2D培养方法成功培养和传代大鼠和小鼠的泪液干细胞，使得可以移植泪液干细胞用于ADDD的治疗。对2D培养的LGs的干细胞18 和间充质干细胞19，20 的研究表明，移植这些细胞可以在一定程度上缓解ADD的症状。通过荧光激活细胞分选，Gromova等人。2 .从小鼠LGs中选取表达LG祖细胞标志物的干细胞， 并在体外将其分化成导管和acini，成功实现成体干细胞分化为LG的功能细胞。还表明，移植足够数量的干细胞可以缓解小鼠的附加症状。
为了满足现有泪液干细胞培养方法中干细胞富集的需要并消除血清依赖性，该方案基于先前发表的研究和类器官3D培养技术21建立了该方案中的泪液干细胞无血清培养系统。因此，该系统有望促进泪液干细胞的临床研究。在该协议中，关键步骤包括初级培养，传代培养和LGSC的扩增，以及将LGSC 原位 移植到小鼠受伤的LGG中。
原代培养是获得 LGSC 的基础。有必要在初级培养期间保持无菌条件。用基质凝胶预涂孔孔，以避免细胞培养孔底部细胞的贴壁生长。使用基质凝胶时，必须遵循制造商的说明，并在加入孔之前始终将其保持在液态，以避免实验过程中基质凝胶损失和培养物中基质凝胶不均匀。
原代培养物中接种的细胞数量为10，000个细胞/孔。在实践中，如果确保适当的生长空间和细胞的营养供应，可以增加接种细胞的数量。传代培养是纯化和富集干细胞的重要步骤。经过后，P1代的LGSC形成更多的球体，P1代细胞比P0代多。这表明具有增殖能力的LGSC在该体系中得到了富集。
当LGSC在该3D系统中培养超过10天时，0.05%的胰蛋白酶- EDTA有时不足以在传代过程中将类器官完全消化成单个细胞。这个问题通过适当延长消化时间得到了解决。 原位 注射治疗是验证LGSC临床价值的必要程序，由于小鼠中LG的体积小且组织薄而松散，如果细胞悬浮液在生理盐水或10mM PBS中制备用于注射，细胞总是从注射部位丢失。因此，建议将细胞悬浮液与基质凝胶混合以进行注射。由于该系统中使用的基质凝胶在高于10°C的温度下固化，因此当注射到LG中时，细胞可以很容易地定植。注射前必须始终将细胞和基质凝胶的混合物保存在冰上，并且注射速度很快。
除了从正常小鼠中分离LGSC外，还使用该协议16首次成功分离和培养来自ADD小鼠的成年LGSC。但是，该系统仍然存在缺陷和未解决的问题。首先，所使用的基质凝胶来源于小鼠22，23，其可能在人体内引起排斥反应，因此具有有限的临床适用性。有必要通过寻找合适的合成凝胶来代替基质凝胶来改善培养系统。
其次，该协议中的微分策略需要改进。不是延长分化21 的培养时间或在培养基中添加血清，而是添加特定的生长因子和改变定向诱导的特定环境条件，可以得到预期的结果。有必要通过阐明导致分化的信号通路，进一步探讨LGSC的维持和分化的机制。此外，先前的研究发现， 体外培养的 肌上皮细胞也表达干细胞基因，如Nestin，Musashi和Pax6，表明肌上皮细胞也具有干细胞特征17。
本研究没有关注肌上皮细胞，因此没有通过鉴定肌上皮细胞的特定表达标志物来验证LG类器官中是否存在肌上皮细胞。由于培养条件的限制，肌上皮细胞无法被诱导，或者它们的数量太小而无法观察到。培养时间可以延长，以观察类器官是否进一步分化成肌上皮细胞，或者在将来的诱导分化和系统改善研究中专注于肌上皮细胞。
总之，该协议提供了一种研究LGSC用于LG的发育，修复和再生的方法。LGSC 的体外 分化可能是未来LG体 外 再生的基础，而LGSC的分离和培养可以解决干细胞同种异体移植中的排斥问题。该方法为LGSC临床个体化治疗干眼症提供了重要依据。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金项目（第31871413号）和广东省科学技术两个计划（2017B020230002和2016B030231001）资助。我们非常感谢在研究期间帮助我们的研究人员以及在动物中心工作的工作人员在动物护理方面的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | - | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | - | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | - | |
| Yeast Extract | OXID | - | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
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